WO2007034999A1 - 酵素の製造方法 - Google Patents

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microfiltration
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Hitoshi Sato
Yutaka Shoga
Shingo Koyama
Iyori Shirakura
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Kao Corporation
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an enzyme, and more particularly to a method for efficiently recovering an enzyme from an enzyme-containing solution.
  • a method for collecting a fermentation product such as a target enzyme by filtering the fermentation broth and removing insoluble substances such as fine particles, cultured cells and spores in the fermentation broth is known.
  • particles close to the size of the separation membrane pores during the filtration operation cause clogging of the separation membrane, and insoluble substances accumulate on the membrane surface, resulting in a decrease in filtration efficiency.
  • JP-A 1 1- 3 1 8 4 8 2 adds a cationic surfactant to a fermentation broth containing a high concentration of cells during microfiltration, and the fermentation broth By reducing the viscosity of the It suppresses power loss and increase in filtration pressure, and improves the recovery rate of fermentation products by improving the concentration rate.
  • JP-A 4-3 5 4 5 8 5 proposes that a flocculant (cationic polymer substance) is added to the fermentation broth when the fermentation broth is processed.
  • these polymer flocculants have a molecular weight of several hundreds of thousands, and the membrane may become clogged by a cationic polymer while being repeatedly used. There was a problem. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a method for recovering an enzyme by microfiltration from an enzyme-containing solution having a bacterial cell concentration of 1% (v / v) or lower and an enzyme concentration of 1% (w / v) or higher.
  • a method for producing an enzyme characterized by adding 0.01 to 1% (w / v) of a cationic surfactant to the liquid containing the solution and performing microfiltration, and a cell concentration of more than 1% (v / v)
  • the bacterial cells are separated from the fermentation broth, and the resulting enzyme-containing solution is purified and concentrated by ultrafiltration.
  • the resulting bacterial cell concentration is 1% ( ⁇ / ⁇ ) or less, and the enzyme concentration is 1
  • a method for producing an enzyme comprising adding 0.01 to 1% (w / v) of a cationic surfactant to an enzyme-containing solution of% (w / v) and performing microfiltration.
  • the cells are first separated from the fermentation broth by microfiltration, and then the enzyme-containing solution obtained by separating the cells is purified and concentrated by ultrafiltration.
  • a technique is used. By this method, an enzyme-containing solution with a high cell concentration of 1% (v / v) or less and an enzyme concentration of 1% ( w / v) or more can be obtained, but the enzyme-producing bacteria can be completely blocked and purified. Requests for further purification and separation of this high-concentration enzyme-containing solution from the viewpoints of removal of various germs generated in the process, insoluble matter generated by increasing the concentration of the enzyme solution, and complete removal of a small amount of remaining contaminants Is growing.
  • an enzyme-containing solution having a bacterial cell concentration of 1% (v / v) or less and an enzyme concentration of 1% (w / v) or more as a protein amount is subjected to precise filtration.
  • the bacterial cell concentration is preferably 0.5% (v / v) or less, particularly 0 to 0.3% (v / v). This is preferable from the viewpoint of reducing the load in microfiltration.
  • the enzyme concentration is further preferably 2% (w / v) or more, particularly 2 to 10% (w / v), from the viewpoint of the efficiency of filtration according to the amount of treatment liquid and the filtration rate, and the solubility of the enzyme.
  • the bacterial cell concentration is defined as the ratio of the volume occupied by bacterial cells to the amount of enzyme-containing solution when centrifuged at a centrifugal effect of 12000 G and a sedimentation time of 5 min.
  • the enzyme in the present invention include protease, esterase, carbohydrase and the like. Specific examples of the protease include pepsin, trypsin, chymotrypsin, collagenase, keratinase, elastase, splicin, papain, aminopeptidase, and carpoxypeptidase.
  • esterases include gastric lipase, pancreatic lipase, plant lipase, phospholipase, cholinesterase, phosphotase and the like.
  • strong lupohydrase include cellulase, maltase, saccharase, amylase, pectinase, mono- and i6-glycosidase. I can get lost.
  • the isoelectric point of the enzyme is preferably 7 to 13, more preferably 8 to 12, and particularly preferably 9 to 11 from the viewpoint of great effect of the present invention.
  • the enzyme in the present invention is preferably a protease, and more preferably an alkaline reprotease, from the viewpoint of the usefulness of the enzyme and the great effect of the present invention.
  • Enzyme concentration is defined as the amount of protein.
  • the microfiltration in the present invention is performed using a microfiltration membrane.
  • the type of the microfiltration membrane is not particularly limited as long as it is a type in which filtration is performed by sweeping the membrane surface, and any of a flat membrane, a hollow fiber membrane, a tube membrane and the like may be used.
  • the material of the membrane is, for example, ceramics such as alumina, titania and zirconia, inorganic membranes such as glass and metal, or cellulose acetate, nitrocellulose, aliphatic polyamide, polysulfone, polyolefin, polyacrylonitrile And organic membranes such as polyethersulfone, polyvinyl chloride, polyvinyl alcohol, and fluorine polymer.
  • the film surface speed is preferably 0.5 to 3 m / s, and more preferably 0.5 to 1.5 m / s.
