KR20080070678A - 결합 효소 시스템을 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 과산화수소(hydrogen peroxide)의 빠르고 효과적인 생산을 위한 결합 효소 시스템을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 이는 과산화수소를 발생시킬 수 있는 첫 번째 효소 시스템을 첫 번째 효소 시스템의 비-과산화수소 생성물을 이용하고 선택적으로 추가로 과산화수소를 발생시킬 수 있는 두 번째 효소 시스템에 결합시켜 이루어진다.
과산화수소, 효소, 시스템

Description

결합 효소 시스템을 포함하는 조성물 {A COMPOSITION COMPRISING A COUPLED ENZYME SYSTEM}
본 발명은 과산화수소의 빠르고 효과적인 생산을 위한 결합 효소 시스템을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 이는 과산화수소를 발생시킬 수 있는 첫 번째 효소 시스템을 첫 번째 효소 시스템의 비-과산화수소 생성물을 이용하고 선택적으로 추가로 과산화수소를 발생시킬 수 있는 두 번째 효소 시스템에 결합시켜 이루어진다.
치아의 구강 악취 및 변색은 많은 사람을 고통스럽게 한다. 또한, 구강 악취는 입냄새 또는 구취로서 알려져 있다. 일반적으로 이러한 원인은 입안의 혐기성 세균, 특히 그램-음성 혐기성 세균이 존재하기 때문이다. 이러한 박테리아는 악취를 유발하는 것으로 알려진 휘발성 황 화합물(volatile sulphur compounds(VSC))을 생산한다.
치아 플라그는 치아 상에 생성되는 노란색의 바이오 필름이다. 만약 정기적으로 제거하지 않는다면, 치아 구멍(충치), 잇몸염 및 치주염을 일으키고 결국 치아를 잃게 된다. 바이오 필름을 형성하는 미생물은 거의 박테리아이며, 입안에 존재하는 위치에 따라 다양한 조성을 갖는다. 치주염은 치아를 둘러싸고 있는 매몰 및 지지 조직(즉, 치아인대, 잇몸 및 치조골)인 치주에 영향을 미친다. 잇몸염과 치주염은 각각 잇몸과 깊은 치주 조직의 염증 질환이다.
오늘날 소비자들은 치아를 하얗게 하는데 매우 관심이 있다. 하얀 치아를 가진 사람들은 더 큰 자신감과 사회 적응력이 있는 것으로 생각된다. 치아는 내부 상아질 층과 외부의 단단한 에나멜 층으로 구성된다. 에나멜 층은 내부 상아질 층과 생조직을 보호하고, 고체 음식을 씹기 위한 접촉 표면으로서 작용한다. 일반적으로 에나멜 층은 반투명의 약한 흰색을 띈다. 또한, 이것은 에나멜을 함유하는 히드록시아파타이트(hydroxy apatite) 결정이 사이사이 초소형의 구멍 또는 채널을 갖는 미시적인 6각형의 막대 또는 프리즘을 형성하기 때문에 다공성으로 알려져 있다. 이러한 다공성 구조 때문에, 항생제, 착색 물질을 함유하는 음식, 커피, 콜라, 차, 담배 등과 같은 착색제 및 변색 물질은 에나멜을 침투하여 표면을 변화시켜 황색 또는 갈색을 나타내게 한다.
치약으로 치아를 닦음으로써 유지되는 좋은 구강 위생 상태는 착색, 잇몸염, 플라그. 치주염 및/또는 악취의 발생을 감소시키는데 도움을 줄 수 있지만, 이들의 발생을 반드시 예방하거나 제거하지는 않는다. 미생물은 잇몸염, 플라그, 치주염 및/또는 악취의 발생과 진행 모두에 관여한다. 따라서, 이러한 상태를 예방 또는 치료하기 위해서는 이들 미생물이 단순한 기계적인 세척 외의 다른 방법에 의해 억제되어야한다. 추가로, 단순한 기계적인 손질은 완전히 모든 착색을 제거시키거나/제거시키고 치아를 하얗게 만드는 것은 아니다.
EC 클래스 1.1.3.에 속하는 효소는 수용체로서 산소를 이용하는 산화환원효 소(oxidoreductases)이고, CH-OH기는 공여체이다. 항균 효과가 있는 과산화수소를 발생하는 이러한 산소 산화환원효소의 능력은 JP-B-73/016612에 기재된 것처럼 치즈, 버터 및 과일 쥬스를 포함하는 특정 식품의 보존 안정성을 향상시키는데 사용되었다. 또한, 산화환원효소는 식품에서 산소 제거제 또는 항산화제로서 잠재적으로 이용될 수 있음이 제시되었다. 산화환원효소(들)를 포함하는 치아 표백 조성물이 US 6,379,653에 개시되었는데, 치아 표백은 글루코스 옥시다제로 처리하였다. 글루코스 옥시다제는 당에 매우 특이적이고, 구강에서 충치를 일으키는 화합물로 분해되는 우식원성(cariogenic) 당의 존재를 필요로 한다.
WO97/06775는 최소 하나의 산화환원효소를 포함하는 구강 조성물을 개시하고 있다. WO97/06775의 산화환원효소는 E.C. 1.1.3, E.C. 1.2.3, E.C. 1.3.3, E.C. 1.4.3, E.C. 1.5.3, E.C. 1.7.3, E.C. 1.8.3, E.C. 1.9.3을 포함하는 옥시다제, E.C. 1.10.3에 속하는 락카제 및 관련 효소, 및 E.C. 1.11.의 퍼옥시다제를 포함하는 효소 클래스 내의 효소를 포함한다. 아미노산, 알코올, 크실리톨 및 소르비톨과 같은 당알코올과 같은 우식원성이 아닌 기질이 산화환원효소의 적절한 기질로서 생각된다. 고려되는 특정 크실리톨 옥시다제는 JP 80892242에 기재된 크실리톨 옥시다제이고, 이는 산소 존재 하에서 크실리톨, D-소르비톨, D-갈락티톨, D-만니톨 및 D-아라비니톨을 산화시키는 것으로 알려져 있다.
치약, 구강세척제 및 치분(dentifrice)과 같은 구강 조성물 내에 특정 산화 효소의 함유는 플라그와 잇몸염을 감소시킬 수 있다. 이러한 활성 성분으로 사용될 수 있는 효소는 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase) 및 글루코스 옥시다제를 포 함한다. 이들 효소는 침의 락토퍼옥시다제(lactoperoxidase)의 존재 하에서 티오시안산염(thiocyanite)을 하이포티오시안산염(hypothiocyanite)으로 변화시키는 식이 발표 탄수화물로부터 과산화수소를 생성한다. 생성된 하이포티오시안산염은 세포 대사를 방해함으로써 세균 억제제로서 작용한다. 소르비톨 옥시다제는 스트렙토미세스 종(Streotomyces sp ) 유래 소르비톨 옥시다제의 클로닝과 발현을 기재하고 있는 Hiraga K. 등의 "Molecular cloning and expression of a gene encoding a novel sorbitol oxidase from Streptomyces sp. H-7775."; Biosci. Biotechnol. Biochem. 62:347-353(1998)로부터 알려져 있다.
식품 소비를 위한 대부분의 당 대체물은 인공적으로 합성된 화합물이다. 하지만, 몇몇 천연 당 대체물이 알려져 있는데 소르비톨 및 크실리톨을 포함하며, 이는 베리, 과일, 야채 및 버섯에 포함되어 있다. 비록 천연일지라고, 이것들은 생산 단가를 줄이기 위하여 대량 식품 생산에서 합성될 수 있다. 크실리톨과 소르비톨 모두 치약과 츄잉검과 같은 구강 케어 조성물에 단맛을 내기 위해 이용될 수 있고, 크실리톨의 경우에는 젖산 생성을 감소시키고 침 생성을 증가시키기 위해 사용된다(Hayes C. J Dent Educ . 65(10): 1106-1109 2001).
잇몸염, 플라그, 치주염, 및/또는 구취의 치료 및/또는 예방 및/또는 치아를 희게 하는데 유용한 조성물을 개발하기 위하여 많은 연구가 수행되었지만, 이를 치료할 수 있는 또 다른 유효한 조성물 및 방법이 여전히 요구된다.
세탁 및 설거지용 세제는 다양한 종류의 성분 복합 혼합물로 이루어져 있으며, 일반적으로 이온 및 비이온 계면활성제, 용매, 세척강화제, 향료, 효소, 표백 성분과 같은 수많은 성분을 포함한다. 이러한 복합 혼합물에 있어서, 보존 안정성 문제, 특히 효소에 대한 문제가 잘 알려져 있다. 몇몇 경우에는 안정성 문제는 세제의 물리적 안정성과 관련이 있으나, 다른 경우에는 세제 내 각 성분의 기능적 안정성과 관련이 있다. 과탄산염(percarbonate) 및 과붕산염(perborate)과 같은 표백제는 분말 세제에 흔히 이용되고, 표백 활성제(예, 테트라 아세틸에틸렌디아민(TAED) 및 노나노일옥시벤젠술포네이트(NOBS))와 함께 작용하여 과산(예, 과초산(peracetic acid), 과산화수소, 및/또는 세척시 물 추가에 따른 다른 관련 물질을 생산한다. 그 후, 과산 또는 다른 활성 산소 물질은 섬유 또는 접시의 특정 얼룩을 표백하거나 밝게 한다. 하지만, 수성 액체 제제에 사용될 수 있는 이상적인 표백 시스템은 없다. 게다가, 얼룩을 표백 및/또는 밝게 하기 위해 세탁 세척액의 세제 희석에 따라 표백제(예, 활성 산소, 과산화물, 및 과산)의 생산이 필요하게 되었다
옥시다제와 같은 효소는 액체 세제 제제에서 보관 안정성 문제에 대해 특히 민감하다. 이러한 문제점은 표백 작용이 있는 섬유 및 집안 세제에 이들의 다양한 사용을 방해한다. 보관시 세제 내에서의 옥시다제 효소 활성 유지를 위한 시도가 있었으며, 특히 옥시다제 기질 성분을 함유한 세제에서 그러하다. 옥시다제 및 옥시다제 기질 모두의 존재는 과산소(peroxygen) 발생을 바로 유발한다. 이는 액체 및 건조 제제 모두에서의 효소의 산화 때문에 감소된 효소 안정성을 나타낸다. 과산화물은 효소의 특정 아미노산 잔기를 산화시키는 것과 같은 다양한 메커니즘 또는 효소의 보조 인자와의 상호작용에 의하여 효소에 악영향을 미친다. 종종 이는 점차적인 활성 소멸을 유발한다. 건조 세제에 있어서 효소는 예를 들어 WO 96/02623에 기재된 것과 같은 효소 캡슐화에 의해서 안정화될 수 있다 .
발명의 요약
본 발명은 첫 번째 효소, 첫 번째 효소를 위한 기질 및 추가의 효소를 포함하는 조성물, 및 예를 들어 치아, 피부, 머리카락, 직물 또는 종이, 구강 관리 제품을 희게 하고/하거나 표백하기 위한 이들의 용도, 치아의 미백 및/또는 표백 방법, 보존제 및 항균제로서의 용도, 화장품, 세제, 페인트, 식품 및 사료, 식품 및 사료 생산 및 제조 및 살충제에 있어서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명자가 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 효소, 및 폴리올과 같은 첫 번째 기질을 포함하는 과산화수소 발생 시스템이 추가의 효소 시스템, 예를 들어 첫 번째 옥시다제에 의해 생성된 비과산화수소를 이용하고(즉, 두 번째 기질), 임의적으로 추가의 과산화수소를 생성하는 산화환원효소와 같은 추가의 효소 시스템에 연결될 때, 놀라운 상승 작용을 나타냄을 발견한 것을 근거로 한 것이다.
첫 번째 및 두 번째 효소(시스템)의 연결은 첫 번째 효소 시스템으로부터의 과산화수소 생성 효능을 매우 증가시킨다는 것을 밝혀내었고, 첫 번째 및 두 번째 기질 모두로부터 과산화수소의 생성을 유발할 수 있다. 이러한 효과는 상당히 많은 과산화수소의 발생이고, 첫 번째 옥시다제 및 추가의 효소/산화환원효소간의 놀라운 상승 효과로 인한 첫 번째 기질/첫 번째 옥시다제 효소 시스템 단독(또는 추가의 산화화원효소 효소 시스템 단독)으로부터 기대된 것과 비교할 때 과산화수소의 매우 높은 비율이다. 추가의 효소 시스템 연결은 터보차저(turbo-charges)가 달린 첫 번째 옥시다제와 같아서 매우 높은 수준의 과산화수소를 생성시킨다.
바람직하게 첫 번째 효소는 옥시다제이고, 여기에서 첫 번째 옥시다제로 언급된다. 바람직한 옥시다제는 소르비톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제이다.
본 발명은 본 발명 조성물을 포함하는 세제 조성물 뿐만 아니라, 액체 세제 내의 본 발명 조성물을 예를 들어 착색된 음식 얼룩을 표백하고 세척하는데 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 개발하는 동안, 놀랍게도 소르비톨 옥시다제가 표백 시스템 사용에 적합하고 현재 사용되는 표백 시스템의 문제점을 피할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 첫 번째 옥시다제를 추가의 효소에 연결하는 것은 첫 번째 기질에서 고정되었던 산화능력을 모두 이용하도록 하게 한다. 첫 번째 옥시다제는 세제에 있어서 매우 강력한 "키(key)"로서 작용하는 것이고, 여기 언급된 바와 같이, 특히 추가의 산화환원효소에 결합하였을 때, 효과적이고 빠른 과산화수소 표백 효과를 나타낸다.
하나의 양태로서 본 발명은 첫 번째 옥시다제, 첫 번째 기질, 및 산화환원효소를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기에서 첫 번째 기질은 첫 번째 옥시다제에 의해 산화될 수 있고 과산화수소와 두 번째 기질을 생성하고, 두 번째 기질은 산화환원효소에 의해 산화될 수 있고 과산화수소와 생성물을 형성한다.
또 다른 양태로서 본 발명은 본 발명에 따른 조성물과 구강 관리 제품에 사용되는 성분을 함유하는 구강 관리 제품을 제공한다.
추가의 양태로서 본 발명은 본 발명에 따른 조성물과 화장품에 사용되는 하나 이상의 성분을 함유하는 화장품을 제공한다.
추가의 양태로서 본 발명은 본 발명에 따른 조성물과 세제에 사용되는 하나 이상의 성분을 함유하는 세제를 제공한다.
추가의 양태로서 본 발명은 본 발명에 따른 조성물과 페인트 제품에 사용되는 하나 이상의 성분을 함유하는 페인트 제품을 제공한다.
추가의 양태로서 본 발명은 본 발명에 따른 조성물과 살충제 제품에 사용되는 하나 이상의 성분을 함유하는 살충제 제품을 제공한다.
추가의 양태에서 본 발명은 피부, 머리카락 또는 치아와 같은 외부 포유동물 조직을 표백 또는 희게 하는 표백 또는 화이트닝 제품을 제공을 제공하는데, 이러한 제품은 본 발명에 따른 조성물과 외부 포유동물 조직에 사용되기에 적합한 표백 및 화이트닝 제품에 사용되는 성분을 함유한다.
추가의 양태로서 본 발명은 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 포유동물 외부 조직의 표백 및/또는 화이트닝을 위한 제품을 포유동물 외부 조직을 표백 및/또는 화이트닝 하기에 적절한 양과 시간 동안 포유동물 외부 조직과 접촉시키는 것을 포함하는 포유동물 외부 조직의 표백 또는 화이트닝을 위한 화장 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 약제를 제공한다.
또한 본 발명은 과일 쥬스와 같은, 본 발명의 조성물을 포함하는 식음료를 제공한다.
하나의 양태에서, 조성물을 첫 번째 기질을 포함하는 것이 아니라, 첫 번째 기질은 본래 존재하거나 조성물 또는 사용 매트릭스에 추가될 수 있다.
추가로 본 발명은 본 발명에 따른 조성물과 세제 또는 표백제에 사용되는 적어도 하나의 추가 성분을 함유하는 세제 또는 표백제를 제공한다.
추가로 본 발명은 유익한 치아 표백 및/또는 화이트닝 효과, 및/또는 연장된 보관 수명, 및/또는 사용 전 또는 사용기간 동안 항균/항세균 효과를 갖는 구강 관리 제품에서 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다.
추가로 본 발명은 각 포유동물에 의해 소비될 때 유익한 프리바이오틱(prebiotic) 효과, 및/또는 연장된 보관 수명을 갖는 식품에 있어서 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다.
추가로 본 발명은 연장된 보관 수명, 및/또는 포유동물의 외부 조직의 표백 및/또는 화이트닝 및/또는 인간 피부에 적용될 때 항균/항세균 효과가 있는 화장품에 있어서 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다.
추가로 본 발명은 사용 전 또는 후에 향상된 보존상태 및/또는 감소한 항-부착효과(anti-fouling)를 나타내는 페인트에 있어서 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다.
추가로 본 발명은 첫 번째 효소 및 첫 번째 기질, 그리고 최소 하나 이상의 추가의 효소의 혼합물을 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다. 여기에서 첫 번째 기질은 소르비톨 옥시다제와 같은 첫 번째 효소에 의해 산화되어 과산화수소와 두 번째 기질을 형성하고, 두 번째 기질은 최소 하나의 추가의 효소에 의해 변형되어 생성물을 형성한다.
본 조성물은 첫 번째 효소와 적어도 하나의 추가 효소가 혼합된 적절한 매트릭스 성분 또는 성분들을 포함할 수 있다. 또한 첫 번째 기질은 매트릭스 성분 내로 혼합될 수 있으며, 또는 하나의 양태로서 매트릭스 성분의 일부 또는 전체를 형성할 수도 있다. 따라서 매트릭스 성분은 첫 번째 기질로서 이루어지거나 첫 번째 기질을 포함할 수 있다.
추가로 본 발명은 첫 번째 옥시다제 및 첫 번째 기질, 및 회소 하나의 추가 산화환원효소의 혼합물을 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다. 여기에서, 첫 번째 기질은 소르비톨 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소와 두 번째 기질을 생성하고, 두 번째 기질은 산화환원효소에 의해 산화될 수 있으며 과산화수소와 생성물을 형성한다.
추가로 본 발명은 잇몸질환, 잇몸염, 치주염, 과민성 대장 증후군, 락토오스 불내증, 결장암, 고지혈증, 고혈압(high blood pressure), 고혈압(hypertension), 감염증, 염증 및 영양실조;로부터 선택되는 의학 질환의 치료 또는 예방용 약제 제조에 있어서 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가로 본 발명은 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명에 따른 약제 또는 구강 관리 제품을 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 의학 치료 방법을 제공한다.
추가로 본 발명은 첫 번째 효소 활성에 의한 첫 번째 기질 산화로부터 과산화수소 발생에 적합한 조건 하에 있는 첫 번째 효소 및 첫 번째 기질, 그리고 최소 하나의 추가 효소를 혼합하고, 임의적으로, 최소 하나의 추가 효소의 활성에 의한 두 번째 기질의 산화로부터의 추가 과산화수소의 발생을 포함하는 과산화수소 발생 방법을 제공한다. 여기에서 두 번째 기질은 첫 번째 옥시다제에 의한 첫 번째 기질의 산화에 의해 발생하고, 두 번째 기질은 최소 하나의 추가 효소에 의해서 생성물로 변화된다.
추가로 본 발명은 첫 번째 옥시다제 활성에 의한 첫 번째 기질 산화로부터 과산화수소의 발생 및 최소 하나의 추가 산화환원효소의 활성에 의한 두 번째 기질의 산화로부터의 과산화수소의 발생에 적합한 조건 하에 있는, 첫 번째 옥시다제 및 첫 번째 기질, 그리고 최소 하나의 추가 산화환원효소를 혼합하는 것을 포함하는 과산화수소 발생 방법을 제공한다. 여기에서 두 번째 기질은 첫 번째 옥시다제에 의한 첫 번째 기질 산화에 의해 발생한다.
