JP2003514563A - タンパク質を精製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本出願において、可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク質（ＰＯＩ）を放出するための方法が、記載される。この本発明の方法は、以下の工程：可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク質を含む細胞を提供する工程；この細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；およびこの目的タンパク質（ＰＯＩ）の特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態でこの目的タンパク質（ＰＯＩ）がこの細胞から放出されるのを引き起こす工程、を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、目的の細胞内タンパク質（ＰＯＩ）を放出するための方法に関する
。

【０００２】 特に、本発明は、目的の細胞内タンパク質（ＰＯＩ）の放出を補助する膜抽出
組成物を使用して、可溶性かまたは膜に結合したＰＯＩを放出するための方法に
関する。

【０００３】 （発明の背景） 細胞内ＰＯＩ（例えば、酵素）を回収するための伝統的な方法は、ビーズミル
またはフレンチプレス原理で作動する細胞ホモジナイザーのような、機械的破壊
方法（Ｎａｇｌａｋら、１９９０）を使用することであった。しかし、これらの
機械的破壊方法は、これらが低い能力でエネルギーを消費する方法であるという
欠点、および機械的破壊のために必要とされる細胞ホモジナイザーまたは類似の
設備が、購入に高価であるという欠点に、悩まされている。さらに、機械的方法
は、細胞、および従って抽出されたＰＯＩを、非常に厳しい条件に曝露する。特
に、大部分のタンパク質は、機械的デバイスおよび／またはホモジネートが効率
的に冷却されない限り発生する熱によって、変性するからである。さらに、酵母
細胞（例えば、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ由来の細胞）のようないくつかの細胞は、機
械的に破壊することが困難であり、そして細胞ホモジナイザーに１回より多く通
過させることを必要とする。細胞ホモジネートはまた、細胞壁フラグメントおよ
びＤＮＡを含み得、これは、高い粘度を生じる。このことは、ＰＯＩからの細胞
の破片の分離が、困難な操作を示し得ることを意味する。さらに、得られる無細
胞ホモジネートは、細胞内ＰＯＩのみでなく、一般的な細胞代謝に関連する多数
（時々数千）の異なる細胞内タンパク質および酵素をもまた含み得る。このこと
は、得られる無細胞ホモジネートが、限外濾過によって濃縮することが困難であ
り得るのみでなく、所定のＰＯＩの正しい市販の濃度を得ることに関する問題を
提供し得ることをもまた意味する。

【０００４】 いくつかの機械的破壊方法の潜在的な有害な効果を最小にするために、酵母細
胞を透過性にするための、例えば界面活性剤を使用する、化学的方法が開発され
た。例示として、非イオン性界面活性剤であるポリエトキシ化オクチルフェノー
ル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００として市販されている）が、単独でかまたは凍結
解凍サイクルとの組み合わせかのいずれかで使用された（Ｎａｇｌａｋら、１９
９０で参照される）。さらに、米国特許第５１２４２５６号（Ｃｒａｈａｙら、
１９９２）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母を水性培地中で、中性の水溶性
無機塩および非イオン性水溶性ポリエトキシ化アルキルフェノール界面活性剤（
８と１５との間の親水性親油性バランス（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｌｉｐｏｐ
ｈｉｌｉｃ Ｂａｌａｎｃｅ）（ＨＬＢ）を有する）で処理することによる、こ
の酵母からタンパク質が抽出された方法を開示する。しかし、これらの非イオン
性水溶性ポリエトキシ化アルキルフェノール界面活性剤（これには、ポリエトキ
シ化オクチルフェノール、ノニルフェノールおよびトリブチルフェノール（特に
、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０およびＳａｐｏｇｅｎａ
ｔ Ｔ−０８０の商品名で市販されているもの）が挙げられる）は、以下の欠点
に悩まされる：（ｉ）これらは、単独で使用される場合に有意な抽出効果を有さ
ないかもしれない；および（ｉｉ）これらの界面活性剤は、引き続くＰＯＩの酵
素活性の測定を妨害し得る。

【０００５】 いくつかの有機溶媒もまた、インサイチュ酵素アッセイにおいて酵素細胞を透
過性にするためと、酵素細胞からタンパク質を除去するためとの両方に、使用さ
れてきた。このような溶媒の例としては、トルエン、酢酸エチル、ジメチルスル
ホキシド、およびグリセロールと混合されたベンゼンが挙げられるが、これらに
限定されない（Ｎａｇｌａｋら、１９９０）。しかし、これらの溶媒は、２００
ｍ³までの醗酵槽容量が必要とされる場合に、産業規模での製造における使用に
対して魅力的ではない。

【０００６】 ジギトニンおよび天然に存在する他のサポニンもまた、多数の真核生物細胞を
透過性にすることが示された（Ｊｏｓｈｉら、１９８９を参照のこと）。ジギト
ニン透過性化の正確な機構は未知であるが、ジギトニンが、細胞膜に存在するコ
レステロールと複合体を形成し、そしてその膜を漏出性にすると考えられる。酵
母細胞のジギトニン透過性化もまた、酵母膜のエルゴステロールの複合体化に起
因し得る。Ｊｏｓｉら（１９８９）は、ジギトニン（０．１％）を使用して、酵
母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓを透過性化し、これは、ラクトースのグルコース
およびガラクトースへの細胞内触媒を容易にした。非イオン性界面活性剤である
サポニン（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｂａｒｋから）は、別のコレステロール複合体化
剤であり、これは、少なくとも哺乳動物細胞を透過性化することが公知である（
Ｎａｇｌａｋら、１９９０）。再度、上で概説したような非イオン性界面活性剤
と同様に、ジギトニンおよび天然に存在する他のサポニンの使用は、単独で使用
される場合に有意な抽出効果を有さないかもしれないという欠点に悩まされ得る
。

【０００７】 カオトロピック剤もまた、細胞内酵素の抽出を容易にするために、使用されて
きた。例示として、米国特許第３８０１４６１号（ＭｉｙａｋｅおよびＳｈｉｏ
ｓａｋａ、１９７４）は、尿素溶液のようなカオトロピック溶液を使用して、真
菌または細菌の菌糸体または細胞において産生される細胞内酵素を抽出するため
の、プロセスを開示する。米国特許第４６８３２９３号（Ｃｒａｉｇ、１９８７
）はまた、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム
、臭化リチウム、グアニジン塩酸塩および尿素のような、カオトロピック塩の存
在下での細胞溶解による、Ｐｉｃｈｉａ属の形質転換された細胞からの親油性タ
ンパク質の選択的な抽出のための方法を、開示する。しかし、カオトロピック剤
は、尿素のようなカオトロピック剤へのＰＯＩの曝露が、ＰＯＩの変性を介して
酵素活性の実際の損失を生じ得るという欠点に悩まされる。

【０００８】 上記で引用した欠点に加えて、上記で引用した従来技術は、宿主細胞の低分子
量分子への透過性化のみに関連し、一方でＰＯＩは、細胞内で変化しないままで
ある。特に、上記で引用した従来技術のいずれも、ＰＯＩの性質および／または
活性に影響を与えない条件下での、膜結合細胞内ＰＯＩの抽出に関連しない。さ
らに具体的には、上記で引用される従来技術のいずれも、トラップされて宿主細
胞から分泌され得ない、膜結合細胞内ＰＯＩの放出を補助するための方法に関し
ない。

【０００９】 従って、本発明は、従来技術の抽出方法に関連する問題を克服することを追求
する。

【００１０】 従って、本発明は、可溶性かまたは膜に結合した、目的の細胞内タンパク質（
ＰＯＩ）を、宿主生物から放出するための方法を提供する。

【００１１】 （発明の要旨） 本発明は、トラップされそして／または宿主細胞から分泌され得ない、可溶性
かまたは膜に結合した細胞内ＰＯＩの放出において、補助するための方法に関す
る。本発明の方法を使用する、細胞内ＰＯＩの抽出を、従来の細胞破壊方法、な
らびに他のイオン性／非イオン性の界面活性剤および乳化剤を使用する抽出手順
と、比較した。プロテアーゼおよび塩との界面活性剤の組み合わせもまた、調査
した。本発明の結果は、本発明の方法を使用する、可溶性かまたは膜に結合した
細胞内ＰＯＩの抽出が、以下の理由により有利であることを示す： （ｉ）伝統的な細胞破壊技術が回避され得る； （ｉｉ）細胞内ＰＯＩがＤＮＡおよび細胞壁フラグメントを含まずに回収され
得る； （ｉｉｉ）細胞内ＰＯＩが、グリコシル化が起こる前に、酵母のような真核生
物宿主生物から回収され得る。分泌タンパク質の過剰のグリコシル化は、酵母の
ような真核生物宿主生物において特に、周知の問題である。酵母発現系に関する
この欠点は、酵母発現ベクターが、多量のバイオマスで高い発現レベルでタンパ
ク質を産生し得、そしてさらに、酵母が食物において認可された用途を有すると
しても、酵母を産生系として使用することの嫌悪をもたらした。ＰＯＩを細胞内
で発現させ、次いでこのＰＯＩを本発明の方法で抽出することによって、このＰ
ＯＩはグリコシル化されない。なぜなら、このＰＯＩは、グリコシル化が起こる
分泌経路を通らなかったからである； （ｉｖ）本発明の方法を進行させる醗酵手順が、宿主細胞のために適切な任意
のｐＨにおいて実施され得る。分泌ＰＯＩがその細胞外培養培地のｐＨによって
影響を受け得ることは、当該分野において周知である。現在まで、宿主生物増殖
培地のｐＨを、おおよそ中性のｐＨに維持することがしばしば必要であった。な
ぜなら、このようなｐＨが細菌夾雑の危険性を通常増加させるとしても、このよ
うなｐＨにおける醗酵が、分泌ＰＯＩの安定性を維持するために必要であると考
えられたからである。本発明の方法を用いると、ＰＯＩは分泌されない。従って
、宿主生物増殖培地のｐＨは、無関係である。なぜなら、培地ｐＨにかかわらず
、細胞内ｐＨが一定に保たれるからである。従って、本発明は、より低いｐＨ（
例えば、ｐＨ４．０）における宿主生物（例えば、酵母）の増殖を可能にし、こ
のことは、バイオマスにもＰＯＩ産生のいずれにも影響を与えることなく、細菌
夾雑の危険を低下させる； （ｖ）本発明の方法を使用して、細胞内ＰＯＩの、細胞外増殖培地との接触を
防止し得る。このことは、ＰＯＩが、例えばプロテアーゼ感受性に起因して細胞
外培地中において不安定である場合に、有利である。このタンパク質を細胞内で
発現させ、次いで本発明の方法を用いて抽出することによって、細胞外培地との
接触が回避される。

【００１２】 （発明の簡単な要旨） １つの広い局面において、本発明は、細胞から目的のタンパク質（ＰＯＩ）を
放出するための方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：可溶性であ
るかまたは膜に結合した細胞内ＰＯＩを含む細胞を提供する工程；この細胞を膜
抽出組成物と接触させる工程；ならびにこのＰＯＩを、ＰＯＩの放出に十分な条
件下で、かつ可溶性形態で、細胞から放出させる工程。ここで、ＰＯＩは、目的
の細胞内タンパク質であり得、そして／またはＰＯＩは、ヘキソースオキシダー
ゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ₂−オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１．３．５）で
あり得る。

【００１３】 （発明の詳細な局面） 本発明の１つの局面に従って、可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク
質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＰＯＩ）を、形質転換細胞か
ら放出するための方法が提供され、この方法は、以下の工程：可溶性または膜結
合性細胞内ＰＯＩを含む形質転換細胞を提供する工程；この形質転換細胞を膜抽
出組成物と接触させる工程；およびＰＯＩの特異的放出およびＰＯＩの可溶性形
態に十分な条件下で、形質転換細胞からＰＯＩを放出させる工程、を包含する。

【００１４】 本発明の別の局面に従って、形質転換細胞からＨＯＸ酵素を放出するための方
法が提供され、この方法は、以下の工程：ＨＯＸ酵素を含む形質転換細胞を提供
する工程；この形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；ならびにＨＯＸ
酵素の特異的放出およびＨＯＸ酵素の可溶性形態に十分な条件下で、形質転換細
胞からＨＯＸ酵素を放出させる工程、を包含する。

【００１５】 本発明の別の局面に従って、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト（
ＩＬ−１ｒａ）を形質転換細胞から放出するための方法が提供され、この方法は
、以下の工程：ＩＬ−１ｒａを含む形質転換細胞を提供する工程；この形質転換
細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；ならびにＩＬ−１ｒａの特異的放出およ
びＩＬ−１ｒａの可溶性形態に十分な条件下で、形質転換細胞からＩＬ−１ｒａ
を放出させる工程、を包含する。

【００１６】 本発明の別の局面に従って、上昇したレベルの、可溶性または膜結合性の細胞
内ＰＯＩを産生する変異体についてスクリーニングするための方法であって、こ
の方法は、以下の工程：変異した細胞を３０℃で成長させる工程；この変異した
細胞を膜抽出組成物と共にインキュベートする工程；無細胞培地を回収する工程
；この無細胞培地を上昇したレベルの細胞内ＰＯＩについてスクリーニングする
工程；を包含し、その結果、無細胞培地内の細胞内ＰＯＩの存在が、細胞内ＰＯ
Ｉが放出されたことを示す。

【００１７】 本発明の別の局面に従って、可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを放出する
ために適切な膜抽出組成物が提供され、ここでこの組成物は、以下の条件下で細
胞と接触される：約０．０５％〜約０．６％（より特に約０．１％〜約０．５％
、より特に約０．２％〜約０．４５％、より特に約０．４％）の重量％の４級ア
ンモニウム化合物；および約２．０〜約１１．０（より特に約５．０〜約７．０
、より特に約６．３）の最適ｐＨ；約４℃〜約４０℃、（より特に約２０℃〜約
３０℃、より特に約２５℃）の最適温度。

【００１８】 本発明の別の局面に従って、可溶性または膜結合性細胞内ＰＯＩの放出に適切
な４級アンモニウム化合物を含む膜抽出組成物が提供される。

【００１９】 本発明の別の局面に従って、真核生物宿主生物から放出される実質的にグリコ
シル化されていないＰＯＩが提供される。

【００２０】 本発明の１つの局面および利点は、添付の特許請求の範囲ならびに以下の説明
および議論に提示される。これらの局面は、別々の節の見出しの下に提示される
。しかし、各説の見出しの下の教示は、特定の節の見出しに限定される必要はな
い。

【００２１】 （発明の詳細な説明） 本発明は、４級アンモニウム化合物を含む膜抽出組成物を使用して、伝統的細
胞破壊技術の使用にたよらずに、可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩの高速、
特異的かつ経済的に効率の良い抽出が得られ得るという、非常に驚くべき発見を
実証する。有利に、かつ予期されず、得られた細胞抽出物は、非常に少ない混入
細胞内ＤＮＡを含有し、そして細胞壁断片を比較的含まず、それにより、ＰＯＩ
がかけられ得る任意のさらなる精製工程を単純化する。これは、従来技術の機械
的抽出方法と対比される。

【００２２】 （細胞内タンパク質） 本明細書中で使用される場合、用語「細胞内」ＰＯＩは、細胞（単数または複
数）内または細胞の内側で見出されるＰＯＩを意味する。細胞内ＰＯＩは、シグ
ナル分泌機構を有するが、細胞内に（例えば細胞の細胞質中に）局在化され得る
。この点において、細胞内ＰＯＩは、細胞から活発に分泌されないか、またはシ
グナル配列分泌機構を有していても細胞により分泌されることができないＰＯＩ
であり得る。あるいは、細胞内ＰＯＩは、細胞からのその分泌を防ぐように操作
された、天然に分泌されたＰＯＩであり得る。あるいは、ＰＯＩは、膜結合ドメ
インを含むキメラタンパク質であり得る。

【００２３】 本発明の方法は、ＡｈｌｓｔｒｏｍおよびＥｄｅｂｏ（（１９９４）ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １１９ ７−１２）に記載され
る方法と対照的であり、これは、テトラデシルベタイナートを用いるＥ．ｃｏｌ
ｉからのペリプラズムβラクタマーゼの放出について報告する。ペリプラズムは
、細胞膜と細胞壁との間の細菌細胞中の領域である。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ由来
のペリプラズムβラクタマーゼは、細胞膜の外側に局在化し、細胞質酵素ではな
い。対照的に、本発明のＰＯＩは、細胞（単数または複数）内または細胞の内側
に見出される細胞内ＰＯＩである。

【００２４】 （膜結合性（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ＰＯＩ） 本明細書で使用される場合、用語「膜結合性ＰＯＩ」は、細胞膜または形質膜
の近傍に局在化し得るが、実質的に細胞膜または形質膜と結合していなくてもよ
いＰＯＩを意味する。従って、膜結合性酵素は、実質的に膜結合タンパク質では
なく、膜結合性酵素は、実質的に細胞膜に結合していない。膜結合性ＰＯＩは、
細胞ホモジェナイザーを用いる機械的処理により可溶化され得る。

【００２５】 （膜結合（ｂｏｕｎｄ）ＰＯＩ） 本明細書で使用される場合、用語「膜結合ＰＯＩ」は、細胞ホモジェナイザー
を茂市イル機械的処理では可溶性にされないタンパク質を意味する。

【００２６】 （特異的放出） 用語「特異的放出」は、ＰＯＩの特異的活性が、ＰＯＩが機械的手段（例えば
、ビードミルの使用またはフレンチプレスの原理で操作するセルホモジェナイザ
ーによる）により抽出された場合よりも高いことを意味する。

【００２７】 （形質転換細胞） 用語「形質転換細胞」は、組換えＤＮＡ技術の使用により形質転換された細胞
を含む。形質転換は、代表的には１つ以上のヌクレオチド配列を、形質転換され
るべき細胞中に挿入することにより起こる。挿入されたヌクレオチド配列は、異
種ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換されるべき細胞に対して天然ではない
配列）であり得る。さらに、またあるいは、挿入されたヌクレオチド配列は、相
同ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換されるべき細胞に天然である配列）で
あり得、その結果、この細胞は、既に細胞中に存在するヌクレオチド配列の１以
上の余分のコピーを受容する。

【００２８】 （膜抽出組成物） 本明細書中で使用される場合、用語「膜抽出組成物」は、細胞膜における成分
に影響し得、その結果、膜結合細胞内ＰＯＩおよび／または膜結合性細胞内ＰＯ
Ｉが、この膜成分から十分に解離されるかおよび／または放出され、そしてＰＯ
Ｉがこの膜抽出組成物から容易に回収されるかおよび／または採取される組成物
を意味する。ＰＯＩはまた、可溶性ＰＯＩであり得る。非常に好ましい実施形態
において、本発明の膜抽出組成物は、１つ以上の４級アンモニウム化合物または
その組合せを含む。

【００２９】 （四級アンモニウム化合物） 本明細書中で使用する「四級アンモニウム化合物」とは、そのＮＨ４＋イオン
の４個の水素原子の全部を有機基（これらは、同一または異なり得る）で置換す
ることにより水酸化アンモニウムまたはアンモニウム塩から誘導できる化合物を
意味する。典型的には、これらの有機基の１個は、長鎖（Ｃ８〜Ｃ１８）アルキ
ル基であり、そして他の３個は、短鎖アルキル基または他の基である。