  • the transmembrane pressure difference during separation by microfiltration refers to the average transmembrane pressure difference between the inlet and the outlet, and is usually preferably 0.2 MPa or less, more preferably. Or 0.02 to 0.15 MPa. If the transmembrane pressure is less than 0.02 MPa, the permeation flux decreases and the processability tends to deteriorate. Also, if the transmembrane pressure exceeds 0.2 MPa, it is not preferred because the membrane may become clogged due to consolidation of the gel layer on the membrane surface and the permeation flux may decrease. Further, the method of applying the transmembrane pressure may be the stock solution side pressurization type, the permeate side pressure reduction type, or a combination of both.
  • the operating temperature is usually 0 to 40 ° C, preferably 5 to 30 ° C. If the operating temperature is less than 0 ° C, the viscosity of the enzyme-containing solution increases and the membrane permeation flux may decrease. If it exceeds 40 ° C, the properties of the enzyme-containing solution deteriorate, which is not preferable.
  • an operation method in the present invention not only a constant pressure filtration method in which a permeation flux is obtained by applying a constant pressure as described above, but also a constant flow filtration method for extracting a permeate at a constant flow rate is adopted.
  • an operation backwashing
  • the permeate is periodically backflowed from the permeate side of the membrane.
  • a cationic surfactant used in the present invention is not particularly limited, but a quaternary ammonium salt type compound having a mono- or di-long-chain alkyl group is preferred from the viewpoint of action and effect, and specifically, an average carbon number of 8 Monoalkyltrimethylammonium chloride, monoalkyltrimethylammonium bromide, dialkyldimethylammonium chloride, dialkyldimethylammonium bromide, Nilammonium chloride (benzalkonium chloride).
  • the average carbon number is further preferably 10 to 18 and particularly preferably 12 to 18 from the viewpoint of solubility in the enzyme-containing solution and action and effect.
  • the amount of cationic surfactant added is defined as pure.
  • the amount of the cationic surfactant added to the enzyme-containing solution is 0.01 to l% (w / v), 0.02 to 0.5% (w / v), particularly 0.03 to 0.3% ( The ability to be w / v) is preferable from the viewpoint of improving enzyme permeability and permeation flux.
  • the addition method is not particularly limited, but from the viewpoint that it can sufficiently act on the enzyme-containing solution, a force thionic surfactant is added to the enzyme-containing solution in a state of being previously dissolved in a solvent such as water or isopropyl alcohol. It is preferable to stir and mix for about 10 minutes by some means (for example, stirring by stirring or liquid circulation using a pump).
  • the addition amount of the cationic surfactant in the present invention varies depending on the kind and properties of the enzyme-containing liquid. It is preferable to obtain the addition amount of a cationic surfactant suitable for the kind and properties of the enzyme-containing liquid by the following method. In order to find the appropriate amount of addition, it is possible to change the amount of each addition and perform the filtration individually. However, since it is time-consuming, use the following simple filtration method to obtain the required amount of addition at once. be able to. That is, filtration is performed in the entire circulation under the specified conditions (the permeate is returned to the stock solution as it is so that the activity of the stock solution does not change), and about 2 hours until the filtration rate of the permeate and the enzyme concentration become constant. Filter.
  • the permeate is sampled and the enzyme concentration and permeation flux in the permeate are measured. Return the permeate to the stock solution immediately after sampling so that the enzyme concentration and volume of the stock solution do not change as much as possible. After it becomes constant, stop the device, add a predetermined amount of cationic surfactant to the stock solution, mix for 15 minutes, filter again for 15 minutes in the same way, and concentrate the enzyme concentration and permeation flux in the permeate. Measure. Then, in the same way, add a cationic surfactant to increase the concentration of the active agent, and investigate the relationship between the concentration of the active agent, the permeability of the enzyme, and the permeation flux. By the above operation, a suitable addition amount can be easily obtained.
  • the cells are separated from the fermentation broth having a cell concentration of more than 1% (v / v), and the resulting enzyme-containing solution is purified and concentrated by ultrafiltration, and the cell concentration obtained Is added to the enzyme-containing solution with an enzyme concentration of 1% (w / v) or more as the amount of protein, and 0.01 to 1% (w / v) of a cationic surfactant is added. It is preferable to perform microfiltration.
  • the fermentation broth in the present invention refers to a fermentation product, that is, a solution containing a product in which microorganisms decompose organic substances and accumulate as metabolites.
  • the fermentation broth may be, for example, a culture of microorganisms such as bacteria, actinomycetes, fungi, or yeast, or may be a culture of animal or plant cells. Specific examples include alcoholic fermentation, food fermentation such as soy sauce and vinegar, fermentation of antibiotics and anticancer substances, organic acid fermentation, amino acid fermentation, and enzyme fermentation.
  • the fermentation broth has a bacterial cell concentration of more than 1% (v / v), more than 3% (v / v), especially 10-20% (v / v).
  • the enzyme concentration in the fermentation broth is 0 :!
  • the method for separating cells from the fermentation broth include microfiltration, centrifugation, and full press. These methods may be combined, but may be performed using a microfiltration membrane. preferable.