또 다른 양태로서 본 발명은 화이트닝 및/또는 표백을 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태로서 본 발명은 치아 표백 및/또는 화이트닝에 적절한 양과 기간 동안, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 구강 관리 제품을 치아에 접촉시키는 것을 포함하는 치아의 표백 및/또는 화이트닝 방법을 제공한다.
본 발명은 치아의 화이트닝 및/또는 표백을 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 주요 양태는 결합 효소 시스템에 관한 것이지만, 아래의 양태와 같은 몇몇 양태에서, 본 발명은, 여기에서 언급하고 있는 것처럼, 폴리올 옥시다제와 첫 번째 기질을 포함하는 조성물을 제공한다. 폴리올 옥시다제/첫 번째 기질 효소 시스템의 사용은 비발효성 기질로부터, 선택적으로 pH 저하 없이, 과산화수소의 발생(예, 추가의 산화환원효소 시스템에 결합 없이), 여기에서 언급된 항균/항세균, 항-부패, 표백 및 화이트닝 특성과 같이 이러한 용도에 매우 유용하다는 것이 밝혀졌다.
본 발명은 폴리올 옥시다제 및 첫 번째 기질을 포함하는 페인트 조성물을 제공하며, 여기에서 첫 번째 기질은 폴리올 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소를 생성한다.
본 발명은 폴리올 옥시다제 및 첫 번째 기질을 포함하는 화장품 조성물을 제공하며, 여기에서 첫 번째 기질은 폴리올 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소를 생성한다.
본 발명은 폴리올 옥시다제 및 첫 번째 기질을 포함하는 식품 또는 사료 조성물을 제공하며, 여기에서 첫 번째 기질은 폴리올 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소를 생성하고, 상기 식품 또는 사료 조성물은 우유, 크림, 치즈, 유장(whey)과 같은 유제품, 과일 쥬스와 같은 음료로부터 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명은 폴리올 옥시다제 및 첫 번째 기질을 포함하는 약제 조성물을 제공하며, 여기에서 첫 번째 기질은 폴리올 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소를 생성하고, 상기 첫 번째 기질은 소르비톨 또는 바람직하게 크실리톨이다.
본 발명은 폴리올 옥시다제 및 첫 번째 기질을 포함하는 살충 조성물을 제공하며, 여기에서 첫 번째 기질은 폴리올 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소를 생성한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 하나의 양태로서 폴리올 옥시다제(예, 소르비톨 옥시다제)와 같은 첫 번째 효소, 첫 번째 기질, 산화환원효소와 같은 추가 효소를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기에서 첫 번째 기질은 첫 번째 옥시다제에 의해 산화되어, 과산화수소와 두 번째 기질을 생성하고, 두 번째 기질은 추가의 효소에 의해 전화되어 생성물을 생성한다.
바람직하게 추가 효소는 추가 산화환원효소이고, 두 번째 기질은 산화환원효소에 의해 산화되어 과산화수소와(추가) 생성물을 생산한다.
본 발명에 따른 조성물은 H2O2 의 생성이 필요한 모든 목적에 적용될 수 있으며, 예를 들어, 표백 및/또는 화이트닝이 필요한 곳이나, 항균 목적 및 특히 비독성 또는 친환경 성분이 필요한 상품에 이용될 수 있다.
첫 번째 기질
본문에서 용어 "첫 번째 기질"은(소르비톨 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제와 같은) 첫 번째 효소에 의해 산화되는 기질을 말하여, 과산화수소와 두 번째 기질을 생성한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 첫 번째 기질은 폴리올이고, 이러한 기질은 D-소르비톨, D-크실리톨, D-만니톨, D-아라비톨, 글리세롤, 이노시톨, 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올, 및 1,4-부탄디올로 이루어지는 군에서 선택되는 당알코올로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 기질이다.
하나의 양태에서, 첫 번째 기질은 D-소르비톨 또는 D-크실리톨로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리올이다.
하나의 양태에서 첫 번째 기질은 D-소르비톨이다.
당 및 당-알코올은 D 또는 L 입체이성질체로 존재한다는 것이 알려져 있으며, D 형태가 천연에 다수 존재하고, 따라서 여기서 언급하고 있는 첫 번째 기질과 두 번째 기질에서 바람직한 형태이다.
본 발명의 추가 양태에서 첫 번째 기질은 D-소르비톨 또는 D-크실리톨로 이루어진 군에서 선택되는 비-우식원성(non-cariogenic) 감미료이다. 추가 양태에서 첫 번째 기질은 D-소르비톨이다. D-소르비톨과 D-크실리톨은 본질적으로 비-우식원성이고, 유용한 효과를 가진 것으로 인공 감미료로서 츄잉검과 같은 구강 관리 제품에 이미 사용되고 있다(Hayes C. J Dent Educ . 65(10): 1106-1109 2001).
하나의 양태로서 첫 번째 기질은 소르비톨, 크실리톨, 말티톨, 만니톨, 갈락티톨, 이소말트, 락티톨, 아라비톨, 및 에리스리톨로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 당 알코올 기질이다.
하나의 양태로서 첫 번째 기질은 리비톨, 트레이톨, 릭시톨, 알리톨, 알트리톨, 굴리톨, 이디톨, 탈리톨, 펜티톨 및 헥시톨로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
하나의 양태로서 첫 번째 기질은 소르비톨, 크실리톨, 말티톨, 만니톨, 갈락티톨, 이소말트, 락티톨, 아라비톨, 에리스리톨, 글리세롤, 이노시톨, 1,2-프로판디올, 1,3-부탄디올, 및 1,4-부탄디올로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 당 알코올 기질이다.
본 발명의 바람직한 양태에서 첫 번째 기질은 소르비톨이거나 이를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서 첫 번째 기질은 크실리톨이거나 이를 포함한다.
폴리올 옥시다제 및 추가 산화환원효소은 과산화물(H202)을 생성할 수 있는 옥시다제이다.
본 발명에 따른 조성물에 존재하는 폴리올 농도(level)는 사용하는 용도 및 제제에 따라 달라질 것이다. 구강 관리 제품에 있어서는 고 농도의 폴리올이 사용될 수 있으며, 여기에서 폴리올은 조성물의 주요 매트릭스 성분이 될 수 있다. 또한, 폴리올은 화장품 제제의 주요 구성성분이 될 수 있다. 이러한 용도에서 폴리올은 습윤제로서 첨가될 수 있다. 폴리올은 또한 비누와 같은 세제에 첨가될 수 있으며, 습윤제 기능을 가지거나 정화제로서 사용될 수 있다.
하지만, 페인트 및 세정제와 같은 몇몇 용도에 있어서, 폴리올은 과산화수소를 발생할 만큼의 충분한 첫 번째 기질이지만, 주요 매트릭스 성분이 아닌, 소수 성분으로서 첨가될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 두 번째 기질의 산화 전에, 본 발명 조성물에 존재하는 첫 번째 기질의 농도는 0.1% 내지 약 70% w/w 범위와 같은, 약 0.05% 내지 약 80% w/w 범위이다.
적절하게 하나의 양태에서, 따라서 구강 관리 제품에 존재하는 폴리올의 농도는 약 10 내지 약 75% w/w 범위 또는 약 20 내지 약 70% w/w와 같은, 약 1 내지 약 80% w/w 범위일 수 있다.
적절하게 하나의 양태에서, 페인트 제품에 존재하는 폴리올의 농도는 약 0.1 내지 약 10% w/w 범위, 약 1 내지 약 5% w/w와 같은, 약 0.01 내지 약 20% w/w 범위일 수 있다.
적절하게 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 화장품 조성물 또는 제품에 존재하는 폴리올의 농도는 약 5 내지 약 40% w/w 범위, 약 10 내지 약 40% w/w 범위와 같은, 약 1 내지 약 50% w/w 범위일 수 있다. US 특허 7094395는 본 발명은 조성물에서 사용될 수 있는 농도 범위와 같은, 약 8-32% 폴리올(습윤제)을 포함하는 화장품을 개시하고 있다.
적절하게 추가의 양태에서 세제 제품에 사용되는 폴리올의 농도는 약 0.1% 내지 약 30% 범위, 약 1% 내지 약 20% 범위, 약 1% 내지 약 10% 또는 약 1% 내지 약 5% 범위와 같은, 약 0.01% 내지 약 40% w/w 범위일 수 있다.
첫 번째 효소
첫 번째 효소는 일반적으로 옥시다제 효소이고, 여기에서 '첫 번째 옥시다제'로 말한다.
첫 번째 옥시다제인 첫 번째 효소는 스트렙토미세스(Streptomyces ), 크산토모나스(Xanthomonas ), 브레비박테리움(Brevibacterium ), 프란키아(Frankia ), 노카르디아(Nocardia ), 야니박터( Janibacter ), 불크홀데리아( Burkholderia ), 파라코쿠스( Paracoccus ), 크로마박테리움( Chromabacterium ), 썰모비피다(Thermobifida ), 슈도모나스( Psuedomonas ), 코리네박테리움(Corynebacterium ) 및 바실루스( Bacillus ) 종 및 이들의 동족체로 이루어진 군에서 선택되는 유기체로부터 유래 또는 분리될 수 있다.
적절한 첫 번째 옥시다제는 EC 1.1.3.14 카테콜 옥시다제, EC 1.1.3.18 2차-알코올 옥시다제, EC 1.1.3.41 크실리톨 옥시다제, EC 1.1.3.13 알코올 옥시다제, EC 1.1.3.19 4-히드록시만델레이트 옥시다제, EC 1.1.3.20 장쇄 알코올 옥시다제, EC 1.1.3.40 D-만니톨 옥시다제. EC 1.1.3.7 아릴알코올 옥시다제, EC 1.1.3.30 폴리비닐알코올 옥시다제, EC 1.1.3.21 글리세롤알코올옥시다제, 및 EC 1.1.3.38 바닐릴알코올 옥시다제로 이루어진 군에서 선택되는 효소 분류 넘버(E.C.)로 카테고리화되는 효소를 포함할 수 있다.
JP 80892242는 산소 존재 하에서 크실리톨, D-소르비톨, D-갈락티톨, D-만니톨 및 D-아라비니톨을 산화하는 크실리톨 옥시다제를 개시하고 있다.
크실리톨 옥시다제는 7.5에서 최적 pH를 갖는 스트렙토미세스 sp.(예, 스트렙토미세스 IKD472, FERM P14339) 균주로부터 얻을 수 있으며, pH 5.5 내지 10.5, 65℃까지의 온도에서 안정하고; 구강 관리 또는 세제 조성물 및 제품과 같이 여기에서 언급되는 용도에 매우 적절하다.
하나의 특정 실시 형태에서, 첫 번째 효소는 7.5에서 최적 pH를 갖는 스트렙토미세스 sp.(예, 스트렙토미세스 IKD472, FERM P14339) 균주로부터 얻을 수 있고 pH 5.5 내지 10.5, 65℃까지의 온도에서 안정한 크실리톨 옥시다제가 아니다.
본 발명을 하는 동안 놀랍게도 소르비톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제가 현재 표백 시스템에서 사용하고 있는 부작용을 피하는 표백 시스템에 사용하는데 적절하다는 것을 알아내었다. 이러한 소르비톨 옥시다제는 스트렙토미세스 또는 크산토모나스 종 및 이들의 동족체와 같은 유기체로부터 분리된 효소를 포함한다. 하지만, 본 발명은 이러한 특정 소르비톨 옥시다제(들)로 한정하려는 의도는 아니다.
소르비톨 옥시다제("SOX" 또는 "SoX")는 소르비톨의 당과 과산화수소로의 변화를 촉진시키는 효소이다. 소르비톨 옥시다제는 공지되어 있고, 다양한 용도에 사용되고 있다(예, Oda and Hiraga, Ann. NY Acad. Sci., 864:454-457 [1998]; 및 Yamashita et al J. Biosci. Bioengin., 89:350-360 [2000] 참조). 소르비톨(D-글루시톨, C6H14O6, MW 182.2, CAS 50-70-4)은 효소 제품 제제에 널리 사용되고 있다. 따라서, 소르비톨 옥시다제는 이러한 소르비톨-포함 효소 제품 제제를 포함하는 세제에 사용되는 효과적인 바이오 표백제를 제공한다.
하나의 양태에서, 첫 번째 옥시다제는 크실리톨과 비교할 때 소르비톨에 대해 적어도 약 1.5배 또는 적어도 약 2배 정도의 높은 특이적 활성을 가진다.
하나의 양태에서, 첫 번째 옥시다제는 소르비톨에 대한 최소 약 5 유니트/mg의 특이적 활성을 갖는다.
소르비톨 및 크실리톨 기질에 대한 첫 번째 옥시다제의 특이적 활성은 실시예에서 사용한 조사방법을 이용하는 것처럼 인비트로에서 확인할 수 있거나, 다르게는 상기 구강 관리 조성물 내에서 in-situ로 확인할 수 있다.
바람직한 SOX는 소르비톨의 글루코스로의 산화를 위한 조효소로서 공유적으로 결합된 FAD를 사용하는 산화환원효소이다. 이 효소는 글루코스 옥시다제 및/또는 헥소스 옥시다제(WO 96/39851 참조)와 같은 탄수화물 옥시다제,(글루코)올리고사카라이드 옥시다제 및 M.니발레(M. nivale ) 탄수화물 옥시다제(WO99/31990 참조)의 혼합하여 사용될 뿐만 아니라, 단독으로 바이오 표백 제제의 후보 제제로서 유일한 선택을 제공한다.
이런 혼합 사용의 장점은 SOX가 소르비톨을 글루코스로 변환시킨다는 사실 때문이며, 그 후 글루코스 옥시다제 및/또는 헥소스 옥시다제에 의해 글루코네이트로 변환되어, 아래에 설명한 바와 같이, 소르비톨 1 몰당 2 몰의 과산화수소를 발생시킨다.
D-소르비톨 + O2 → D-글루코스 + H2O2
D-글루코스 + O2 → D-글루코네이트 + H2O2
바람직한 글리세롤 옥시다제(GLOX)는 페니실리움(Penicillium ) 및 보트리티스(Botrytis) 속에서 발견되는 효소이다(예, Lin et al Enz. 마이크로. Technol.,18:383-387 [1996]; 및 Uwajima et al, Agric. Biol. Chem., 44:399-406 [1989] 참조). 이 효소는 아래에서와 같이 글리세롤과 산소의 글리세르알데히드와 과산화수소로의 변화을 촉진한다.
CH2OH-CHOH-CH2OH + O2 → CH2OH-CHOH-CHO + H2O2
글리세롤(글리세린, C3H8O3, MW 92.09, CAS 56-81-5)은 효소 제품 제제, 비누 및 세제 제제, 식품 및 음료, 약제에서 널리 사용되고, 화장품 및 개인 관리 제품에 많이 사용된다. 따라서, 글리세롤 옥시다제는 이들 글리세롤-포함 효소 제제를 포함하는 세제에서 사용되는 유용한 바이오표백제를 제공한다.
본 발명 개발 과정에서, 소르비톨 옥시다제는 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans(SCO6147)(SEQ ID NO 2) 및 스트렙토미세스 sp. H7775(SEQ ID NO 1)로부터 분리하였다(Hiraga et al ., Biosci. Biotech. Biochem., 61:1699-1704 [1997] 참조). 소르비톨 옥시다제는 이들 유기체로부터 세포내와 세포외에서 모두 발현되었다. 배합군(prosthetic group) FAD에 공유적으로 결합한다(1mol의 FAD 대 1mol의 SOX). 따라서, SCO6147 SOX(S. 리비단스(S. lividans)에서 발현)에 대해 276, 358 및 455nm에서 전형적인 최대 흡광도를 갖는 황색단백질(flavoprotein)이며, 이는 히스티딘-플라빈 결합을 나타낸다. 플라빈은 UV-VIS 스펙트럼에서 바람직한 변화에 의해 관찰되는 소르비톨의 산화에 있어서 기능적으로 참여한다. FAD는 단백질에 매우 강하게 결합되어 있어서 세탁용으로 매우 안정한 효소를 제공한다.
SOX 유전자를 스트렙토미세스 종 H-7775(Genbank accession number AB000519)로부터 클로닝하고 서열화하였다.
스트렙토미세스 종 H-7775(Genbank accession number AB000519) 유래 소르비톨 옥시다제 유전자는 이론적으로 45,158 Daltons의 분자량을 가진 420개의 아미노산을 갖는 단백질을 인코딩하는 1260 bp 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. 효소는 pH 7.5에서 50℃의 최적 온도를 갖고, pH 7.5-10, 30℃, 24시간 동안 안정하다. 또한, 55℃까지 열에 안정하다. 이들 효소와 가장 가까운 동족체는 크실리톨 옥시다제이다(51% 상동성). SOX는 세제, 섬유 관리, 집안 관리, 구강 관리(예, 치아 화이트닝 및/또는 세척), 개인 관리 용품, 방직 공정, 식품 공정 및 산업용 세척을 포함하는 다양한 용도에 효과적인 효소이다. 게다가, 많은 SOXs는 크실리톨, 만니톨, 아라비톨, 리비톨, 에리스리톨, 이노시톨, 글리세롤, 프로판디올 및 부탄디올과 같은 다른 기질을 촉진한다. 따라서, 이들 효소는 다양한 종류의 기질을 이용할 수 있어, 다양한 용도에서 기질 사용에 있어 융통성을 제공한다.
여기에서 제공되는 많은 이러한 첫 번째 기질은 일반적인 세제, 구강 관리 제품 및 화장품 제제에 존재하거나 이들에 포함될 수 있다.
스트렙토미세스 sp. H7775 유래 소르비톨 옥시다제의 아미노산 서열은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며, SEQ ID NO:1에 표시하였다.
상기 언급한 바와 같이, 여기에서 사용된 소르비톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제는 열에 안정하고 넓은 pH 범위에서 안정하다고 알려져 있다. 실제로 사용된 소르비톨 옥시다제의 pH 프로파일은 세제 및 다른 세척 제제 뿐만 아니라, 산업상에서 필수적으로 사용되는 pH에서 안정하다는 것이 알려져 있다.
게다가, 본 발명에 의해 제공되는 소르비톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제는 바람직하게 글루코스와 같은 당, 즉, 알데히드 생성물을 생성할 수 있으며, 이들은 출발 기질 소르비톨로부터 유래한 다른 과산화수소를 방출하는 헥소스 옥시다제 또는 글루코스 옥시다제와 같은 다른 옥시다제를 사용하여 추가로 산화되어 글루콘산, 카르복실산을 생성한다. 유사하게 헥소스 옥시다제, 크실로스 옥시다제, 피라노스 옥시다제, 아라비노스 옥시다제, 및 만노스 옥시다제와 같은 다른 적절한 옥시다제에 의한 추가 산화를 위한 두 번째 기질로서 각각 해당하는 크실로스, 아라비노스, 만노스를 형성하는, 대기 중 산소의 도움으로 소르비톨 옥시다제, 크실리톨 옥시다제, 만니톨 옥시다제에 의한 크실리톨, 아라비톨, 만니톨과 같은 폴리올의 산화가 가능하다.
식용 및 구강 관리 조성물에서 사용을 위하여, 또한, 입안의 pH, 즉, pH 5.0 내지 9.0, 바람직하게 pH 6.0 내지 8.5, 특히 pH 6.4 내지 7.5 범위에서 본질적으로 활성이 있는 효소를 사용하는 것이 효과적이다.
하나의 양태에서, 폴리올 옥시다제는 펜티톨 또는 헥시톨 옥시다제이다.
하나의 양태에서 폴리올 옥시다제는 트리오스 옥시다제가 아니거나, 글리세롤 옥시다제가 아니다.