【００３０】 好ましい実施態様では、これらの化合物は、以下の構造を有する： ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−Ｎ（ＣＨ₃）⁺³ ここで、ｎは、その鎖内のメチレン基の数であり、ここで、その対イオンは、ハ
ロゲン（例えば、塩素または臭素）イオンであり得る。これらの化合物は、カチ
オン洗浄剤の特性を有し、強力な抗菌剤である。

【００３１】 これらの四級アンモニウム化合物の例には、ラウロイルトリメチル臭化アンモ
ニウム（ＬＴＡＢ）、ミリスチルトリメチル塩化アンモニウム（ＭＴＡＣ）、セ
チルトリメチル塩化アンモニウム（ＣＴＡＣ）、セチルトリメチル臭化アンモニ
ウム（ＣＴＡＢ）、セトリミド（またはセトリミダム（Ｃｅｔｒｍｉｄｕｍ）（
これは、アルキル臭化アンモニウム（主に、ＣＴＡＢ）の混合物を含有する））
、ステアロイルトリメチル塩化アンモニウム（ＳＴＡＣ）、ステアロイルトリメ
チル臭化アンモニウム（ＳＴＡＢ）、塩化ベンズアルコニウム（塩化アルキルジ
メチルベンズアルコニウム）、臭化Ｎ−セチルピリジニウム（臭化Ｎ−ヘキサデ
シルピリジニウム）、ベンジルジメチルテトラデシル塩化アンモニウム、および
ベンジルジメチルヘキサデシル塩化アンモニウムが挙げられるが、これらに限定
されない。

【００３２】 一例として、これらの化合物の一部の構造は、以下のように図示される。これ
らの化合物は、メチレン基が多い順に列挙されている： ＬＴＡＢは、Ｈ₃Ｃ−Ｃ（ＣＨ₂）₁₁−Ｎ（ＣＨ₃）₃Ｂｒである。

【００３３】 ＭＴＡＣは、Ｈ₃Ｃ−Ｃ（ＣＨ₂）₁₃−Ｎ（ＣＨ₃）₃Ｃｌである。

【００３４】 ＣＴＡＣは、Ｈ₃Ｃ−Ｃ（ＣＨ₂）₁₅−Ｎ（ＣＨ₃）₃Ｃｌである。

【００３５】 ＣＴＡＢは、Ｈ₃Ｃ−Ｃ（ＣＨ₂）₁₅−Ｎ（ＣＨ₃）₃Ｂｒである。

【００３６】 ＳＴＡＣは、Ｈ₃Ｃ−Ｃ（ＣＨ₂）₁₇−Ｎ（ＣＨ₃）₃Ｃｌである。

【００３７】 ＳＴＡＢは、Ｈ₃Ｃ−Ｃ（ＣＨ₂）₁₇−Ｎ（ＣＨ₃）₃Ｂｒである。

【００３８】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化セチルピリジニウム（ＣＰ
Ｃ、Ｃ₂₁Ｈ₃₈ＮＣｌ）である。ＣＰＣの構造は、以下のように図示される：

【００３９】

【化１】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、臭化セチルピリジニウム（ＣＰ
Ｂ、Ｃ₂₁Ｈ₃₈ＮＢｒ）である。ＣＰＢの構造は、以下のように図示される：

【００４０】

【化２】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルテトラデシル
塩化アンモニウム（ＢＤＴＡＣ、Ｃ₂₃Ｈ₄₂ＮＣｌ）である。ＢＤＴＡＣの構造は
、以下のように図示される：

【００４１】

【化３】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルヘキサデシル
塩化アンモニウム（ＢＤＨＡＣ、Ｃ₂₅Ｈ₄₆ＮＣｌ）である。ＢＤＨＡＣの構造は
、以下のように図示される：

【００４２】

【化４】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化ベンズアルコニウム（塩化
アルキルジメチルベンズアルコニウム）である。

【００４３】 塩化ベンズアルコニウムの構造は、以下のように図示される： Ｃ₁₂Ｈ₂₅Ｎ（ＣＨ₃）₂Ｃ₇Ｈ₇Ｃｌ ＣＴＡＢと塩化ベンズアルコニウム（これはまた、塩化アルキルジメチルベン
ズアルコニウムとしても知られている−本明細書中では、Ｒｏｄａｌｏｎの登録
商標権名で呼ぶ）の構造の比較は、以下のように図示される：

【００４４】

【化５】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ラウロイルテトラメチル臭化ア
ンモニウム（ＬＴＡＢ）である。

【００４５】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、セチルトリメチル塩化アンモニ
ウム（ＣＴＡＣ）である。

【００４６】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、セチルトリメチル臭化アンモニ
ウム（ＣＴＡＢ）である。

【００４７】 カチオン洗浄剤ＣＴＡＢは、おそらく、膜間細孔を形成することにより、イー
スト菌の浸透性を変えることができることが明らかとなっており、これは、他の
２種の非イオン性洗浄剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８およびＴｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００）について提案された機構と類似している（Ｋｉｎｇら、１９
９１）。ＣＴＡＢのような洗浄剤を使用する細胞浸透性の変化は、全細胞での細
胞内酵素活性の測定を容易にした（Ｓｅｋｈａｒら、１９９９）。さらに、ＣＴ
ＡＢ浸透化細胞の開発は、例えば、イースト菌株（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｇｏｗｄａら、１９９１）およびＫｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｊｏｓｈｉら、１９８７））に由来の細
胞での細胞内酵素触媒作用に有用であることが判明している。これらの研究では
、洗浄剤ＣＴＡＢは、細胞内酵素および他のＰＯＩ類を細胞内で未変化のままに
しつつ、イースト細胞を低分子量分子（例えば、基質、生成物、補助因子）に対
して浸透性にしたことを述べておくことは重要である。本発明とは対照区別して
、上記研究のいずれも、ホスト細胞からの溶解性または膜結合した細胞内ＰＯＩ
の放出を助けるのに、洗浄剤ＣＴＡＢ（または関連した四級アンモニウム化合物
（例えば、ＬＴＡＢまたはＣＴＡＣ））が使用され得ることを開示または示唆し
ていない。

【００４８】 カチオン性洗浄剤ＣＴＡＢはまた、通例、ＤＮＡ／ＲＮＡ分子を単離する方法
で、使用されている。一例として、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ−ＣＴＡＢ沈殿物が形
成され容易に回収されるように、高温（約６５℃）および低塩濃度（０．６Ｍ未
満のＮａＣｌ）で細胞をＣＴＡＢで処理することにより、単離され得る。ＣＴＡ
Ｂ洗浄剤はまた、エタノールまたはイソプロパノールのいずれかによる中性多糖
類の共沈が重大な問題を引き起こし得る場合、植物から核酸を抽出するのに頻繁
に使用される。ＣＴＡＢはまた、繊維状ファージで感染したＥ．Ｃｏｌｉ培養物
の上澄み液からのＤＮＡの直接的な溶解および沈殿で使用されている（Ｉｓｈａ
ｑら、１９９０ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９（ｌ）：１９〜２０，２２，
２４；Ｋａｍｂｏｕｒｉｓら、１９９９：ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２５（３）：２５５〜６４；Ｋｕｉｐｅｒｓら、１９９９
Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ５８（２）：１０３〜８；Ｖｅｌｅｇｒａｋｉ
ら、１９９９ Ｍｅｄ Ｍｙｃｏｌ ３７（ｌ） ６９〜７３；Ｗｈｉｔｅら、
１９９８ Ｍｅｄ Ｍｙｃｏｌ ３６（５）：２９９〜３０３；Ｗｏｏｄｈｅａ
ｄら、１９９８ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９（３）：２４３−６；Ｍｉ
ｔｏ ａｎｄ Ｄｅｔｓｃｈａｒｔ １９９８ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ Ｒｅｓ
８４（７） ５９６〜７；Ｚｈａｎｇら、１９１９９８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ７１（ｌ） ４５〜５０；Ｒｅｉｎｅｋｅら、（１９９８） Ｉ
ｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７（ｌ） ９５−９を参照）。ＤＮＡ分子を単
離するこれらのＣＴＡＢベース方法の全ては、残りのタンパク質および中性多糖
類を溶液中で維持しつつ、ＣＴＡＢが核酸および酸多糖類を沈殿する特性を活用
することに頼っている。驚くべきことに、また、予想外に、本発明の方法は、こ
の沈殿を促進するだけでなく、細胞内ＤＮＡの保持を促進する。結果的に、本発
明の方法は、細胞内ＰＯＬの選択的な放出を促進する。

【００４９】 （放出） 本発明の方法によれば、この溶解性または膜結合した細胞内ＰＯＩは、細胞内
ＰＯＩの放出に十分な条件下にてホスト細胞を膜抽出組成物と接触させることに
より、この細胞から放出される。

【００５０】 （ＰＯＩを放出するのに十分な好ましい条件） （Ｉ）四級アンモニウム化合物の％ 好ましくは、この膜抽出組成物は、約０．０５重量％〜約０．６重量％の四級
アンモニウム化合物、好ましくは、約０．１重量％〜約０．５重量％の四級アン
モニウム化合物、好ましくは、約０．２重量％〜約０．４５重量％の四級アンモ
ニウム化合物、さらに好ましくは、約０．４重量％の四級アンモニウム化合物を
含有する。

【００５１】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ＬＴＡＢである。

【００５２】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ＣＴＡＣである。

【００５３】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ＣＴＡＢである。

【００５４】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化ベンズアルコニウム（Ｃ１
２Ｈ２５Ｎ（ＣＨ２）３Ｃ７Ｈ７Ｃｌ）である。

【００５５】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、塩化セチルピリジニウム（ＣＰ
Ｃ、Ｃ２１Ｈ３８ＮＣｌ）である。

【００５６】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、臭化セチルピリジニウム（ＣＰ
Ｃ、Ｃ２１Ｈ３８ＮＢｒ）である。

【００５７】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルテトラデシル
塩化アンモニウム（ＢＤＴＡＣ：Ｃ２３Ｈ４２ＮＣｌ）である。

【００５８】 好ましくは、この四級アンモニウム化合物は、ベンジルジメチルヘキサデシル
塩化アンモニウム（ＢＤＴＡＣ：Ｃ２５Ｈ４６ＮＣｌ）である。 （ＩＩ）温度 好ましくは、このホスト細胞は、約４℃〜約４０℃の温度で、この膜抽出組成
物と接触される。

【００５９】 好ましくは、このホスト細胞は、約２０℃〜約３０℃の温度で、この膜抽出組
成物と接触される。

【００６０】 好ましくは、このホスト細胞は、約２５℃の温度で、この膜抽出組成物と接触
される。

【００６１】 好ましくは、上記温度は、もしＰＯＩが熱安定性ＰＯＬであるなら、さらに高
くなる。 （ＩＩＩ）ｐＨ 好ましくは、このホスト細胞は、約２．０〜約１１．０のｐＨで、この膜抽出
組成物と接触される。

【００６２】 好ましくは、このホスト細胞は、約５．０〜約７．０のｐＨで、この膜抽出組
成物と接触される。

【００６３】 好ましくは、このホスト細胞は、約６．３のｐＨで、この膜抽出組成物と接触
される。

【００６４】 本発明の方法に先立つ発酵操作がこのホスト細胞に適当な任意のｐＨで行うこ
とができるは、非常に有利である。分泌されたＰＯＩがその細胞外成長培地のｐ
Ｈで影響され得ることは、当該技術分野で周知である。今まで、ホスト有機体成
長培地のｐＨを適当な中性ｐＨで維持する必要があった。その理由は、このよう
なｐＨでの発酵は、通常、細菌汚染の危険を高めたとしても、分泌されたＰＯＩ
の安定性を維持するのに必要であると思われたからである。本発明の方法を使う
と、このＰＯＩは、分泌されない。それゆえ、このホスト有機体成長培地のｐＨ
は、細胞外ｐＨが培地ｐＨとは無関係に一定のままであるので、無関係である。
従って、本発明は、生物量またはＰＯＩ生成のいずれかに影響を与えることにく
、細菌汚染の危険を減らす低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）で、ホスト有機体（
例えば、イースト菌）の成長を可能にする。

【００６５】 本発明のさらに他の利点は、細胞内ＰＯＩが細胞外成長培地と接触するのを防
止するのに使用できることにある。このことは、もし、このＰＯＩが、例えば、
プロテアーゼ感受性があるために、この細胞外培地で不安定であるなら、有利で
ある。このタンパク質を細胞内で発現させることに次いで、本発明の方法で抽出
することにより、この細胞外培地との接触は、回避される。

【００６６】 （ＰＯＩ回収） 本発明の方法に従って抽出された細胞内ＰＯＩは、そのＰＯＬをさらに濃縮し
精製するために、当業者に公知の方法を使用することによりさらに処理される。
それゆえ、抽出した細胞内ＰＯＩは、例えば、限外濾過、逆相樹脂への通過に続
いて、最小容量の溶媒での溶出、沈殿、限外濾過および凍結乾燥により、濃縮さ
れ得る。このＰＯＬをさらに精製するのに利用できる技術には、サイズ排除樹脂
を使用するサイズ分別、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換および疎水性
クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。

【００６７】 （ＰＯＩ） 本明細書中で使用する「ＰＯＩ」との用語には、タンパク質、ポリペプチドま
たはペプチド（これらには、構造タンパク質が挙げられるが、これに限定されな
い）、酵素、サイトカイン（例えば、インターフェロンおよび／またはインター
ロイキン）、インターロイキンレセプタアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１ｒａ
）、抗生物質、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはその有効部分
（例えば、Ｆｖ断片（この抗体またはその一部は、天然、合成またはヒト化され
得る））、ペプチドホルモン、抗原（例えば、細菌／ウイルス／原生動物／寄生
抗原）、腫瘍抗原、レセプタ、配位子、制御因子、情報伝達分子、神経伝達物質
、凝固因子、または任意の他のタンパク質（これらには、膜結合タンパク質およ
び／または膜結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げら
れるが、これらに限定されない。

【００６８】 本発明の方法では、このＰＯＩは、細胞内で発現され、すなわち、それは、細
胞内ＰＯＩである。

【００６９】 このＰＯＩは、関心ヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を使用して、組換えＤＮＡ技
術により、産生され得る。

【００７０】 （ＮＯＩ） 本明細書中で使用する「ＮＯＩ」との用語は、合成起源および天然起源の両方
のＤＮＡおよびＲＮＡを包含するように規定され、これらのＤＮＡまたはＲＮＡ
は、変性または未変性のデオキシ−またはジデオキシ−ヌクレオチドまたはリボ
ヌクレオチドまたはそれらの類似物を含有し得る。この核酸は、一本鎖または二
本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ
共重合体として存在し得、ここで、「共重合体」との用語は、リボヌクレオチド
およびデオキシリボヌクレオチドの両方を含有する単一の核酸鎖を意味する。こ
のＮＯＩは、発現をさらに高めるために最適化されたコドンでさえあり得る。

【００７１】 （合成） 本明細書中で使用する「合成」との用語は、インビトロ化学合成または酵素合
成により生成したものとして規定される。それには、ホスト有機体（例えば、メ
チロトローフイースト菌であるＰｉｃｈｉａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ）に最適
なコドン用法で製造したＮＯＩ類が挙げられるが、これらに限定されない。

【００７２】 （構築物） このＮＯＩは、目的の宿主細胞において活性である、転写および翻訳の調節エ
レメントに対して作動可能に連結され得る。このＮＯＩはまた、たとえば、Ｓｃ
ｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ由来のグルコアミラーゼ
遺伝子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα因子接合
型遺伝子、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＴＡＫＡ−アミ
ラーゼに由来するもののような、シグナル配列を含む融合タンパク質をコードし
得る。あるいは、このＮＯＩは、膜結合ドメインを含む融合タンパク質をコード
し得る。

【００７３】 （発現ベクター） このＮＯＩは、発現ベクターを用いて宿主生物において所望のレベルで発現さ
れ得る。

【００７４】 本発明に従うＮＯＩを含む発現ベクターは、選択された宿主生物におけるＮＯ
Ｉをコードする遺伝子を発現し得る任意のベクターであり得、そしてベクターの
選択は、それが導入されるべき宿主細胞に依存する。従って、そのベクターは、
自律複製ベクター、すなわち、エピソーム存在物として存在するベクター（この
ベクターの複製は、染色体複製とは独立しており、たとえば、プラスミド、バク
テリオファージまたはエピソームエレメント、ミニ染色体または人工染色体など
）であり得る。あるいは、本発明に従うベクターは、宿主細胞に導入されるとき
、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そして染色体とともに複製されるものである。

【００７５】 （発現ベクターの成分） 発現ベクターは代表的に、クローニングベクターの成分（たとえば、選択され
た宿主生物においてベクターの自律複製を許容するエレメントおよび選択目的で
１つ以上の表現型で検出可能なマーカーを含む。発現ベクターは、通常、プロモ
ーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび必要に応
じてリプレッサー遺伝子または１つ以上のアクチベーター遺伝子をコードする制
御ヌクレオチド配列を含む。さらに、この発現ベクターは、ＰＯＩを宿主細胞オ
ルガネラ（たとえば、ペルオキシソーム）または特定の宿主細胞区画へと標的か
し得るアミノ酸配列をコードする配列を含み得る。そのような標的化配列として
は、配列ＳＫＬが挙げられるがそれに限定されない。本発明の状況において、用
語「発現シグナル」とは、上記制御配列、リプレッサー配列またはアクチベータ
ー配列のいずれかを包含する。制御配列の指示のもとでの発現のために、ＰＯＩ
をコードするＮＯＩは、発現に関して適切な様式で制御配列と作動可能に連結さ
れる。

【００７６】 （プロモーター） ベクターにおいて、ＰＯＩをコードするＮＯＩは、適切なプロモータ配列と作
動可能にあわせられる。このプロモーターは、選択した宿主細胞における転写活
性を有する任意のＤＮＡ配列であり得、そしてその宿主生物と同種または異種で
ある遺伝子に由来し得る。

【００７７】 （細菌プロモーター） 細菌宿主における本発明の改変されたヌクレオチド配列の転写を指向するため
の適切なプロモーターの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロンのプロモー
ター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子ｄａ
ｇＡプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアミラーゼ
遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロ
モーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓαアミラー
ゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢの遺伝子のプロモーター、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｓｐ．由来のプロモーターに由来するプロモーター（ｐ１７０プロモーター
を含む）が挙げられる。本発明のＰＯＩをコードする遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉの
ような細菌種において発現され、適切なプロモーターは、たとえば、Ｔ７プロモ
ーターおよびファージλプロモーターを含むバクテリオファージプロモーターか
ら選択され得る。

【００７８】 （真菌プロモーター） 真菌種における転写のために、有用なプロモーターの例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈ
ｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性
αアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ酸安定性αアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコア
ミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚ
ａｅトリオースホスフェートイソメラーゼまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼに由来するプロモーターである。