  • Ultrafiltration means that the membrane diameter is O. lnn! Filtration using an ultrafiltration membrane with a molecular weight range of ⁇ 2nm or a molecular weight cut-off range of 500-100,000. Larger particles and high-molecular substances are blocked by the filtration membrane, and low-molecular substances are filtered. A process that removes a membrane by permeating it. By this operation, the enzyme concentration in the fermented product of 0.1-2% (w / v) can be concentrated to about 1-20% (w / v).
  • the type and material of the ultrafiltration membrane used in the present invention are the same as those of the above-described microfiltration membrane.
  • the operating temperature is 0-40 ° C, preferably 5-30 ° C. If the operation temperature is less than 0 ° C, the viscosity of the fermented product-containing liquid increases and the operability deteriorates. Moreover, if the temperature exceeds 40 ° C, the activity of the fermentation product decreases, which is not preferable.
  • water purification may be performed in which water is added to further increase the degree of purification.
  • the solubility of the enzyme may decrease, and calcium chloride water, sodium sulfate aqueous solution, or the like can be used for hydrolysis.
  • these salts may be added to the concentrated solution after the ultrafiltration.
  • Figure 1 is a graph showing the relationship between surfactant concentration, enzyme permeability, and membrane permeation flux.
  • Bacillus SP KSM-9865 (FEM-P18566) alkaline protease (isoelectric point 9.5) fermented liquid (cell concentration 10.8% (v / v)) 100L effective membrane area 0.41m 2 , pore size 0.1 Microfiltration (MF) was performed at 10 ° C using a hollow fiber microfiltration membrane (Asahi Kasei Co., Ltd., PSP-113L) with ⁇ m and thread inner diameter of 1.9 ⁇ . After concentrating 3 times, an equivalent amount of deionized water was added to the concentrated solution, and the concentration was repeated again three times to obtain a total of 168 L of MF permeate.
  • FEM-P18566 alkaline protease (isoelectric point 9.5) fermented liquid (cell concentration 10.8% (v / v)) 100L effective membrane area 0.41m 2 , pore size 0.1 Microfiltration (MF) was performed at 10 ° C using a hollow fiber microfiltration membrane (Asahi Kasei Co.,
  • the obtained MF permeate was subjected to ultrafiltration concentration (UF) with an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 6000 (Asahi Kasei Corporation, AIP-2013, membrane area lm 2 ). After 7-fold concentration, add 0.4% (v / v) aqueous solution of calcium chloride equal to the amount of the concentrated solution, and perform the concentration again 9 times to obtain a protein concentration of 4.8% (w / v). 23.5 L of UF concentrate Obtained. The cell concentration in the UF concentrate at this time was 0% (v / v). Thereafter, sodium sulfate was dissolved in the UF concentrate to a concentration of 2% (v / v).
  • UF ultrafiltration concentration
  • 1.5 ° C of the above solution is 10 ° by using an effective membrane area of 0.015m 2 , pore diameter of 0.25 ⁇ m, thread inner diameter of 0.7mm, module length of 130mm and thread count of 100 hollow fiber microfiltration membranes (Asahi Kasei Corporation, PSP-003). Microfiltration was performed at C.
  • the treatment conditions were a circulation flow rate of 1.8 L / min (intramembrane linear velocity: 0.8 m / s), an average pressure of 0.06 Mpa, backwashing from the permeate side of the membrane at 15-minute intervals, and immediately after backwashing until the next backwashing.
  • the average enzyme permeability and permeation flux for 15 minutes were measured and filtered for about 2 hours until constant.
  • the permeate was returned to the stock solution tank immediately after sampling, so that the enzyme concentration and volume of the stock solution did not change as much as possible (hereinafter referred to as “total circulation operation”).
  • total circulation operation After the enzyme permeation rate became constant, the apparatus was temporarily stopped, and the surfactants shown in Table 1 were added in the amounts shown in Table 1 and mixed for 15 minutes. Again, after 15 minutes after backwashing again, Filtration was performed, and the enzyme permeability and permeation flux in the permeate were measured. Subsequently, a cationic surfactant was added in the same manner to increase the concentration of the active agent, and the relationship between the active agent concentration, the enzyme permeability, and the permeation flux was investigated.
  • the enzyme permeability was defined by the following equation (1).
  • Enzyme permeability (%) permeate activity (unit) / stock solution activity (unit) X 1 0 0 (1)
  • Protein concentration was measured using bovine serum albumin as a standard.
  • the treatment conditions were the same as in Example 1 with a circulating flow rate of 7.2 L / min (intramembrane linear velocity 0.8 m) and an average pressure of 0.05 MPa.