효소가 하나 이상의 기질에 대해 활성이 있다는 것은 알려져 있다. 따라서, 우리가 산화시키는 화합물의 이름에 따라 효소를 지칭할 때, 예를 들어, 소르비톨 옥시다제(소르비톨) 또는 헥소스 옥시다제(헥소스) 또는 글루코스 옥시다제(글루코스)처럼, 그 이름은 EC 넘버와 같이 효소에 주어진 분류를 일컫거나, 본 기술분야에서 언급되는 이름 또는 효소가 가장 높은 특이적 활성을 갖는 기질에 비유한 현저한 활성을 일컫는다. 이러한 관점에서, 소르비톨 옥시다제는 예를 들어 크실리톨 보다 소르비톨에 대한 더 높은 특이적 활성을 갖는다. 적절하게 하나의 양태에서 소르비톨 옥시다제는 D-소르비톨, D-크실리톨, D-만니톨, D-아라비톨, 글리세롤, 이노시톨, 1,2-프로판디올, 1,3-부탄디올, 및 1,4-부탄디올로 이루어진 최소 2개 군을 포함하는 몇몇 폴리올의 산화를 촉진할 수 있다.
하나의 양태에서 폴리올 옥시다제는 리비톨 옥시다제, 트레이톨 옥시다제, 크실리톨 옥시다제, 알리톨 옥시다제, 알트리톨 옥시다제, 굴리톨 옥시다제, 이디톨 옥시다제, 탈리톨 옥시다제, 펜티톨 옥시다제 및 헥시톨 옥시다제로 이루어진 군에서 선택된다.
하나의 양태에서 폴리올 옥시다제는 후에 언급하는 폴리올에 대해, 여기에서 상기 첫 번째 기질 또는 상기 두 번째 기질로서 열거되는 다른 기질과 비교할 때, 후에 언급되는 폴리올 기질을 제외하고, 약 1.5 이상, 약 2 이상, 약 3 이상, 약 4 이상, 약 5 이상, 약 10 이상인 것과 같이 1 이상인 비율의 특이적 활성을 갖는다. 하나의 양태에서 폴리올 옥시다제는 다른 기질에 대한 특이적 활성과 비교하여 소르비톨에 대해 약 1.5 이상, 약 2 이상, 약 3 이상, 약 4 이상, 약 5 이상인 것와 같이 1 이상인 비율의 특이적 활성을 갖고, 여기에서 다른 기질은 말토스, 헥소스, 글루코스, 만노스, 갈락토스, 이소말투로스, 락토스, 아라비노스, 에리스로스, 펜토스, 크실로스 및 트리오스, 바람직하게 글루코스와 같은 당; 글리세롤과 같은 트리오스 폴리올, 및 크실리톨로 이루어진 군에서 선택된다.
하나의 양태에서 폴리올 옥시다제는 크실리톨 옥시다제는 아니다.
하나의 양태에서, 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제는 크실리톨 보다 소르비톨에 대해 예를 들어 1.5배 더 높은 활성, 2배 더 높은 활성과 같이 더 높은 활성을 갖는다. 몇몇 양태 또는 다른 양태에서, 크실리톨과 비교하여 소르비톨에 대해서 3배 이상의 활성을 갖지 않는다.
하나의 양태에서, 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제는 소르비톨 옥시다제, 크실리톨 옥시다제, 말티톨 옥시다제, 만니톨 옥시다제, 갈락티톨 옥시다제, 이소말트 옥시다제, 락티톨 옥시다제, 아라비톨 옥시다제, 아라비톨 옥시다제 및 에리스리톨 옥시다제로 이루어진 군에서 선택된다.
하나의 양태에서, 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제는 소르비톨, 크실리톨, 말티톨, 만니톨, 갈락티톨, 이소말트, 락티톨, 아라비톨, 아라비톨 및 에리스리톨로 이루어진 군에서 선택되는 기질과 같이, 각각의(예, 폴리올) 기질을 사용할 때, 최소 약 5 유니트/g 단백질의(특이적) 옥시다제 활성을 갖는다.
폴리올 옥시다제와 같은 바람직한 첫 번째 옥시다제는 소르비톨 옥시다제이거나, 소르비톨 활성을 갖는 효소이다.
하나의 양태에서 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제는 크실리톨 옥시다제이거나, 크실리톨 옥시다제 활성을 갖는다.
하나의 양태에서 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제는 글리세롤 옥시다제이거나, 글리세롤 옥시다제 활성을 포함한다.
하나의 양태에서, 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제는 해당하는 당 대비 각각의 폴리올에 대해, 최소 약 1.5, 최소 약 2, 최소 약 3, 최소 약 4, 최소 약 5, 최소 약 10과 같이 1 이상인 비율의 특이적 활성을 갖는다. 하나의 양태에서, 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제는 글루코스 대비 각각의 폴리올에 대해 최소 약 1.5, 최소 약 2, 최소 약 3, 최소 약 4, 최소 약 5, 최소 약 10와 같이 약 1 이상인 비율의 특이적 활성을 갖는다.
하나의 양태에서, 소르비톨 옥시다제 또는 크실리톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제는 스트렙토미세스 코에리콜롤(S. coelicolor ), 또는 스트렙토미세스 sp. IKD472와 같은 스트렙토미세스 균주로부터 유래되거나 얻을 수 있다.
하나의 양태에서, 소르비톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제는 스트렙토미세스 코에리콜롤(S. coelicolor ) 균주로부터 유래되거나 얻을 수 있다.
바람직한 하나의 양태에서, 소르비톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제는 SEQ ID NO 1 또는 SEQ ID NO 2 및 이들의 동족체, 변이체 또는 단편으로 이루어지거나 유도된 폴리펩타이드이다.
하나의 양태에서, 실시예 6에 의해 제공된 분석을 이용할 때, 폴리올 옥시다제는 D-소르비톨, D-크실리톨, D-만니톨, D-리비톨, 미오-이노시톨, 및 글리세롤에 대해 활성을 갖는다. 같은 또는 다른 추가 양태에서 폴리올 옥시다제는 1,3 프로판디올 및/또는 1,2 프로판디올에 대해 활성이 있다.
하나의 양태에서, 실시예 6에 의해 제공된 분석을 이용할 때, 폴리올 옥시다제는 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜에 대해 활성이 없다.
소르비톨 옥시다제(SOX)는 스트렙토미세스와 같은 적당한 미생물로부터 얻을 수 있다. Hiragi K. et al.(Biosci. Biotechnol. Biochem. 62:347-353(1998))는 대장균(E. coli)에서 재조합 소르비톨 옥시다제의 제조를 개시하고 있다. 다른 공급원은 예를 들어, US 특허 5,741,687 및 US 5,472, 862에 개시되어 있으며, 일본 기후현 후화-군 세키가하라-조의 토양, 크산토모나스 말토필리아(Xanthomonas maltophilia) TE3539(FERM BP-4512)와 같은 크산토모나스 속 유래 미생물이 개시되어 있다. 폴리올 옥시다제의 다른 예는 달팽이 헬릭스 아스페르사(Helix aspersa) 및 아리온 아테르(Arion ater)로부터 유래한 만니톨 옥시다제(EC 1.1.3.40)이고, 이는 D-아라비니톨, D-만니톨 및, 더 적게는, D-글루시톨(소르비톨)의 산화를 촉진하고, and from 스트렙토미세스 코에리콜롤(S. coelicolor) 유래 크실리톨 옥시다제( EC 1.1.3.41)가 있으며, 이는 D-크실리톨을 산화하여 크실로스와 H2O2를 생성하고, D-소르비톨를 산화하여 글루코스와 H2O2 를 생성한다.
소르비톨 또는 크실리톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제 같은 첫 번째 옥시다제는 박테리아 또는 곰팡이와 같은 미생물 공급원으로부터 얻을 수 있다. 특히, 액티노박테리아 목(class) 및 액티노미세탈레스(Actinomycetales) 과(order)로 분류되는 박테리아로부터 유래된다.
소르비톨 또는 크실리톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제 같은 첫 번째 옥시다제는 다른 종의 스트렙토미세스, 크산토모나스, 브레비박테리움, 프란키아, 노카르디아, 야니박터, 불크홀데리아, 파라코쿠스, 크로마박테리아, 썰모비피다, 슈도모나스, 코리네박테리움 및 바실루스 종 및 이들의 동족체로부터 얻을 수 있다.
소르비톨 또는 크실리톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제 같은 첫 번째 옥시다제는 스트렙토미세스 균주, 바람직하게 스트렙토미세스 코엘리콜롤(S. coelicolor ) 또는 스트렙토미세스 sp . IKD472(Yamashita, Mitsuo et al., Journal of Bioscience and Bioengineering (2000), 89(4), 350-360), 및 스트렙토미세스 sp . H-7775.(Hiraga, Kazumi et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (1997), 61(10), 1699-1704.) 균주로부터 얻을 수 있다.
JP 09206072는 본 발명에서 또한 사용하고 있는 스트렙토미세스의 소르비톨 옥시다제 및 이의 생산 방법 및 사용을 개시하고 있다.
JP 06169764 본 발명에서 또한 사용하고 있는 크산토모나스의 소르비톨 옥시다제를 개시하고 있다.
본 발명의 하나의 양태로서 소르비톨와 같은 폴리올 옥시다제 같은 첫 번째 옥시다제는 스트렙토미세스 균주로부터 유래할 수 있다.
추가 양태에서 예, 소르비톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시타제 같은 첫 번째 효소는 재조합 방법에 의해 생산된다.
하나의 양태에서, 첫 번째 효소/옥시다제 및 추가 효소는 주위 온도에서 활성이 있다.
하나의 양태에서, 첫 번째 효소/옥시다제 및 추가 효소는 약 37℃와 같이 입 또는 체온에서 활성이 있다.
당업자가 필요한 목적에 따라 적절한 농도(유효량)에서 첫 번째 효소/옥시다제를 사용할 것이라는 것은 알려져 있지만, 하나의 양태에서 첫 번째 옥시다제는 kg 당 약 0.1 내지 약 100,000 유니트, kg 당 약 1 내지 약 100,000 유니트, kg 당 약 5 내지 약 50,000 유니트, kg 당 약 10 내지 약 20,000 유니트, kg 당 약 100 내지 약 10,000 유니트와 같이, kg 당 약 0.1 내지 약 200,000 유니트 범위의 농도인 것으로 파악된다. 특정 양태를 위한 다른 적절한 범위는 kg 당 약 10 내지 약 1,000 유니트, 또는 kg 당 약 1 내지 약 10,000 유니트를 포함한다.
하나의 양태에서, 구강 관리 조성물에 대해서 1 및 10000U(유니트)/100 g의 첫 번째 옥시다제를 사용할 수 있다. 또한, 100g 당 5-20 유니트의 용량이 특정 양태에서 적절한 것으로 생각될 수 있다.
식품 및 사료 조성물 사용을 위하여, 또한, 상기 용량이 적절할 수 있다. 하나의 양태에서, 페인트 조성물에 대하여 약 10 내지 약 10000U/100g의 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제가 사용될 수 있다. 또한, 100g 당 10-50 유니트가 특정 양태에서 적절한 것으로 생각될 수 있다.
하나의 양태에서, 화장품 조성물에 대하여 약 1 내지 약 10000U/100g의 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제가 사용될 수 있다. 또한, 100g 당 5-20 유니트가 특정 양태에서 적절한 것으로 생각될 수 있다.
하나의 양태에서, 세제 조성물에 대하여 약 0.1 내지 약 10000U/100g의 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제가 사용될 수 있다. 또한, 100g 당 5-100 유니트가 특정 양태에서 적절한 것으로 생각될 수 있다.
두 번째 기질
두 번째 기질은(최소 하나의) 추가 효소에 의해 변화되어 생성물을 발생할 수 있다. 바람직하게 두 번째 기질은 추가 효소(추가 산화환원효소)에 의해 산화될 수 있으며, 추가 과산화수소와 생성물을 발생한다.
본문에서 용어 "두 번째 기질"은 첫 번째 기질 산화의 결과물인 기질을 말하고, 추가효소에 의해 변화되어 생성물을 형성한다.
바람직한 양태에서, 용어 "두 번째 기질"은 첫 번째 효소에 의한 첫 번째 기질 산화의 결과물인 기질이고, 추가 산화환원효소에 의해 산화되어 과산화수소와 생성물을 형성한다.
하나의 양태로서 두 번째 기질은 글루코스, 크실로스, 말토스, 만노스, 갈락토스, 이솔말툴로스, 락토스, 아라비노스 및 에리스로스로 이루어진 군에서 선택되는 당과 같은 하나 이상의 당이다.
하나의 양태로서 두 번째 기질은 리보스, 라이소스, 알로스, 알트로스, 굴로스, 아이도스 및 탈로스로 이루어진 군에서 선택되는 당과 같은 하나 또는 그 이상의 당이다.
따라서, 두 번째 기질은 예를 들어 첫 번째 기질이 소르비톨이거나, 소르비톨을 포함할 때, 글루코스이거나 글루코스를 포함할 수 있다.
폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제와 추가 산화환원효소와 같은 추가 효소와의 현저한 상승효과 때문에, 두 번째 기질의 평형 상태의 농도는 일반적으로 낮다. 예를 들어 페인트 또는 화장품과 같은 방부 용도 외에 구강 관리 제품에서, 낮은 농도의 두 번째 기질은 매우 유용할 수 있는데, 특히 두 번째 기질이 발효성 또는 우식원성 당일 때, 즉, 미생물/박테리아(예, 구강 충치에 있는 우식원성 박테리아)와 같은 해로운 유기체 또는 조류 및 발니칼스(barnicales, 예를 들어 해변가 페인트 상의 부착물)의 성장을 돕거나 부양할 수 있는 화합물일 때 유용하다. 따라서, 본 발명은 효과적이고 다량의 과산화수소의 생성을 제공할 뿐만 아니라, 해로운 유기체의 원치 않는 성장을 감소시킬 수 있는, 최소 농도의 발효성 기질이 있는 시스템을 제공할 수 있다.
하나의 양태에서, 첫 번째 옥시다제에 의해 발생하는, 하나 또는 그 이상의 발효성 또는 우식원성 당과 같은 두 번째 기질이 본 발명에 따른 조성물에 존재하는 농도는 몰랄 비율에 의해 측정했을 때, 조성물 내에 존재하는 폴리올(초기) 농도의 약 25% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 1% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.1%이하, 약 0.05% 이하, 약 0.01% 이하와 같은 50% 이하이다.
바람직한 양태에서 두 번째 기질은 당이다.
하나의 양태에서 당은 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 만노스, 소르보스로 이루어진 군에서 선택되는 헥소스와 같은 모노사카라이드 헥소스이다.
하나의 양태에서 당은 리보스, 아라비노스, 크실로스 또는 라이소스로 이루어진 군에서 선택되는 펜토스와 같은 모노사카라이트 펜토스이다.
하나의 양태에서 당은 알도트리오스 또는 케토트리오스와 같은 트리오스이다.
하나의 양태에서 당은 수크로스 또는 말토스와 같은 디사카라이드이다.
추가 효소
(최소 하나의) 추가 효소는 두 번째 기질을 변화시켜 생성물을 형성할 수 있는 특징을 갖는다.
추가 효소는 첫 번째 효소와 같은 효소 또는 효소적 본체(enzymatic entity)가 아니다. 하지만, 하나의 양태에서, 추가 효소는 첫 번째 효소에 결합할 수 있으며, 예를 들어 첫 번째 및 추가 효소는 폴리프로테인으로서 공동 발현될 수 있다.
추가 효소는 본 발명에 따른 조성물 또는 여기에서 개시하고 있는 용품에 존재하는 어떠한 효소이고, 두 번째 기질을 생성물로 변화시킬 수 있으며, 첫 번째 효소에 의한 첫 번째 기질의 산화로부터 유래한 과산화수소 발생에 악영향을 미치지 않는다.
적절한 추가 효소의 예는 NAD+가 공급될 때, D-글루코노-1,5-락토 + NADH의 생성물을 형성하는 글루코스 디히드로게나제(E.C: 1.1.1.118); NADP+가 공급될 때, D-글루코노-1,5-락톤 + NADPH의 생성물을 형성하는 글루코스 1-디히드로게나제(E.C: 1.1.1.119)(NADP(+)); 글루코스의 COOH기를 인산화하여 글루코스-6-포스페이트를 생성하는 글루코키나제(E.C. 2.7.1.2); D-글루코스 + D-프룩토스 <=> D-글루코노락톤 + D-글루시톨로 변화하는 글루코키나제를 포함한다.
따라서, 하나의 양태에서 조성물은 추가 효소에 의해 두 번째 기질과 함께 사용되어 생성물(들)을 형성하는 추가 화합물을 포함할 수 있으며, 이러한 적절한 추가 화합물은 예를 들어, NAD+, NADP+, 또는 프룩토스로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
바람직한 양태에서(최소 하나의) 추가 효소는(최소 하나의) 추가 산화환원효소(산화환원효소로서 또한 언급됨)이다.
추가 산화환원효소는 바람직하게 폴리올 옥시다제가 아닌 옥시다제이다.
추가 산화환원효소는 여기에서 첫 번째 옥시다제로 언급된 폴리올 옥시다제가 아니다.
산화환원효소는 EC 클래스 1.x.x.x.에 속하는 효소이다. 본 발명에서 산화환원효소는 CH-OH 또는 알데히드 또는 옥소와 같은 산소 수용체를 사용한다(EC 1.2.3.x).
바람직한 양태에서 본 발명의 산화환원효소는 수용체로서 산소와 작용하는 EC 클래스 1.1.3.에 포함되는 효소이다. 예를 들어 헥소스 옥시다제(D-헥소스 : O2-산화환원효소, EC 1.1.3.5)는 산소 존재하에서 D-글루코스, 및 말토스, 락토스 및 셀로비오스를 포함하는 다른 환원당을 산화하여 대응 락톤을 형성하고, 연이은 가수분해로 과산화수소 형성 시 각각의 알도비온산을 생성한다. 글루코스 및 갈락토스에 대한 헥소스 옥시다제에 의한 산화는 예를 들어 아래와 같이 표현할 수 있다.
D-글루코스 + O2 → δ-D-글루코노락톤 + H2O2, 또는
D-갈락토스 + O2 → γ-D-갈락토갈락톤 + H2O2
본 발명의 다른 양태에서 산화환원효소는 헥소스 옥시다제, 글루코스 옥시다제, 카보하이드레이트 옥시다제, 및(글루코)올리고사카라이드 옥시다제와 같은 올리고사카라이드 옥시다제로 이루어진 군에서 하나 또는 그 이상 선택된다. 본 발명의 추가 양태에서 산화환원효소 카보하이드레이트 옥시다제,(글루코)올리고사카라이드 옥시다제, 피라노스 옥시다제, 헥소스 옥시다제 또는 글루코스 옥시다제로 이루어진 군에서 선택되는 것과 같은, 당 산화를 촉진하는 하나 또는 그 이상의 효소이다. 본 발명의 추가의 양태에서 산화환원효소는 글루코스 옥시다제 및/또는 헥소스 옥시다제이다. 본 발명의 추가 양태에서 산화환원효소는 헥소스 옥시다제이다.
바람직한 양태에서 산화환원효소는 카보하이드레이트 옥시다제, 올리고사카라이드 옥시다제, 말토스 옥시다제, 헥소스 옥시다제, 글루코스 옥시다제, 만노스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 이소말툴로스 옥시다제, 락토스 옥시다제, 아라비노스 옥시다제, 에리스로스 옥시다제, 펜토스 옥시다제, 크실로스 옥시다제, 트리오스 옥시다제로 이루어진 군에서 선택되는 당-옥시다제이다,
하나의 양태에서 당-옥시다제는 EC 1.1.3.4 글루코스 옥시다제, EC 1.1.3.5 헥소스 옥시다제, EC 1.1.3.9 갈락토스 옥시다제, EC 1.1.3.10 피라노스 옥시다제, EC 1.1.3.11 L-소르보스 옥시다제, 및 EC 1.1.3.40 D-만니톨 옥시다제로 이루어진 군에서 선택된다.
적절한 옥시다제는 IUBMB(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)의 권고(1992)에 따라 효소 분류 넘버 E.C.1(산화환원효소)로 특정되고, 이는 산화화원을 촉진하는 효소이고, 특히, E.C. 1.1.3. 또는 E.C. 1.2.3.에 열거된 특정 옥시다제이고, 즉, 옥시다제는 산소분자(02)에 작용하여 공여체로서 CH-OH 또는 알데히드 또는 옥소 그룹을 이용하여, 과산화물(H2O2)을 형성한다.