【００７９】 （酵母プロモーター） 酵母種における発現のために適切なプロモーターの例は、以下が挙げられるが
それらに限定されない：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
のＧａｌ １プロモーターおよびＧａｌ １０プロモーターならびにＰｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ１またはＡＯＸ２プロモーター。

【００８０】 （宿主生物） （Ｉ：細菌宿主生物） 適切な細菌宿主生物の例は、グラム陽性細菌種（たとえば、Ｂａｃｉｌｌａｃ
ｅａｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ，Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａ
ｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉ
ｕｍおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ種（たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ），乳酸細
菌種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（たとえば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉを含む）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．、Ｐ
ｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）
）である。あるいは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
を含むまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅに属するグラム陰性細菌種は、
宿主生物として選択され得る。

【００８１】 （ＩＩ：酵母宿主生物） 適切な酵母宿主生物は、以下のような酵母種などであるがそれらに限定されな
い生物工学的に関連する酵母から選択され得る：Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．，Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ ｓｐまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ
種またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅを含む）またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅに属する
種（たとえば、Ｓ．Ｐｏｍｂｅ種など）。

【００８２】 好ましくは、メチル栄養性酵母種であるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの株
が宿主生物として使用される。

【００８３】 好ましくは、宿主生物は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種である。

【００８４】 グリコシル化が起こる前に、本発明の方法を使用することは、酵母のような真
核生物宿主細胞から細胞内ＰＯＩを回収するために非常に有利である。分泌され
たタンパク質のオリゴグリコシル化は、酵母のような真核生物宿主生物において
特に周知の問題である。酵母発現系に関連するこの欠点は、酵母発現ベクターが
、大量のバイオマスの高レベルの発現を行い、そしてさらに、酵母は、食品にお
ける使用が承認されているにもかかわらず、生産系として酵母を使用することを
ためらわせている。本発明の方法を用いてＰＯＩを細胞内で発現させ、そしてそ
のＰＯＩを抽出することによって、そのＰＯＩは、グリコシル化されない。なぜ
なら、ＰＯＩは、グリコシル化部位が行われる分泌経路を通らないからである。

【００８５】 （ＩＩＩ．真菌宿主生物） 糸状真菌のなかで適切な宿主生物としては、以下のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種
が挙げられる：たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ，
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｄｕｌａｎｓ。あるいは、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種の株（たとえば、Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）またはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ種の株（たとえば、Ｒｈ
ｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）は、宿主生物として使用され得る。他の適切
な株としては、ＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓおよびＭｕｃｏｒ種が挙げられる。

【００８６】 （大規模適用） 本発明の好ましい実施形態において、ＰＯＩは、大規模適用のために使用され
る。

【００８７】 好ましくは、このＰＯＩは、宿主生物の培養の後、１ｇ／Ｌから約２ｇ／Ｌの
総細胞培養物容量の質量で生産される。

【００８８】 好ましくは、このＰＯＩは、宿主生物の培養の後、１００ｍｇ／Ｌから約９０
０ｍｇ／Ｌの総細胞培養物容量の質量で生産される。

【００８９】 好ましくは、このＰＯＩは、宿主生物の培養の後、２５０ｍｇ／Ｌから約５０
０ｍｇ／Ｌの総細胞培養物容量の質量で生産される。

【００９０】 （食品適用） １つの好ましい実施形態において、本発明の方法は、飲料のような食品の製造
において使用するためにＰＯＩを放出するために用いられる。

【００９１】 別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、界面活性剤の調製において
使用するためにＰＯＩを放出するために用いられる。

【００９２】 別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、製パンにおいて使用するた
めに使用するために適切なＰＯＩを放出するために用いられる。

【００９３】 別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、生地改善剤において使用す
るために適切なＰＯＩを放出するために用いられる。

【００９４】 別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、粉生地、粉生地改善組成物
および改善された食品の特性を改善するためにＰＯＩを放出するために用いられ
る（以下を参照のこと：ＷＯ ９６／３９８５１およびＥＰ−Ｂ−０ ８３３
５６３）。

【００９５】 好ましい実施形態において、放出されたＰＯＩは、ヘキソースオキシダーゼ（
Ｄ−ヘキソース：Ｏ₂オキシドレダクターゼ、 ＥＣ １．１．３．５）である
。

【００９６】 （ＨＯＸ酵素） ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ、Ｅ
Ｃ １．１．３．５）（これはまた、ＨＯＸとも称する）は、Ｄ−グルコースお
よび他のいくつかの還元糖（マルトース、ラクトースおよびセロビオースを含む
）を、それらの対応するラクトンへと酸化し得、その後、これを加水分解してそ
れぞれのアルドービオン酸（ａｌｄｏｂｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）へと変換し得る
。従って、ＨＯＸは、別のオキシドレダクターゼであるグルコースオキシダーゼ
（これは、Ｄ−グルコースのみを変換し得る）とは、その酵素がより広い範囲の
糖基質を利用し得るという点において異なる。ＨＯＸによって触媒される酸化は
、以下に例示され得る： Ｄ−グルコース＋Ｏ₂−−−−−＞γ−Ｄ−グルクノラクトン＋Ｈ₂Ｏ₂、また
は Ｄ−ガラクトース＋Ｏ₂−−−−＞γ−Ｄ−ガラクトノラクトン＋Ｈ₂Ｏ₂。

【００９７】 ＨＯＸは、いくつかの海草種により天然で生産される。そのような種は、とり
わけ、Ｇｉｇａｒｔｉｎａｃｅａｅ科において見出される。本命最初において使
用される用語「ＨＯＸ」とは、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノ
ース、マルトース、ラクトースおよびセロビオースからなる群より選択される基
質を酸化し得る酵素をいう。

【００９８】 （ＨＯＸ産生） ＨＯＸ酵素をコードする遺伝子は、海草Ｃｈｏｎｄｒｕｓ ｃｒｉｓｐｕｓか
らクローニングされた（Ｓｔｏｕｇａａｒｄ ａｎｄ Ｈａｎｓｅｎ １９９６
，Ｈａｎｓｅｎ ａｎｄ Ｓｔｏｕｇａａｒｄ，１９９７）。メチル栄養性酵母
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（異種タンパク質のための発現系と
してＲｈｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ／Ｇｅｒｍａｎｙで開
発）もまた、ＨＯＸ酵素（天然のタンパク質は、海草から精製された（Ｐｏｕｌ
ｓｅｎ ａｎｄ Ｈｓｔｒｕｐ，１９９８））を生産するために用いられてきた
。ＷＯ ９６／４０９３５およびＷＯ ９８／１３４７８もっまた、ＨＯＸ活性
を有するタンパク質をコードする遺伝子の組み換え宿主生物におけるクローニン
グおよび発現を開示する。

【００９９】 １つの好ましい実施形態において、ＨＯＸ酵素は、配列番号２２において示さ
れる配列を含む。

【０１００】 １つの好ましい実施形態において、ＨＯＸ酵素は、配列番号２２において示さ
れる配列、またはその改変体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントを包含す
る。

【０１０１】 （改変体／ホモログ／誘導体（アミノ酸配列）） 本発明の好ましいアミノ酸配列は、配列番号２２に示される。か、または本発
明のＨＯＸ酵素から入手可能な配列であるが、任意の供給源（例えば、関連する
ウイルス／細菌タンパク質、細胞ホモログおよび合成ペプチドならびにそれらの
改変体または誘導体）から得られたホモログ配列を包含する。

【０１０２】 従って、本発明は、本命最初において提示されるアミノ酸配列の改変体、ホモ
ログまたは誘導体、ならびにそれらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列の改変体、ホモログまたは誘導体を包含する。

【０１０３】 本発明の文脈において、ホモログ配列は、少なくとも、例えば、本明細書にお
いて列挙される配列の配列番号２２において示されるアミノ酸配列に対して、少
なくとも７５、８５、９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９８％同
一であるアミノ酸配列を包含すると解釈される。特に、相同性は、代表的に、必
須ではない隣接する配列ではなく、酵素活性について必須であることが知られる
配列のそれらの領域に関して考慮されるべきである。これらの領域としては、以
下が挙げられるがそれらに限定されない：ＳＧＧＨ₇₉Ｃ、ＬＧＧＨ₁₄₆ｌおよび
ＬＧＧＨ₃₂₀ＡのようなＨＯＸにおけるＦＡＤ推定結合ドメイン。相同性はまた
、類似性（すなわち、類似の化学特性／官能基を有するアミノ酸残基）に関して
考慮され得るが、本発明の文脈において、配列同一性の観点で相同性を表現する
ことが好ましい。

【０１０４】 相同性比較は、目またはより通常には、利用可能な配列比較プログラムを用い
て実施され得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列の
間の相同性％を算出し得る。

【０１０５】 ％相同性は、連続配列にわたって算出され得る（すなわち、１つの配列は、他
の配列と整列され、そして一方の配列におけるのおののアミノ酸は、他の配列に
おける対応するアミノ酸と、１回に１残基ごと直接比較される）。これは、「ギ
ャップされた」配列と呼ばれる。代表的には、そのようなギャップのない整列は
、比較的短い数の残基にわたってのみ行われる。

【０１０６】 このことは、非常に単純かつ一貫した方法であるが、例えば、そうでなければ
同一の対の配列において、１つの挿入または欠失が、次のアミノ酸残基が整列か
ら追い出され、従って、全体の整列が行われるとき、相同性％における大きな減
少を潜在的に生じ得ることを考慮していない。結果として、ほとんどの配列比較
方法は、相同性全体のスコアを不当にペナルティ付与せずに、可能な挿入および
欠失を考慮する最適な整列を生成するように設計される。このことは、局所的相
同性を最大限にするように試みる配列整列において「ギャップ」を挿入すること
によって達成される。

【０１０７】 しかし、これらのより複雑な方法は、整列において生じるおのおののギャップ
に対して「ギャップペナルティ」を割り当て、その結果、同じ数の同一アミノ酸
について、可能な限り少ないギャップを伴う配列整列（すなわち、比較される２
つの配列の間の最大限の関連性を反映する）は、多くのギャップを用いて１を超
える高いスコアを達成する。「アフィンギャップコスト」が代表的に使用される
。これは、ギャップの存在について比較的高いコストを、およびギャップにおけ
るおのおのの次の残基についてのより少ないペナルティーを付与する。これは最
も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナ
ルティーは、当然、より少ないギャップを伴う、最適化された整列を生じる。ほ
とんどの整列プログラムは、そのギャップペナルティーが改変されることを可能
にする。しかし、配列比較のためのそのようなソフトウェアを使用するときは、
デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐａｃｋａｇｅ（以下を参照）を用いるとき、アミノ酸配列
のためのそのデフォルトギャップペナルティーは、ギャップについて−１２であ
り、そして各々の伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）について−４である。

【０１０８】 従って、最大％相同性の算出は、まず、ギャップペナルティーを考慮した、最
適の整列の生成を必要とする。そのような整列を行うための適切なコンピュータ
プログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐａｃｋａｇｅ
（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅ
ｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ １２：３８７）である。配列比較を行い得る他のソフトウェアの例とし
ては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＢＬＡＳＴ ｐａｃｋａｇｅ
（以下を参照：Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐ
ｔｅｒ １８）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳの比較ツール
スイート。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは両方とも、オフラインおよびオンライ
ンの検索について利用可能である（以下を参照：Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．
，１９９９ 同上，７−５８〜７−６０頁）。しかし、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔ
プログラムを使用することが好ましい。

【０１０９】 最終的な％相同性は、同一性の観点で測定され得るが、その整列プロセス自体
は、代表的には、オールオアナッシングの対比較に基づかない。代わりに、化学
的類似性または進化的距離に基づいて各々対での比較に対してスコアを割り当て
る、スケール調節した類似性スコア行列が一般的に使用される。一般的に使用さ
れるそのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムスイ
ートについてのデフォルト行列）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラ
ムは、一般的に、公のデフォルト値または供給される場合カスタムのシンボル比
較表のいずれかを使用する（さらなる詳細についてユーザーマニュアルを参照）
。ＧＣＧパッケージのための公のデフォルト値あるいは、他のソフトウェアの場
合、デフォルト行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）を使用することが好ましい。

【０１１０】 一旦ソフトウェアが最適整列を生成すると、％相同性、好ましくは＄配列同一
性を算出することが可能である。このソフトウェアは、代表的には、その配列比
較の部分としてこのことを行い、数的な結果を生成する。

【０１１１】 本発明のアミノ酸配列に関して、用語「改変体」または「誘導体」は、得られ
るアミノ酸配列が、酵素活性を有し、好ましくは、配列番号２２に示されるアミ
ノ酸配列と少なくともひとつの同じ酵素活性を有する限り、その配列からまたは
それに対して、１（またはそれを超える）アミノ酸の任意の置換、変更、改変、
置き換え、欠失、または付加を包含する。

【０１１２】 配列番号２２は、本発明における使用のために改変され得る。代表的には、配
列の酵素活性を維持する改変が行われる。アミノ酸置換は、改変された配列が要
求される酵素活性を保持する限り、例えば、１、２または３〜１０または２０の
置換がなされ得る。アミノ酸置換は、天然に存在しないアナログの使用を包含し
得る。

【０１１３】 本発明の配列番号２２はまた、サイレントな変化を生成し、そして機能的に等
価な酵素を生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。故意のア
ミノ酸置換は、ＨＯＸ酵素の酵素活性が保持される限り、その残基の極性、電荷
、可溶性、疎水性、親水性および／または両親媒性の特性における類似性に基づ
いて行われ得る。例えば、負に荷電されたアミノ酸としては、アスパラギン酸お
よびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電されたアミノ酸としては、リジンおよび
アルギニンが挙げられ；および荷電されておらず、極性基を有志、類似の親水性
値を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、ア
ラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、
およびチロシンが挙げられる。

【０１１４】 保存的な置換は、例えば、以下の表に従って作成され得る。第二列における同
じブロックにおけるアミノ酸、および好ましくは第三列における同じ線上のアミ
ノ酸は、互いに置換され得る。

【０１１５】

【表１】 （改変体／ホモログ／誘導体（ヌクレオチド配列）） 当業者は、遺伝コードの縮重性の結果、多数の異なるヌクレオチド配列が同じ
ＨＯＸ酵素をコードし得ることを理解する。さらに、当業者は、慣用技術を用い
て、本発明のＨＯＸ酵素が発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用を
反映させるように、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるＨＯＸ酵素
に影響させずにぬくれ土地度配列を行い得ることが理解されるべきである。

【０１１６】 本発明の配列番号２２において示されるヌクレオチド配列に関して用語「改変
体」、「ホモログ」または「誘導体」には、酵素活性を有し、好ましくは配列表
の配列番号２２に示されるヌクレオチド配列と同じ活性を少なくとも有する、Ｈ
ＯＸ酵素をコードする得られたヌクレオチド配列を提供する配列からまたはそれ
に対して、任意の置換、変更、改変、置き換え、欠失または付加を包含する。

【０１１７】 配列相同性に関して上記のように、本明細書における配列表に示される配列に
対して、好ましくは、少なくとも７５％の、より好ましくは８５％の、より好ま
しくは９０％の、相同性が存在する。より好ましくは、少なくとも９５％の、よ
り好ましくは９８％の、相同性が存在する。ヌクレオチド相同性比較は、上記に
記載されるように行われ得る。好ましい配列比較プログラムは、上記のＧＣＧ
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。 デフォルトスコアリ
ングマトリクスは、各々の同一ヌクレオチドについて１０のマッチ値を有志、ミ
スマッチについて−９を有する。デフォルトギャップ作成ペナルティーは、−５
０であり、そしてそのデフォルトギャップ伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルテ
ィーは、各々のヌクレオチドについて−３である。

【０１１８】 本発明はまた、本明細書に置いて提示される配列に選択的にハイブリダイズし
得るヌクレオチド配列、またはその任意の改変対、フラグメントもしくは誘導体
、あるいは上記のいずれかに対する相補体を包含する。ヌクレオチド配列は好ま
しくは、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも２０
、３０、４０または５０ヌクレオチド長である。

【０１１９】 （ハイブリダイゼーション） 本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の鎖
が塩基対合を通じて相補鎖と結合するプロセス、およびポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）技術において行われるような増幅プロセスを包含する。

【０１２０】 本発明のヌクレオチド配列は、本明細書ににおいて提示されるヌクレオチド配
列またはその相補体に対して選択的にハイブリダイズし得、本明細書において提
示された対応するヌクレオチド配列に対して、少なくとも２０、好ましくは少な
くとも２５もしくは３０、例えば、少なくとも４０、６０もしくは１００または
それを超える連続するヌクレオチドにわたって、一般的に少なくとも７５％、好
ましくは少なくとも８５もしくは９０％、および依り好ましくは少なくとも９５
％もしくは９８％相同である。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、配列番号
２２に示されるヌクレオチド配列に対して相同な領域を含み、配列番号２２に示
されるヌクレオチド配列に対して、好ましくは８０または９０％相同であり、そ
して依り好ましくは少なくとも９５％相同である。

【０１２１】 用語「選択的にハイブリダイズ可能」とは、プローブとして使用されるヌクレ
オチド配列が、本発明の標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドを超えて有意
なレベルでプローブにハイブリダイズすることが見出される条件下で使用される
ことを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、他のヌクレオチ
ド配列が存在する（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーがスクリ
ーニングされる場合）。この事象において、バックグラウンドは、プローブとそ
のライブラリーの非特異的なＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって生成され
るシグナルのレベルを意味する。このレベルは、標的ＤＮＡで観察された特異的
相互作用の１０倍未満、好ましくは１００倍未満の強度である。相互作用の強度
は、例えば、³²Ｐを用いて、プローブを例えば放射標識することによって、測定
され得る。

【０１２２】 ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９
８７，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５２，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に教示されるように
、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、そして以下に説明するような規
定された「ストリンジェンシー」を与える。

【０１２３】 最大のストリンジェンシーは代表的に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃
下）で生じ；高度のストリンジェンシーは、Ｔｍの約５℃から１０℃下で商事；
中程度のストリンジェンシーは、Ｔｍの約１０℃〜２０度下で生じ；そして低ス
トリンジェンシーは、Ｔｍの約２０℃〜２５℃で生じる。

【０１２４】 当業者によって理解されるように、最大のストリンジェンシーハイブリダイゼ
ーションは、同一のヌクレオチド配列を同定または検出するために使用され得る
が、中程度（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似ま
たは関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために用いられ得る。

【０１２５】 好ましい局面において、本発明は、ストリンジェントな条件下で本発明のヌク
レオチド配列に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含する（例え
ば、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、０．
０１５ Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ ７．０）である。本発明のヌクレオチ
ド配列が、二本鎖である場合、その二重鎖の両方の鎖は、個々または組み合わせ
てかのいずれかで、本発明により包含される。ヌクレオチド配列が一本鎖のとき
、そのヌクレオチド配列の相補鎖もまた、本発明の範囲内に包含されることが理
解されるべきである。