Abstract

本発明は、菌体濃度が１％(v/v)以下であり、酵素濃度がタンパク量として１％(w/v)以上である酵素含有液から精密濾過により酵素を回収する方法であって、該酵素含有液にカチオン性界面活性剤を0.01～１％(w/v) 添加して精密濾過を行う。

Description

明細書 酵素の製造方法 技術分野
本発明は酵素の製造方法に関し、 詳しくは酵素含有液から効率良く酵 素を回収する方法に関する。 従来の技術
発酵液を濾過し、 発酵液中の微粒子、 培養細胞および胞子などの不溶 解物質を除去して目的とする酵素等の発酵生産物を回収する方法は公知 である。 ところが、 濾過操作中に分離膜細孔の大きさに近い粒子によつ て分離膜の目詰まりを起こし、 さらに膜面上に不溶解物質が堆積し、 濾 過効率の低下を招く問題がある。 従来、 こうした分離膜の物理的目詰ま りや膜面上の不溶解物質の堆積に対し、 膜面上を掃流しながら濾過を行 う等の操作により、 目詰まりゃ不溶解物質の堆積を避けていたが、 高濃 度菌体を含有する発酵液の場合には、 発酵液の粘度が高いため、 掃流す る際の圧力損失が大きく、 濾過圧力が増大し、 不溶解物質の膜面上での 圧密化をもたらし、 かえって濾過効率の低下を招く問題があった。
このような問題を解決するため、 J P— A 1 1— 3 1 8 4 8 2では、 精密濾過に際し高濃度の菌体を含有する発酵培養液にカチオン性界面活 性剤を添加し、 発酵液の粘度を低下させることにより、 掃流する際の圧 力損失と濾過圧力の増大を抑制し、 濃縮率の向上により発酵生産物の回 収率を向上している。 また J P - A 4 - 3 5 4 5 8 5では、 発酵液の処 理に際し発酵培養液に凝集剤 （カチオン系高分子物質） を添加すること が提案されている。 しかしこれらの高分子凝集剤は分子量が数十万あ り、 繰り返し使用するうちに逆に膜がカチオン系の高分子により目詰ま りを起こし、 膜の洗浄回復が不能になる可能性があるという問題点があ つた。 発明の開示
本発明は、 菌体濃度が 1 % (v/v)以下であり、 酵素濃度が 1 % (w/v)以上 である酵素含有液から精密濾過により酵素を回収する方法であって、 該 酵素含有液にカチオン性界面活性剤を 0.01〜 1 % (w/v) 添加して精密濾 過を行うことを特徵とする酵素の製造方法、 並びに菌体濃度が 1 % (v/v) 超の発酵培養液から菌体を分離し、 得られた酵素含有液を限外濾過によ り精製 ·濃縮し、 得られた菌体濃度が 1 % (ν/ν) 以下であり、 酵素濃度 が 1 % (w/v)である酵素含有液にカチオン性界面活性剤を 0.01〜 1 % (w/v)添加して精密濾過を行うことを特徴とする酵素の製造方法である。 発明の詳細な説明
プロテア一ゼ等の酵素の醱酵生産に際しては、 まず発酵培養液から菌 体を精密濾過等により分離し、 次に菌体を分離して得られた酵素含有液 を限外濾過により精製 ·濃縮する手法が用いられることが多い。 この方法により、 菌体濃度が 1 % (v/v)以下、 酵素濃度が 1 % (w/v)以 上という高濃度の酵素含有液が得られるが、 酵素生産菌の完全阻止、 精 製過程で発生する雑菌の除去、 酵素溶液を高濃度化することにより発生 する不溶物、 残存する少量の夾雑物の完全除去等の観点から、 この高濃 度酵素含有液を更に精製 ·分離する要望が高まっている。
この高濃度酵素含有液の精製 ·分離には、 精密濾過膜を用いることが 考えられるが、 このような高濃度酵素含有液の場合、 菌体濃度が低く、 発酵液の粘度が問題にならない溶液であるにも関わらず、 高タンパク濃 度であるため精密濾過の際の酵素透過率、 透過流束が劣り、 生産効率が 非常に悪いという問題があることが判明した。
また一般的に高タンパク質溶液の精密ろ過による精製では、 除去すベ き混在するウィルス等の不純物は少量であっても、 夾雑する ppbオーダ 一の D N A等により膜透過における透過流束が減少すること、 タンパク 質溶液の透過率が悪いこと、 といった問題点を有している。 このような 問題を解決する手段として、 JP-A 2 0 0 4— 8 9 1 5 5では、 タンパク 質溶液を膜によりろ過する際にタンパク質溶液を D N A分解酵素、 D N a s eで処理した後に、 あるいは D N a s e処理しつつ濾過する方法が 提案されている。 しかし、 高濃度のプロテアーゼの発酵液中では D N a s e自身もタンパク質であるため、 プロテア一ゼにより容易に分解され てしまい効果が期待できない。
以上の通り、 高濃度酵素含有液の最終的な精製 ·分離である精密ろ過 による精製においては、 十分な酵素透過率、 透過流束を発現するのは非 常に困難であり、 生産効率が非常に悪いという問題点があることが判明 した。
本発明者らは、 精密濾過膜を用いた高濃度酵素含有液の最終的な精 製 ·分離において十分に大きな酵素透過率、 透過流束を実現する方法を 検討した結果、 前記の本発明を完成した。