적절한 글루코스 옥시다제는 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger ) 균주와 같은 아스퍼질러스 sp. 또는, 클라도스포리움(Cladosporiurn ) sp, 특히, 클라도스포리움 옥시스포룸(Cladosporium oxysporum), 특히, WO 95/29996(Novo Nordisk A/S)에 기재된 클라도스포리움 옥시스포룸 CBS 163 균주로부터 유래한다.
붉은 바닷말 콘드루스 크리스푸스(Chondrus crispus)(Irish moss로 널리 알려짐) 유래 헥소스 옥시다제는(Sullivan and Ikawa,(1973),Biochim. Biophys. Acts, 309, p. 11-22; Ikawa,(1982), Meth. In Enzymol. 89, carbohydrate metabolism part D, 145-149) D-글루코스, D-갈락토스, 말토스, 셀로비오스, 락토스, D-글루코스 6-포스페이트, D-만노스, 2-디옥시-D-글루콜, 2-디옥시-D-갈락토스, D-푸카스, D-글루쿠론산, 및 D-크실로스와 같은 넓은 스펙트럼의 탄수화물을 산화시킨다.
또한, 붉은 바닷말 이리도피쿠스 플락시둠(Iridophycus flaccidum)은 쉽게 추출가능한 헥소스 옥시다제를 생성하고, 이는 몇몇 다른 모노- 및 디카라이드를 산화한다(Bean and Hassid,(1956), J. Biol. Chem, 218, p. 425; Rand et al.(1972, J. of Food Science 37, p. 698-710).
헥소스 옥시다제의 넓은 기질 스펙트럼은 입안에 존재하는 사용 가능한 기질(즉, 탄수화물)의 총량이 보다 특이적인 촉매 특성을 가진 관련 효소에 대해 매우 더 크기 때문에, 치아 표백과 관련하여 유용하다.
EP 1041890에 기재된 미크로도키움 니발레(마이크로dochium nivale) 유래 카보하이드레이트 옥시다제는 올리고사카라이드 뿐만 아니라, 글루코스, 락토스 및 크실로스를 포함하는 몇몇 당에 대해서도 활성이 있다.
몇몇 당과 올리고사카라이드에 반응할 수 있는 다른 산화환원효소는 악레모니움 스트릭툼(Acremonium strictum)으로부터 얻을 수 있다( Lin, et al. Biochemica and Biophysica Acta 118(1991)). 제빵에서의 이의 사용이 JP 11056219에 기재되어 있다.
적절한 산화환원효소의 다른 예는 글루코스 옥시다제(EC 1.1.3.4)와 갈락토스 옥시다제(EC 1.1.3.9)이다.
하나의 양태에서 산화환원효소는 카보하이드레이트 옥시다제, 헥소스 옥시다제 또는 글루코스 옥시다제로 이루어진 군에서 하나 또는 그 이상 선택된다.
하나의 양태에서 산화환원효소는 헥소스 옥시다제이다.
적절한 산화환원효소의 다른 예는 헥소스 옥시다제(HOX)(EC 1.1.3.5)이고, 이는 이리도피쿠스 플락시둠(Iridophycus flaccidum)(Bean and Hassid, 1956) 및 콘드루스 크리스푸스(Chondrus crispus)(Sullivan et al. 1973)와 같은 몇몇 홍조류 유래 효소를 분리함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서 HOX는 WO 01/38544에 기재된 바와 같이 얻거나 제조할 수 있다. HOX는 DairyHOX™ 로서 Danisco A/S로부터 이용가능하다.
추가 산화환원효소의 용량은 비록 여기에서 언급된 것처럼 하나의 양태에서 과량의 추가 옥시다제가 첨가되는 것이 알려져 있지만, 선행하는 폴리올 옥시다제에서 언급한 것과 동일한 범위 내에 있다.
효소 조성물
소르비톨 옥시다제 및/또는 추가 산화환원효소와 같은 정제된 효소, 즉, 본 발명 조성물에 첨가하기 전에 정제된 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게 효소 정제는 SDS-PAGE 및 농도계를 사용하여 확인한다. 정제된 효소는 최소 약 30% 순도, 최소 약 40% 순도, 최소 약 50% 순도와 같이, 최소 약 20% 순도이다. 하지만, 정제된 효소는 다른 단백질과 함께 제제화 될 수 있으며, 예를 들어, BSA 또는 효소와 같이 단백질 안정화제와 혼합될 수 있다. 따라서, 효소 정제의 측정은 정제 후 효소에 결합한 단백질을 제외한다.
과산화수소 생성의 비율은 예를 들어, 추가 효소/산화환원효소에 비교된 특정 비욜의 유효량의 첫 번째 효소/옥시다제를 포함하는 조성물을 제조함으로써 조절할 수 있다. 일반적으로, 실시예에서 기재된 바와 같이, 과량의 추가 효소/산화환원효소는 증가된 비율의 과산화수소 생성을 유발한다.
하나의 양태에서 생성된 총 과산화수소의 몰랄 양은 두 번째 기질로 변화된(또는 변화될 수 있는) 첫 번째 기질의 몰랄 양 또는 존재하는 첫 번째 기질 양보다 더 크다. 적절하게, 하나의 양태에서, 생성된(생성될 수 있는) 과산화수소의 몰랄 양은 두 번째 기질로 변화된(또는 변화될 수 있는) 첫 번째 기질의 몰랄 양 또는 존재하는 첫 번째 기질 양의 100%를 이상이고 200% 이하인 범위이다. 따라서, 본 발명의 사용은 소르비톨 옥시다제 효소 단독 사용으로부터 생산되는 한 분자의 과산화수소와 비교할 때, 소르비톨 첫 번째 기질로부터 생산되는 두 분자의 과산화수소가 가능하다. 하나의 양태에서, 생성되는(또는 생성될 수 있는) 과산화수소의 몰랄 양은 추가 산화환원효소가 없는 폴리올 옥시다제 시스템으로부터 생성될 수 있는 과산화수소 몰랄 양의 2배이다.
하나의 바람직한 양태에서, 폴리올 옥시다제(예, 소르비톨 옥시다제)와 같은, 본 발명 조성물에 존재하는 첫 번째 효소/옥시다제의 양과 비교한, 최소 하나의 추가 효소/산화환원효소의 양은, 상기 조성물 내에 존재하는 효소 유니트의 각각의 수에 의해 측정할 때, 약 1.5 이상, 약 2 이상, 약 3 이상, 약 5 이상, 약 10이상, 약 20 이상, 약 50 이상, 약 100 이상, 약 150 이상, 약 200 이상, 약 300 이상, 약 500 이상, 약 1000 이상과 같이, 1 이상이다.
본 발명 조성물의 추가 장점은 생성물로서 우식원성 감미료 또는 당의 축적 없이, 화이트닝제 과산화수소를 생성하는 효소와 기질의 조합을 선택할 수 있다는 것이다.
예를 들어, SOX는 D-소르비톨 산화를 촉진시켜 1 몰의 D-글루코스와 1 몰의 H2O2를 생성한다. HOX와 같은 산화환원효소는 D-글루코스의 산화를 촉진시켜 1 몰의 D-글루콘산과 1 몰의 H2O2를 생성한다. 따라서, SOX 및 HOX의 조합 사용은 아래의 반응식에 기재된 바와 같이, 1 몰의 소르비톨 옥시다제 기질로부터 2 몰의 H2O2를 생성할 수 있다.
SOX의 효소 반응의 결과물은 우식원성이 중간체 글루코스이나, 글루콘산으로 빠르게 변화하는 짧은 수명을 갖고 있다. 본 발명의 추가 장점은 단 1 몰의 클루콘산이 2 몰의 과산화수소에 대해 형성된다는 것이다.
Figure 112008036182013-PCT00001
Figure 112008036182013-PCT00002
상기 표현된 반응식은 두 개의 연이은 효소 반응에 의한 폴리올의 대응산으로의 변화를 나타낸다. D-소르비톨의 글루콘산으로의 변화를 예로 할 수 있다.(1) D-소르비톨,(2) 폴리올 옥시다제에 의한 촉매 반응(3) D-글루코스(4) 헥소스 옥시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코올리고사카라이드 옥시다제, 카보하이드레이트 옥시다제에 의한 촉매 반응 (5) D-글루코노-1,5-락톤(6) 수성상에서의 가수분해(7) D-글루콘산.
반응은 다음과 같이 일반화될 수 있다:
첫 번째 옥시다제 추가 산화환원효소
폴리올 → 당 → 락톤
추가 구체적 예는 다음을 포함한다:
소르비톨 → 글루코스 → D-글루코노-1,5-락톤
갈락티톨 → 갈락토스 → D-갈락토노-1,5-락톤*
만니톨 → 만노스 → D-만노노-1,5-락톤
락티톨 → 락토스 → D-락토노노-1,5-락톤
크실리톨 → 크실로스 → D-크실로노-1,5-락톤
*(또는 D-갈락토헥사디알도스(만약 갈락토스 옥시다제가 사용된다면)는 C6에서 산화한다)
락톤 생성물은 일반적으로 수성 상에서 산으로 변화된다. 첫 번째 옥시다제는 여기에서 언급된 것으로부터 선택될 수 있다. 추가 산화환원효소는 헥소스 옥시다제 또는 만노스 옥시다제(만노스용)와 같이, 여기에서 언급한 당 옥시다제이다.
본 발명 조성물에 존재하는 각 효소의 양, 또는 존재하는 또는 여기에서 언급되는 조성물 또는(용품) 제품에 추가되는 효소의 총량은 필요한 제제에서 사용되고 원하는 효소에 따라 달라질 것이다. 하지만, 일반적으로 최종 조성물의 무게의 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.005% 내지 약 2%, 약 0.01% 내지 약 1%와 같은 약 0.0001% 내지 약 20%이다.
일반적으로, 두 효소의 결합은 첫 번째 효소/첫 번째 기질 시스템 단독과 비교하여 약 200-300% 비율의 과산화수소를 발생하는 것으로 알려져 있다. 폴리올 옥시다제(예, 소르비톨 옥시다제) 및 헥소스 또는 글루코스 옥시다제와 같은 추가 산화환원효소 둘에 대해 동등한 유니트 용량을 사용할 때도 상당히 증가된 과산화수소를 얻을 수 있지만, 상승효과는 조성물에 과량의 추가 산화환원효소를 첨가함으로써 추가로 증가될 수 있으며, 더 빠른 비율로 더 많은 과산화수소를 생성할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태로서 조성물은 소르비톨 옥시다제 및 헥소스 옥시다제 그리고 첫 번째 기질로서 D-소르비톨을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태로서 조성물은 소르비톨 옥시다제 및 글루코스 옥시다제 그리고 첫 번째 기질로서 D-소르비톨을 포함한다.
하나의 양태에서, 추가 산환환원효소가 HOX일 때, 소르비톨 또는 크실리톨 옥시다제 같은 폴리올 옥시다제는 D-크실리톨의 산화를 촉진시켜 1몰의 크실로스와 1몰의 H2O2를 생성한다. 이는 크실로스에 대한 HOX의 낮은 활성 때문에 크실로스가 축적될 수 있다는 점에서 크실리톨이 아닌, 소르비톨과 같은 다른 폴리올인 특정 양태에서 유용하다. 크실로스는 프리바이오틱 화합물이다. 따라서, 이러한 화합물은 또한 본 발명의 다른 유용한 효과를 얻는 것과 동시에, 크실로스 함량을 증가시키기 위해서 식품 및 사료 조성물, 또는 의약품, 또는 식품 또는 사료 조성물 또는 의약품의 제조에 있어서 사용될 수 있다.
소르비톨 옥시다제 또는 크실리톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제와 D-크실리톨 또는 소르비톨와 같은 폴리올은 비독성 성분을 이용하여 얻는 H2O2 에 의한 항균 및/또는 표백 효과와 당과 같은 우식원성 화합물을 피할 수 있는 장점이 있다.
조성물 매트릭스
본 발명에 따른 조성물은 적절하게 여기에서 언급된 제품 또는 다른 적절한 제품에 일반적으로 사용되는 다른 성분을 포함할 수 있다.
매트릭스 물질은 조성물에 사용되는 효소와 양립가능하고, 사용되는 효과적인 양의 효소가 사용될 수 있도록 적절히 선택된다.
생성물
상기 언급한 바와 같이, 바람직한 양태는 두 번째 기질에 대한 추가 효소의 반응이 추가 과산화수소와 생성물을 형성할 때이다. 따라서 생성물은 과산화수소가 아니다.
하나의 양태에서, 두 번째 기질에 대한 추가 효소의 반응에 의해 형성되는 생성물은 하나 이상의 생성물, 즉 생성물들일 수 있다.
본 발명 조성물 또는 여기에서 언급하고 있는 용도에서 생성물의 축적은 바람직하게 첫 번째 효소에 의한 첫 번째 기질의 변화로부터 발생하는 과산화수소의 발생 비율에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 실질적으로, 본 발명자가 발견한 것처럼, 두 번째 기질의 생성물로의 변화는 첫 번째 기질에 대한 첫 번째 효소의 반응에 영향을 미쳐 과산화수소의 발생 비율을 크게 증가시킬 뿐만 아니라, 있을 수 있는 원치않는 두 번째 기질의 축적을 줄이는 두 번째 기질을 효과적으로 제거한다.
바람직한 양태에서, 생성물은 추가 산화환원효소에 의한 두 번째 기질의 산화에 의해 생성되고, 예를 들어 락톤(C1 위치에서 산화), 디알도스(펜토스의 C5 위치에서, 헥소스의 C6 위치에서 산화, 등)일 수 있다. 하나의 예는 갈락토스 옥시다제에 의해 생성되는 D-갈락토헥사디알도스 또는 만약, 산화가 당쇄 중간에 있는 어느 지점에서 일어난다면, 탈수소-당일 수 있다. 추가 예는 글루코스 C2 위치에서의 산화에 의한 피라노스 옥시다제에 의해 생성되는 2-디히드로-D-글루코스이다.
생성물은 D-글루코노-1,5-락톤, D-크실로노-1,5-락톤, D-말토노-1,5-락톤, D-만노노-1,5-락톤, D-갈락토노-1,5-락톤, D-헥사디알도스, D-락토노-1,5-락톤, D-아라보노-1,5-락톤, D-에리스로노-1,5-락톤, D-리보노-1,5-락톤, D-릭소노-1,5-락톤, D-알로노-1,5-락톤, D-알트로노-1,5-락톤, D-굴로노-1,5-락톤, D-이도노-1,5-락톤, D-탈로노-1,5-락톤, 및 이소말툴로스의 락톤, 및 당의 C6 위치에서의 갈락토스 옥시다제 산화로부터 발생가능한 몇몇 다른 생성물로부터 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
정의
다르게 기재되어 있지 않은 한, 본 발명의 실시는 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 조작, 단백질 및 DNA 시퀀싱, 재조합 DNA 분야 및 산업 효소 사용및 개발, 본 기술 모든 분야에서 흔히 사용되는 보편적인 기술을 포함한다.
여기에서 다른 정의가 있지 않은 한, 여기에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 쉽게 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, Singleton and Sainsbury, Dictionary of 마이크로biology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY(1994); 및 Hale and Margham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY(1991)은 당업자에게 본 발명에서 사용된 많은 용어의 일반적인 사전을 제공한다. 비록 여기에서 언급된 것과 유사 또는 동등한 어떠한 방법 및 물질이 본 발명의 실시에서 사용되는 것을 발견할지라도, 바람직한 방법 및 물질이 여기에 기재되어 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 전체로서 명세서에 대한 참조에 의해 더욱 완전하게 기술된다. 또한, 여기에서 사용된, 단수 용어 "a," "an," 및 "the"은 본문에서 명확하게 다르게 기재하고 있지 않다면, 복수 의미를 포함한다. 다르게 기재되어 있지 않은 한, 핵산은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재되어 있으며; 아미노산 서열은 각각 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재되어 있다. 본 발명은 여기에서 언급된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약에 한정되는 것이 아니고, 본 기술 분야의 당업자에게 사용되는 이들은 본문에 따라 변화될 수 있다.
본 명세서 전체에 기재된 모든 최대 수 한정은, 여기에서 더 낮은 수 한정을 명백히 표현하고 있는 것처럼, 모든 더 낮은 수 한정을 포함한다. 본 명세서 전체에 기재된 모든 최소 수 한정은, 여기에서 더 높은 수 한정을 명백히 표현하고 있는 것처럼, 모든 더 높은 수 한정을 포함할 것이다. 본 명세서 전체에 기재된 모든 수 범위는, 여기에서 더 좁은 수 범위를 명백히 표현하고 있는 것처럼, 이러한 더 넓은 수 범위에 포함되는 모든 좁은 수 범위를 포함할 것이다.
효소의 "각각의 폴리올 기질"을 언급할 때, 효소가 사용하는 기질을 말한다. 예로서, 소르비톨 옥시다제의 각각의 기질은 소르비톨이고, 크실리톨 옥시다제의 각각의 기질은 크실리톨이다.
여기에서 사용하는, 용어 "양립가능한"은 조성물 매트릭스 물질(다른 성분)이 옥시다제(들)가 정상적으로 사용되는 동안 원하는 효과가 없을 정도로 여기에서 제공되는 옥시다제 효소(들)의 효소 활성을 감소시키지 않는 것을 의미한다. 구체적인 세제 조성물 물질을 이후에 상세히 예시하고 있다.
여기에서 사용하는 "유효량의 효소"는 특정 용도에서 필요한 효소 활성을 나타내기 위해 필요한 효소의 양을 의미한다. 이러한 유효량은 당업자에 의해 쉽게 확정되고, 사용되는 특정 효소 변이체, 세제 제품, 세제 조성물의 특정 조성 및 필요한 형태가 액체 또는 건조(예, 과립) 형태인 지 등등과 같은, 많은 요소에 근거한다.
아미노산 및 폴리뉴클레오티드 상동성은 표준 셋팅을 이용한 클러스탈W 알고리즘(ClustalW algorithm): 참조 http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html, Method : EMBOSS::water(local): Gap Open = 10.0, Gap extend = 0.5, using Blosum 62(protein), 또는 뉴클레오티드 시퀀싱을 위한 DNAfull을 이용하여 확인할 수 있다.
"두 번째 기질이 최소 하나의 추가 효소에 의해 양립가능하고 생성물을 형성한다"고 언급할 때, 두 번째 기질은 추가 효소(산화환원효소)에 의해 산화되어 과산화수소와 생성물을 형성한다는 것이다.
여기에서 사용하는 용어 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2와 같은 폴리펩타이드(서열)의 "변이체(들)"는 천연(모) 폴리펩타이드로부터 제조한 또는 모 펩타이드로부터 유래한 서열 정보를 이용한 폴리펩타이드로서, 상기 서열 내에서 하나 또는 그 이상의 아미노산, 즉, 약 40 이하, 약 30 이하, 약 20 이하, 또는, 1 아미노산, 1-2 아미노산, 1-3 아미노산, 1-4 아미노산, 1-5 아미노산과 같이 약 10 이하인, 최소 하나 이상의 아미노산이지만 바람직하게 약 50 아미노산 이하인 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환으로 제조된다.
여기에서 사용하는 용어 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2와 같은 폴리펩타이드의 "동족체(들)"는 상기 폴리펩티드 서열에 대해서 최소 약 80% 상동성, 최소 약 85% 상동성, 또는 최소 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 상동성과 같은 최소 약 90% 상동성과 같이, 최소 약 70% 상동성이다. 두 폴리펩티드 서열 간의 상동성은 여기에서 기재하고 있는 것처럼 표준 셋팅을 이용한 클러스탈W 알고리즘을 이용하여 확인할 수 있다.