【０１２６】 本発明の配列に対して１００％相同ではないが、本発明の範囲内に入るヌクレ
オチド配列は、多数の方法で入手することができる。本明細書において記載され
る他の改変体は、ある範囲の供給源から作製されたＤＮＡライブラリーをプロー
ブ検査することによって例えば得られ得る。さらに、他のウイルス／細菌、また
は細胞ホモログ（特に、哺乳動物細胞（たとえば、ラット、マウス、ウシおよび
霊長類細胞）から見出された細胞ホモログ）が得られ得、そしてそのようなホモ
ログおよびそのフラグメントは、一般に、本明細書におけるは入れうｔ表に示さ
れる配列に選択的にハイブリダイズし得る。そのような配列は、他の動物種から
作製されたｃＤＮＡライブラリーまたはそれからのゲノムＤＮＡライブラリーを
プローブ検査すること、およびそのようなライブラリーを、配列番号２２に示す
ヌクレオチド配列のすべてまたは部分を含むプローブで、中程度から高度のスト
リンジェンシーの条件下でプローブ検査することによって得られ得る。類似の考
慮条件は、本発明のアミノ酸および／またはヌクレオチドの配列の種ホモログお
よび対立遺伝子変異体を得ることに適用される。改変体および株／種ホモログは
また、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする改変体およびホモ
ログ内の標的配列に対して設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて
得られ得る。

【０１２７】 保存された配列は、例えば、いくつかの改変体／ホモログからのアミノ酸配列
を整列することによって予測され得る。配列整列は、当該分野において耕地のコ
ンピュータソフトウェアを用いて行われ得る。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムは、広汎に使用されている。縮重ＰＣＲにおいて
使用されるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、そして公知の配列に対し
て単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用されるもの
よりも低いストリンジェント条件下で使用される。

【０１２８】 あるいは、そのようなヌクレオチド配列は、特徴付けられた配列（例えば、配
列番号２２に示されるヌクレオチド配列）の部位特異的変異誘発によって得られ
得る。このことは、そのヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞にとって
コドン優先度を最適化するための配列にとって必要である。他の配列変化は、制
限酵素認識部位を導入するため、またはヌクレオチド配列によってコードされる
ＨＯＸ酵素の酵素活性を変更するために所望され得る。

【０１２９】 本発明のヌクレオチド配列は、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー、代替
増幅反応のためのプライマー）、プローブ（例えば、放射標識または非放射方式
を用いて従来の手段により表示標識によって標識されている）を生成するために
用いられ得、あるいはそのヌクレオチド配列は、ベクター中にクローニングされ
得る。そのようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、少なくとも
１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０または４０の
ヌクレオチド長であり、そしてまた、本明細書において使用される本発明の用語
ヌクレオチド配列によって包含される。

【０１３０】 本発明に従ったヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド）および
プローブは、組み換え的に、合成的に、または当業者に利用可能な任意の手段で
生成され得る。これらはまた、標準的な技術によってクローニングされ得る。

【０１３１】 一般に、プライマーは、合成的手段によって生成され得、これには、一度に１
ヌクレオチドという所望の核酸配列の段階的製造が包含される。自動化技術を用
いてこれを達成するための技術は、当該分野において容易に利用可能である。

【０１３２】 より長いヌクレオチド配列は、一般的に、組み換え手段（例えば、ＰＣＲ（ポ
リメラーゼ連鎖反応）クローニング技術）を用いて生産される。これは、クロー
ニングすることが所望される標的配列の領域に隣接する、一対のプライマー（例
えば、１５〜３０ヌクレオチド長）を作製する工程、そのプライマーを、ｍＲＮ
ＡまたはｃＤＮＡに接触させる工程、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を所望の
領域の増幅をもたらす条件下で行う工程、増幅したフラグメントを例えば、アガ
ロースゲルにおいて反応混合物を精製することによる）およびその増幅したＤＮ
Ａを回収する工程を包含する。このプライマーは、増幅したＤＮＡが適切なクロ
ーニングベクター中にクローニングされ得るように、適切な制限酵素認識部位を
含むように設計され得る。

【０１３３】 遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じまたは機能的に等価なアミ
ノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を使用してＨＯＸ酵素をクローニングおよ
び発現し得る。当業者に明らかなように、天然に存在しないコドンを含むＨＯＸ
酵素コードヌクレオチド配列を生成することが有利であり得る。特定の原核生物
または真核生物宿主によって好まれるコドン（Ｍｕｒｒａｙ Ｅ ｅｔ ａｌ（
１９８９）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：４７７−５０８）が選択され得
、例えば、これにより、ＨＯＸ酵素発現率を増加させ得、または所望の特性（例
えば、天然に存在する配列から生産される転写物より長い半減期）を有する組み
換えＤＮＡ転写物を生産し得る。

【０１３４】 （スクリーニング） 本発明の方法は、変異した宿主細胞生物における細胞内ＰＯＩのレベル上昇に
ついてスクリーニングするために使用され得る。このようなスクリーニングにお
いて使用される細胞は、固体支持体または固体基材に固定され得る（例えば、プ
ラスチックピンまたは他のいくらかの表面）。その細胞は、本発明の膜抽出組成
物に接触され得、そして放出されたＰＯＩレベルは、当該分野において公知の方
法を用いて測定され得る。

【０１３５】 （高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）） 本発明の方法は、高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）系において使用され得
る。ここで、標的細胞は、マイクロタイタープレート（１００００変異体／日）
でロボットにより増殖およびスクリーニングされる。例示の目的で、新たな組み
換え生産株を作製する場合、生産性を増加するために伝統的な変異誘発を１回ま
たは数回行うことが通常必要である。これは、変異された細胞のＨＴＳを用いて
最も効率的に行われる。

【０１３６】 本発明の方法は、非常に有利である。なぜなら、これは、細胞内ＰＯＩのレベ
ルの増加を高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）に可能とするからである。これ
までは、これらの系は、分泌されたＰＯＩのより高いレベルについてスクリーニ
ングのみを行うことができた。

【０１３７】 （実施例節および図面への導入） わずかにより詳細には、 図１は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉａにおけるＨＯＸ産生の
ための発現ベクターの物理的マップを提供する。任意のシグナル配列に融合され
た合成ＨＯＸ遺伝子のコード領域を有する、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ平滑フラグメ
ントを、標準的なＨａｎｓｅｎｕｌａ発現ベクターの多重クローニング部位中に
クローニングした。この発現ベクターは、蟻酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）遺伝
子のプロモーターおよびメタノールオキシダーゼ遺伝子のターミネーター（ＭＯ
Ｘ−Ｔ）を、フラグメント部位についての複数クローニング部位によって分離さ
れて、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける増殖および選択のためのｏｒｉおよびｂｌ
ａ（ａｍｐＲ）、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおける複製のためのＡＲＳ（ＨＡ
ＲＳ）配列、選択のためのＵＲＡ３遺伝子を包含する。

【０１３８】 図２Ａは、１．４ｋｂの純正のＦＭＤ遺伝子（上スキーム）およびクローニン
グされた異種ＤＮＡを有するＦＭＤプロモーター（下スキーム）の図を示す。制
限部位は、Ａｓｐ７１８、ＮｃｏＩである。

【０１３９】 図２Ｂは、組み込まれた遺伝子の遺伝子コピーを示す。レーン１−１２は、異
なる組み換え単離体およびその対応するＤＮＡ希釈を示す。レーン１３は、形質
転換されていない宿主株を示し、そしてレーン１４は、サイズマーカー（Ｍ）を
示す。

【０１４０】 図３Ａおよび３Ｂは、ＨＯＸ発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を提供する。図３Ａ
は、変異誘発した株ＤＫ８−２７ＫａｎＩＩ３−ｍｕｔ２５のグリセロール醗酵
からの培養物濾液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を提供する。レーン１は、マーカータ
ンパク質を示す。レーン２は、ＨＯＸ標準（０．０３Ｕ／ｍｌ；１８μｌ）を示
す。レーン３は、プローブ３（１８μｌ）からの上清を示す。レーン４は、プロ
ーブ４（１８μｌ）からの上清を示す。レーン５は、プローブ５（１８μｌ）か
らの上清を示す。レーン６は、プローブ６（１８μｌ）からの上清を示す。レー
ン７は、プローブ７（１８μｌ）からの上清を示す。レーン８は、プローブ８（
１８μｌ）からの上清を示す。レーン９は、プローブ９（１８μｌ）からの上清
を示す。レーン１０は、プローブ１０（１８μｌ）からの上清を示す。レーン７
は、プローブ７（１８μｌ）からの上清を示す。

【０１４１】 図３Ｂは、ＨＯＸを発現する組み換え株のウェスタンブロット分析を提供する
。レーンに適用されたサンプルは、図３Ａについてと同様である。膜は、ポリク
ローナルＨＯＸ抗体でプローブ検査した。

【０１４２】 図４は、分泌株ＤＫ８−２７ＫａｎＩＩ３−ｍｕｔ２５の１０リットルの醗酵
培養物の増殖および生産性を示す。この醗酵は、２５℃およびｐＨ５．０で、グ
リセロールおよびｐＯ₂制御のもとで行った。

【０１４３】 図５は、コドン最適化を伴うＨＯＸ遺伝子を合成するために使用される個々の
オリゴヌクレオチドを提供する。

【０１４４】 図６は、合成ＨＯＸ遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を
提供する。

【０１４５】 図７Ａ−７Ｄは、免疫蛍光により決定されるようなＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
におけるＨＯＸ酵素の局在化を示す。ＨＯＸ酵素（緑色シグナル）の局在化の、
核局在（青色シグナル）との重ね合わせを示す。以下を参照：Ａ）ＨＯＸ遺伝子
なしのＲＢ １１ 株、Ｂ）ＤＫ８−２７、Ｃ）ＤＫ８−２７ ｍｕｔ２５、Ｄ
）ＤＫ２ＩＩ−Ｉ。

【０１４６】 図８は、細胞ホモジナイザーを通じたサイクルの数の関数としてのＨＯＸ活性
を示すグラフを提供する。

【０１４７】 図９は、ＣＴＡＢおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の異なる濃度で抽出された
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞を示すグラフを提供する。

【０１４８】 図１０Ａは、ＣＴＡＢ処理後の細胞上清（レーン７−１０）およびペレット（
レーン２−５）におけるにおけるＨＯＸ酵素レベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
ＨＯＸ酵素は、機械的抽出によりペレットから放出された。そのサンプルは、Ｍ
ＥＳ，Ｎｏｖｅｘからの４−１２％ＮｕＰＡＧＥゲルの上で分析し、そして１０
μｌのサンプルを以下の順で各々のレーンにロードした：レーン２−５：細胞ペ
レットにおける残りのＨＯＸ；レーン７−１０：上清における放出されたＨＯＸ
；レーン１および６：Ｎｏｖｅｘ Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ標準物；レーン２：コント
ロール；レーン３：０．１％ ＣＴＡＢ；レーン４：０．２％ＣＴＡＢ；レーン
５：０．４％ＣＴＡＢ；レーン７：コントロール；レーン８：０．１％ ＣＴＡ
Ｂ；レーン９：０．２％ ＣＴＡＢおよびレーン１０：０．４％ ＣＴＡＢ。

【０１４９】 図１０Ｂは、細胞上清（レーン７−１０）およびペレット（レーン２−５）に
おけるＨＯＸ酵素レベルのウェスタンブロット分析を示す。ＨＯＸ酵素は、機械
的抽出によりペレットから放出された。このサンプルを、ＭＥＳ，Ｎｏｖｅｘか
らの４−１２％ ＮｕＰＡＧＥゲルにおいて分析し、そして５μｌのサンプルを
各々のレーンに以下の順序でロードした：レーン１ および６：Ｎｏｖｅｘ Ｓ
ｅｅ Ｂｌｕｅ 標準物，レーン２：コントロール，レーン３：０．１％ ＣＴ
ＡＢ；レーン４：０．２％ ＣＴＡＢ；レーン５：０．４％ ＣＴＡＢ；レーン
７：コントロール，レーン８：０．１％ ＣＴＡＢ；レーン９：０．２％ ＣＴ
ＡＢおよびレーン１０：０．４％ ＣＴＡＢ。

【０１５０】 図１１Ａは、ＣＴＡＢ抽出されたＨＯＸについての溶出プロファイルを示す。

【０１５１】 図１１Ｂは、機械的に抽出されたＨＯＸについての溶出プロファイルを示す。

【０１５２】 （実施例） （材料および方法） （化学物質） 使用したすべての化学物質は、分析試薬等級のものであった。レシチン（３−
ｓｎ−ホスファチジルコリン）は、Ｓｔｅｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）からＳｔｅｒｎ
ｐｕｒ ＰＭとして市販されている。プロナーゼＥ（エキソペプチダーゼおよび
エンドペプチダーゼの混合物についての専用名称であって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ から得られ、実質的に任意のタンパク質を加水分解し
てほとんど完全にアミノ酸を遊離させ得るもの）。リゾレシチン（リゾホスファ
チジルコリン）、Ｄ−グルコース、ｏ−ジアニシジン、ペルオキシダーゼ（Ｐ−
８１２５）、カプロン酸（デカン酸）、サポニン（植物において広く分布するグ
リコシドの大群のいずれかのメンバーであって、強力な界面活性剤である）およ
びＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチル
アンモニウムブロミドとしても知られる）（Ｈ−５８８２）はすべて、Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡから購入した。メタノール（ＨＰＬＣ）
は、Ｌａｂ−Ｓｃａｎ Ｌｔｄからであった。過酸化水素およびＴｒｉｔｏｎ
Ｘ１００（ポリエトキシル化オクチルフェノールについての専用名称）は、Ｍｅ
ｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。Ｐａｌｓｇａａｒｄ ４４４５としても
市販される乳化剤ＹＮは、Ｐａｌｓｇａａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋからであった。
四級アンモニウム化合物（例えば、ＬＴＡＢ（ラウロイルトリメチルアンモニウ
ムブロミド）、Ｃｅｔｒｉｍｉｄｅ−４０（ｃｅｔｒｉｍｉｄｕｍとしても知ら
れる）（これは、アルキルアンモニウムブロミド、主にＣＴＡＢからなる界面活
性剤殺菌剤である）、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、Ｓ
ＴＡＢ（ステアロイルトリメチルアンモニウムブロミド）、ＭＴＡＣ（ミリスチ
ルトリメチルアンモニウムクロリド）、ＣＴＡＣ（セチルトリメチルアンモニウ
ムクロリド），ＳＴＡＣ（ステアロイルトリメチルアンモニウムクロリド）は、
すべて、ＦｅＦ，Ｄｅｎｍａｒｋからであった。Ｒｏｄａｌｏｎは、約９．５％
（９５ｇ／ｌ）のアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド（Ｃ_l2Ｈ₂₅Ｎ
（ＣＨ₃）₂Ｃ₇Ｈ₇Ｃｌ）を含み、これは、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏ
ｒ，２９５０ Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋから得た。アルキルジメチルベ
ンジルアンモニウムクロリドはまた、塩化ベンザルコニウムとしても知られる。
乳化剤ラウロイルラクチレートナトリウム（ＳＬＬ）は、Ｄａｎｉｓｃｏ Ｃｕ
ｌｔｏｒ，Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄ，Ｄｅｎｍａｒｋからであった。

【０１５３】 （酵母醗酵） 酵母の培養は、１０ＬスケールについてのＲｈｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ醗酵マ
ニュアルに従って６Ｌまたは１００Ｌの醗酵槽において行った。

【０１５４】 （実施例１） （合成の、コドン最適化ＨＯＸ遺伝子のアセンブリ） （遺伝子設計） ネイティブのＨＯＸ遺伝子のヌクレオチド配列を改変し、合成遺伝子を生成し
た。この合成ＨＯＸ遺伝子（図６）は、コドン使用法を、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．
、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉ
ｎｉａ、Ｓ．Ｐｏｍｂｅのような生物工学的に関係ある酵母の既知のコドン優先
度と正確に一致するように、これら生物における高レベル生産を容易にするため
設計した。遺伝子は、３つの別個のアセンブルおよび／またはクローン化された
フラグメントに分割した。５’基部半分と称したサブアセンブリは、相補的なペ
アとして図５に提示されるような以下のオリゴヌクレオチドから構成された：Ｈ
ＯＸ１ａ／ＨＯＸ２ｂ、ＨＯＸ３ａ／ＨＯＸ４ｂ、ＨＯＸ５ａ／ＨＯＸ６ｂ、Ｈ
ＯＸ７ａ／ＨＯＸ８ｂ、ＨＯＸ９ａ／ＨＯＸ１０ｂ；プライマー１−６を用いる
３’遠位部半分およびプライマー６−１０を用いる３’遠位部半分。

【０１５５】 （５’基部合成ＨＯＸ遺伝子） 合成ＨＯＸ遺伝子の５’基部半分は、１０のオリゴヌクレオチドＨＯＸ１Ａ〜
ＨＯＸ１０Ｂを用いて合成した。１００μＬのホットスタートＰＣＲ反応（熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼＰｗｏ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いる）において、
１００−１２０塩基対の範囲の長さを有するオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用いた（濃度＝各々０．１μＭ）。ホットスタートは、ｄＮＴＰ（２５０μ
Ｍ）およびＰｗｏポリメラーゼ（２．５単位）を添加する前に、オリゴヌクレオ
チド、緩衝液、ＭｇＳＯ₄の混合物を、９０℃まで加熱することにより実施した
。４０サイクルのＰＣＲは、９４℃３０秒、５７℃１分および７２℃１分のＰＣ
Ｒプロフィールを用いた。７２℃における１０分の伸長ステップを、４０サイク
ルの終わりに含めた。アガロースゲル電気泳動におけるこのＰＣＲからの産物の
分析は、サイズが１００〜８５０塩基対の範囲のＤＮＡバンドのスメアを示した
。最初のＰＣＲを、上記反応からの２μｌをテンプレートとして、および隣接プ
ライマーＨＯＸ１ＡおよびＨＯＸ１Ｂ（各々１μＭ）用いて再増幅した。この反
応は、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂および２単位のＡｍｐｌ
ｉＴａｑ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を含んだ。Ｐ
ＣＲ条件は：９４℃２分間、次いで９４℃３０秒間、６０℃１分間および７２℃
４５秒間のプロフィールをもつＰＣＲの３０サイクルであった。７２℃における
１０分の伸長ステップを、４０サイクルの終わりに含めた。アガロースゲル電気
泳動による第２のＰＣＲ産物の分析は、次いでゲルから精製され、そしてベクタ
ーｐＣＲ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化された、８５０
ｂｐのＤＮＡバンドの存在を示した。