本発明においては、 菌体濃度が 1 % (v/v)以下であり、 酵素濃度がタン パク量として 1 % (w/v)以上である酵素含有液を対象とし、 これを精密瀘 過することにより酵素を回収する。 菌体濃度は、 更に 0.5 % (v/v)以下、 特に 0〜0.3% (v/v)であること力 精密濾過での負荷低減の点から好まし い。 酵素濃度は、 更に 2 % (w/v)以上、 特に 2〜10 % (w/v)であることが、 処理液量と濾過速度による濾過の効率、酵素の溶解性の点から好ましい。 菌体濃度は遠心効果 12000 G、沈降時間 5 minの条件で遠心分離した際 の酵素含有液量に対する菌体の占める容積の比率として定義される。 本発明における酵素は、 プロテアーゼ、 エステラーゼ、 カルボヒドラ 一ゼ等をあげることができる。 プロテア一ゼの具体例としては、 ぺプシ ン、 トリプシン、 キモトリブシン、 コラゲナーゼ、 ケラチナーゼ、 エラ スターゼ、 スプリシチン、 パパイン、 アミノぺプチダ一ゼ、 カルポキシ ぺプチダーゼ等を挙げることができる。エステラーゼの具体例としては、 ガストリックリパーゼ、 パンクレアチックリパ一ゼ、 植物リパ一ゼ類、 ホスホリパーゼ類、 コリンエステラーゼ類、 ホスホタ一ゼ類等が挙げら れる。 力ルポヒドラ一ゼとしては、 セルラーゼ、 マルターゼ、 サッカラ ーゼ、 アミラーゼ、 ぺクチナーゼ、 一及び i6—グリコシダーゼ等が挙 げられる。 また、 酵素の等電点が 7〜 1 3、 更に 8〜 1 2、 特に 9〜 1 1であることが、 本発明の効果が大きい点から好ましい。 また本発明に おける酵素は、 酵素の有用性、 本発明の効果が大きい点から、 プロテア ーゼが好ましく、 更にアル力リプロテアーゼが好ましい。
酵素濃度は、 タンパク量として定義される。
本発明における精密濾過は、 精密濾過膜を使用して行う。 精密濾過膜 の形式は、 膜面上を掃流して濾過を行う形式であれば特に制限はなく、 平膜、 中空糸状膜、 チューブ状膜等のいずれであっても良い。 膜の材質 は例えば、 アルミナ、 チタニア、 ジルコニァ等のセラミック、 ガラス、 金属等の無機膜、 または、 酢酸セルロース系、 二トロセルロース系、 脂 肪族ポリアミド系、 ポリスルホン系、 ポリオレフイン系、 ポリアクリロ 二トリル系、 ポリエーテルスルホン系、 ポリ塩化ビニル系、 ボリビニル アルコール系、 フッ素系高分子等の有機膜が挙げられる。
分離膜面上の掃流の観点からは、 膜面速度が大きいほど膜面上の掃流 効果が大きくなる。 しかし、 ある速度以上では、 圧力損失が大きくなり、 膜近傍でのゲル層の圧密化が起こり、 膜透過流束および酵素含有液中の 酵素の回収率が低下する。 また、 膜面速度が低過ぎると圧力損失は低下 し、 圧密化は回避されるが、 ゲル層の剥離効果が低下し、 酵素含有液中 の酵素の回収率が低下する。 これらの点から膜面速度は 0.5〜 3 m/s、 更 に 0.5~ 1.5m/sとすることが好ましい。
本発明において精密濾過により分離する際における膜間差圧は、 入口 と出口の平均膜間差圧をいい、 通常 0.2MPa以下が好ましく、 より好ま しくは 0.02〜0.15MPaである。 膜間差圧が 0.02MPa より小さいと透 過流束が低下し、 処理性が悪化する傾向がある。 また、 膜間差圧が 0.2MPa を超えると膜面でのゲル層の圧密化等により.膜閉塞が生じて透 過流束が低下する場合があるので好ましくない。 また、 膜間差圧の与え 方は、 原液側加圧式、 透過液側減圧式あるいは両者の組み合わせでも良 い。 操作温度は、 通常 0〜40°Cであり、 好ましくは 5〜30°Cである。 操 作温度が 0 °C未満では酵素含有液の粘度が大きくなるため膜透過流束が 低下することがあり、また 40°Cを超えると酵素含有液の性状が悪化し、 好ましくない。
本発明における運転方法としては、 上述するような一定の圧力をかけ て透過流束は成り行きとなる定圧濾過方式だけでなく、 一定流量で透過 液を抜き出す定流量濾過方式も採用される。 また、 膜の濾過性を高く維 持するために、膜の透過側から定期的に透過液を逆流させる操作（逆洗） を行っても良い。
本発明においては、 精密濾過を行う前に、 上記酵素含有液にカチオン 性界面活性剤を 0.01〜 l % (w/v) 添加することが必要である。 本発明で 使用するカチオン性界面活性剤は特に限定はされないが、 モノ又はジ長 鎖アルキル基を有する第 4級アンモニゥム塩型の化合物が作用効果の点 から好ましく、具体的には平均炭素数 8〜18の直鎖アルキル基を含むモ ノアルキルトリメチルアンモニゥムクロリ ド、 モノアルキルトリメチル アンモニゥムブロマイド、 ジアルキルジメチルアンモニゥムクロリ ド、 ジアルキルジメチルアンモニゥムブロマイド、 モノアルキルジメチルべ ンジルアンモニゥムクロリ ド （塩化ベンザルコニゥム塩） 等が挙げられ る。 平均炭素数は、 更に 10〜： 18、 特に 12〜： 18であることが酵素含有液 への溶解性、 作用効果の点から好ましい。
カチオン性界面活性剤の添加量は、 純分で定義される。 カチオン性界 面活性剤の酵素含有液への添加量は、 酵素含有液中の濃度として 0.01〜 l % (w/v)、 更に 0.02〜0.5 % (w/v)、 特に 0.03〜0.3 % (w/v)であること力 酵素透過性の向上、 透過流束の向上の点から好ましい。 添加方法は特に 限定されないが、 酵素含有液に充分に作用させることができる点から、 力チオン性界面活性剤を水あるいはィソプロピルアルコール等の溶剤に 予め溶解した状態で酵素含有液に添加し、.何らかの手段 （例えば攪拌モ 一夕による攪拌やポンプによる液循環） により 1 0分程度、 撹拌、 混合 することが好ましい。