여기에서 사용하는 용어 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2와 같은 폴리펩타이드의 "단편(들)"은 상기 폴리펩티드의 일부분으로 구성된 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 단편은 상기 폴리펩티드 서열의 최소 약 60%, 최소 약 70%, 최소 약 80%, 최소 약 90% 또는 최소 약 95%와 같이 최소 약 50%를 포함하거나, 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 변이체, 동족체 및 단편은 모 효소의(본 발명의 목적에) 바람직한 효소 활성의 최소 부분을 모두 유지하고 있으며, 예를 들어 모 효소 활성의 최소 약 10%, 최소 약 20%, 최소 약 30%, 최소 약 40%, 최소 약 50%, 최소 약 60%, 최소 약 70%, 최소 약 80%, 최소 약 90% 또는 모든 활성과 같다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 바람직한 효소를 이들의 특정 서열 ID로 확인할 때, 이들은 천연 숙주 종 또는 이종 숙주 종 내 발현된 대응 아미노산 SEQ ID를 암호화하는 핵산 서열로부터 유래한 효소를 포함하고, 이러한 효소는 공동 또는 후 번역된다는 것도 당업자에게 잘 알려져 있다.
여기에서 사용하는 농도, 활성 및 상태 등을 말하는 용어 "약"은 언급되는 특정 값 또는 범위를 포함하거나 구체적으로 개시한다.
여기에서 사용하는 용어 "폴리올"은 하나보다 더 많은 수산기를 포함하는 당 알코올을 말한다. 폴리올은 하나의 수산기(COH)를 포함하는 폴리올로서의 당과 명확히 구별되고, 일반적인 그룹 알디톨에 속하는 반면, 당은 카르보닐 기(COOH)를 포함한다.
디사카라이드 및 모노사카라이드 모두 당 알코올을 형성할 수 있다; 하지만, 디사카라이드 유래 당 알코올(예, 말티톨 및 락티톨)은 단지 하나의 알데히드기가 환원에 이용가능하기 때문에 완전하게 수소화되지는 않는다. 하나의 양태에서 당 알코올 완전히 수소화된다.
당 알코올은 당보다 칼로리가 더 낮기 때문에, 음식에 흔히 첨가된다; 하지만, 또한 덜 달아서 종종 강한 감미료와 같이 사용된다. 또한, 구강 내 박테리아에 의해 대사되지(즉, 분해되지) 않기 때문에 츄잉 껌에 첨가되지만, 충치를 일으키지는 않는다. 말티톨, 소르비톨 및 이소말트는 더 흔히 사용되는 몇몇 종류이다. 당 알코올은 이들의 아날로그 당으로부터 완화한 환원 조건 하에서 형성될 수 있다.
여기에서 사용하는 용어 "옥시다제"는 전자 수용체로서 산소 분자(O2)를 포함하는 산화/환원 반응을 촉진하는 효소를 말한다. 이러한 반응에서, 산소는 환원되어 물(H2O) 또는 과산화수소(H2O2)가 된다. 옥시다제는 산화환원효소의 하위부류에 있다.
용어 "폴리올 옥시다제"는 폴리올을 해당 당으로 산화시킬 수 있는 효소이다. 폴리올 옥시다제 반응에 의한 폴리올의 산화는 과산화수소를 생성한다.
여기에서 사용하는 용어 "글루코스 옥시다제"("Gox")는 베타-D-글루코스(즉, 6 탄소 당, 글루코스의 이성질체)에 결합하고, 당을 대사체로 분해시키는 것을 돕는 옥시다제 효소(EC 1.1.3.4)를 말한다. GOx는 베타-D-글루코스를 D-글루코노-1,5-락톤으로의 산화를 촉진하고, 가수분해하여 글루콘산을 생성하고 동시에 일어나는 산소 분자의 환원으로 과산화수소를 형성하는 이량체 단백질이다
여기에서 사용하는 용어 "알코올 옥시다제"("Aox")는 알코올을 알데히드로 변화하고, 동시에 일어나는 산소 분자의 환원으로 과산화수소를 형성하는 옥시다제 효소(EC 1.1.3.13)이다.
여기에서 사용하는 용어 "콜린 옥시다제"("Cox")는 콜린의 4-전자 산화를 촉진하여 중간체로서 베타인 알데히드와 함께 글리신 베타인을 생성하고, 동시에 일어나는 두 분자의 산소 분자의 환원으로 두 분자의 과산화수소를 형성하는 옥시다제 효소(EC 1.1.3. 17)이다.
여기에서 사용하는 용어 "헥소스 옥시다제"("Hox")는 모노 및 디사카라이드를 산화시켜 대응 락톤을 형성하고, 동시에 일어나는 산소 분자의 환원으로 과산화수소를 형성하는 옥시다제 효소(EC 1.1.3.5)를 말한다. 헥소스 옥시다제는 D-글루코스, D-갈락토스, 말토스, 셀로비오스, 및 락토스 등을 포함하는 다양한 기질을 산화시킬 수 있다.
여기에서 사용하는 "글리세롤 옥시다제"는 글리세롤의 글리세르알데히드로의 산화를 촉진하고, 동시에 일어나는 산소 분자의 환원으로 과산화수소를 형성하는 옥시다제 효소(EC 1.1.3.)를 말한다.
효소의 활성은 조건과 이용가능한 기질에 좌우된다는 것이 잘 알려져 있으므로, 효소의 활성은 원하는 용도에 따른 조성물의 사용 또는 본 발명에 따른 조성물 내에서와 비교할 때, 표준 분석 상태와는(인 비트로 분석) 다르다. 하나의 양태에서, 효소 활성은 실시예에서 언급하고 있는 인 비트로에 의해 확인된다. 다르게는 효소 활성은 인 시추(in situ), 즉, 본 발명에 따른 조성물 내에서 조성물이 사용되는 조건 하에서 확인된다. 동일한 분석 방법이 인 비트로 활성에 대한 것처럼 인 시추 효소 활성을 확인하는데 사용될 수 있으며, 그 분석은 조성물 매트릭스 또는 본 발명의 조성물/제품이 사용되는 조건 하에서 수행된다.
여기에서 사용되는 용어 "당"은 락토스, 말토스, 소르보스, 트리오스, 펜토스, 헥소스, 만노스, 글루코스, 갈락토스, 크실로스, 프룩토스, 이소말토스, 에리스로스로 이루어진 군에서 선택되는 당과 같이, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 올리고사카라이드, 헥소스를 말한다.
당은 알데히드기(-CHO) 또는 케톤기(C=O)를 포함하며, 당을 반응성 있게 하는 탄소-산소 이중결합이 있다. 바람직하게, 용어 당은(CH2O)n으로 표현할 수 있으며, 여기에서 n은 3, 5 또는 6, 또는 5 또는 6과 같이 3 내지 6 범위이다.
당은 트리오스, 펜토스 또는 헥소스, 바람직하게 펜토스 또는 헥소스 당이고, 바람직하게 닫힌 체인 형태이다.
당은 수크로스, 프룩토스, 글루코스, 갈락토스, 말토스, 락토스 및 만노스로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
여기에서 사용되는 "구강 관리 제품"은 치료 약제의 전신적인 투여를 위한 목적으로 의도적으로 삼키지 않는 제품을 의미하지만, 구강 활동을 위해 모든 치아 표면 및/또는 구강 점막 조직에 실질적으로 접촉할 만큼의 충분한 시간 동안 구강에 유지될 수 있는 제품을 의미한다. 본 발명의 명세서에서 구강 관리 제품은 또한 틀니, 인공 치아 등을 세척하는 제품을 포함한다. 구강 관리 제품은 예, 파우더, 페이스트, 겔, 액체, 연고, 츄잉 검, 정제 또는 스프레이와 같이 적절한 물리적 형태를 가질 수 있다.
여기에서 사용하는 "세척 조성물" 및 "세척 제제"는 섬유, 그릇, 콘택트 렌즈, 다른 고체 물질, 머리카락(샴푸), 피부(피부 크림), 치아(구강세척제, 치약) 등과 같이, 세척되는 아이템으로부터 원치 않는 화합물 제거에 사용되는 조성물을 말한다. 용어는 조성물이 옥시다제 및 조성물에 사용되는 다른 효소(들) 및 조성물 내 다른 가역적 효소 억제제와 양립가능한 한, 원하는 특정 형태의 세척 조성물 및 제품의 형태(예, 액체, 겔, 과립 또는 스프레이 조성물)을 위해 선택되는 물질/화합물을 포함한다. 세척 조성물 물질의 구체적인 선택은 세척되는 표면, 아이템 또는 섬유 및 사용하는 동안 세척 상태를 위한 조성물의 원하는 형태를 고려하여 쉽게 결정될 수 있다.
상기 용어는 세척, 표백, 소독, 및/또는 물질 및/또는 표면을 멸균하는데 적절한 어떠한 조성물을 추가로 일컫는다. 상기 용어는 이들로 제한하는 것은 아니지만, 세제 조성물(예, 액체 및/또는 고체 세탁 세제 및 섬세한 섬유 세제; 유리, 나무, 세라믹 및 금속 조리대 및 창문과 같은 단단한 표면 세척 제제; 카페트 크리너; 오븐 크리너; 섬유 청정제; 섬유 유연제; 및 직물 및 세탁 전 표백제, 그릇 세제)를 포함한다.
실질적으로 여기에서 사용되는 용어 "세척 조성물"은 달리 기재되어 있지 않다면, 과립 또는 파우더 형태의 다목적 또는 강력 세척제, 특히 세척 세제; 액체, 겔 또는 페이스트 형태의 다목적 세척제, 특히 강력 액체(HDL)라고 불리는 형태; 액체 섬세한 섬유 세제; 손 설거지 또는 경량 설거지 세제, 특히 거품이 많이 나는 형태의 세제; 집안 및 공공 목적 용의 다양한 정제, 과립, 액체 및 헹굼 보조 형태의 기계 설거지 세제; 항균 손-세척 형태, 클렌징 바, 구강세척제, 의치 세척제, 차 또는 카페트 샴푸, 욕실 세척제를 포함하는 액체 세척 및 소독제; 헤어 샴푸 및 헤어 린스; 샤워 겔 및 거품 바쓰 및 금속 클리너; 추가 표백 및 스테인 스틱(stain-stick) 또는 전처리 형태와 같은 세척 보조물을 포함한다.
여기에서 사용되는 용어 "세제 조성물" 및 "세제 제제"는 오염된 제품의 세척을 위한 세정제에 사용되기 위한 혼합물에 대하여 사용된다. 몇몇 바람직한 양태에서 상기 용어는 세탁 섬유 및/또는 의복에 대하여 사용된다(예, "세탁 세제"). 다른 양태에서는, 접시, 칼붙이를 세척하는 데 사용되는 것과 같은 다른 세제를 말한다(예, "설거지용 세제"). 본 발명은 특정 세제 제제 또는 조성물에 제한하려는 의도는 없다. 실제로 상기 용어는 계면활성제, 옥시다제 뿐만 아니라, 전이효소, 가수분해 효소, 산환환원효소, 퍼히드로라제, 강화제, 표백제, 표백 활성제, 청분제 및 형광 염색제, 침전 억제제, 마스킹제, 효소 활성제, 효소 억제제, 항산화제 및 용해제를 포함하는 세제를 포함한다. 몇몇 바람직한 양태에서, 세제 제제는 이에 제한하는 것은 아니지만, WO 05/52161 및 WO 05/056782 뿐만 아니라 특허 출원 번호 10/576,331 및 10/581,014에 기재된 것도 포함한다. 하지만, 어떤 적절한 세제 제제도 본 발명에서 사용될 수 있기 때문에, 본 발명은 특정 세제 제제에 제한하려는 의도는 없다.
여기에서 사용하는 "설거지용 조성물"은 칼붙이를 포함하는 접시를 세척하는 모든 형태의 조성물을 말하며, 이에 제한되는 것은 아니지만 과립 및 액체 형태를 포함한다. 본 발명을 특정 형태 또는 식기류 조성물에 한정하려는 의도는 아니다. 실질적으로, 본 발명은 식기류(예, 이에 한정되는 것은 아니지만, 플레이트, 컵, 유리잔, 보울 등을 포함하는 접시) 및 칼붙이(예, 이에 한정되는 것은 아니지만, 스푼, 칼, 포크, 서빙 기구 등을 포함하는 기구), 이에 한정하는 것은 아니지만 세라믹, 플라스틱, 금속, 도자기, 유리, 아크릴 등을 포함하는 어떤 물질에 사용될 수 있다. 용어 "식기"는 여기에서 접시 및 칼붙이 모두에 관하여 사용된다.
여기에서 사용되는 효소의 "세척능"은 조성물에 효소의 추가가 없는 세제에 추가의 세척능을 제공하는 효소의 공헌도를 의미한다. 세척능은 적절한 세척 상태 하에서 비교된다.
여기에서 사용되는 용어 "적절한 세척 상태"는 특히 세제 시장권 내의 집안에서 실질적으로 사용되는 세척 온도, 시간, 세척 기계, 농도, 세제 종류 및 물의 경도의 상태를 나타낸다.
여기에서 사용되는 용어 "향상된 세척능"은 적절한 세척 상태 하에서, 세척 아이템(예, 직물 또는 식기 및/또는 칼붙이)로부터 얼룩 제거에 있어서 더 좋은 결과를 얻거나, 다른 효소와 비교해서 동일한 효과를 얻기 위해 무게에 근거하여 더 적은 효소가 필요한 것을 말한다.
용어 "유지 세척능"은 무게에 근거한 효소의 세척능이 적절한 세척 상태 하에서 다른 효소 대비 최소 80%인 것을 나타내는데 사용된다.
효소의 세척능은 적절한 테스트 조건 하에서 특정 대표적인 오염을 제거하는 능력에 의해 일반적으로 측정된다. 이러한 테스트 시스템에서, 세제 조성물, 농도, 물 경도, 세척 기계, 시간, pH 및/또는 온도와 같은 다른 적절한 요인이 특정 시장권 내 가정용 일반적인 조건과 유사하게 조절될 수 있다.
여기에서 사용하는 용어 "소독"은 아이템 표면의 미생물을 억제 또는 죽이는 것 뿐만 아니라, 표면으로부터 오염물의 제거를 의미한다. 본 발명은 특정 표면, 아이템 또는 제거될 오염물(들) 또는 미생물에 제한하려는 의도는 아니다.
반응 조절
모든 산화 반응은 산소의 존재를 필요로 하며, 따라서 조절된 산소 환경(산소가 한정된 환경), 산소 분자의 제한 또는 부재와 같이, 조성물이 밀봉된 용기에 담겨져 있는 한, 유의한 정도로 반응은 발생하지 않는다. 용기가 오픈되고, 조성물이 대기 공기 또는 산소 분자의 다른 공급원에 높여질 때, 반응은 일어날 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 포장된 제품을 제공하는데, 여기에서 조성물은 상기 포장된 제품 내에서 과산화수소의 생성을 방지하거나 감소할 수 있을 정도로 조절된 산소 환경, 또는 산소 제한된 환경, 예를 들어(이용가능한) 산소 분자의 부재와 같은 환경에서 유지된다.
다른 방법은 물이 조절된 환경에 있는 본 발명의 조성물을 제공한다. 여기에서 물의 농도는 조성물 또는 포장된 제품 내에서 과산화수소의 생성을 방지하거나 감소시킬 정도로 충분히 낮다. 이러한 조성물 내에서의 적절한 물의 농도는 약 1% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.2% 이하 또는 약 0.1% 이하처럼 약 2% 이하이다.
다르게는 반응은 본 기술 분야에서 잘 알려진 구분 방법에 의해서 서로로부터 효소와 기질을 물리적으로 분리시킴으로써 반응이 미리 일어나는 것을 방지할 수 있다. 하나의 양태에서, 첫 번째 옥시다제와 추가 산화환원효소를 포함하는 조성물 부분으로부터 첫 번째 기질을 분리함으로써 반응의 발생을 방지할 수 있다. 첫 번째 기질은 조성물을 활성화시키기 위해 첨가되거나, 상기 제품 매트릭스의 일반적인 성분 또는 조성물 추가 전 또는 추가하는 동안 상기 제품 매트릭스에 보충된 것으로서 제품 매트릭스 부분을 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 첫 번째 기질을 포함하는 추가 조성물이 있는 키트의 일부분 내에, 여기에서 언급하고 있는 것처럼, 첫 번째 옥시다제(예, 폴리올 옥시다제)와 추가 산화환원효소을 포함하는 조성물을 제공한다. 여기에서 상기 첫 번째 조성물과 추가 조성물은 서로 분리되어 있다.
본 발명의 조성물은 사용시 조합용으로 둘 이상의 시스템으로 제공될 수도 있지만, 또한, 캡슐화 또는 마이크로캡슐화와 같은 기술이 기질로부터 분리된 조성물 효소 부분을 유지하기 위해서 사용될 수 있다. 마이크로-캡슐로부터의 유리는 예를 들어 본 발명 조성물 사용시 기계적 힘이나 희석에 의해 일어날 수 있다.
하나의 양태로서 본 발명의 조성물은 최소 두 포트를 포함하는 키트 부분을 포함하는데, 여기에서 첫 번째 포트는 첫 번째 옥시다제와 추가 산화환원효소를 포함하고, 두 번째 포트는 첫 번째 기질을 포함한다.
하나의 양태에서 화장품(또한, 구강 관리 제품)과 같은 여기에서 개시되고 있는 제품에서, 과산화수소의 발생이 사용시 일어나게 하도록, 예를 들어 물리적으로 문지름으로써 사용시 인 시추 상에서 효소 시스템의 유리가 일어나서 첫 번째 기질과 접촉되도록 하는, 하지만 보관 시에는 일어나지 않도록 본 발명의 조성물을 구분하는 것이 유리하다.
본 발명의 하나의 양태로서 조성물의 pH는 5 내지 9, 바람직하게 6 내지 8이다. 본 발명의 조성물이 구강 관리 제품일 때, SOX와 같은 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제와 산화환원효소를 사용하는 것이 바람직하고, 이는 입안의 pH, 즉, pH(약) 5 내지(약) 9, 바람직하게 약 6 내지 약 8 범위의 pH에서 실질적으로 활성이 있다. 추가로, 소르비톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제와 산화환원효소는 대기 온도, 또는 체온에서 활성이 있다.
하나의 양태에서 첫 번째 옥시다제, 및 또는 추가 산화환원효소, 및 어느 다른 효소의 존재는 고정되어 있다.
추가 효소 및 효소 시스템
본 발명에 따른 조성물은 락토퍼옥시다제와 같은 퍼옥시다제, 락카제, 아밀로글루코시다제, 노바밀TM와 같은 말토제닉 및 비-말토제닉 아밀라제와 같은 아밀라제, 글루코아밀라제, 덱스르타나제, 프로테아제, 라이소자임, 뮤타나제, 리파제, WO2004064537에 기재된 아실-트란스페라제와 같은 아실-트란스페라제, 및 크실라나제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 효소와 같은 추가 효소를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 구강 조성물 또는 여기에서 언급하고 있는 다른 조성물과 같은 본 발명의 조성물은 티오시안산염을 포함할 수 있으며, 과산화수소 생성 때문에, 티오시안산염을 하이포티오시안산염으로 변화시킨다. 구강 관리 제품에 대해서는, 침에 일반적으로 충분한 양의 락토퍼옥시다제가 있어, 과산화수소 존재 하에서 티오시안산염을 하이포티오시안산염으로 변화시킬 수 있다. 하지만, 본 발명에 따른 조성물은 이러한 변화을 촉진하기 위해 락토퍼옥시다제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 인 시추상에서 효과적인 항균제의 생산을 가능하게 한다.
과산화수소의 발생 비율은 산소의 이용률이 제한되면 제한될 수 있는 것이 알려져 있다. 따라서, 산소 발생 시스템에 효소 시스템의 커플링이 바람직하다고 생각된다.
용도
본 발명에 따른 조성물은 예를 들어, 치아 종이 및 직물과 같이 화이트닝 및/또는 표백이 필요한 물질 종류를 처리하는데 사용할 수 있다.