【０１５６】 （３’遠位部合成ＨＯＸ遺伝子） ＨＯＸ遺伝子の遠位部分を合成するために、９０−１２６塩基対の範囲の長さ
のプライマーを設計した。これらプライマーは、約６０℃の計算された融解温度
をもつ１６−２１塩基対の重複（相補的）領域を含んだ。このＨＯＸ遺伝子の遠
位部分は、各々が５３０塩基対のサイズをもつ２つのフラグメント（ＡおよびＢ
）として合成された。２つのＰＣＲ反応を、６つのプライマーを用いて一度に実
施した。ＰＣＲ反応１はプライマー１−６を含み、そしてＰＣＲ反応２はプライ
マー５−１０を含んだ。ＰＣＲ増幅反応は、１００μｌの反応容量中、０．１μ
Ｍの各々のプライマー、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＳＯ₄および２
．５単位のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
由来のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いる２つのＰＣＲ反応のサイクリングパラメーターは、９５℃における
１分の変性、次いで：９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１分間のＰＣＲ
の３０サイクルを含めた。次いで、７２℃における３分の伸長反応を行った。ア
ガロースゲル電気泳動による２つのＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の分析は、両方
の場合で、長さが約５３０ｂｐの正確なサイズの１つの特異的ＤＮＡバンドの合
成を示した。これらＰＣＲ産物を、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔベクター（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。クローン化された部分的合成ＨＯ
Ｘ遺伝子を、複数クローニング部位に隣接するプライマー（Ｍ１３逆プライマー
およびＴ７プロモータープライマー）を用いて配列決定した。配列決定結果は、
合成された部分遺伝子が正確な配列を含んでいたことを確証した。

【０１５７】 （最終のコドン最適化ＨＯＸ遺伝子のアセンブリ） 合成ＨＯＸ遺伝子の３つの部分を、Ｎｃｏ１／ＰｖｕＩＩ ５’基部ＨＯＸ、
３’遠位ＰｖｕＩＩ／ＳｐｅＩ ＨＯＸフラグメントＡおよびＳｐｅＩ／Ｎｏｔ
Ｉで切断されたフラグメントＢからなる、ゲル精製されたＤＮＡフラグメントの
連結により結合した。完全なコドン最適化された合成ＨＯＸ遺伝子（図６）を、
Ｈａｎｓｅｎｕｌａから外来タンパク質の発現および分泌を媒介するために開発
されたＨａｎｓｅｎｕｌａ発現ベクター中にアセンブルした。この発現ベクター
は、ギ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＦＭＤ）、ＭＯＸターミネーター、酵
母分泌シグナルありまたはなしに基づく。

【０１５８】 （結果１） （Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおける組換えＨＯＸの発現） 表１は、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ発現／組み込みベクターの複数クローニン
グ部位中に、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ平滑フラグメントとして挿入された種々のＨ
ＯＸ／分泌融合構築物を示す。異なるシグナル配列は、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙ
ｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからのグルコアミラーゼ遺伝子、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα因子接合型遺伝子およびＡｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡアミラーゼ由来であった。シ
グナル配列なしのＮｏｃＩ／ＮｏｔＩ ＨＯＸ構築物もまたベクター中にクロー
ン化した。

【０１５９】

【表２】 用語、変異体合成は、推定のＫＥＸ２プロテアーゼ切断部位Ｒ₃₃₁−Ｋ₃₃₂〜Ｒ_{33 1} −Ｐ₃₃₂に関する。

【０１６０】 （実施例２） （形質転換および継代） 異なるＨＯＸ発現プラスミドを用いて、ウラシル栄養要求性Ｈ．ｐｏｌｙｍｏ
ｐｈａ株ＲＢ１１を、ウリジン原栄養に形質転換した。異なる発現プラスミドを
保持するＨＯＸ形質転換体を、選択的条件下で３０世代の間培養し、プラスミド
ＤＮＡを増幅し、そしてゲノム中へ組み込ませた。これら形質転換体を、完全非
選択培地上で２０世代の間増殖させた。選択に加え、ＰＣＲおよびサザン分析を
用いて形質転換体を特徴付けた。

【０１６１】 （組み込まれた異質ＤＮＡのコピー数の決定） 非形質転換宿主株および特定のＨＯＸ構築物の種々の組換え単離株のゲノムＤ
ＮＡを制限酵素Ａｓｐ７１８／ＮｃｏＩで消化した。制限酵素消化ＤＮＡを、０
．８％アガロースゲル上で分離し、メンブレン（ニトロセルロース）に移し、そ
してクローン化ＦＭＤプロモーターの³²Ｐ標識フラグメントにハイブリダイズし
た。このハイブリダイゼーションパターンは２つのシグナルを示し、１つは真の
単一コピー１．４ｋｂＦＭＤ遺伝子であり、そしてもう１つはわずかにより小さ
な異種融合に由来する。一連の希釈は、固有の単一コピーのコントロールと比較
して組み込まれたＤＮＡの単一強度の推定を可能にした。

【０１６２】 （結果２） （ＨＯＸ発現のスクリーニング） 形質転換体を、３ｍＬのチューブ培養中で生育させ、そして１％グリセロール
を培地に補填することによる脱抑制条件の下で培養した。ＨＯＸ発現を、グリセ
ロール発酵からの培養のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。ポリクローナル
ＨＯＸ抗体を用いるウェスタンブロット分析を用いてＨＯＸタンパク質の存在を
検出した。

【０１６３】

【表３】 （実施例３） （Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおける組換えＨＯＸの局在化） 組換えＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの免疫蛍光顕微鏡法には、細胞を、Ｙｅａｓ
ｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＹＮＢ）＋グルコース中で、１０⁸細胞／ｍ
ｌの密度まで前培養した。発現を誘導するために、３×１０⁸細胞を、ＹＮＢ＋
１％グリセロールで補填した１００ｍＬの振盪フラスコ培養にシフトした。脱抑
制条件下の１、２または３日の増殖の後、５×１０⁸細胞を、組合わせたパラ−
ホルムアルデヒド（４％）およびグルタルアルデヒド（０．２％）処置（Ｈａｇ
ｅｎおよびＨｙａｍ、１９８８）により固定した。１ｍＬのＰＥＭ（１００ｍＭ
Ｐｉｐｅｓ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、ｐＨ６．９）で３回洗
浄した後、細胞壁を、０．５ｍｇ／ｍＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ−１００Ｔを補填
したＰＥＭＳ（ＰＥＭ＋１Ｍソルビトール）中で部分的に除去した。消化の約６
０分後、細胞を、ＰＥＭＳ＋１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００にシフトし、３０秒イ
ンキュベートし、そして０．５ｍＬのＰＥＭで３回洗浄した。未反応グルタルア
ルデヒド細胞をクエンチするために、細胞をＰＥＭ＋１ｍｇ／ｍＬホウ化水素ナ
トリウム中に再懸濁した。この直後、細胞を、ＰＥＭ中で２回洗浄し、ＰＥＭＢ
ＡＬ（ＰＥＭ＋１％ＢＳＡ（グロブリンフリー）、１ｍＭ リジン塩酸塩、０．
１％ＮａＮ₃）中に再懸濁し、そして回転ホイール上でインキュベートした。１
０⁸細胞に等しい、細胞懸濁物の２５％を、１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精
製したポリクローナル抗−ＨＯＸ抗体で補填し、そして室温で一晩インキュベー
トした。０．５ｍＬのＰＥＭＢＡＬ中で３回洗浄した後、細胞を、ＰＥＭＢＡＬ
中に懸濁し、そして０．５％のＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ）と
ともに暗中で５−２０時間インキュベートした。ＰＥＭＢＡＬ中の洗浄後、細胞
を、ＰＢＳ中で１回、ＰＢＳ＋０．２μｇ／ｍＬジアミジノフェニルインドール
（ＤＡＰＩ）中で１回洗浄し、そして最後にＰＢＳ＋０．１％ＮａＮ₃中に再懸
濁した。顕微鏡観察には、細胞懸濁物の小サンプルを、ポリＬリジンでコートさ
れたカバースリップ上に乾燥し、そして１ｍｇ／ｍＬパラ−フェニレンジアミン
を含む１００％グリセロールの液滴中に転置した。細胞を、間接免疫蛍光装置を
備えたＺｅｉｓｓ顕微鏡で検査し（１．０００×）、そしてイメージを、ＣＣＤ
カメラ（ＭｉｃｒｏＭＡＸ Ｋｏｄａｋ）によりキャプチャーし、そしてＭｅｔ
ａＭｏｒｐｈソフトウェアを用いてプロセッシングした。

【０１６４】 （結果３） ＤＫ８−２７形質転換体の免疫蛍光顕微鏡検査は、組換えＨＯＸタンパク質が
、凝集体として、主に細胞の周縁に局在化していることを示した（図７ｂ）。生
化学的データと組合わせ、これらの結果は、ある程度までのＨＯＸが、（実質的
な膜結合タンパク質に対し）膜結合タンパク質であり得ることを示す。ＨＯＸは
、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ中の原形質膜に局在化する可能性が最も高い。また
、ＤＫ８−２７由来のＤＫ８−２７ｍｕｔ２５株では、ＨＯＸは、原形質膜と結
合している（図７ｃ）。しかし、このタンパク質は、凝集体で蓄積せず、より均
一に分布している。種々のリーダーペプチドに融合するとき、ＨＯＸは、巨大な
細胞内凝集体で蓄積する（図７ｄ）。

【０１６５】 （実施例４） （異なる界面活性剤およびプロテアーゼによる組換えＨａｎｓｅｎｕｌａから
のＨＯＸの抽出） 実験は、１５ｍＬの遠心分離チューブ中の５．０ｍＬの細胞懸濁物（細胞＋上
清）を用いることにより実施した（ＨＯＸ９９２６−７、３１７ｇ細胞／Ｌ湿潤
重量、０．３Ｕ／ｍＬ細胞外ＨＯＸ活性）。細胞を、４０００ｇで１０分間の遠
心分離により分離した。透過性実験には、次いで、上清を、ＣＴＡＢ、ＣＴＡＴ
＋プロナーゼＥ、プロナーゼＥ、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレートの商標名）およびＴｗｅｅｎ８０（ソルビタンモノラウレート
の商標名）のいずれかで補填した。次いで、細胞を、４．０ｍＬの上清中に再懸
濁し、そして２５℃で２３時間インキュベートした（５００ｒｐｍ）。ＣＴＡＢ
との時間の効果を調べるために、チューブの１つの中の細胞を、４ｍＬの０．４
％ＣＴＡＢ中２５℃で７分間のインキュベートのみをした。次いで、細胞を、遠
心分離により分離した。次いで、細胞を、添加されるＣＴＡＢのない元の上清中
に再懸濁し、次いで、上記のように２３時間インキュベートした。インキュベー
ション後、細胞フリー抽出物中の細胞外ＨＯＸを、ＨＯＸアッセイにより測定し
た。

【０１６６】 （ＨＯＸ活性の測定のためのアッセイ方法（ＨＯＸアッセイ）） ＨＯＸ活性は、ＳｕｌｌｉｖａｎおよびＩｋａｗａ（１９７３）のアッセイに
より推定した。このアッセイを、マイクロタイタープレート中で行うためにスケ
ールダウンした。

【０１６７】 （原理） ＨＯＸアッセイは、グルコースの酸化で発生する過酸化水素の測定に基づく。
この過酸化水素は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下でｏ−ジアニシジンを
酸化し、色素を形成する。

【０１６８】 ＨＯＸ β−Ｄ−グルコース＋Ｈ₂Ｏ＋Ｏ₂ → Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン＋Ｈ₂Ｏ₂ ＰＯＤ Ｈ₂Ｏ₂＋ｏ−ジアニシジン_red → ２Ｈ₂Ｏ＋ｏ−ジアニシジン_ox （試薬） １．１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．３ ２．１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．３中の１００ｍＭ Ｄ−グルコース ３．ｏ−ジアニシジン、３．０ｍｇ／ｍｌ蒸留水中 ４．ペルオキシダーゼ、０．１０ｍｇ／ｌｍＬ １００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐ
Ｈ６．３中 （アッセイ） １２０μｌ 試薬１ １５０μｌ 試薬２ １０μｌ 試薬３ １０μｌ 試薬４ および １０μｌ 酵素溶液（適正な希釈中） このアッセイは、マイクロタイタープレート中で実施される。反応は、酵素溶
液の添加により開始される。この混合物は、振盪しながら２５℃で１０分間イン
キュベートされる。ブランクの反応は、酵素溶液に代わる水とすべての成分を含
む。色素の形成は、４０５ｎｍにおけるマイクロタイタープレートリーダー中で
測定される。反応の直線性は、マイクロリーダー上の動力学的プログラムを用い
ることによりチェックされる。

【０１６９】 （過酸化水素標準曲線） 過酸化水素標準曲線は、変化する濃度の新鮮Ｈ₂Ｏ₂を用いることにより構築す
る。１単位の酵素活性を、２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのＨ₂Ｏ₂を生成する
酵素量と規定する。

【０１７０】 （結果４） 表３に提示されたデータは、ＣＴＡＢがＨＯＸを抽出することで非常に効率的
であることを示す。ＣＴＡＢはまた、Ｔｗｅｅｎ２０およびＴｗｅｅｎ８０より
かなり効率的である。プロテアーゼを添加することの有意な利点はない。非常に
興味深いことに、ＣＴＡＢは、ほんの７分のプレインキュベーションでもちいる
ときでさえ、そのポジティブな影響を奏し、これは、ＣＴＡＢが、Ｈａｎｓｅｎ
ｕｌａ細胞壁に非常に迅速に結合し、かつ透過処理することを示す。これは、Ｃ
ＴＡＢに対する細胞フリー上清の分析により支持されており（以下を参照のこと
）、これは、添加された４０００ｐｐｍのＣＴＡＢのうちほんの５０−１００ｐ
ｐｍが細胞フリー上清中に存在することを示す。

【０１７１】 各試験薬剤についての遠心分離チューブ中の沈殿物の比較はまた、ＣＴＡＢ処
置細胞のパックされた細胞容積が、ＣＴＡＢ以外の界面活性剤で処理されたコン
トロール細胞（単数または複数）の容積より小さいことを示す。細胞のこの収縮
は、細胞が実際に透過処理され、そしてそれらの可溶性内容物のあるものが空に
されたことを示す。

【０１７２】

【表４】 （実施例５） （ＣＴＡＢおよびベンズアルコニウムクロライド（ＢＡＣ）を用いるＨＯＸの
抽出） この実験は、１５ｍＬ遠心分離チューブ中の５．０ｍＬの細胞懸濁物（細胞＋
上清）（ＨＯＸ９９５９、Ｍｕｔ４５）を用いることにより実施した。次いで、
細胞懸濁物を、ＣＴＡＢ（１０％ＣＴＡＢストック溶液から）またはベンズアル
コニウムクロライド（Ｒｏｄａｌｏｎ、９．５％ベンズアルコニウムクロライド
）いずれかで補填し、そして２５℃で２２時間インキュベートした（２００ｒｐ
ｍ）。インキュベーション後、細胞外ＨＯＸ（細胞を４０００ｇで１０分間の遠
心分離により除去した）をＨＯＸアッセイにより測定した。

【０１７３】 （結果５） 表４に提示したデータは、ベンズアルコニウムクロライド（ＢＡＣ）が細胞か
らＨＯＸ酵素を放出することで非常に効果的であることを示す。

【０１７４】

【表５】 （実施例６） （塩と組み合わせたＣＴＡＢによる、かつ異なる温度におけるＨＯＸの抽出） ＣＴＡＢ効果の機構を試験するために、ＣＴＡＢをカオトロピック塩および非
カオトロピック塩と組み合わせた。５ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を１５ｍ
Ｌ遠心管に加えた（ＨＯＸ９９２６−７、３１７ｇ細胞／リットル湿重量、０．
３Ｕ／ｍＬ細胞内ＨＯＸ活性）。細胞を４０００ｇで１０分間遠心分離によって
分離した。次いで、上清をＣＴＡＢ、ＣＴＡＢ＋ＮａＣｌ、ＣＴＡＢ＋尿素、Ｃ
ＴＡＢ＋硫酸アンモニウムまたは非イオン性洗浄剤であるオクチル−グリコシド
のいずれかで補充した。次いで、細胞を４．０ｍＬの上清中に再懸濁させ、そし
て２５℃で２６時間インキュベートした（５００ｒｐｍ）。この実験において、
振盪および温度の効果もまた、試験した。インキュベーション後、細胞を含まな
い抽出物を使用して、実施例４に概説されるようなＨＯＸアッセイを用いてＨＯ
Ｘ活性を試験した。

【０１７５】 （結果６） 結果を表５に示す。振盪が、ＣＴＡＢの存在下でＨＯＸの抽出をするために必
ずしも必要でないことが明白である。明らかな温度効果があり、これは、４℃で
の抽出は、２５℃で抽出された活性の半分だけ生じることを意味する。塩化ナト
リウムおよび硫酸アンモニウムの添加は両方とも、ＣＴＡＢ処理の効果を減少さ
せ、これは、ＣＴＡＢ］のイオン性が重要であることを示し得る。尿素の添加は
、あまり強烈でない効果を有するが、依然として抽出されたＨＯＸの量を０．４
％のＣＴＡＢで抽出された量の約半分まで減少させる。尿素は、非イオン性であ
るが、疎水性の相互作用によって妨害され得る。尿素は、親油性のタンパク質の
抽出のためにＰｉｃｈｉａ細胞を透過させる手法として、先行技術において報告
された（Ｃｒａｉｇ １９８７）。非イオン洗浄剤であるオクチルグルコシドは
、有意な抽出効果を有さない。 表５ 細胞内ＨＯＸの抽出に対する洗浄剤、塩と組み合わせた洗浄剤、振盪、および温
度の効果

【０１７６】

【表６】 （実施例７） （ＨＯＸを含む細胞抽出物におけるＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによるＣＴＡＢおよび
ＬＴＡＢの決定） 実施例５からの抽出されたＨＯＸのサンプルを、以下のユニットからなるＨｅ
ｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １１００ ＨＰＬＣ−ＭＳシステムにおけるＬＣ
−ＥＳＩ−ＭＳの手法によって、それらのＣＴＡＢの含量について分析した： ａ）二成分勾配ポンプ、ＨＰ１１００ ｂ）自動サンプラー、ＨＰ１１００、 ｃ）サーモスタットのカラム成分、ＨＰ１１００ ｄ）質量選択検出器、ＨＰ１１００ ｅ）クロマトグラフィーデータシステム、ＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ、Ｖ
ｅｒｓｉｏｎ６．０１。

【０１７７】 このシステムに、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）ＸＤＢ−Ｃ８、
５μＭ、１５０×４．６ｍＭ ｉｄ．（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラ
ムを備えた。カラム温度は２５℃であった。

【０１７８】 クロマトグラフィー条件は、２つの溶媒からなる移動相であった。溶媒Ａ：１
ｍＭ ＮＨ₄ＯＡｃ／水、溶媒Ｂ：１ｍＭ ＮＨ₄ＯＡｃ／メタノール。カラムを
、アイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）条件によって（すなわち、クロマト
グラフィーの期間の間、溶出液の組成が一定に保持される条件を用いて）実行し
た：５％Ａ＋９５％Ｂ、０．８０ｍＬ／分の溶媒流速および１０μＬの注入量で
。サンプルを直接注入した。

【０１７９】 質量分析条件は、以下の噴霧室設定であった： イオン化モード：ポジティブモードにおけるエレクトロスプレー 乾燥ガス（Ｎ₂）温度：３５０℃ 乾燥ガス流速：６．０ｌ／分 噴霧器圧：６０ｐｓｉ 毛細管電圧：−４０００ボルト フラグメンター（ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ）電圧：１００ボルト。