本発明におけるカチオン性界面活性剤の添加量は、 酵素含有液の種類 や性状により異なる。 酵素含有液の種類や性状に対応して適したカチォ ン性界面活性剤の添加量を、下記のような方法で求めることが好ましい。 適した添加量を求めるには種々添加量を変えて濾過をそれぞれ単独で行 つてもよいが、 手間がかかることから、 以下のような簡便な濾過方法に より、 一度で必要な添加量を求めることができる。 すなわち、 所定の条 件で全循環で濾過を行い （原液の活性が変わらないように透過液をその まま原液に戻す。）、 透過液の濾過速度、 酵素濃度が一定になるまでに約 2時間濾過を行う。 透過液の濾過速度、 酵素濃度が一定となったら透過 液のサンプリングを行い、透過液中の酵素濃度及び透過流束を測定する。 透過液はサンプリング後、 すぐに原液に戻し、 原液の酵素濃度、 液量が 極力変わらないようにする。 一定になった後、 装置を一旦停止し、 原液 に所定量のカチオン性界面活性剤を添加し、 15分間混合し、 再度同様に 15分間濾過を行い、 透過液中の酵素濃度及び透過流束を測定する。 その 後、 同様にカチオン性界面活性剤を添加し活性剤濃度を増やし、 活性剤 濃度と酵素の透過率、 透過流束の関係を調べる。 以上のような操作によ り、 適した添加量を簡便に求めることができる。
本発明においては、 菌体濃度が 1 % (v/v)超の発酵培養液から菌体を分 離し、 得られた酵素含有液を限外濾過により精製，濃縮し、 得られた菌 体濃度が 1 % (ν/ν) 以下であり、 酵素濃度が夕ンパク量として 1 % (w/v) 以上である酵素含有液にカチオン性界面活性剤を 0.01〜 1 % (w/v) 添加 して精密濾過を行うことが好ましい。
本発明における発酵培養液とは、 発酵生産物、 即ち微生物が有機物を 分解し、 その代謝物として蓄積される生産物を含有する液をいう'。 発酵 培養液は、 例えば細菌、 放線菌、 カビ、 酵母等の微生物を培養したもの でも良く、 動物あるいは植物の細胞を培養したものでも良い。 具体的に は、 アルコール発酵、 醤油、 食酢等の食品発酵、 抗生物質および抗ガン 物質の発酵、 有機酸発酵、 アミノ酸発酵、 酵素の発酵等が挙げられる。 発酵培養液は、 菌体濃度が 1 % (v/v)超、 更に 3 % (v/v)以上、 特に 10〜 20 % (v/v)のものである。なお、発酵培養液中の酵素濃度は 0.：！〜 2% (w/v) 程度である。 本発酵終了時点の発酵培養液中には、 微生物等の菌体が高 濃度で存在するため、 まず菌体を分離することが好ましい。 本発明にお ける発酵培養液からの菌体の分離法は、 例えば精密濾過法、 遠心分離、 フル夕一プレス等が挙げられ、 これらの方法を組み合わせても良いが、 精密濾過膜を使用して行うことが好ましい。
発酵培養液からの菌体の分離すなわち発酵生産物の回収を行った後、 通常、 限外濾過により濃縮を行うことが好ましい。 限外濾過とは、 膜口 径が例えば O. lnn！〜 2nm の範囲ないし分画分子量が 5 0 0〜 1 0万の 範囲の限外濾過膜を用いて濾過し、 これより大きな粒子や高分子物質が 濾過膜により阻止され、 低分子物質を、 濾過膜を透過させることにより 除去するプロセスをいう。 当該操作により発酵生産物中の酵素濃度が 0.1〜2 % (w/v)であったものを l〜20% (w/v)程度に濃縮することができ る。
本発明に使用する限外濾過膜の形式 ·材質については、 前記した精密 濾過膜の場合と同様である。 限外濾過膜により濃縮を行う際の膜面上の 掃流を行うための膜面速度は大きいほど掃流効果が大きいが、 0.5〜 3 m/sが適当である。 膜間差圧は大きいほど濾過速度は大きくなるが、 あ まり大きすぎると膜近傍でゲル層が圧密化するため、 濾過速度は向上し. なくなる。 したがって 00.5〜0. 3 MPa が適当である。 操作温度は 0〜 40°Cであり、 好ましくは 5〜30°Cである。 操作温度が 0 °C未満では発酵 生産物含有液の粘度が大きくなり、 操作性が悪化する。 また 40°Cを超え ると発酵生産物の活性が低下するため好ましくない。
限外濾過の操作条件としては 1次濃縮の後、 更に精製度を上げるため に加水して更に濃縮を行う加水精製を行ってもよい。 その際、 発酵液の 塩濃度が低下すると酵素の溶解度が低下する場合があり、 加水精製には 塩化カルシゥム水や硫酸ナトリウム水溶液等を用いることもできる。 ま た、 限外濾過終了後の濃縮液にこれらの塩を添加しても良い。 図面の簡単な説明
図 1は、 界面活性剤濃度と酵素透過率、 膜透過流束の関係を示したグ ラフである。 実施例
次の実施例は本発明の実施について述べる。 実施例は本発明の例示 について述べるものであり、 本発明を限定するためではない。
実施例 1〜 7、 及び比較例 1、 2