표백 및/또는 화이트닝을 위한 이러한 조합의 효소 사용의 장점은 화이트닝 및/또는 표백 효과가 예를 들어, 구강 관리 제품에서 표백제의 선사용과 비교할 때 위험하지 않은 물질을 사용하여 이루어진다는 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 과산화수소 유발에 의해 항균 효과를 추가로 포함한다. 본 발명의 추가 양태는 악취 또는 치주염에 관련하는 미생물 효과를 치료 또는 방지하기 위한 구강 관리 제품의 제조에 있어서 본 발명에 다른 조성물의 사용에 관한 것이다.
본 조성물의 다른 유익한 용도는 음식 방부제에 있는데, 여기에서 조성물은 1 몰의 당이 사용될 때마다, 2 몰의 O2를 이용하는 산소 제거제로서 작용한다.
개인 위생 분야에 있어서, 본 발명의 조성물은 항박테리아제로서 작용하기에 충분한 양으로 치약, 특히, 치아 화이트닝, 구강 세척, 의치 크리너, 액체 비누, 피부 관리 크림 및 로션, 헤어 케어 및 바디케어 제제 및 콘택트 렌즈 세척용 액제에 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은 세탁 세제 조성물 또는 설거지 세제 조성물의 구성성분이 될 수 있으며, 과산화수소 발생 기원으로서 사용될 수도 있다. 세탁 세제 조성물은 계면활성제, 본 발명의 상기 조성물을 함유할 수 있다. 설거지 세제 조성물은 상기 본 발명의 조성물과 표백 전구체 또는 퍼옥시산을 함유할 수 있다. 특히 본 발명의 조성물은 오염을 제거하는데 사용될 수 있다.
세제
본 발명에 따른 세제(제품)은 본 발명에 따른 조성물을 함유한다. 따라서, 하나의 양태에서 본 발명은 세척 조성물, 세척 제제, 세제 조성물 또는 세제 조성물과 같은 세제 제품에서의 본 발명 조성물의 이용을 제공한다.
세제(제품)은 표백 또는 화이트닝제로 사용될 수 있으며, 소독제, 또는 표백/화이트닝 및 소독제 모두로 사용될 수 있다.
세제(제품)은 여기에서 언급한 추가 효소 또는 효소 시스템, 특히 포옥시다제, 프로테아제, 아밀라제, 리파제, 아실-트란스페라제 및 락토퍼옥시다제(선택적으로 티오시안산염의 존재 하)를 함유할 수 있다.
하나의 양태에서, 세제 제품은 세척 조성물 또는 세척 제제의 형태일 수 있다.
하나의 양태에서, 세제 제품은 세제 조성물 또는 세제 제제 형태일 수 있다.
세제 제품은 설거지 조성물이다.
바람직하게 본 발명에 따른 세제 제품은 적절한 세척 상태 하에서 본 발명의 조성물을 포함하지 않는 동등한 제품과 비교할 때, 향상된 세척능을 갖는다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 조성물을 포함하는 세제, 및 표백 증진제는 세탁 세척액에서 오염을 표백하기 위하여 활성 산소를 발생시키기 위해 사용된다.
몇몇 양태에서 세제 조성물은 세탁 세척액에서 오염을 표백하기 위하여 활성 산소를 발생시키기 위해 사용되는 아실-트란스페라제와 이의 기질을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 양태에서 본 조성물은 구강 관리 조성물,(구강 투여되는) 의약 조성물, 식품 또는 사료 조성물과 같은 먹을 수 있는 조성물이다.
용어 '먹을 수 있는 조성물'은 구강 투여 또는 구강을 통한 소모용 조성물을 의미한다.
먹을 수 있는 조성물은 인간(또는 동물) 소비에(일반적으로) 적합한 하나 이상의 항료, 보존제, 조직 성분, 유화제, 감미료, 습윤제 및/또는 표백제를 포함한다.
구강 관리
본 발명의 하나의 양태로서 본 발명에 따른 조성물과 구강 관리 제품에 사용되는 성분을 함유하는 구강 관리 제품을 제공한다.
본 발명의 추가 양태에서 본 발명에 따른 구강 관리 제품은 소르비톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 효소 , 추가 산화환원효소와 같은 추가 효소 및 소르비톨과 같은 폴리올 및 구강 관리 제품에 사용되는 성분을 함유하고, 원하는 항균 효과 및/또는 화이트닝 및/또는 표백 기능이 있다.
구강 관리 제품의 예는 치약, 치아 크림, 겔 또는 치아 파우더, 치아, 구강 린스, 구강 스프레이, 전- 또는 후-칫솔질 린스 제제, 츄잉 검, 로젠지(lozenge) 및 캔디를 포함한다.
구강 관리 제품은 티오시안산염, 글루콘산 아연, 라이소자임, 락토페린, 락토퍼옥시다제 및 아밀로글루코시다제와 같은 추가 활성 성분을 포함할 수 있다. 추가 성분은 WO97/06775에 열거되어 있으며, 산화환원반응 매개자도 포함한다.
하나의 양태에서 본 발명에 따른 구강 관리 조성물/제품은 불소를 추가로 포함한다.
치약 및 치아 겔은 일반적으로 연마 광택제, 거품제, 향료, 습윤제, 결합제, 농축제, 감미제, 화이트닝/표백/오염 제거제, 물 및 선택적으로 효소와 같은 성분을 포함한다.
플라그 제거액과 같은 구강 세척액은 일반적으로 물/알코올 용액, 향료, 습윤제, 감미료, 거품제, 색조, 또는 선택적으로 효소와 같은 성분을 포함한다.
츄잉 검: 츄잉 검 제조를 위한 적절한 조성물은 WO2005/006872 및 US 4,564,519에 기재되어 있다.
구강 관리 제품에서 사용되는 소르비톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제와 추가 효소(예, 추가 산화환원효소)의 양은 안전하고 효과적인 양이어야 하는데, 이는 처리되는 상태를 유의하게 변형하거나 원하는 화이트닝 및/또는 표백 효과를 유발할 정도로 충분한 양이지만 심각한 부작용을 피할 수 있을 만큼의 적은 양을 의미한다.
추가의 양태에서 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 구강 관리 제품을 치아 표백 및/또는 화이트닝에 적절한 양과 시간으로 치아에 접촉시키는 것을 포함하는, 치아의 표백 및/또는 화이트닝 방법을 제공한다.
본 발명은 비-우식원성 기질(즉, 수크로스, 글루코스, 프룩토스, 말토스 등과 같은 우석원성 당으로 분해되지 않는 기질)에 작용할 수 있는 소르비톨 옥시다제와 같은 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제의 사용을 제공함으로써 종래 기술에 비해 장점을 가진 안전한 치아 화이트닝 조성물을 제공한다.
식품 및 사료
본 발명의 조성물은 식품 및 사료 및 식품 및 사료 환경, 제조, 착유실, 치즈 제조 설비, 육류 가공 공장, 채소 및 과일 세척 및 가공 공장과 같은 제조 설비 과정, 레스토랑 등에서의 일반적인 소독에 사용된다.
고기(즉, 생선을 포함하는 동물 고기) 가공 공장에서, 본 발명의 조성물은 고기 및 이로부터 유래한 식품 제품의 세척 및 소독에 사용될 수 있다. 폴리올 옥시다제/추가 효소 시스템의 사용은 이것이 특히 고기 제품의 표면 내 또는 위에 있는 발효성 당의 농도를 줄이고, 따라서 원치 않는 미생물의 성장을 감소시킬 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 본 발명에 따른 조성물 추가로 알칼리 실리케이트를 포함할 수 있으며(US2004062851, 참고 문헌으로서 포함됨), 이러한 조성물은 고기 제품의 오염을 제거하는데 특히 유용하다. 또한 알칼리 실리케이트의 사용은 고기 및 고기 제품의 수분 유지 특성을 향상시키고, 고기 및 고기 제품에서 본 발명 조성물의 유지를 증가시키는데 사용될 수 있다.
추가 장점은 산성 추가 생성물의 발현으로 인하여 pH를 저하시키는 것이고, ㄸ또한, 고기 표면 내 또는 위에 있는 미생물의 발생을 억제할 수도 있다. 유사한 장점이 채소 및 과일 세척 및 가공 공장에서 나타날 수 있다.
또한 본 발명 조성물은 식품 또는 사료 제품에 이용될 수 있다. 과산화수소는 유제품 및 계란 제품 생산에 항균제로서 널리 사용된다. 적절하게 본 발명에 따른 조성물은 우유, 크림, 치즈, 유장, 요구르트, 버터와 같은 유제품 또는 계란 노른자 또는 흰자와 같은 계란으로 이루어진 군에서 선택되는 식품 제품에 있거나 추가될 수 있다.
산성 추가 생성물의 축적으로 인한 pH 저하는 또한 치즈와 같은 다른 식품 형태에 이로운 것으로 여겨진다. 빠른 pH 감소는 체다 치즈와 이탈리아 단단한 치즈의 숙성 속도를 증가시키고, 숙성 및 보관 시간을 감소시킨다. 따라서, pH의 감소는 또한 치즈의 향상된 맛에 관여한다.
하나의 양태에서 본 발명의 조성물은 과일 주스와 같은 음료에 사용된다. 과일 주스는 일반적으로 적절한 첫 번째 기질을 함유하고, 따라서, 과일 주스에 추가 첫 번째 기질을 추가하는 것이 불필요하며, 다르게는 과일 주스에 여기에서 언급된 첫 번째 기질이 보충될 수 있다.
추가. O2는 크실로스 생성에 의해 제거되고, 이는 식품 부패를 방지할 수 있다. 추가의 이점은 어떤 pH의 저하가 관찰되지 않는 SOX가 단독으로 사용된 시스템과 비교할 때, pH를 낮추는 것이다. pH 저하는 식품 부패를 방지하거나 줄일 수 있다.
개인 관리 제품
개인 관리 영역에서, 본 발명의 조성물은 의치 클리너와 같은 구강 관리 제품, 액상 비누, 스킨 케어 크림 및 로션, 헤어 케어 및 바디 케어 제제 및 콘택트 렌즈용 액제 보다 개인 관리 제품에 항박테리아 제로서 작용하기에 유용한 양으로 첨가될 수 있다.
종이 제조
본 발명의 조성물은 또한 제조 공장 세척용으로 사용될 수 있으며, 생성된 과산화수소는 카보하이드레이트를 해당 산으로 산화시키고, 결국 스케일과 같은 무기산의 양이온과 킬레이트를 형성하는 것으로 알려져 있다. 이것은 침전물의 세척 및/또는 조절을 더욱 가능하게 하고, 물 줄기와 관련하여 혼탁 정도를 감소시켜, 착색 감소 뿐만 아니라, 치전 능을 향상시킨다. 이러한 모든 작용은 세척 및 방출 조절 과정을 더 쉽고 더욱 경제적으로 만든다(WO06/061018 참조).
화장품
글루코스 옥시다제는 화장품 및 화장품류용 상업용 보존 시스템의 주성분으로 사용되어 왔다. 하지만, 본 발명은 과산화수소를 생성하는데 보다 효과적인 시스템을 제공하고, 및/또는 또한 사용시 효과적인 항균/항박테리아 활성을 제공하기 때문에, 글루코스 옥시다제 사용의 적절한 교체를 제공한다. 또한, 사용시 피부 표백 또는 화이트닝을 하는 화장 기능이 있는 두가지 기능성 제품을 제공한다.
락토퍼옥시다제 시스템은 수많은 화장품에 사용된다. 본 발명에 따른 화장품 조성물 또는 제품은 따라서 락토퍼옥시다제 및 티오시안산염을 추가로 포함할 수 있다.
소르비톨과 같은 폴리올은 일반적으로 화장품의 주요 성분이고, 본 발명에 따른 조성물에서 폴리올 옥시다제에 대한 적절한 기질을 제공하기 위해 화장품에 추가될 수 있다.
화장품에서 본 발명 조성물의 사용은 다음과 같은 하나 이상의 이점을 제공한다: 화장품의 보존, 및 피부에 적용했을 때 미생물/박테리아 활성, 및 피부 화이트닝/표백 효과.
화장품은 항산화제, 결합제, 연화제, 유화제, 습윤제, 색소, 윤활제, 방부제, 용매, 방향제, 계면활성제, 불활성 베이스 물질가 같은 담체 물질, 안정화제 및 농축제를 포함한다.
본 발명의 조성물/제품은 립스틱, 립글로스, 립펜슬, 립-인크; 리퀴드 파운데이션; 크림 파운데이션; 파우더; 루즈(블러쉬 또는 블러셔); 브론져; 마스카라; 아이라이너 및 아이쉐도우; 매니큐어; 컨실러; 예, 얼굴 및 몸에 수분을 제공하는 크림 및 로션과 같은 스킨 케어 제품; 선스크린 및 선로션; 피부 결점을 치료 및 숨기는 치료제품으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화장품 제품 형태에 사용될 수 있다.
화장품은 또한, 사용 영역뿐만 아니라 제품 형태에 의해서 기술될 수 있다. 화장품은 리퀴드 또는 크림 에멀젼; 압착 및 루스 파우더; 디스펄젼; 및 무수 크림 또는 스틱이 될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물/제품은 또한 피부 표백 및/또는 화이트닝과 같은 화장 기술에 사용될 수 있다.
피부 표백
히드로퀴논은 피부 표백을 위한 제제 성분으로서 사용되어 왔다. 하지만, 최근 US 환경보호국에서는 하이드로퀴논을 함유한 OTC 피부 표백 약품이 잠정적으로 발암성이고, 일반적으로 안정하고 효과적인 것으로 알려져 있지(GRAS) 않으며, 부정표시된 것이라는 것을 확립하는 제안법제를 공표했다.
본 발명에 따른 조성물 및 제품은 피부 표백을 위한 효소를 기초로 한 제품 제조에 사용될 수 있으며, 따라서, 히드로퀴논 사용에 대해 안전한 대체품을 제공한다.
피부 표백 제품은 적절한 원료 매트릭스 및 슨스크린 뿐만 아니라, 감초 추출물, 뽕나무 추출물, 알부틴, 코지산, 월귤나무 추출물, AHA 혼합물, 살리실산, 알로에산, 시트르산, 락트산과 같은 다른 표백제를 포함할 수 있다.
헤어 표백
헤어 컬러링 표백을 위한 화학적 산화제가 사용된다. 적절한 산화제는 과황산(persulfate), 녹니석(chlorite) 및 결국 과산화수소, 또는 요소, 멜라닌, 붕산나트륨 함유 다른 제품이 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 헤어 표백을 위하여 과산화수소의 안전한 대체 원료로서 사용될 수 있다
또한 적절한 헤어 표백 조성물은 케라틴 섬유를 착색하는데 사용될 수 있으며, 따라서, 본 발명 조성물뿐만 아니라 최소 하나의 염색 전구체를 함유한다. 또한, 본 발명은 본 발명 조성물을 사용하여 케라틴 함유 섬유를 컬러링하는 방법에 관한 것이다.
페인트
본 발명 본문에서 사용되는 용어 '페인트'는 색소 또는 비색소 코팅으로 커버하여 물체 또는 표면을 보호 및/또는 착색하는데 사용되는 제품군을 의미하고, 니스, 우드 스테인, 셸락, 락커 및 에나멜을 포함한다. 페인트는 거의 모든 종류의 제품에 사용될 수 있다. 페인트는 최종 제품이 그 자체로서 페인트된 물품이기 때문에, 반제품(semifinished product)이다.
페인트는 해상 페인트와 같은 건조 페인트는 자연 수성 환경에 노출되는 용도로 사용될 수 있다. 해상 페인트는 조류, 발니칼 등의 유기체의 성장에 의해 유발되는 보트와 배의 선체 상의 항-부착물을 방지하거나 감소시키기 위해 사용된다.
페인트는 장식용 페인트일 수 있으며, 예를 들어 빌딩과 다른 물건의 인테리어 또는 외부에 사용될 수 있다.
페인트는 보호용 페인트일 수 있으며, 페인트가 적용되는 물질 또는 표면에 습식 부패 또는 건조 부패와 같은 미생물 부패를 방지하거나 감소시킨다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 페인트의 방부제로서 사용될 수 있다. 다르게 또는 추가로, 조성물은 해상 페인트와 같이 부착물을 감소시키기 위한 페인트에 사용될 수 있으며, 여기에서 과산화수소의 생성은 표면 위에 부착 유기체의 부착 또는 생성을 방지하거나 감소시키는 산화 층을 형성한다. 본 발명에 따른 조성물을 함유하는 이러한 페인트는 페인트 내에 발효성 기질의 추가 또는 유의한 축적 없이 과산화수소가 생성되기 때문에, 이러한 문제에 효과적인 효소 용액을 제공하고, 이는 특히 결국 페인트 내 효소가 불활성화된다면, 실질적으로 항-부착물 효과를 발휘할 수 있다.
살충제
살충제는 일반적으로 35% 정도의 과산화수소를 포함하고, 스프레이 또는 액제로서 사용할 때, 1% 또는 그 이하로 보통 희석시킨다. 과산화수소는 많은 실내 및 실외 비-식품 및 식품 작물(예, 과일, 너트 및 야채)에, 수확 전 후 및 식품 저장 설비 소독 용으로 사용된다. 목표로 하는 해충은 일반적으로 식물 질병을 일으키는 곰팡이 및 박테리아를 포함하는 미생물이다. 식물 병원을 억제하거나 조절하는데 사용되는, 과산화수소 포함 살충제는 일반적으로 잎에 스프레이되거나, 또는 가지 및 뿌리에 담그거나, 또는 식재 전 토양 처리로서 사용된다.
따라서, 본 발명에 따른 조성물은 인 시추 상에서 과산화수소 생성을 유발하는 직접적인 살충제로서 또는 적절한 표면에 적용하여 과산화수소의 발생을 위한 시스템으로서 사용될 수 있다.
추가양태:
1. 소르비톨 옥시다제, 첫 번째 기질, 및 산화환원효소를 포함하는 조성물로서, 여기에서 첫 번째 기질은 소르비톨 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소와 두 번째 기질을 생성하고, 두 번째 기질은 산화환원효소에 의해 산화되어 과산화수소와 생성물을 형성한다.
2. 제 1 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물로서, 여기에서 첫 번째 기질은 D-소르비톨, D-크실리톨, D-만니톨, D-아라비톨, 글리세롤, 이노시톨, 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올, 및 1,4-부탄디올로 이루어진 군에서 하나 또는 그 이상 선택된다.
3. 제 2 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물로서, 여기에서 첫 번째 기질은 D-소르비톨 또는 D-크실리톨로 이루어진 군에서 하나 또는 그 이상 선택된다.
4. 제 3 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물로서, 여기에서 첫 번째 기질은 D-소르비톨이다.
5. 제 1 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물로서, 여기에서 산화환원효소는 헥소스 옥시다제, 글루코스 옥시다제, 카보하이드레이트 옥시다제, 및 올리고사카라이드 옥시다제로 이루어진 군에서 하나 또는 그 이상 선택된다.
6. 제 5 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물로서, 여기에서 산화환원효소는 카보하이드레이트 옥시다제, 헥소스 옥시다제 또는 글루코스 옥시다제로 이루어진 군에서 하나 또는 그 이상 선택된다.
7. 제 6 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물로서, 여기에서 산화환원효소는 헥소스 옥시다제이다.
8. 제 1 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물로서, 여기에서 소르비톨 옥시다제는 스트렙토미세스 균주로부터 유래한다.
9. 제 1 내지 8 양태 중 어느 하나의 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물로서, 여기에서 조성물의 pH는 5 내지 9이다.
10. 제 1 내지 9 양태 중 어느 하나의 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물로서, 여기에서 조성물의 pH는 6 내지 8이다.
11. 제 1 내지 10 양태 중 어느 하나의 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물로서, 여기에서 소르비톨 옥시다제와 산화환원효소는 주위 온도에서 활성이다.
12. 제 1 내지 11 양태 중 어느 하나의 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물 및 구강 관리 제품에 사용되는 성분을 구강 관리 제품.
13. 소르비톨 옥시다제 화이트닝 및/또는 표백을 위한 소르비톨 옥시다제의 용도.