【０１８０】 検出器の設定は以下であった：ＳＩＭパラメータ：ｍ／ｚ ２８４．１（ヘキ
サデシルトリメチルアンモニウムカチオン）。５００μｇのＣＴＡＢ／ｍＬ水（
中心集中度 １０００）を含むストック溶液を、水で希釈し、以下の中心集中度
を有する標準溶液を得た：３００−１００−３０−１０。サンプルに、０．４％
のＣＴＡＢを添加し、これによって、抽出物に全ＣＴＡＢが存在する場合、４０
００μｇ／ｍＬを得た。

【０１８１】 四級アンモニウム化合物のための分析方法を、異なるカラムを用いることによ
って、そして異なる移動相を用いることによって最適化した。２つの９０Ｌスケ
ールの発酵（３１４ｇ／Ｌウエットセルのバイオマス濃度のＶｅｓｔ０００２ｂ
および３３２ｇ／Ｌウエットセルのバイオマス濃度のＶｅｓｔ０００３ｂ）を、
０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度までＬＴＡＢに添加し、そしてＨＯＸを２４時間抽
出した。各発酵からのサンプルを１００００ｇで１０分間遠心分離し、そして得
られた上清をＬＴＡＢ分析のために除去した。以下の方法を用いて、以下のユニ
ットからなるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １１００ ＨＰＬＣ−ＭＳシス
テムにおけるＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳの手法によって、上清中のＬＴＡＢ含量を定量
した： ａ）二成分勾配ポンプ、ＨＰ１１００ ｂ）自動サンプラー、ＨＰ１１００ ｃ）サーモスタットのカラム成分、ＨＰ１１００ ｄ）質量選択検出器、ＨＰ１１００ ｅ）クロマトグラフィーデータシステム、ＨＰ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ、Ｖ
ｅｒｓｉｏｎ６．０１。

【０１８２】 このシステムに、ＰＬＲＰ−Ｓ、１００Å、５μｍ、２５０×４．６ｍＭ ｉ
ｄ．（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カラムを備えた。カラム温
度は２５℃であった。

【０１８３】 クロマトグラフィー条件は、メタノール中の０．１％のヘプタフルオロ酪酸か
らなる移動相であった。カラムを１．００ｍＬ／分の溶媒流速および５μＬの注
入量で実行した。サンプルをメタノールで２５倍に希釈し、そして注入前に、Ｇ
ｅｌｍａｎ ＧＨＰ Ａｃｒｏｄｉｓｃ １３ｍＭ Ｍｉｎｉｓｐｉｋｅ ０．
４５μＭを介して濾過した。

【０１８４】 質量分析条件は、以下の噴霧室設定であった： イオン化モード：ポジティブモードにおけるエレクトロスプレー 乾燥ガス（Ｎ₂）温度：３５０℃ 乾燥ガス流速：１３．０Ｌ／分 噴霧器圧：６０ｐｓｉ 毛細管電圧：−４０００ボルト フラグメンター（ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ）電圧：１５０ボルト。

【０１８５】 検出器の設定は以下であった：ＳＩＭパラメータ：ｍ／ｚ ２２８．１（ラウ
オリルトリメチルアンモニウムカチオン）。２５０μｇのＬＴＡＢ／ｍＬメタノ
ール（中心集中度 １０００）を含むストック溶液を、メタノールで希釈し、以
下の中心集中度を有する標準溶液を得た：４００−２００−１２０−８０−３６
−１０．８−５．４−２．１６−０．８６４。

【０１８６】 （結果７） 表６から、ＨＯＸ酵素を含む細胞抽出物におけるＣＴＡＢのレベルは、細胞に
添加された量よりずっとより低いことが明白である。これは、酵母細胞壁へのＣ
ＴＡＢの結合およびそれ故の固定化によって説明される。これは、得られたＨＯ
Ｘ酵素のみが、非常に低いレベルのＣＴＡＢを含むことを意味する。 表６ 実施例６からの抽出されたＨＯＸ上清中のＣＴＡＢの含量

【０１８７】

【表７】 上清中のＬＴＡＢについて得られた結果（表６ａ参照）は、添加されたＬＴＡ
Ｂの約２７％のみが、細胞を含まない画分において見出されることを示す。この
結果は、表６のＣＴＡＢでの結果と同じ傾向を示す。 表６ａ 実施例６からの発酵Ｖｅｓｔ０００２ｂおよびＶｅｓｔ０００３ｂから抽出され
た上清中のＬＴＡＢ含量

【０１８８】

【表８】 （実施例８） （ＣＴＡＢによるＨＯＸの抽出の時間および効率に対する温度の効果） ＣＴＡＢによるＨＯＸの抽出の時間および効率に対する温度の効果を、Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａサンプル上で試験した：Ｍｕｔ４５、ＨＯＸ９９４９、２８４ｇ／
Ｌ、２．６Ｕ／ｍＬ。

【０１８９】 遠心管中の発酵物（細胞＋上清）５ｍＬに、（１０％のＣＴＡＢ溶液からの）
０．２％か０．４％のいずれかのＣＴＡＢを添加した。この管を、それぞれ、２
５、３０、３５および４０℃でインキュベートした（２００ｒｐｍ）。指示され
た時間に、サンプルを取り、そして１０００ｇで５分間遠心分離した後、上清を
ＨＯＸ活性についてアッセイした。結果を表７に示す。 表７ 異なる温度でのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのＨＯＸ抽出の時間経過

【０１９０】

【表９】 （結果８） ＣＴＡＢ抽出は、温度に依存すること、およびより高い温度を用いることによ
ってより速い抽出が達成され得ることが明白である。しかし、これは、抽出され
たタンパク質の安定性によってバランスされるべきパラメータである。この実験
において、０．２％または０．４％のＣＴＡＢを用いることの間に、有意差は存
在しないようである。しかし、これは、特定の実験における細胞濃度に依存する
。

【０１９１】 （実施例９） （異なる４級アンモニウム化合物によるＨＯＸ抽出） いくつかの異なる４級アンモニウム化合物を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈａ由来の細胞内ＨＯＸ酵素の抽出に関して試験した。発酵培養液のサ
ンプルを、６Ｌスケールの発酵（ここでは、バイオマス濃度が１Ｌ当たり約３４
０ｇ湿重量である）から除去した。表８に列挙される４級アンモニウム化合物の
各々の４％（ｗ／ｖ）溶液１ｍＬを、プラスチック管に発酵培養液９ｍＬまで添
加した。２５℃で２００ＲＰＭでの２４時間のインキュベーション後に、管を２
０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を、前記のように、ＨＯＸアッセイを用
いてＨＯＸ活性について分析した。

【０１９２】 ＨＯＸ抽出の時間経過をＣＴＡＢ、ＬＴＡＢおよびＣＴＡＣを用いて研究した
。１Ｌ当たり２８０ｇの湿重量のＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを
含む発酵サンプルを発酵層から除去した。ＣＴＡＢ、ＬＴＡＢおよびＣＴＡＣの
４％（ｗ／ｖ）溶液を、発酵培養液９ｍＬを含むプラスチック管に最終濃度０．
２または０．４（ｗ／ｖ）まで添加した。２５℃で２００ＲＰＭでの４８時間の
インキュベーションの０、７、１７、２４、および４８時間後に、管を２０００
ｇで１０分間遠心分離した。上清を、前記のようにＨＯＸアッセイを用いてＨＯ
Ｘ活性について分析した。

【０１９３】 ＬＴＡＢの抽出効果を、細胞内でＨＯＸを産生するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ株番号３４９において試験した。発酵培養液のサンプルを６Ｌスケールの
発酵（ここで、バイオマス濃度は、１Ｌ当たり約２３２ｇ湿重量であった）から
除去した。発酵培養液９ｍＬを、ＬＴＡＢの１０％（ｗ／ｖ）溶液 ０μＬ（コ
ントロール）または１８０μＬと共にプラスチック管に添加した。３０℃で２０
ＲＰＭでの２４時間のインキュベーション後に、管を９０００ｇで５分間遠心分
離した。上清を前記のようにＨＯＸアッセイを用いてＨＯＸ活性について分析し
た。

【０１９４】 （結果９） ＨＯＸは、０．４％（ｗ／ｖ）の終濃度で発酵サンプルに添加した場合の全て
の試験した四級アンモニウム化合物で抽出することができた（表８を参照のこと
）。２５℃での２４時間のインキュベーション後、ＬＴＡＢは、ＨＯＸの抽出に
関して、他の試験した化合物より優れていた。抽出されたＨＯＸの量は、四級ア
ンモニウム化合物の鎖の長さが増加するにつれ減少するようであった。

【０１９５】 ＣＴＡＢ、ＬＴＡＢまたはＣＴＡＣを用いたＨＯＸ抽出の時間経過を、表９に
示す。インキュベーション時間および抽出試薬濃度の両方が抽出されるＨＯＸ活
性の量に影響を与えることが、明らかである。ＬＴＡＢは、分析した全インキュ
ベーション時間において最良の抽出試薬であることが見出され、これは、表８に
示す結果と一致する。ＬＴＡＢを用いたＨＯＸの抽出は、０．４％（ｗ／ｖ）の
濃度のＬＴＡＢよりも、０．２％（ｗ／ｖ）ＬＴＡＢの濃度においてよりゆっく
りとした速度で進行するようである。ＨＯＸ酵素の抽出に関して、０．２％（ｗ
／ｖ）のＣＴＡＢの使用と０．４％（ｗ／ｖ）のＣＴＡＢの使用との間にほとん
ど差異はないようである。

【０１９６】 （表８） （種々の四級アンモニウム化合物を用いたＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈａからのＨＯＸの抽出）

【０１９７】

【表１０】 抽出試薬の添加前の発酵培地における細胞外ＨＯＸレベルは、２４時間後にＬＴ
ＡＢで抽出したＨＯＸ活性の約９％であった。^a 化合物は、全て構造：ＣＨ₃−（ＣＨ₂）_n−Ｎ（ＣＨ₃）⁺ ₃（塩化物または臭化
物を対イオンとして有する）である。^b 全ての実験を２連で実行した。^c Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからの結果を、いずれのＬＴＡＢの添加も伴
わないコントロールチューブでの抽出ＨＯＸに対して標準化した。抽出開始前の
発酵中の細胞外ＨＯＸレベルは、コントロール（すなわち、いずれのＬＴＡＢの
添加も伴わないプラスチックチューブ）中の抽出レベルの約２４％であった。

【０１９８】 （表９） （ＣＴＡＢ、ＬＴＡＢ、およびＣＴＡＣを用いたＨＯＸ酵素の抽出の時間経過
）

【０１９９】

【表１１】 抽出試薬の添加前の発酵培地における細胞外ＨＯＸレベルは、４８時間後に０．
４％（ｗ／ｖ）ＬＴＡＢで抽出したＨＯＸ活性の約４％であった。値を、±１標
準偏差で提供する。ｎ：実験数。

【０２００】 全ての値を、４８時間後に０．４％（ｗ／ｖ）ＬＴＡＢを用いた抽出レベルに
対して標準化する。

【０２０１】 （実験１０） （ＨＯＸ抽出に関するＣＴＡＢと他の乳化剤との間の比較） リゾレシチン（リゾホスファチジルクロライド）は、高分子の選択的な放出を
伴って少なくとも哺乳動物細胞を透過可能であり得る。リゾレシチンおよび多数
の他の乳化剤および短い鎖の脂肪酸の効果を試験するために、ＨＯＸを抽出する
これらの能力を試験してＣＴＡＢと比較した。

【０２０２】 ５ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を、１５ｍＬの遠心分離チューブに添加し
た（ＨＯＸ９９１０Ｂ、３０５ｇ細胞／Ｌ 湿重量、１．６Ｕ／ｍｌ 細胞外Ｈ
ＯＸ活性）。細胞を、４０００ｇで１０分間、遠心分離によって分離した。次い
で、細胞を、ＣＴＡＢ、乳化剤ＳＬＬ、ＹＮ、カプリン酸、リゾレシチン、また
はレシチンのいずれかを補充した４．０ｍＬ ２５ｍＭクエン酸（ｐＨ６．３）
中に再懸濁した。次いで細胞を、２０時間２５℃（５００ｒｐｍ）でインキュベ
ートした。

【０２０３】 （結果１０） インキュベーション後、無細胞抽出物中のＨＯＸ活性のレベルを、ＨＯＸアッ
セイによって測定した。表１０に示すデータは、ＣＴＡＢ以外の試験した乳化剤
が、非常に低いレベルの活性酵素を放出し得るのみであることを示す。この結果
はまた、ＣＴＡＢが、上清中の潜在的な酵素を活性化し得ること（おそらく、膜
結合フラグメントから酵素を放出することによる）を示す。

【０２０４】 （表１０） （ＨＯＸ抽出に対する界面活性剤、乳化剤、およびリン脂質の効果）

【０２０５】

【表１２】 （実施例１１） （ＨＯＸの抽出に関するＣＴＡＢとサポニンとの間の比較） サポニンがジギトニンのように作用するか否かを確認するために、Ｈａｎｓｅ
ｎｕｌａからのＨＯＸ酵素の抽出に対するサポニンの効果を試験した。

【０２０６】 実験を、５．０ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を用いて１５ｍＬ遠心分離チ
ューブ中で実行した（ＨＯＸ１９０７９９、３４０ｇ細胞／Ｌ 湿重量、０．５
Ｕ／ｍＬ 細胞外ＨＯＸ活性）。細胞を、４０００ｇで１０分間、遠心分離する
ことによって分離した。次いで、細胞を、ＣＴＡＢもしくははサポニンのいずれ
かを補充した４．０ｍＬの上清中に再懸濁するか、またはＣＴＡＢもしくはサポ
ニンのいずれかを補充した２５ｍＭ クエン酸（ｐＨ６．３）中に再懸濁した。

【０２０７】 無細胞抽出液（ＣＴＡＢを用いた処理後）中の測定されたＨＯＸ活性が実際に
抽出の結果であり、単に上清中のＨＯＸ活性化の結果ではないこと（これは、Ｈ
ＯＸは上清中に既に存在するが不活性であることであり得る）を確認するために
、無細胞抽出液（ＣＴＡＢまたはサポニンでの補充後）をまた、インキュベート
し、そしてＨＯＸ活性について分析した。このチューブを、１９時間２５℃（５
００ｒｐｍ）でインキュベートした。インキュベーション後、無細胞抽出物中の
細胞外ＨＯＸを、ＨＯＸアッセイによって測定した。

【０２０８】 （結果１１） 表１１の結果は、サポニンがＨＯＸを細胞から抽出するごくわずかな能力を有
することを示す。さらに、サポニンによるＨＯＸ活性化の指標も、ＣＴＡＢによ
るＨＯＸ活性化の指標も、いずれもなかった。

【０２０９】 （表１１） 異なる透過剤を使用することによる比較ＨＯＸ抽出／活性化 試験 ＨＯＸ活性％ コントロール ０（細胞＋上清） １００ ０．２％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） １２００ ０．４％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） ３１００ ０．２％ サポニン（細胞＋上清） １５０ ０．４％ サポニン（細胞＋上清） １４０ ０．８％ サポニン（細胞＋上清） １４０ コントロール １（細胞＋緩衝液） １００ ０．２％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） ３１００ ０．４％ ＣＴＡＢ（細胞＋上清） ７７００ ０．２％ サポニン（細胞＋上清） ２３０ ０．４％ サポニン（細胞＋上清） ２３０ ０．８％ サポニン（細胞＋上清） ２３０ 上清＋０．２％ ＣＴＡＢ ８０ 上清＋０．４％ ＣＴＡＢ ８０ 上清＋０．２％ サポニン ８０ 上清＋０．４％ サポニン ８０ 上清＋０．８％ サポニン ８０ （実施例１２） （１００Ｌ発酵槽におけるＨＯＸのＣＴＡＢ抽出） １２０時間の発酵（ＦｅｒｍＩＤ Ｖｅｓｔ９９１０ｂ）の後、ＣＴＡＢ溶液
（４０℃の水３．６Ｌに溶解した３６０ｇのＣＴＡＢ）を１００Ｌ発酵槽の入口
ポートを介してブロスに直接添加した。活性な発酵物容量が約９０Ｌであったた
め、発酵ブロス中のＣＴＡＢの最終濃度は、約４ｇ／Ｌであった。

【０２１０】 同時に、撹拌、通気、ｐＨ制御、および栄養物添加をとめた。温度を２５℃に
制御し、そして２２時間のＣＴＡＢ処理の後、ブロスのＨＯＸ含量は、１．６Ｕ
／ｍＬから３０Ｕ／ｍＬに増加した。

【０２１１】 （実施例１３） （実験室スケールにおけるＨＯＸ産生Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａの均質化） ＣＴＡＢ処理の結果としてＨＯＸ抽出の効率を試験するために、２つの異なる
発酵試験からの細胞を、細胞分裂装置「Ｚ Ｐｌｕｓ」２．２ｋＷ（Ｃｏｎｓｔ
ａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ，ＵＫ）を使用することによって分裂させた。
細胞（５ｍＬ）をワンショットポンプヘッドを使用して様々な圧力で分裂させた
。開始後、この細胞片を遠心分離（１０，０００ｇで５分）によって上清から分
離し、そして細胞を含まない上清中の細胞内ＨＯＸレベルを、上記のようなＨＯ
Ｘアッセイを使用して測定した。同じ細胞をまた、０．２％ ＣＴＡＢで処理し
（２５℃、５００ｒｐｍ、２０時間）、そして細胞を含まない抽出物を比較物質
として使用した。

【０２１２】 （結果１３） 表１２に示すデータは、細胞内ＨＯＸの総量が０．２％ ＣＴＡＢでの処理に
よって抽出されることを示す。

【０２１３】 （表１２） ＣＴＡＢ処理の有効性

【０２１４】

【表１４】 ^*細胞は２５℃で４８時間インキュベートした。

【０２１５】 （実施例１４） （大スケールにおけるＨＯＸ産生Ｈｏｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
の均質化） ＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ高圧ホモジナイザーモデル３０ＣＤで、１０Ｌの発酵ブ
ロス（ＦｅｒｍＩＤ Ｖｅｓｔ９９０７ｂ）をホモジナイズした。ホモジナイザ
ーを最大流速（１００Ｌ／分）で、１０００ｂａｒの圧力によって作動させた。
均質化手順の間、このブロスを氷水で冷却し、そして産物の温度は決して２０℃
を越えなかった。ＨＯＸ活性の迅速な増加は、初めの３サイクルの間に観察され
、続いて５〜７サイクル後にほとんど定常レベルが観察された。

【０２１６】 （結果１４） この結果を、表１３および図８に示す。

【０２１７】 （表１３） （Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのＨＯＸの機械抽出）

【０２１８】

【表１５】 （実施例１５） （Ｈｏｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａからのＨＯＸの抽出に対するＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の効果） ＣＴＡＢまたはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、遠心分離管の５ｍＬの発酵物（
サンプル ＨＯＸ９９５４、Ｍｕｔ ４５、１８．１０．９９，ＨＶＰ）に添加
した。水をコントロールに添加した。サンプルを、２５℃、２００ｒｐｍで２２
時間インキュベートした。インキュベーションの後、これらのサンプルを遠心分
離し、そして上清を、上記のようにＨＯＸ活性について分析した。