バチルス エスピー KSM-9865 (FEM-P18566号） のアルカリプロテ —ゼ （等電点 9.5付近） の発酵液 （菌体濃度 10.8% (v/v)) 100Lを有効 膜面積 0.41m2、細孔径 0.1 ^ m、糸内径 1.9πιιη φの中空糸精密濾過膜（旭 化成 (株)、 PSP-113L) により、 10°Cにて精密濾過 （MF) を行った。 3 倍に濃縮の後、 濃縮液量に対して等量の脱イオン水を添加し、 再度濃縮 を行う操作を 3回繰り返し、 計 168Lの MF 透過液を得た。 得られた MF透過液を分画分子量 6000の限外濾過膜 （旭化成 (株)、 AIP-2013,膜 面積 lm2) にて限外濾過濃縮 （UF) を行った。 7倍濃縮の後、 濃縮液量 に対して、 等量の 0.4% (v/v)塩化カルシウム水溶液を添加し、 再度濃縮 を行う操作を 9回行い、 タンパク濃度 4.8% (w/v)の UF濃縮液を 23.5L 得た。 このときの UF濃縮液中の菌体濃度は 0% (v/v)であった。 その後、 UF濃縮液に 2 % (v/v)の濃度になるように硫酸ナトリゥムを溶解した。 上記液 1.5 Lを有効膜面積 0.015m2、 細孔径 0.25 ^ m、 糸内径 0.7mm φモジュール長 130mm糸本数 100本の中空糸精密濾過膜 （旭化成 (株)、 PSP-003) により、 10°Cにて精密濾過を行った。 処理条件は、 循環流量 1.8L/min (膜内線速度 0.8m/s)、 平均圧力 0.06Mpaで行い、 15分間隔 で膜の透過側から逆洗を行い、 逆洗直後から次の逆洗までの間の 15 分 間の平均の酵素の透過率及び透過流束を測定し、 一定になるまで約 2時 間濾過を行った。 透過液はサンプリング後、 すぐに原液タンクに戻し、 原液の酵素濃度、液量が極力変わらないようにした（以下、「全循環操作」 という）。 酵素透過率が一定になった後、 装置を一旦停止し、 表 1に示し た界面活性剤を、 それぞれ表 1に示した量添加し、 15分間混合し、 再度 同様に逆洗の後 15分間濾過を行い、 透過液中の酵素透過率及び透過流 束を測定した。 その後、 同様にカチオン性界面活性剤を添加し活性剤濃 度を増やしてゆき、 活性剤濃度と酵素の透過率、 透過流束の関係を調べ た。 酵素の透過率は次の （1 ) 式で定義した。
酵素透過率（％) =透過液活性（単位）/原液活性（単位） X 1 0 0 ( 1 ) 〔酵素活性測定法一力ゼィン法〕
カゼイン 1 % (v/v) (hanmerstein, メルク社） を含む 50mMホウ酸 緩衝溶液 （pHlO) 1.0mlを 30°Cで 5分間保温した後、 0.1mlの酵素溶 液を加え、 15分間反応を行った。 反応停止液 （0.11Mトリクロ口酢酸一 0.22M酢酸ナトリウム— 0.33M酢酸） を 2.0ml加え、 室温で 10分間放 置したのち、 濾過 （N o l濾紙、 アドバンテック東洋） を行い、 濾液中 の酸可溶夕ンパク質を L o w r yらの方法 U.Biol.Chem., 193,265- 275,1981) により次のように定量した。 0.5mlの濾液にアルカリ性銅液 [1%酒石酸ナトリウムカリウム： 1%硫酸銅： 1 %炭酸ナトリウム = 1 ·· 1： 100]を 2.5ml添加し、 30°Cにて 10分間放置後、 希釈フエノ一ル液 （フ ェノール試薬 （関東化学） を脱イオン水で 2倍希釈） 0.25mlを添加して 30分間恒温したのち、 660nmにおける吸光度を測定した。 酵素 1単位 は、 上記反応にて 1分間に lmmol のチロシンに相当する酸可溶タンパ ク質分解物を遊離させるのに必要な酵素量とした。
〔タンパク質濃度の測定法〕
上記 Lowryらの方法により、牛血清アルブミンをスタンダードとし、 タンパク質濃度を測定した。
Figure imgf000014_0001
表 1の結果から、 カチオン性界面活性剤を添加することにより、 精密 濾過における酵素の透過率及び透過流束が大幅に向上することが分かつ た。 また、 ァニオン性界面活性剤は、 カチオン性界面活性剤に比べて酵 素透過率向上効果が小さく、 透過流束向上効果がないことが分かった。 実施例 8、 及び比較例 3、 4
上記実施例 1で使用したアル力リプロテア一ゼの UF濃縮液 （タンパ ク濃度 4.8% (w/v)) に硫酸ナトリウムを 2%濃度になるように溶解した 液 23.5Lを、 有効膜面積 0.2m2、 細孔径 0.25 i m、 糸内径 0.7πιπι φ、 モジュール長 347mm、 糸本数 400本の中空糸精密濾過膜 （旭化成㈱製、 PMP- 102) により、 10°Cにて全循環操作にて精密濾過を行った。 処理条 件は、 循環流量 7.2L/min (膜内線速度 0.8m ）、 平均圧力 0.05Mpaで 行い、 実施例 1と同様な操作を行った。 酵素濃度が一定になった後、 装 置を一旦停止し、 原液に表 2に示した界面活性剤を、 それぞれ表 2に示 した量添加し、 15分間混合し、 再度同様に逆洗の後 15分間濾過を行い、 透過液中の酵素濃度及び透過流束を測定した。 また、 それぞれの界面活 性剤の濃度に対する効果の違いを図 1に示した。
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0002
表 2及び図 1の結果から、 膜のスケールが変わっても、 同様にカチォ ン界面活性剤を添加することにより、 精密濾過における酵素の透過率お よび透過流束が大幅に向上することが分かった。 また、 ノニオン性界面 活性剤は、カチオン性界面活性剤に比べて酵素透過率向上効果が小さく、 透過流束向上効果が小さいことが分かつた。 実施例 9、 及び比較例 5