14. 화이트닝 및/또는 표백을 위한 제 1 내지 10 양태 중 어느 하나의 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물의 용도.
15. 치아 화이트닝 및/또는 표백을 위한 제 13 내지 14 양태 중 어느 하나의 양태와 같은 본 발명에 따른 용도.
16. 제 1 내지 10 양태 중 어느 하나의 양태와 같은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 구강 관리제품을 표백 및/또는 화이트닝에 적절한 양과 시간 동안 치아와 접촉하는 것을 포함하는, 치아의 표백 및/또는 화이트닝 방법.
17. 의약품으로서의 소르비톨 옥시다제 및 D-크실리톨의 용도.
18. 제 17 양태와 같은 본 발명에 따른 의약품으로서, 여기에서 소르비톨 옥시다제는 스트렙토미세스 균주로부터 유래된다.
19. 소르비톨 옥시다제 및 D-크실리톨, 및 구강 관리 제품에 사용되는 성분을 포함하는 구강 관리 제품.
20. 치아 화이트닝 및/또는 표백을 위한 소르비톨 옥시다제 및 D-크실리톨의 용도.
도:
도 1: 발현 플라스미드(pKB105-TAT-SOX-7775).
도 2: 플라스미드 "pKB105-CelA-Sox7775"
도 3: 첫 번째 옥시다제(SOX)와 비교한, 1x 내지 3000x 과량의 추가 효소(산화환원효소)가 있는 조성물을 이용한 H2O2 생성 초기 속도, 300㎕ ABTS 분석에서 5분에 걸쳐 측정. 보여지는 과산화수소 생성 속도에서 약 250-300% 증가까지 현저한 상승효과가 글루코스 옥시다제 및 헥소스 옥시다제 추가 효소 모두에 나타났다.
도 4: 폴리올 옥시다제와 비교한, 1x 내지 3000x 과량의 추가 효소(산화환원효소)가 있는 조성물을 이용한 H2O2 생성 초기 속도, 300㎕ ABTS 분석에서 5분에 걸쳐 측정. 현저한 상승효과가 글루코스 옥시다제 및 헥소스 옥시다제 추가 효소 모두에 나타났고, 특히 폴리올 옥시다제 비교 2x 용량의 추가 효소와 같이 1x을 이상인 용량에서 나타났다.
도 5a: pET 24a - 소르비톨 옥시다제(H7775) 발현 벡터.
도 5b. 대장균(E.coli) BL21(DE3) pLysS 균주 내에서의 활성 소르비톨 옥시다제의 발현:
a) 스트렙토미세스 H-7775 SOX 합성 유전자를 코딩하는 1.27 NdeI-BamHI 단편을 함유하는 발현 벡터.
b) 기질로서 소르비톨을 이용한 인 겔 오버레이 활성 분석(PMS/NBT). 음성 대조군: 레인 1 내 글루코스 옥시다제(GOX), 레인 2-10은 다른 형질변환체 유래 세포 용해물이다.
도 6. 스트렙토미세스 리비단스 균주 g3s3 내 추정 SOX 유전자 발현을 위한 구조체. 추정 SOX 유전자는 Nco1-BamH1 PCR 단편으로서 클로닝되고 삽입되었다.
아래의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태 및 형태를 증명하고 추가적으로 설명하기 위해 제공된 것으로, 본 발명의 권리범위를 한정하려는 것은 아니다.
하기에 기재되는 실시예에서 아래의 약어가 사용된다.
℃(섭씨 온도); rpm(분당 회전); H2O(물); HCl　(염산); aa(아미노산); bp(염기쌍); kb(킬로염기쌍); kD　(킬로달톤); gm(그램); ㎍ 및 ug(마이크로그램s); mg(밀리그램); ng(나노그램); ㎕ 및 ul(마이크로리터); ml(밀리리터); mm(밀리미터); nm(나노미터); ㎛ 및 um(마이크로미터); M(몰랄); mM(밀리몰랄); μM 및 uM(마이크로몰랄); U(유니트); V(볼트); MW(분자량); sec(초); min(s)(분/분(s)); hr(s)(시/시(s)); MgCl2(염화마그네슘); NaCl(염화나트륨); OD280(280 nm에서의 광학 밀도); OD600(600 nm에서의 광학 밀도); EFT("효과적인 발효 시간"); HDL(강력 세제액); EtOH(에탄올); PBS(포스페이트 완충 식염수 [150 mM NaCl, 10 mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 7.2]); SDS(소디움 도데실 설페이트); Tris(트리스(히드록시메틸)아미노메탄); TAED(N,N,N',N'-테트라아세틸에틸렌디아민); w/v(부피 당 무게); v/v(부피 당 부피); GOX 및 GOx(글루코스 옥시다제); AOX 및 AOx(알코올 옥시다제); COX 및 Cox(콜린 옥시다제); HOX 및 HOx (헥소스 옥시다제); SOX 및 Sox(소르비톨 옥시다제); AATCC(미국섬유화학염색자협회); WFK(wfk Testgewebe GmbH, Bruggen-Bracht, Germany); Testfabrics(Testfabrics Inc, Pittston PA,); ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA); Geneart(Geneart, Regesburg, Germany); Invitrogen(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); Baker(J.T.Baker, Phillipsburg, NJ); NAEF(NAEF, Press and Dies, Inc., Bolton Landing, NY); Fluka(Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland); Prometric(Prometic Biosciences, Wayne NJ); Minolta(Konica Minolta. Glen Cove, NY);.및 Sigma(Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO).
실시예 1: 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans ) 내에서 스트렙토미세스 sp. h-7775의 소르비톨 옥시다제를 발현하는 균주의 구축
소르비톨 옥시다제의 단백질 서열(SEQ ID NO:1)을 공개된 아미노산 서열로부터 얻었다(예, Hiraga et al ., Biosci. Biotechnol. Biochem., 62: 4347-353 [1998] 참조). 스트렙토미세스 코엘리콜롤( ceolicolor ) SCO6772 유전자(SEQ ID NO:3)의 트윈-아르기닌 경로의 시그날 서열은 스트렙토미세스 코엘리콜롤( Streptomyces coelicolor )의 완전한 게놈 서열로부터 얻었다.
소르비톨 옥시다제는 스트렙토미세스에서 SCO6772 단백질(SEQ ID NO:3)의 시그날 서열과 소르비톨 옥시다제(SEQ ID NO:1)의 융합 단백질로서 발현되었다. NcoI의 제한 부위는 클로닝을 위하여 DNA의 5' 말단에 도입하였고, 2 위치에서 아미노산 글리신 잔기의 추가를 일으켰다(SEQ ID NO:4 참조).
BamHI을 위한 제한 부위는 클로닝을 위하여 DNA의 3' 말단에 도입하였다. 융합 유전자의 코돈은 스트렙토미세스 리비단스 내에서 발현을 위하여 최적화하였다. DNA는 Geneart에 의해 합성되었다. 두 개의 제한 부위를 연결하는 DNA 단편(즉, NcoI로부터 BamHI까지(SEQ ID NO:5))을 BamHI으로 완전히 그리고 NcoI으로 부분적으로 잘려진 스트렙토미세스 발현 플라스미드 pKB105(2005.12.16.자로 출원된 U.S. 특허 출원 번호 11/303,650, 전체로 참고문헌으로서 병합됨) 내로 클로닝하였다.
발현 플러스미드(pKB105-TAT-SOX-7775; 도 1)을 스트렙토미세스 리비단스 균주 g3s3(U.S. 특허 출원 번호. 11/305,650, supra)로 형질변환하고, 3개의 형질변환체를 선택하여 30℃, 50 ug/ml 티오스트렙톤 존재하에서 2-3일간 TS 배지에서 성장시켰다. 그 후, 세포를 항균제가 없는 생산 배지로 이식시키고, 추가 3일간 계속 성장시켰다. 그 후, 배양균 1 ml를 각 2개의 배양 튜브로 이동시키고, 세포를 상청액으로부터 세포를 분리시키기에 충분한 조건 하에서 원심분리에 의해 제거시켰다. 이들 2개의 배양 튜브로부터 얻어진 상청액을 효소 활성 분석에서 테스트하였다. 두 개의 올리고(SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7)를 Invitrogen으로부터 얻었다.
Figure 112008036182013-PCT00003
(SEQ ID NO:6)
Figure 112008036182013-PCT00004
(SEQ ID NO:7)
소르비톨 옥시다제 유전자를 증폭시키고, 소르비톨 옥시다제 유전자를 celA 시그날 서열에 융합시키기 위하여 프라이머를 PCR에서 사용하였다. 1x 완충액 내 DNA, dNTPs, 프라이머 및 4% DMSO를 함유하는 PCR 반응 혼합물을 4분간 98℃까지 가열시켜 변성시켰다. 헤르쿨라제®II 효소(Stratagene)를 튜브에 첨가하고, PCR 반응을 98℃ 30초간, 62℃ 30초간 및 72℃ 1분 8초 동안 30 사이클로 실시하였다. 72℃에서 최종 증폭을 5분간 실시하고, 반응물을 4℃로 냉각시켰다.
결과물인 PCR 단편은 celA 시그날 서열 일부, 소르비톨 옥시다제 유전자, 및 2개의 제한 효소 부위를 포함하는 벡터 서열 일부를 함유하였다(SEQ ID NO:8).
PCR 단편을 제한 효소 NheI 및 BamHI로 잘라 벡터 서열 부위를 제거하였다. 그 후, 얻어진 단편을 발현 벡터 pKB105로 클로닝하여 플라스미드 "pKB105-CelA-Sox7775"를 제조하였다(도 2 참조). 발현 플라스미드를 스트렙토미세스 리비단스 균주 g3s3 내로 형질변환하고, 3개의 형질변환체를 선택하여 30℃, 50 ug/ml의 티오스트렙톤 존재 하에서 2-3일간 TS 배지에서 배양시켰다. 그 후, 세포를 항생제가 없는 생산 배지에 이동하여 추가 3일 동안 계속 배양시켰다. 그 후, 1 ml 샘플을 각 2개의 새로운 배양 튜브 내로 이동시키고, 세포를 제거하고, 효소를 실시예 2 처럼 정제하였다.
실시예 2: 대장균(E. coli ) 균주 BL21(DE3)pLysS 내에서 스트렙토미세스 sp. H-7775 유래 소르비톨 옥시다제 유전자의 발현
Hiraga et al. 1998. Bioscience Biotech Biochem. 61:1699-1704, 1998에 의해 공개된, 스트렙토미세스 sp . H-7775 SOX 유전자 유래 소르비톨 옥시다제 유전자의 아미노산 서열은 서열 데이터베이스로부터 검색하였다.
H-7775 SOX 유전자를 코딩하는 합성 유전자(중성 코돈 함유)를 E. coli 균주 BL21(DE3)pLysS 내에서 소르비톨 옥시다제 유전자를 발현하기 위해 사용하였다. SOX 유전자 함유 발현 벡터 pET 24a는 Nde1 + Bam H1 단편으로서 클로닝되었다. 얻어진 플라스미드(도 5a.)를 E. coli Top10 세포(Invitrogen, USA) 내에서 형질변환하고 증식시켰다. 1.2 kb SOX 유전자를 포함하는 카나마이신 저항성 형질변환체를 직접 콜로니 PCR 방법으로 확인하였다. SOX 양성 형질변환체를 배양하고, 플라스미드 DNA를 분리하였다. 그 후, 클로닝된 SOX 유전자 함유 플라스미드 DNA를 숙주 균주 BL21(DE3)pLysS를 형질변환하기 위해 사용하였다. 완전한 형질변환 반응이 25ml LB + 항생제 카나마이신(50ug/ml) 및 클로람페니콜(34ug/ml)을 포함하는 250ml 플라스크를 접종하기 위해 직접 사용되었다. 배양체를 37℃, 밤새 쉐이킹하여 배양하였다. 카나마이신(50ug/ml) 및 클로람페니콜(34ug/ml)을 함유하는 500 ml의 LB 포함 플라스크 2 리터를 25 ml의 밤새 배양체로 접종하고, 2시간 동안 성배양시켜 약 OD600 O.4-O.6 중간 대수상에 도달하게 하였다. IPTG를 배양체에 추가하여 최종 농도 1mM로 하였다. 배양체를 추가 2시간 동안 추가 배양하고, 원심분리로 수확하였다. 얻어진 펠렛은 포스페이트 완충액에 재현탁하고, 세포를 세포 붕괴/용해를 위하여 프렌치 프레스를 통과시켰다. 다른 세포 용해물을 sox 활성에 대해 분석하고(아래 표 1 참조), 겔 전기영동에 의해 분획화하였다(천연 및 변성 상태). 세포 용해물을 천연 겔 상에서 분획화하였고, 기질로서 소르비톨과 NBT의 PMS 매개 환원에 근거한 분석을 이용하여 인-겔 오버레이 활성 분석(in-gel overlay activity assay)에서 추가 테스트하였다. 도 5b은 황색단백질에 대응하는 분리된 착색 단백질과 소르비톨에 대해 활성이 있는 SOX 단백질의 존재를 보여준다. PMS/NBT는 황색단백질에 대한 진단 조사방법으로 PMS=페나진 메토설페이트는 환원된 FAD에 의해 환원되는 산화환원반응 매개자이다. 또한, 글루코스 옥시다제는 도 5의 레인 1에서 황색단백질이지만, 소르비톨에 대해 활성이 없으며, 따라서, 착색된 밴드가 없다. P10은 활성 SOX 단백질 밴드의 부재를 보이는 빈 벡터 pET24a(SOX 유전자가 없는)를 가진 형질변환체이다. 레인 1에서 착색된 밴드의 부재는 글루코스 옥시다제가 소르비톨, 오버레이 분석 혼합에서 사용된 기질에 대해 활성이 없다는 것을 보여준다. 따라서, 이러한 분석은 본 발명의 폴리올 옥시다제와 같은 첫 번째 옥시다제가 두 번째 기질에 대해 중요한 활성이 있는지 여부를 확인하는데 사용될 수 있다.
1. 분석 시약 (100 mM Kpi, pH 7, 1% 소르비톨, 5mM ABTS, 10U7ml HRP) 2. 37℃, 990㎕ 분석 시약 3. 3 분 4. P10 대조군 = 0.2U/mg 5. P18 = 1.2U/mg 6. P6 =1.05 U/mg 7. P6H = 1.49 U/mg 8. P19 = 0.69 U/mg 9. P19H = 1.17 U/mg 10. 세포 추출 단계에서 SOX의 Oda & Hiraga E. coli 발현 = 1.1U/mg.　
6개의 다른 대장균(E. coli) 세포 추출물로(ABTS/HRP 분석)을 이용한 SOX 활성. P10 추출물은 배경 활성이 있는 음성 대조군이다. 표 1은 E. coli BL21(DE3)pLysS에서 활성 효소로서 소르비톨 옥시다제의 생산을 보여준다. 음성 대조군은 0.2U/mg의 배경 활성을 보였다. 효소 활성은 세포 부재 추출물 P6H & P19H을 가열함(H)으로써 향상되고, 가열 처리 단계는 SOX 단백질의 정제를 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. SOX가 발현된 대장균(E. coli)은 Kohei Oda & Kazumi Hiraga(Biosci Biotech Biochem 61:1699-1704, 1997)에 의해 수행된 이전 연구와 유사한 특이적 활성을 갖는다.
실시예 3: 스트렙토미세스 리비단스 균주 S3G3 내에서 스트렙토미세스 코엘리콜롤( coelicolor )/리비단스( lividans ) 유래 추정 소르비톨 옥시다제 유전자의 발현
추정적 크실리톨 옥시다제(XOX)로 주석이 달린 스트렙토미세스 코엘리콜롤 gi|28380233|sp|Q9ZBU1|XYOA_STRCO을 블라스트 서치로 동정하여 서열 동일성에 있어서 스트렙토미세스 sp H-7775 소르비톨 옥시다제 유전자와 가장 가까웠다(서열에 의존하는 54-60% 범위). 스트렙토미세스 코엘리콜롤(coelicolor ) 추정 XOX 유전자, SCO6147, ORFNames=SC1A9.11c 서열을 포함하는 유전자 좌(locus)는 서열 데이터베이스로부터 구축될 수 있고, 몇몇 유전자 특이적 프라이머와 플랭킹 프라이머는 PCR에 의해 대응하는 S. 리비단스 유전자를 분리하기 위해 사용하였다. 스트렙토미세스 리비단스( lividans ) 완전 게놈 서열은 이용 가능하지 않지만, 전체 시퀀싱된 S. 코엘리코롤(coelicolor) 게놈과 거의 동일하다. 최종 PCR 반응은 프라이머 us-sco1 5'gcccatatgagcgacatcacggtcacc(SEQ ID NO 9) 및 ls-sco1 5' ggatcctcagcccgcgagcacccc(SEQ ID NO 10), 1.269 kb PCR 단편 합성을 유발하는 템플릿으로서 S. 리비단스 유래 게놈성 DNA로 이루어졌다. 이러한 최종 PCR 단계에서 사용된 PCR 조건은 30 사이클로 이루어졌다: 94℃, 55 초간 변성, 55℃, 55 두 번째 초간 어닐링, 68℃, 1-2 분간 증폭. 사용된 폴리머라제는 Invitrogen의 증강 용액을 포함하는 플래티넘 Pfx DNA 폴리머라제이다. 얻어진 PCR 생성물을 대장균 벡터 PCR Blunt TOPO 내로 직접 클로닝하였다. 프라이머 us-s1 5'gccatgggcgacatcacggtcaccaac(SEQ ID NO 11), 및 ls-s1 5' atggatcctcagcccgcgagcacccc(SEQ ID NO 12)를 상기와 같은 동일한 조건의 PCR 반응에 사용하였다. 1.268kb PCR 생성물을 Nco1-BamH1로 절단하고, 얻어진 단편을 Nco1+ Bam H1 절단된 스트렙토미세스 벡터 pKB105 내로 직접 클로닝하였다. 최종 구조체는 도 6에서 pSMM-SOX(S. 리비단스)로 명명된 발현 벡터이다. PCR Blunt TOPO에서 클로닝된 SOX를 추정 SOX 유전자의 뉴클레오티드 서열을 확인하기 위해 사용하였다. 5 ul의 플라스미드DNA(도 6)를 스트렙토미세스 g3s3 원형질체를 형질변환하기 위해 사용하였다. 형질변환 반응을 R5 플레이트 상에서 평판 배양하고, 32℃ 18시간 동안 배양하였다. 티오스트렙톤을 함유하는 부드러운 영양분 한천 배지 오버레이를 플레이트 상에 덮고, 3일간 추가 배양하였다. 단일 콜로니를 티오스트렙톤을 함유하는 20 ml TS-G 배지로 250 ml 플라스크를 접종하는데 사용하였다. 30℃ 쉐이킹 배양 3일 후, 2 ml를 생산 배지를 함유하는 250 ml 플라스크를 접종하는데 사용하였다. 세포 펠렛을 원심분리로 수확하고, 버퍼 내에서 재현탁시킨 후, 파열시켰다. 표 2는 SOX 활성이 다른 스트렙토미세스 형질변환체로부터 유래된 세포-비함유 추출액 내에 존재하는 것을 보여준다.
형질변환체 17 20 22 24
1 11.38 8.03 10.89 13.60
2 6.77 13.14 12.38 10.38
3 8.88 16.81 8.85 17.03
4 9.37 12.32 16.30 18.28
5 7.34 11.68 0.02 18.14
다양한 양의 활성을 보여주는 20개의 다른 스트렙토미세스 형질변환체로부터 유래한 세포-비함유 추출액의 SOX. 추정 SOX 활성 분석(ABTS/HRP)(U/mg). S. 코엘리콜롤(coelicolor)(SCO6147) 유래 소르비톨 옥시다제의 DNA 및 단백질 서열은 각각 SEQ ID NO: 2 및 13으로 표시된다.