【０２１９】 （結果１５） 結果を表１４および図９に示す。非イオン性界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００を使用して、酵母細胞を透過化処理し（Ｎａｇｌａｋら、１９９０および
米国特許第第５１２４２５６号を参照のこと）たが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
はＣＴＡＢ（これは、当該分野において、細胞内酵素（例えば、ＨＯＸ酵素）を
抽出し得ることが記載されていないが、細胞の透過性化を与えることが記載され
ている）とは逆に抽出効果を有さないことは明らかである。

【０２２０】 （表１４） （Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と比較したＣＴＡＢでのＨＯＸ抽出）

【０２２１】

【表１６】 （実施例１６） （ウェスタンブロッティング） ウェスタンブロッティングを用いて、残余（ペレット）のＨＯＸ酵素および放
出された（上清の）ＨＯＸ酵素の量を分析することによりＨＯＸ分泌の効力を試
験した。細胞を、それぞれ、０％、０．１％、０．２％、および０．４％ＣＴＡ
Ｂを用いて処置した。インキュベーションの後、細胞を、４０００ｇで１０分間
遠心分離により分離した。得られた上清のＳＤＳ−Ｐａｇｅ（４−１２％ Ｍｅ
ｓ Ｎｕ−Ｐａｇｅ）は、図１０Ａのレーン７−１０に示される。ペレットを緩
衝液を用いて２回洗浄し、次いで、緩衝液中に再懸濁したＦａｓｔＰｒｅｐ細胞
崩壊剤において崩壊させた。ペレット抽出物をまた、製造業者の指示書（Ｎｏｖ
ｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳ）に従って、プレキャストＮｏｖｅｘゲルを使
用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０Ａ中のレーン２−５を参照のこと）にアプラ
イした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、製造業者の指示書（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ，ＵＳ）に従って、ニトロセルロース膜にブロットした。このブロット
を、ＨＯＸ酵素に対して惹起された抗体（ウサギ抗血清＃４３６４ ＢＩ／ＯＣ
Ｈ １９０７９７）（この調製を以下に記載する）と共にインキュベートした。

【０２２２】 （ＨＯＸ特異的抗体の調製） 組換えＨＯＸ酵素をＷＯ９６／４０９３５に記載されるように、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて、発現プラスミドＰＵＰＯ１８１から産生させた
。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞発現組換えＨＯＸの粗抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分
析した。ＨＯＸに対応する６２ｋＤの相対分子量（Ｍｒ）でのプロミネントタン
パク質のバンドを、ＷＯ９６／４０９３５に記載されるように、ポリビニリデン
ジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写させ、そしてＮ−末端アミノ酸配列分析に供
した。同定したアミノ酸配列は：Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−（配列番号１）であった。この配列は
、ＨＯＸについて開示された配列（ＨａｎｓｅｎおよびＳｔｏｕｇａａｒｄ，１
９９７）中のアミノ酸番号２〜１１に対応した。従って、発現した６２ｋＤタン
パク質は、Ｎ−末端アミノ酸のメチオニン（Ｍｅｔ₁）を欠く組換えＨＯＸであ
った。

【０２２３】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて観察された６２ｋＤのＨＯＸのバンドを、プレパラ
ティブＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製し、そしてＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら（１９
８３）により記載されるようにゲルから電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏ
ｎ）した。電気溶出した６２ｋＤのＨＯＸバンドの純度を、上記のように、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、そしてアミノ酸配列分析により分析した。精製したＨＯＸを、ウ
サギにおける抗体産生のために用いた。約５０μｇを、等量の不完全Ｆｒｅｕｎ
ｄ’ｓアジュバントと混合し、そして免疫に用いた。 ウサギにおいて産生したＨＯＸ特異的モノクローナル抗体を、ウェスタンブロ
ット分析における本研究を通じて用いた。ウェスタンブロット分析により分析さ
れるタンパク質を、上記のように、電気泳動し、そして標準的手順に従って、ニ
トロセルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を、３％脱脂粉乳を含む
ＴＢＳ−Ｔ溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０
．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１時間ブロックした。１．５％脱脂粉乳を含むＴ
ＢＳ−Ｔ中に１：１０，０００で希釈したＨＯＸ特異的抗体を添加し、そして一
晩ブロットした。このブロットを、ＴＢＳ−Ｔ中で３回洗浄した後、１．５％脱
脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔ中に１：１０００で希釈した二次抗体（アルカリホスフ
ァターゼ結合体化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン、ＤＡＫＯ，カタログ番号Ｄ４８
７）と共にインキュベーション（１〜２時間）した。このブロットを、引き続い
て、ＴＢＳ−Ｔ（２ｘ２０分）およびＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５
；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１×５分）中で洗浄した後、標準的な手順に従って、
ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフ
ェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）緩衝液中で発色させた。

【０２２４】 抗体の特異性を、それぞれ、Ｃｈｏｎｄｒｕｓ ｃｒｉｓｐｕｓ、Ｅ．ｃｏｌ
ｉおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の抽出物を含むＨＯＸを用いる一
連のウェスタンブロットにおいて調査した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの抽出物を含
むＨＯＸのウェスタンブロット分析は、Ｍｒ６２ｋＤの強力なＨＯＸ特異的バン
ド、およびより低い分子量の２つまたは３つの弱いバンドを示した。

【０２２５】 （結果１６） ウェスタンブロットの結果を、図１０Ｂに示す。このウェスタンブロットは、
実質的に、ＨＯＸが０．４％ＣＴＡＢを用いる処置の後の細胞に残らないことを
確認した。

【０２２６】 （実施例１７） （細胞内酵素の増加したレベルに対するハイスループットスクリーニング（Ｈ
ＴＳ）についての記載） 細胞内ＨＯＸ酵素を発現するＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ菌株
を、２５４ｎｍの波長のＵＶ光を用いて変異させた。変異した菌株を、寒天プレ
ート（Ｇｉｂｃｏからの１．４ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓ
ｅ（ＹＮＢ）、５ｇ／Ｌ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１ｇ／Ｌグリセロールおよび２％（
ｗ／ｖ）寒天）上にプレートし、そしてコロニーが形成されるまで３０℃でイン
キュベートした。コロニーを、ロボテックコロニーピッカー（ｒｏｂｏｔｉｃ
ｃｏｌｏｎｙ ｐｉｃｋｅｒ）（Ｑ−Ｐｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｘ，Ｃｈｒｉｓｔｃ
ｈｕｒｃｈ Ｄｏｒｓｅｔｔ，ＵＫ）を用いて９６ウェルマイクロタイタープレ
ートに播種した。各マイクロタイターウェルは、２００μＬ ＹＮＢ培地（１０
０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．１、１．４ｇ／Ｌ ＹＮＢ（Ｇｉｂｃｏから）、５ｇ
／Ｌ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄および１０ｇ／Ｌグリセロール）を含んだ。マイクロタイ
タープレートを、ＩＯＣ４００．ＸＸ２．Ｃ ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔ
ｏｒ（ＳＡＮＹＯ Ｇａｌｌｅｎｋａｍｐ ＢＶ，Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔ
ｈｅｒｌａｎｄｓ）中で、７日間振盪させて２５℃でインキュベートした。ＨＯ
Ｘ活性を、１０５μＬの試薬を含むように改変されたＨＯＸアッセイを用いて１
０μＬ発酵ブロスで測定し、そして１５μＬ ０．４％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢを、
アッセイに加えた。反応時間は、３０℃で６０分であった。ＨＯＸアッセイをＰ
ｌａｔｏ ７ ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ ｒｏｂｏｔ（Ｒｏｓｙｓ，Ｈｏｍｂｒｅｃ
ｈｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて実行し、吸収度をＳｐｅｃｔ
ｒａｍａｘ ｐｌｕｓ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＫ）で測定した。それぞれの個々のマイ
クロタイターウェルにおける増殖を、１０μＬの発酵ブロスを新しいマイクロタ
イタープレートに移し、１００μＬの１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．３を加
え、そして６００ｎｍにおける吸収度を測定した。ＨＯＸ測定を、乏しい増殖を
考慮に入れるために、６００ｎｍでの吸収度に関して規格化した。

【０２２７】 （結果１７） この結果は、上昇したレベルの細胞内ＨＯＸ酵素を産生するＨａｎｓｅｎｕｌ
ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの変異についてスクリーニングすることが可能である
ことを示す。

【０２２８】 （実施例１８） ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸ（例えば、表１２を参照のこと）および「機械抽出」ＨＯ
Ｘ酵素（例えば、表１３および図８を参照のこと）からの比活性の比較。

【０２２９】 （結果１８） この結果は、ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸからの比活性が、「機械抽出」ＨＯＸの比活
性よりも高いことを示す。これらの結果は、ＣＴＡＢが、細胞小器官に局在化す
る細胞内タンパク質のすべてを抽出するわけではないが、主に細胞質ゾルタンパ
ク質を抽出することを示す。

【０２３０】 （実施例１９） アニオン交換クロマトグラフィーによるＣＴＡＢ抽出ＨＯＸおよび機械抽出Ｈ
ＯＸの特徴付け） ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸの純度を分析するために、これを細胞破壊を使用すること
によって抽出されたＨＯＸと比較した。比活性を測定し、比較して、そして抽出
物の核酸含有量を比較した。さらに、純度をアニオン交換クロマトグラフィーに
よって調べた。

【０２３１】 ７ｍＬの細胞懸濁液（細胞＋上清）を、１５ｍＬの遠心分離チューブ（ＨＯＸ
９９５７，Ｍｕｔ ４５）に加えた。０．４％ＣＴＡＢの添加時に、細胞懸濁液
を２３時間、３０℃で（２００ｒｐｍ）インキュベートした。細胞を遠心分離（
１００００ｇおよび１０分）で除去し、細胞を含まない上清をＣＴＡＢ抽出ＨＯ
Ｘの供給源として使用した。別の７ｍＬの同じ細胞懸濁液（ＣＴＡＢを添加しな
い）を、ワンショットポンプヘッド（Ｚ Ｐｌｕｓ，２．２ｋＷ，Ｃｏｎｓｔａ
ｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ，ＵＫ）を２×２４００ｂａｒで使用することに
よって破壊した。次いで、細胞の破片を遠心分離（１００００ｇおよび１０分）
によって分離し、そして上清を機械抽出ＨＯＸの供給源として使用した。

【０２３２】 両方のサンプルを２０ｍＭ ＴＥＡ（トリエタノールアミン、Ｍｅｒｃｋ）緩
衝液、ｐＨ７．３で、ＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．
）で脱塩した。サンプルをＨＯＸ活性およびタンパク質濃度について分析した（
タンパク質アッセイは、Ｓｃｈｌｅｉｆ ａｎｄ Ｗｅｎｓｉｎｋ，１９８１に
よって記載されるアッセイ方法に基づく）。核酸の含有量は、２６０ｎｍおよび
２８０ｎｍの測定によって決定した（Ｂｏｌｌａｇ ａｎｄ Ｅｄｅｌｓｔｅｉ
ｎ，１９９１）。

【０２３３】 イオン交換クロマトグラフィーを、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｄｕｏ Ｆｌｏｗ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）システムを使用することによって行った。５
００μｌの脱塩化サンプルを、ＴＥＡ緩衝液（緩衝液Ａ、２０ｍＭ、ｐＨ７．３
）で平衡化されたＳｏｕｒｃｅ Ｑ １５ ｃｏｌｕｍｎ（ＨＲ５／５，Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）に適用した。ＨＯＸを、１．５ｍＬ／分の流
速で、緩衝液Ａ中０−０．５Ｍ ＮａＣｌの２０ｍＬの直線勾配で溶出し、この
間、１．５ｍＬの画分が、収集され、そしてＨＯＸ活性についてアッセイされた
。

【０２３４】 （結果１９） 比活性の決定は、ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸが、機械抽出ＨＯＸと比較してずっとよ
り純粋であることを示す（表１５）。また、この核酸の含有量は、機械抽出ＨＯ
Ｘにおけるよりも、ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸにおいてずっと低い（表１５）。

【０２３５】

【表１７】 ＣＴＡＢ抽出ＨＯＸおよび機械抽出ＨＯＸについてのＳｏｕｒｃｅ Ｑ分析の
クロマトグラムを示す図１１Ａおよび１１Ｂにおけるアニオン交換クロマトグラ
フィー分析はまた、この結果を強く確認する。

【０２３６】 （ＣＴＡＢを用いた実験） （実施例２０） （１．振とうフラスコ実験） ２種の異なる培地を、ＣＴＡＢとの実験のために選択した： ・ＹＰ／１％のグリセロール ・ＹＮＢ／１％のグリセロール＋０．１ＭのＮａＰｉ ｐＨ６．０。

【０２３７】 （（ａ）ＹＰ／１％のグリセロール中での培養） ５０ｍＬの培地を、２．５ｍＬのＹＰＤプレ培地を用いてインキュベートし、
そして３７℃、１６０ｒｐｍで培養した。培養の２８時間後に、１％（ｖ／ｖ）
のメタノールを添加し、そして３７℃、１６ｒｐｍで１８時間さらにインキュベ
ートした。このＯＤ_600nmを測定して、必要であるＣＴＡＢの量を計算した。上
清（ＳＮ）のアリコートおよび１．５ｍＬの培地の細胞ペレットを取り出した。
細胞を機械で破壊した後、可溶なフラクション（ＣＸ）を単離した。 → これらの状態のＳＮを、Ａと命名した。

【０２３８】 これらの状態のＣＸを、Ｄと命名した。

【０２３９】 これらの培養物の同一の体積（２０ｍＬ）を、２個の振とうフラスコにアリコ
ートした。２０ｍＬの培地に、０．００５ｇのＣＴＡＢを補充した。（ＣＴＡＢ
−ストック溶液：０．０２ｇ／ｍＬ；ＤＡＮＩＳＣＯ：０．４％（発酵槽培地中
）（ＯＤ_600nm〜３００）→振とうフラスコ実験ＯＤ_600nm〜２０→０．０２７ｇ
のＣＴＡＢ／１００ｍＬの培地）培地のインキュベーション：２４時間、４℃（
振とう無し）。 → これらの状態のＳＮを、Ｃと命名した。

【０２４０】 これらの状態のＣＸを、Ｆと命名した。

【０２４１】 ＣＴＡＢを含まない第２の振とうフラスコを、ＣＴＡＢ−フラスコとして同一
の条件下でインキュベートし、そして参照培地として利用した。 → これらの状態のＳＮを、Ｂと命名した。

【０２４２】 これらの状態のＣＸを、Ｅと命名した。

【０２４３】 ５種の異なるＩＬ−１ｒａ構築物を有する菌株を培養した。この菌株４−１７
、ＡＬ９／２およびＩＩ３−１は、単一の配列を有さない、３種の異なる構築物
を含んだが、この菌株ＭＦα２およびＭＦαＡＬ７／１は、ＭＦαプレ−プロ配
列を有する、２種の異なる構築物を示した。

【０２４４】 菌株ＦＰＭＴ８を、組換え菌株と同一の条件下で培養した。この菌株をエンプ
ティーＨａｎｓｅｎｕｌａベクターｐＦＰＭＴ１２１のほぼ３０個のコピーに必
須のＲＢ１１であり、ネガティブコントロールとして役立つ。

【０２４５】 ＣＴＡＢでの処理後に、４０倍（２０倍）から１１０倍のＩＬ−１ｒａ濃度の
増加が、単一配列を有さない構築物を含む、菌株の上清において検出された。Ｃ
ＴＡＢで処置したＭＦα−菌株に関して、ＩＬ−１ｒａ濃度のより低い増加（２
倍〜５倍）が測定された。

【０２４６】 （結果２０） これらの結果を、表１６に要約した。

【０２４７】

【表１８】 表１６：ＹＰ／グリセロール／メタノール中でのＣＴＡＢとの実験 Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中での４６時間の培養後の上清 Ｂ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢ
なしで２４時間インキュベートした後の上清 Ｃ：ＹＰ／グリコール／メタノール中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢな
しで２４時間インキュベートした後の滅菌濾過した上清。 ＊注釈 菌株ＡＬ９／２の上清中のこのＩＬ−１ｒａ濃度は、通常低かった。第４の実施
形態において、０．６と０．７μｇ／ｍＬとの間の濃度が検出された。低い収率
の理由は、公知ではない。

【０２４８】 （実施例２１） （（ｂ）ＹＮＢ／１％のグリセロール＋０．１ＭのＮａＰｉ ｐＨ６．０中で
の培養） ＣＴＡＢでのさらなる実験にために、シグナル配列を有さない３種の異なる構
築物を含む３種の菌株を、選択した（菌株４−１７；ＡＬ９／２；ＩＩ３−１）
。

【０２４９】 ４５ｍＬの培地を、５ｍＬのＹＰＤプレ培養で播種し、そして３７℃、１６０
ｒｐｍで培養した。２８時間培養した後、１％（ｖ／ｖ）のメタノールを添加し
、そして３７℃、１６０ｒｐｍで１８時間さらにインキュベートした。

【０２５０】 このＯＤ_600nmを測定して、必要であるＣＴＡＢの量を計算した。上清（ＳＮ
）のアリコートおよび３ｍＬの培地の細胞ペレットを取り出した。細胞を機械的
に破壊した後、可溶なフラクション（ＣＸ）を単離した。 → これらの状態のＳＮを、Ａと命名した。

【０２５１】 これらの状態のＣＸを、Ｄと命名した。

【０２５２】 これらの培養物の同一の体積（２０ｍＬ）を、２個の振とうフラスコにアリコ
ートした。２０ｍＬの培地に、０．００３ｇのＣＴＡＢを補充した。培地のイン
キュベーション：２４時間、４℃（振とう無し）。 → これらの状態のＳＮを、Ｃと命名した。

【０２５３】 これらの状態のＣＸを、Ｆと命名した。

【０２５４】 ＣＴＡＢを含まない第２の振とうフラスコを、ＣＴＡＢ−フラスコとして同一
の条件下でインキュベートし、そして参照培地として利用した。 → これらの状態のＳＮを、Ｂと命名した。

【０２５５】 これらの状態のＣＸを、Ｅと命名した。

【０２５６】 全ての場合において、ＣＴＡＢでのインキュベーションは、上清のＩＬ−１ｒ
ａ濃度の有意な増加（１００〜１３０倍）に導いた。

【０２５７】 （結果２１） ２種の培地において培養した後の、ＣＴＡＢ実験のＥＬＩＳＡ結果を、以下の
表１７において比較する。

【０２５８】

【表１９】 表１７：ＹＰ／グリセロール／メタノールおよびＹＮＢ／グリコール／メタノー
ル中でのＣＴＡＢでの比較 Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール（またはＹＮＢ／グリセロール／メタノー
ル）中での４６時間の培養後の上清 Ｂ：ＹＰ／グリセロール／メタノール（またはＹＮＢ／グリセロール／メタノー
ル）中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートし
た後の上清 Ｃ：ＹＰ／グリセロール／メタノール（またはＹＮＢ／グリセロール／メタノー
ル）中での４６時間の培養、次いで、ＣＴＡＢなしで２４時間インキュベートし
た後の滅菌濾過した上清。

