JP6778867B2 - ポリペプチド抽出方法 - Google Patents
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[1]酵母と、界面活性剤とを含有する水溶液とを接触させて静置又は撹拌することを特徴とする酵母からポリペプチドを抽出する方法であって、水溶液のpHが6.1〜13.0である方法。
[2]水溶液が、0.1〜3%の界面活性剤を含有することを特徴とする上記[1]記載の方法。
[3]界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、又はポリエチレングリコール−p−オクチルフェニルエーテルであることを特徴とする上記[1]又は[2]記載の方法。
[4]水溶液のpHが7.0〜10.5であることを特徴とする上記[1]〜[3]のいずれか記載の方法。
[5]ポリペプチドがタンパク質であることを特徴とする上記[1]〜[4]のいずれか記載の方法。
[6]タンパク質が、親水性タンパク質であることを特徴とする上記[5]記載の方法。
赤色蛍光タンパク質を発現するサッカロマイセス・セレビシエを培養し、様々な水溶液による酵母からの赤色蛍光タンパク質の抽出を行った。
pH4,5,6:20.9gのMOPSを約80mLの水に溶解し、pHを測定しながらNaOHで各pHに調整した。調整後、100mLにメスアップして1M MOPS緩衝液を得た。使用時に、900μLの蒸留水に100μLの前記1M MOPS緩衝液を加えて0.1M MOPS緩衝液を調整した。
pH7,8,9,10:12.1gのTrizma Base(シグマアルドリッチ社製)を約80mLの水に溶解し、pHを測定しながらHClで各pHに調整した。調整後、100mLにメスアップして1M Tris−HCl緩衝液を得た。使用時に、900μLの蒸留水に100μLの前記1M Tris−HCl緩衝液を加えて0.1M Tris−HCl緩衝液を調整した。
pH10.5:12.1gのTrizma Baseを水に溶解し100mLにメスアップして1M Tris溶液を得た。使用時に、900μLの蒸留水に100μLの前記1M Tris溶液を加えて、0.1M Tris溶液を調整した。
250mL容量のバッフル付三角フラスコに、酵母用培地(国際公開第2014/030774号パンフレット)においてウラシルを欠損させた培地50mLを用意し、かかる培地にyEmRFP−6HISを発現するサッカロマイセス・セレビシエRAK12987を植菌した。サッカロマイセス・セレビシエRAK12987はサッカロマイセス・セレビシエBY4741株にyEmRFP−6HIS遺伝子を含むサッカロマイセス・セレビシエの2μmプラスミドを導入して作製した。かかるサッカロマイセス・セレビシエRAK12987を30℃のインキュベータ内で150rpmの速度で1日振とう培養した。培養液1mLを1.5mLチューブに移して12000rpm 5分遠心し、上清を捨てて集菌した。集菌した菌体に上記で調整した各pHのMOPS緩衝液、Tris−HCl緩衝液、又はTris溶液を洗浄液として加えて撹拌し、その後洗浄液を除去して菌体を洗浄し、さらに再度各pHのMOPS緩衝液、Tris−HCl緩衝液、又はTris溶液を300μL加え、撹拌後に50℃で30分静置した。なお、RFPは分子量27000の親水性赤色蛍光タンパク質である。また、コントロールとして、蒸留水(DW)を用いて同様の操作を行った。結果を図1に示す。
界面活性剤を含有する緩衝液又は溶液を用いて、酵母からの赤色蛍光タンパク質の抽出を試みた。
蒸留水400μLに上記で調整した1Mの各pHの緩衝液又は溶液を50μL、10%Triton X−100(和光純薬工業社製)を50μL加えて1%Triton X−100含有0.1M各pHの緩衝液又は溶液を調整した。
緩衝液又は溶液として1%Triton X−100含有0.1M各pHの緩衝液又は溶液、1%NP−40含有0.1M各pHの緩衝液又は溶液、又は1%Tween−20含有0.1M各pHの緩衝液又は溶液を用いた以外は、上記と同様の方法でサッカロマイセス・セレビシエRAK12987の培養、集菌、及び緩衝液又は溶液を加えた後の静置を行った。なお、コントロールとして、1%Triton X−100、1%NP−40、又は1%Tween−20含有蒸留水を用いて同様に操作を行った。
実施例1において、上記1%Triton X−100、1%NP−40を含有するpH8の緩衝液又はpH10.5の溶液を用いて抽出したタンパク質をSDS−PAGEによって解析した。
実施例1において、1%Triton X−100、1%NP−40を含有するpH8の緩衝液又はpH10.5の溶液を用いて抽出したタンパク質をNative−PAGEによって解析した。
水溶液として1%Triton X−100含有0.1M Tris溶液を用い、抽出温度及び時間を検討した。
250mL容量のバッフル付三角フラスコにAYD−U培地(50mL)を用意し、そこにyEmRFP−6HISを発現するサッカロマイセス・セレビシエK7を植菌した。サッカロマイセス・セレビシエK7はRAK2359(Ano, A. et al., Biosci. Bioethanol. Biochem., 73(3):633-640(2009))にyEmRFP−6HIS遺伝子を含むサッカロマイセス・セレビシエの2μプラスミドを導入して作製した。かかるサッカロマイセス・セレビシエK7を30℃のインキュベータ内で150rpmの速度で1日振とう培養した。培養液1mLを1.5mLチューブに移して集菌した。集菌した菌体を上記0.1M Tris溶液で洗浄した後、1%Triton X−100含有0.1M Tris溶液を300μL加え、撹拌後に4、30、50、70℃については30分又は一晩(O/N:24時間)、さらに80、90℃については30分静置した。結果を図7に示す。
図7に示すそれぞれのTris溶液の上清について、上記と同様の方法でSDS−PAGEによって解析した。結果を図8に示す。
実施例1においてはサッカロマイセス・セレビシエを用いたが、クルイベロマイセス・マルシアヌスを用いても同様にタンパク質を抽出できるかを調べた。
microscope (Carl Zeiss社製)を用い、100ミリ秒で設定して撮影した。結果を図13に示す。
Claims (5)
- 酵母と、0.1〜3%のエーテル系界面活性剤を含有する水溶液(NaCl、KCl、NaNO3、KNO3、又はNa2SO4を0.25M以上含有する水溶液、及びN,N−dimethyltetradecylamineを含有する水溶液を除く)とを接触させて静置又は撹拌することを特徴とする、酵母を物理的に破壊することなく酵母の細胞膜内からポリペプチドを抽出する方法であって、水溶液のpHが6.1〜13.0であり、酵母を凍結させる工程を含まない方法。
- 界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、又はポリエチレングリコール−p−オクチルフェニルエーテルであることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 水溶液のpHが7.0〜10.5であることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
- ポリペプチドがタンパク質であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の方法。
- タンパク質が、親水性タンパク質であることを特徴とする請求項4記載の方法。
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