比較例 1、 実施例 4一 1において、 バチルス エスピー KSM-9865 (FEM-P18566号） のアルカリプロテーゼ （等電点 9.5付近） に代えて、 バチルス エスピー KSM-K16のアル力リプロテアーゼ（等電点 10.2付 近） の U F濃縮液 （菌体濃度 0% (v/v)、 タンパク濃度 5.6% (w/v) ) を 用いる以外は、 比較例 1、 実施例 4一 1と同様の操作を行った。 結果を 表 3に示す。
表 3
Figure imgf000018_0001
表 3より、 異なる酵素においても、 カチオン性界面活性剤を添加する ことにより、 精密濾過における酵素の透過率及び透過流束が大幅に向上 することが分かった。 '

Claims

請求の範囲
1. 菌体濃度が 1 %(v/v)以下であり、 酵素濃度がタンパク量として 1 %(w/v)以上である酵素含有液から精密濾過により酵素を回収する方 法であって、 該酵素含有液にカチオン性界面活性剤を 0.01〜 l %(w/v) 添加して精密濾過を行うことを特徴とする酵素の製造方法。
2. 菌体濃度が 1 %(v/v)超の発酵培養液から菌体を分離し、 得られた 酵素含有液を限外濾過により精製 ·濃縮し、 得られた菌体濃度が 1 % (v/v) 以下であり、 酵素濃度がタンパク量として 1 %(w/v)以上である酵 素含有液にカチオン性界面活性剤を 0.01〜 1 %(w/v) 添加して精密濾過 を行うことを特徴とする酵素の製造方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013077341A1 (ja) 2011-11-21 2013-05-30 東レ株式会社 セルラーゼの製造方法およびその装置
JP2015122981A (ja) * 2013-12-26 2015-07-06 花王株式会社 精製疎水性酵素溶液の製造方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116323635A (zh) 2020-09-22 2023-06-23 巴斯夫欧洲公司 从包含高度裂解细胞的发酵液中回收蛋白的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11215980A (ja) * 1998-02-02 1999-08-10 Kurita Water Ind Ltd 菌体含有液の処理方法
JPH11318482A (ja) * 1998-05-14 1999-11-24 Kao Corp 発酵生産物の回収方法
JP2003514563A (ja) * 1999-11-24 2003-04-22 ダニスコ エイ／エス タンパク質を精製する方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5552316A (en) * 1993-06-04 1996-09-03 Environmental Marketing Services, Ltd. Clarifying E. coli fermentation broths with a combination of anionic and cationic flocculants
WO1998006829A1 (fr) * 1996-08-12 1998-02-19 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Procedes pour preparer des bioreacteurs
US7455990B2 (en) * 1999-11-24 2008-11-25 Danisco A/S Method of extracting recombinant hexose oxidase
CN1209458C (zh) * 2002-10-16 2005-07-06 叶高瑞 一种番木瓜蛋白、凝乳酶的制作方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11215980A (ja) * 1998-02-02 1999-08-10 Kurita Water Ind Ltd 菌体含有液の処理方法
JPH11318482A (ja) * 1998-05-14 1999-11-24 Kao Corp 発酵生産物の回収方法
JP2003514563A (ja) * 1999-11-24 2003-04-22 ダニスコ エイ／エス タンパク質を精製する方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1930419A4 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013077341A1 (ja) 2011-11-21 2013-05-30 東レ株式会社 セルラーゼの製造方法およびその装置
US11253818B2 (en) 2011-11-21 2022-02-22 Toray Industries, Inc. Method for producing cellulase and apparatus for said method
JP2015122981A (ja) * 2013-12-26 2015-07-06 花王株式会社 精製疎水性酵素溶液の製造方法

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