【０２５９】 （実施例２２） （異なるインキュベーション条件の試験） ＹＰ／グリセロール／メタノール中で培養した菌株ＩＩ ３／１（１．ａを参
照のこと）について、ＣＴＡＢの添加後に異なるインキュベーション条件を試験
した。 条件： ＞２４時間 ＣＴＡＢ；４℃ 振盪なし（「標準的」条件） ＞２４時間 ＣＴＡＢ；４℃ 緩やかに振盪 ＞２４時間 ＣＴＡＢ；３７℃ 振盪なし ＞２４時間 ＣＴＡＢ；３７℃ 緩やかに振盪 （結果２２） 上清中のＩＬ−１ｒａの濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、表１
８に要約する。

【０２６０】

【表２０】 Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養後の上清 Ｂ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養し、次いでＣＴＡＢなし
で２４時間インキュベートした後の上清 Ｃ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養し、次いでＣＴＡＢと共
に２４時間インキュベートした後の滅菌濾過上清。

【０２６１】 上清におけるＩＬ−１ｒａの最も高い増加は、振盪なしで３７℃でＣＴＡＢイ
ンキュベーション後（７６倍）、および振盪なしで４℃でＣＴＡＢインキュベー
ション後（４９倍）で測定された。

【０２６２】 最も高いＩＬ−１ｒａの濃度は、３７℃で検出されたが、ＣＴＡＢなしでイン
キュベートした参照サンプルにおける濃度もまた、増加した（１６倍）。参照サ
ンプルにおける高い濃度は、細胞の溶解によって引き起こされ得る。 ＝＞最良の条件：４℃（細胞の溶解を回避するため）振盪なし。

【０２６３】 （実施例２３） （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットおよびクマシー染色） 振盪フラスコ実験から単離された粗抽出物の上清および可溶性画分を、還元条
件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。 ゲル：１６％Ｎｏｖｅｘ−ｇｅｌ ＴＧ １ｍｍ；還元条件 コロイド状クマシー染色（ＢＩＯ−ＳＡＦＥ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ，Ｂｉ
ｏｒａｄ） サンプル：Ａ：ＹＰ／グリセロール／メタノール中で４６時間培養後の上清 Ｂ：ＣＴＡＢを含まない参照上清 Ｄ：粗抽出物の可溶性画分（ＣＸ） １：３希釈 Ｅ：参照培養物の粗抽出物の可溶性画分（ＣＸ） １：３希釈 Ｆ：ＣＴＡＢ処理後の粗抽出物の可溶性画分（ＣＸ） １：３希釈。

【０２６４】 （結果２３） （＊ＷＢ３３およびＣｏｏ２） 菌株： ４〜１７ｐＦＰＭＴ ｉｃＩＬ １ｒａＩ Ａｌ ９／２ｐＦＰＭＴ ｉｃＩＬ １ｒａＩ＋Ａｌ ＣＴＡＢ：２４時間インキュベーション；４℃、振盪なし。

【０２６５】 ウエスタンブロット（ＷＢ３３）の結果を、図１２Ａに示す。試験サンプルお
よび添加した量を、図１２Ａについての以下の説明文において示す。

【０２６６】

【表２１】 この結果は、両方の菌株について、ＳＮにおけるＩＬ−１ｒａの増加（レーン
４、レーン９）およびＣＸにおける減少（レーン５、レーン１０）が、ＣＴＡＢ
での処理後に検出されたことを実証する。

【０２６７】 コロイド状のクマシー（Ｃｏｏ２）ブルー染色を、図１２Ｂに示す。この試験
サンプルおよび添加量を、図１２Ｂについての以下の説明文において示す。

【０２６８】

【表２２】 （＊ＷＢ３４およびＣｏｏ３） 菌株： ＭＦα２ ｐＦＰＭＴ ＭＦα ＩＬ−１ｒａＩ ＭＦαＡＬ ７／１ｐＦＰＭＴ ＭＦα ＩＬ−１ｒａＩ＋Ａｌ ＣＴＡＢ：２４時間インキュベーション；４℃、振盪なし。

【０２６９】 ウエスタンブロット（ＷＢ３４）の結果を、図１３Ａに示す。試験サンプルお
よび添加した量を、図１３Ａについての以下の説明文において示す。

【０２７０】

【表２３】 この結果は、ＣＴＡＢでの処理後に、細胞内および分泌されたＩＬ−１ｒａの
混合物が、レーン４および９において上清Ｃにおいて検出されたことを示す。 ＭＦα２：細胞内ＩＬ−１ｒａ由来の〜２０ｋＤａおよび３４ｋＤａのさらなる
バンド。

【０２７１】 ＭＦα７／１： 細胞内ＩＬ−１ｒａ由来の１７ｋＤａ未満のさらなるバンド 増加した１８ｋＤａシグナルの強度 コロイド状クマシー（Ｃｏｏ３）結果を図１３Ｂに示す。

【０２７２】 添加された試験サンプルおよび量を、図１３Ｂに対する以下の説明文に示す。

【０２７３】

【表２４】 （ＷＢ３５およびＣｏｏ４） 株：ＩＩ３／１ｐＦＰＭＴ ｉｃＩＬ−１ｒａ ＩＩ型 ＣＴＡＢの添加後の異なったインキュベーション条件： ２４時間ＣＴＡＢ、４℃、浸透せず（「標準条件」） ２４時間ＣＴＡＢ、３７℃、浸透せず ウエスタンブロット（ＷＢ３５）結果を図１４Ａに示す。

【０２７４】 添加された試験サンプルおよび量を図１４Ａに対する以下の説明文に示す。

【０２７５】

【表２５】 コロイド状クマシー（Ｃｏｏ４）結果を図１４Ｂに示す。

【０２７６】 添加された試験サンプルおよび量を、図１４Ｂに対する以下の説明文に示す。

【０２７７】

【表２６】 ４℃および３７℃におけるＣＴＡＢのインキュベーション後、ＳＮにおけるＩ
Ｌ−１ｒａの増加（ＷＢ３５：レーン４、レーン８）の増加およびＣＸにおける
減少（ＷＢ３５：レーン５、レーン９）が検出されたことを、この結果は実証す
る。

【０２７８】 ＳＮ ＣＴＡＢ ３７℃（レーン８）において、最も多い量のＩＬ−１ｒａＩ
Ｉを得た。この結果は、ＥＬＩＳＡ結果と一致している（表３を参照のこと）。

【０２７９】 この上清において、より多くのＩＬ−１ｒａＩＩだけでなく、より多くの他の
タンパク質（３５ｋＤａを超える）が染色された（Ｃｏｏ４：レーン８）。この
観察は、４℃と比較して３７℃で有意な細胞溶解が発生するという仮定を確かめ
た。

【０２８０】 （考察） Ｃｈｏｎｄｒｕｓ ｃｒｉｓｐｕｓ ＨＯＸ遺伝子のコドン用法（Ｓｔｏｕｇ
ａａｒｄおよびＨａｎｓｅｎ １９９６、ＨａｎｓｅｎおよびＳｔｏｕｇａａｄ
，１９９７）は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ宿主生物体のより頻繁に使用されたコドン
のコドン用法と、低使用コドンとの置換によって改変された。ＨＯＸの発現のた
めのコドン至適化されたＨＯＸ ＤＮＡフラグメントを含む酵母、Ｈａｎｓｅｎ
ｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、発現系（Ｒｈｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｄｕｓ
ｓｌｄｏｒｆ／ドイツで開発された）の形質転換体を調製した。

【０２８１】 ＨＯＸ酵素をコードする遺伝子のコドン至適化は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈａ酵母宿主生物体におけるＨＯＸ酵素の高レベルの発現（高レベ
ルの酵素活性の点から）を生じた。シグナル配列が存在しない場合、ＨＯＸ酵素
は、細胞内に局在化される。しかし、多数の異なったシグナル配列が異なった構
築物において使用される場合でさえ、少しのＨＯＸ活性が細胞外培地において測
定され得たか、または全く活性が測定され得なった。これらの結果は、ＨＯＸ酵
素が、シグナル配列を含むＨＯＸ酵素を発現する宿主株からでさえ分泌され得な
いことを示す。ウエスタンブロットはまた、シグナル配列が存在する場合でさえ
、ＨＯＸ酵素が膜結合画分中に局在化し得ることを確認し、ＨＯＸ遺伝子の転写
および翻訳が存在するが、ＨＯＸ酵素は分泌されずそして分泌経路にとどまって
いるようであることを示す。

【０２８２】 本発明の方法を使用する細胞内酵素学的に活性なＨＯＸ酵素は、他のイオン性
／非イオン性界面活性剤および乳化剤を使用して、伝統的な細胞破壊方法および
抽出方法と比較された。プロテアーゼおよび塩と界面活性剤との組み合わせがま
た、調べられた。

【０２８３】 （要約） 本発明の１つの広範な局面において、目的の可溶性かまたは膜結合細胞内タン
パク質（ＰＯＩ）を放出する方法が提供され、この方法は、以下の工程：可溶性
かまたは膜結合細胞内ＰＯＩを含む細胞を提供する工程；膜抽出組成物と細胞を
接触させる工程；およびＰＯＩの放出に十分な条件下でおよび可溶性形態で、Ｐ
ＯＩを細胞から放出させる工程を包含する。

【０２８４】 本発明の別の広範な局面において、目的の可溶性かまたは膜結合細胞内タンパ
ク質（ＰＯＩ）を特異的に放出する工程が提供され、この方法は、以下の工程：
可溶性かまたは膜結合細胞内ＰＯＩを含む細胞を提供する工程；膜抽出組成物と
細胞を接触させる工程；およびＰＯＩの放出について十分な条件下で細胞から放
出されるが、他の混入したタンパク質の放出に不十分である工程を包含する。

【０２８５】 上記の明細書中で述べられた全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用さ
れる。本発明の記載された方法および系の種々の改変およびバリエーションは、
本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は
、特定の好ましい実施形態と関連して記載されているが、要求されるような本発
明が、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解さ
れるべきである。確かに、分子生物学または関連した分野における当業者に明ら
かである本発明を実施するために記載されたモデルの種々の改変は、以下の特許
請求の範囲内であることが意図される。

【０２８６】 （参考文献）

【０２８７】

【表２７】 本発明は、以下の図面を参照して、例示の目的でのみ説明される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、遺伝子構築物を提供する。

【図２Ａ】 図２Ａは、遺伝子構築物を提供する。

【図２Ｂ】 図２Ｂは、写真図を提供する。

【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、写真図提供する。

【図４】 図４は、グラフを提供する。

【図５】 図５は、配列表を提供する。

【図６】 図６は、配列表を提供する。

【図７】 図７Ａ−Ｄは、写真図を提供する。

【図８】 図８は、グラフを提供する。

【図９】 図９は、グラフを提供する。

【図１０】 図１０Ａ−Ｂは、写真図を提供する。

【図１１】 図１１Ａ−Ｂは、写真図を提供する。

【図１２】 図１２Ａ−Ｂは、写真図を提供する。

【図１３】 図１３Ａ−Ｂは、写真図を提供する。

【図１４】 図１４Ａ−Ｂは、写真図を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マドリッド， スーザン マムプスティ デンマーク国 デーカー−2950 ヴェドベ ーク， エレフォルデン ７ (72)発明者 ペデルセン， ヘンリク デンマーク国 デーカー−8752 エストビ ルク， ヤディングヴェイ 11 (72)発明者 ポウルセン， シャルロット オールスマ ンス デンマーク国 デーカー−8220 ブレバン ド， ラングダルスヴェイ 37 (72)発明者 ザルガヒ， マスード ラヤビ デンマーク国 デーカー−8230 オービヘ イ， カスタニエ アレー ９ベー Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 BA80 CA04 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 HA11 HA15 4B050 CC03 CC04 DD01 FF01 FF02 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ05 QQ42 QQ52 QQ79 QR33 QR59 QR74 QR80 QS05 QS14 QS33 QS36 QX02 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 CE08 CE11 DA13 DA20 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA00 EA50 FA72 FA74 GA01

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞から可溶性または膜結合性の細胞内の目的タンパク質（
   ＰＯＩ）を放出するための方法であって、以下の工程： 可溶性または膜結合性の細胞内のＰＯＩを含む細胞を提供する工程； 該細胞を膜抽出組成物と接触させることによって、該細胞から該ＰＯＩを放出
   する工程；および 該ＰＯＩの特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態で、該ＰＯＩを該細胞
   から放出させる工程、 を包含し、該放出されたＰＯＩが機械的手段によって抽出された場合よりも高い
   比活性を、該放出されたＰＯＩが有する、方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、前記細胞が形質転換された
   細胞である、方法。
3. 【請求項３】 形質転換細胞からＰＯＩを放出させるための請求項１または
   請求項２に記載の方法であって、該ＰＯＩがＨＯＸ酵素であり、該方法は、以下
   の工程： ＨＯＸ酵素を含む形質転換細胞を提供する工程； 該形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；および 該ＨＯＸ酵素の特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態で、該ＨＯＸ酵素
   を該形質転換細胞から放出させる工程、 を包含する、方法。
4. 【請求項４】 形質転換細胞からＰＯＩを放出させるための方法であって、
   該ＰＯＩがインターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）であ
   り、該方法は、以下の工程： ＩＬ−１ｒａを含む形質転換細胞を提供する工程； 該形質転換細胞を膜抽出組成物と接触させる工程；および 該ＩＬ−１ｒａの特異的放出に十分な条件下でかつ可溶性形態で、該ＩＬ−１
   ｒａが該形質転換細胞から放出させる工程、 を包含する、方法。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、
   前記細胞が、酵母細胞、真菌細胞および細菌細胞からなる群より選択され、好ま
   しくは酵母細胞および真菌細胞から選択される、方法。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、
   前記細胞内ＰＯＩが、組換えＤＮＡ技術によって産生される、方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、
   前記膜抽出組成物が、四級アンモニウム化合物を含む、方法。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法であって、
   前記四級アンモニウム化合物が、ラウロイルトリメチルアンモニウムブロミド（
   ＬＴＡＢ）、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＭＴＡＣ）、セチル
   トリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、セトリミド、セチルトリメチル
   アンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ステアロイルトリメチルアンモニウムクロ
   リド（ＳＴＡＣ）、ステアロイルトリメチルアンモニウムブロミド（ＳＴＡＢ）
   、塩化ベンザルコニウム（アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド）、
   Ｎ−セチルピリジニウムブロミド（Ｎ−ヘキサデシルピリジニウムブロミド）、
   Ｎ−セチルピリジニウムクロリド（Ｎ−ヘキサデシルピリジニウムクロリド）、
   ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサ
   デシルアンモニウムクロリドおよびこれらのうちの任意の２つ以上の組み合わせ
   からなる群より選択される、方法。
9. 【請求項９】 請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の方法であって、
   前記膜抽出組成物が、約０．０５重量％〜約０．６重量％の前記四級アンモニウ
   ム化合物を含み、好ましくは約０．１重量％〜約０．５重量％の前記四級アンモ
   ニウム化合物を含み、好ましくは約０．２重量％〜約０．４５重量％の前記四級
   アンモニウム化合物を含み、より好ましくは約０．４重量％の前記四級アンモニ
   ウム化合物を含む、方法。
10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、前記
    細胞が、温度約４℃〜４０℃、好ましくは約２０℃〜約３０℃、より好ましくは
    約２５℃で、前記膜抽出組成物と接触される、方法。
11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前
    記細胞が、ｐＨ約２．０〜約１１．０（より特には約５．０〜約７．０、より特
    には約６．３）で、前記膜抽出組成物と接触される、方法。
12. 【請求項１２】 上昇したレベルの可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを
    産生する変異細胞または形質転換細胞についてスクリーニングするための方法で
    あって、以下の工程： （ａ）該変異細胞を３０℃で増殖させる工程； （ｂ）該変異細胞または形質転換細胞を、請求項７または請求項８に規定され
    るような膜抽出組成物とともにインキュベートする工程； （ｃ）前記細胞フリー培地を回収する工程； （ｄ）上昇したレベルの該細胞内ＰＯＩについて該細胞フリー培地をスクリー
    ニングする工程； を包含し、該細胞フリー培地中の該細胞内ＰＯＩの存在が、該細胞内ＰＯＩが放
    出されたことを示す、方法。
13. 【請求項１３】 可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを特異的に放出する
    ために適切な、膜抽出組成物であって、該組成物は、以下の条件： （ａ）四級アンモニウム化合物の重量パーセンテージ約０．０５％〜約０．６
    ％（より特には約０．１％〜約０．５％、より特には約０．２％〜約０．４５％
    、より特には約０．４％）； （ｂ）ｐＨ約２．０〜約１１．０（より特には約５．０〜約７．０、より特に
    は約６．３）； （ｃ）温度約４℃〜４０℃（より特には約２０℃〜約３０℃、より特には約２
    ５℃）； の下で、細胞と接触させられ、混入タンパク質を実質的に含まない細胞内ＰＯＩ
    が得られる、組成物。
14. 【請求項１４】 可溶性または膜結合性の細胞内ＰＯＩを選択的に放出する
    ための、四級アンモニウム化合物を含む膜抽出組成物の使用。
15. 【請求項１５】 請求項１〜１４のうちのいずれか１項に記載の方法であっ
    て、前記ＰＯＩがＨＯＸ酵素である、方法。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法であって、前記ＨＯＸ酵素が、配
    列番号２２に示されるアミノ酸配列、あるいはその改変体、ホモログ、誘導体ま
    たはフラグメントを含む、方法。
17. 【請求項１７】 請求項１５または請求項１６に記載の方法であって、前記
    ＨＯＸ酵素が、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列、あるいはその改変体
    、ホモログ、誘導体またはフラグメントによりコードされる、方法。
18. 【請求項１８】 請求項１５または請求項１６または請求項１７に記載の方
    法であって、前記ＨＯＸ酵素が、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列、あ
    るいはその改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントにハイブリダイズし得
    るヌクレオチド配列によってか、あるいは該ハイブリダイズし得る配列と相補的
    な配列によってコードされる、方法。
19. 【請求項１９】 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法によって生成
    可能なＨＯＸ酵素であって、該ＨＯＸ酵素は、請求項１６〜１８のうちのいずれ
    か１項にて規定されるようなヌクレオチド配列によりコードされ、そして該ヌク
    レオチド配列は、配列番号２〜２２に示されるようなオリゴヌクレオチドによっ
    て合成される、ＨＯＸ酵素。
20. 【請求項２０】 請求項１またはそれに従属する任意の請求項にて規定され
    るようなＰＯＩであって、該ＰＯＩが、真核生物宿主生物から実質的に非グリコ
    シル化形態で放出される、ＰＯＩ。
21. 【請求項２１】 真核生物宿主生物から放出された、実質的に非グリコシル
    化されたＰＯＩ。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の実質的に非グリコシル化されたＰＯＩ
    であって、該ＰＯＩは、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の方法によ
    って放出される、ＰＯＩ。
23. 【請求項２３】 実質的には、本明細書中および添付の図面を参照して記載
    されるような、方法および組成物。