실시예 4: 소르비톨 옥시다제의 정제
본 실시예에서는 S. 리비단스에 의해 생성된 소르비톨 옥시다제(실시예 1 - 4)를 정제하는 방법을 설명하고 있다. 스트렙토미세스 리비단스 유래 소르비톨 옥시다제는 균사체에 집중되어 있다. 따라서, 효소를 100mM Kpi 버퍼, 포타슘 포스페이트, pH 7.0에서 세포 추출물로부터 프렌치 프레스를 이용하여 세포 용해에 의해 분리하였다. 세포 추출물을 1시간 동안 50℃로 가열하고, 이후 파편을 제거하도록 충분히 원심분리하였다. 그 후, 세포 용해 상청액을 황산 암모늄과 32% 포화도로 혼합하여, 소르비톨 옥시다제를 포함하는 단백질 분획을 침전시켰다. 단백질 침전물을 밤새 4℃로 유지시킨 후, Sorvall 원심분리기와 SLA-1500 Sorvall 축자를 이용하여 10,000 RPM 원심분리로 모액으로부터 분리시켰다.
그 후, 단백질 침전물을 32% 포화된 황산 암모늄 용액으로 세척하였다. 세척한 단백질 침전물을 Kpi 버퍼에 다시 용해시키고, 불용성 물질을 폐기하였다. 가용성 분획을 25 mM Kpi 버퍼, pH 7.0, 밤새 투석하였고, 그 후, 활성 오렌지 레진(Prometic) 상에서 친화성 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제하였다. 이는 소르비톨 옥시다제 제제를 부분적으로 정제하였고, 발효 배양액 세포 용해물(108 시간의 EFT)을 바이오 표백제에 대한 실험 샘플로서 사용하였다. 효소의 분자량을 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 확인하였는데 ~45,000 Da.였다. 보조기는 FAD에 공유적으로 결합된다(1 mol SOX 대 1mol FAD).
실시예 5: HDL 세탁 세척 조건에서의 SOX 안정성 및 표백능
본 실시예는 AATCC 액체 세제 세탁 세척 조건에서 SOX 안정성 및 표백능을 확인하는 방법을 기술하고 있다. 이러한 실험에서 AATCC 표준 세제(미국섬유화학염색자협회 형광 발광제 무함유 강력 액체 세제 버전 2003; 주요 성분은 선형 알칸 술포네이트, 알코올 엑톡실레이트, 프로판디올, 시트르산, 지방산, 카스틱 소다(castic soda) 및 물을 포함한다; 테스트페브릭)를 사용한다.
주스(STC CFT CS-15), 와인(STC CFT CS-3), 및 차(STC CFT BC-3)로 얼룩진 3개의 표백가능한 면 천조각을 사용한다. 천조각을 직물 구멍이 있는 15mm 원으로 자른다(5/8" die cutter가 구비된 모델 B; 모델 93046; NAEF).
하나의 천조각 디스크를 24-웰 마이크로플레이트(Costar 3526)의 각 웰에 둔다. pH 8, 리터 당 1.5 ml AATCC HDL 세제, 75-100 mM 소르비톨, 6gpg 경도(1.735 M 염화칼슘 및 0.67 M 염화 마그네슘을 포함하는 15000 gpg 저장 경도 용액으로부터 희석), 및 0.05% TAED(테트라아세틸에틸렌디아민, Fluka)을 포함하는 1 ml 의 세척액을 각 웰에 첨가하였다. 실시예 1 및 2에서 설명한 이전 발효 반응(108 hr EFT "효과적인 발효 시간")으로부터 유래한 5-50 ul의 부분적으로 정제된 소르비톨 옥시다제 또는 소르비톨 옥시다제를 한 컬럼 내 3-8웰에 포지티브 디스플레이스먼트 피펫(positive displacement pipette)을 이용하여 첨가한다. 헥소스 옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 0.5, 5, 50, 500, 1000 및 1500U로 첨가한다. 대조 웰은 효소를 포함하지 않는다. 마이크로플레이트를 플라스틱 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮고, 14시간, 100rpm 완화한 교반으로 37℃에서 배양하였다. 그 후, 플레이트를 쉐이커로부터 제거하고, 과산화물 테스트 스트립(Baker)로 과산화수소 존재를 테스트하였다.
백 마이크로리터(100 ul)의 0.1 mM 탄산나트륨을 pH를 10까지 올리기 위하여 첨가한다. 마이크로플레이트를 추가 90 분간 교반하여 배양하고, 상청액을 흡입으로 제거한다. 각 웰을 1.5 ml Dulbecco's PBS, pH 7.3으로 3번 세척하고, 1.5 ml 증류수로도 3번 세척한다. 각 디스크를 웰로부터 제거하고, 페이퍼 타월 시트 사이에 밤새 건조시키고, 직광에 노출시키지 않는다. 디스크를 육안으로 검사하고, 표준 흰색 타일로 대응시킨 Reflectometer CR-200(Minolta)로 분석한다. 평균 L 수치를 % SR로서 계산한다(% SR(percent soil release) = 100% X(최종 반사율- 초기 반사율)/(흰 표준물의 반사율-초기 반사율).
예비 결과는 소르비톨 옥시다제/헥소스 옥시다제 조성물가 일반적인 액체 세제에서 안정하고, 세제에 혼합된 기질 소르비톨과 이용 가능한 대기 산소 존재 하에서 효과적인 농도의 과산화수소를 생성한다는 것을 증명한다. 추가로, 표백 증강제(즉, TAED) 존재 하에서 과산화수소를 발생하는 조성물은 블루베리, 차 및 와인과 같은 일반적인 착색 오염을 표백하는데 기여할 수 있다.
실시예 6: 소르비톨 옥시다제의 기질 범위 연구
실시예 3-4에 기재한 방법을 이용하여 얻은 소르비톨 옥시다제를 다양한 폴리올 기질을 이용하의 이의 활성을 확인하기 위해 테스트하였다. 본 조사에 사용된 모든 기질은 25?, 100 mM 포스페이트 버퍼 pH 7.0 내 용해된 55mM였다.(++++++ = 100%)로서 소르비톨을 이용한 상대적 활성을 표 1에 나타낸다. 이러한 기질 외에, 이에 제한되는 것은 아니지만 글리세롤을 포함한 다른 기질도 본 발명에서 사용될 것이라는 것을 예상할 수 있다.
화합물 상대적 활성(+, 0)
D-소르비톨 ++++++
D-크실리톨 ++++
D-만니톨 +++
D-리비톨 +
미오-이노시톨 +
글리세롤 +
1,3-프로판디올 +/2
1,2-프로판디올 +/2
프로필렌 글리콜 0
에틸렌 글리콜 0
실시예 7: SOX, HOX 및 GOX 활성의 확인
글루코스 옥시다제는 글루코스를 산화하여 과산화수소를 생성하는 능력이 있다. 예로는 카보하이드레이트 옥시다제, 글루코올리고사카라이드 옥시다제 및 글루코스 옥시다제가 있다. 헥소스 옥시다제는 비록 말토스와 같은 디사카라이드 뿐만 아니라 다른 헥소스에 대한 중요한 활성이 있는, 더 넓은 특이성을 갖더라도, 또한 글루코스 옥시다제로서 분류될 수 있다.
유닛 정의
1 폴리올 유닛(POX)은 특정 조건 하에서 분당 1 mmole의 특정 폴리올을 변화시켜 1 mmole의 과산화수소(H2O2)의 생성하는 효소의 양에 대응한다.
1 소르비톨 옥시다제(SOX) 유닛은 특정 조건 하에서 분당 1 mmole의 소르비톨을 변화시켜 1 mmole의 과산화수소(H2O2)의 생성하는 효소의 양에 대응한다.
정의: 1 헥소스 옥시다제(HOX) 유닛은 특정 조건 하에서 분당 1 mmole의 글루코스, 또는 다른 헥소스 당을 변화시켜 1 mmole의 과산화수소(H2O2)를 생성하는 효소의 양에 대응한다.
정의: 1 글루코스 옥시다제(gluOX) 유닛은 특정 조건 하에서 분당 1 mmole의 글루코스를 변화시켜 1 mmole의 과산화수소(H2O2)의 생성하는 효소의 양에 대응한다.
마이크로타이터 플레이트(300 ml)에서의 SOX, HOX 또는 GOX의 활성 분석
흔히 사용되는 서양고추냉이 퍼옥시다제 염색 기질 ABTS를 본 분석에 사용하였으며, HOX 또는 GOX 각각에 의해 생성되는 H2O2의 생성을 측정하였다. ABTS는 퍼옥시다제에 대한 발색 기질로서 역할을 한다. H2O2와 조합된 퍼옥시다제는 발색성 염색으로부터 전자 이동을 촉진시켜, 강한 초록/파란색 화합물로 산화된다.
인비트로 분석
분석 혼합물은 266 ml 소르비톨(Sigma P-5504, 0.1 M 소디움 포스페이트 버퍼 내 0.055 M, pH 6.3), (또는 다른 기질, 예, 크실리톨), 12 ml 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티오졸린-6-술폰산)(ABTS)(Sigma A-9941, 5 mg/ml 수성 용액), 12 ml 퍼옥시다제(POD)(Sigma P-6782, 0.1 mg/ml in 0.1 M 소디움 포스페이트 버퍼, pH 6.3) 및 10 ml 효소(SOX 또는 HOX) 수성 용액을 포함하였다.
분석은 25℃에서 수행한다.
배양은 글루코스를 첨가하여 시작하였다. 흡광도는 ELISA 측정기에서 405 nm에서 관찰하였다. H2O2의 다양한 농도에 근거한 표준 커브를 상기 정의에 따른 효소 활성을 계산하는데 사용하였다.
소르비톨을 이용하는 설명된 반응은 아래와 같은 방식으로 기술될 수 있다:
소르비톨 + O2 + → 글루코스 + H2O2
(1)
글루코스 + O2 + H2O → 글루콘산 + H2O2
(2)
H2O2 + 2ABTS (무색) + 2 H+ → 2 H2O + 2ABTS (파란색/초록색)
(3)
반응(1)은 효소(SOX)에 의해 촉진된다.
반응(2)는 효소(HOX 또는 GOX) 에 의해 촉진된다.
반응(3)은 효소(POD)에 의해 촉진된다.
반응(2)와 관련하여 GOOX 및 MnCO은 또한 이러한 반응을 촉진할 수 있는 효소이다.
'인 시추' 분석을 위하여 분석 성분과 비특이적으로 반응하는 방해 물질의 효과를 무시할 정도로 충분하게 적게 하기 위하여, 분석 전에 매트릭스를 희석하는 것이 필요할 수 있다. 다르게는, 매트릭스 조성물을 방해 물질(s)을 제거하여 준비할 수도 있다.
실시예 8: 크실리톨 및 소르비톨에 대한 상대적 활성
목적은 D-소르비톨 및 D-크실리톨에 대한 소르비톨 옥시다제의 활성의 차이를 측정하는 것이다. ABTS 분석이 D-소르비톨 및 D-크실리톨 모두가 과량 있을 때, H2O2 의 비율을 측정하기 위해 앞서 설명한 것처럼 사용되었다. 앞선 실시예에서 준비된 동일한 양의 효소가 두 경우에 모두 사용되었다. 아래의 표는 두 기질에 대한 상대적 활성을 나타낸다(퍼센트 값으로 주어짐). 사용된 효소는 실시예 3 및 4에서 제조한 것이었다.
기질 상대적 활성 %
D-소르비톨 100
D-크실리톨 47.6
실시예 9: 두 효소간 상승효과
본 실시예에서 사용된 세 개의 효소는 아래와 같다;
1. 헥소스 옥시다제: 혹시퓨어(Hoxypure)TM, Danisco A/S로부터 이용가능.
2. S. 코엘리콜롤 (SCO6147) 소르비톨 옥시다제를 이전 실시예 3-4에서 설명한 바와 같이 획득하였다.
3. 글루코스 옥시다제: 시그마 G7141
본 실시예에서 아래의 효소 양은 유닛 양으로 주어진다.
HOX 유닛은 기질이 과량일 때, 1 umol H202/분을 생산하는 효소 양이다.
GOX 유닛은 기질이 과량일 때, 1 umol H202/분을 생산하는 효소 양이다.
SOX 유닛은 기질이 과량일 때, 1 umol H202/분을 생산하는 효소 양이다.
주. 아래 실시예에서 오직 SOX만 과량의 기질을 가지게 될 것이다. 생성된 당은 두 번째 효소에 대하여 제한 요인이 될 것이다. 상기 알려진 바와 같이 활성은 D-소르비톨과 산소 모두 과량이 존재할 때, D-소르비톨을 촉진하는 SOX의 퍼센트 수치로서 나타낸다.
초기 속도는 300 uL ABTS 분석 (앞에 설명된 것과 같이)에서 5분간 거쳐 측정하였다. 과산화수소 생성의 생성 속도는 표준 커브로부터 추정된다. 도 3 및 도 4에 보여지는 측정된 활성은 퍼센트 값으로 나타낸다. 100%는 기질 D-소르비톨과 산소가 과량일 경우, 단독 소르비톨 옥시다제에 의해 생성된 과산화수소 생성 속도로서 정의된다 (선형 속도 커브)
실시예 10: 츄어블 정
효소 조성물을 1 유닛 SOX (실시예 1-4에서 제조됨)의 첨가로 제조하고, 헥소스 옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 마이크로리터 당 0.5, 5, 50, 500, 1000 및 1500U로 100mM 소디움 포스페이트 버퍼, pH 6.7, 50mM 소르비톨에 첨가하였다. 수성 효소 조성물이 츄어블 정을 제조하기 위해 사용된다. 정제 및 검 조성물을 함유하는 조성물은 아래에 기재된 일반적인 원료 성분을 이용하여 제조한다 (wt%로 열거된 성분)
정제 및 검 조성물을 함유하는 조성물은 아래에 기재된 일반적인 원료 성분을 이용하여 제조한다 (wt%로 열거된 성분)
효소조성물 0.5% (물 성분의 일부로서 제공됨)
라이카진 75% 48.9%
이소말트 또는 크실리톨 23.1%
수소화된 야채 기름 8.7 %
물 4.8%
젤라틴 (40% 용액) 2.9%
전분 코팅된 다칼슘 포스페이트 8. 7%
모노-디글리세리드 혼합물 0.8%
레시틴 0.3%
아스파탐 0.05%
아스파탐 K 0.05%
바닐린 0.05%
글리세린 0.1%
탄산수소나트륨 0.10%
민트향 0.19%
츄어블 정은 이소말트, 라이카진, 물, 지방, 모노 및 디글리세리드 혼합물, 글리세린 및 레시틴을 131℃까지 끓이고, 후에 글리세린을 추가하고, 혼합물을 30℃ (HOX) 또는 60℃ (GOX)로 냉각시켜 제조한다. 그 후, 탄산수소나트륨, 효소 조성물, 디칼슘 포스페이트 및 나머지 성분을 추가한다. 그 후, 실온(23℃)으로 냉각된 혼합물을 파우더로 하고, 정제 프레스를 이용하여 정제로 압착시켰다.
인비보 플라그 감소 효능
히드록시아파타이트 디스크 상에서 인크라-구강 보유물(inkra-oral retainer) 내 인비보 성장한 플라그를 이용하여 인간 지원자가 츄어블 정을 씹은 2 및 5시간 후 플라그 감소에 대해 테스트하였다. 시각화하고, 플라그 범위 및 플라그 미세구조에서의 변화를 정량화하기 위해 공초점 현미경을 사용한다. 플라그 제거를 또한 크리스탈 바이올렛 표시자 처리 전 및 후 플라그를 염색하고, 색 강도 변화를 측정함으로써 전통적인 광 현미경으로 측정할 수 있다. 상 프로 분석 소프트웨어를 상 분석과 정량 측정을 수행하기 위해 사용한다. 색 강도를 측정하고, 염색 제거를 확인하기 위해 사용하였다. 강도가 더 크면 세척 효능이 더 크다.
실시예 11: 츄잉 검
아래의 성분은 본 발명의 조성물을 포함하는 츄잉 검을 제조하기 위해서 혼합될 수 있다:
검 베이스 31.20%
소르비톨 28.08%
크실리톨 5.23%
효소조성물 1.00% (이전 실시예 참조)
아세설페임 K 0.16%
아스파탐 0.16%
멘톨 파우더 1.00%
액체 향료 0.47%
이소말트 PF 11.70%
이소말트 DC 16.00%
항고착제* 4.00%
8는 향료 2.00%
* 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 실리카 겔
실시예 12: 수성 페인트
아래의 성분은 본 발명 조성물을 포함하는 수성 페인트를 제조하기 위해서 혼합될 수 있다.
효소조성물 0.5%
소르비톨 0.5%
안료 15%
아크릴성 결합제 25%
물 50%
다른 첨가제* 9.5%
*는 페인트 종류에 따라 하기의 성분을 포함할 수 있다; 분산제(dispersion agent), 현탁제, 분산제(dispersant), 소포제, 습윤제, 유착제, 다양한 충진제, 계면활성제, 공-살생물제, 농축제, 공-방부제, 라텍스
실시예 13: 유성 페인트
하기의 성분은 본 발명의 조성물을 함유하는 유성 페인트를 제조하기 위해서 혼합될 수 있다.
효소조성물 0.5%, 80% 소르비톨에 용해
TiO2 안료 20%
알키드 결합제 40%
탄화수소 용매 20%
다른 첨가제* 19.5%
*는 페인트 종류에 따라 하기의 성분을 포함할 수 있다; 분산제(dispersion agent), 현탁제, 분산제(dispersant), 소포제, 습윤제, 유착제, 다양한 충진제, 계면활성제, 공-살생물제, 농축제, 공-방부제, 라텍스
SEQUENCE LISTING <110> Dansico A/S <120> A composition <130> 16318PCT00 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 420 <212> PRT <213> Streptomyces sp. H7775 <400> 1 Met Thr Pro Ala Glu Lys Asn Trp Ala Gly Asn Ile Thr Phe Gly Ala 1 5 10 15 Lys Arg Leu Cys Val Pro Arg Ser Val Arg Glu Leu Arg Glu Thr Val 20 25 30 Ala Ala Ser Gly Ala Val Arg Pro Leu Gly Thr Arg His Ser Phe Asn 35 40 45 Thr Val Ala Asp Thr Ser Gly Asp His Val Ser Leu Ala Gly Leu Pro 50 55 60 Arg Val Val Asp Ile Asp Val Pro Gly Arg Ala Val Ser Leu Ser Ala 65 70 75 80 Gly Leu Arg Phe Gly Glu Phe Ala Ala Glu Leu His Ala Arg Gly Leu 85 90 95 Ala Leu Ala Asn Leu Gly Ser Leu Pro His Ile Ser Val Ala Gly Ala 100 105 110 Val Ala Thr Gly Thr His Gly Ser Gly Val Gly Asn Arg Ser Leu Ala 115 120 125 Gly Ala Val Arg Ala Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Arg 130 135 140 Thr Leu Arg Arg Thr Asp Glu Asp Phe Ala Gly Ala Val Val Ser Leu 145 150 155 160 Gly Ala Leu Gly Val Val Thr Ser Leu Glu Leu Asp Leu Val Pro Ala 165 170 175 Phe Glu Val Arg Gln Trp Val Tyr Glu Asp Leu Pro Glu Ala Thr Leu 180 185 190 Ala Ala Arg Phe Asp Glu Val Met Ser Ala Ala Tyr Ser Val Ser Val 195 200 205 Phe Thr Asp Trp Arg Pro Gly Pro Val Gly Gln Val Trp Leu Lys Gln 210 215 220 Arg Val Gly Asp Glu Gly Ala Arg Ser Val Met Pro Ala Glu Trp Leu 225 230 235 240 Gly Ala Arg Leu Ala Asp Gly Pro Arg His Pro Val Pro Gly Met Pro 245 250 255 Ala Gly Asn Cys Thr Ala Gln Gln Gly Val Pro Gly Pro Trp His Glu 260 265 270 Arg Leu Pro His Phe Arg Met Glu Phe Thr Pro Ser Asn Gly Asp Glu 275 280 285 Leu Gln Ser Glu Tyr Phe Val Ala Arg Ala Asp Ala Val Ala Ala Tyr 290 295 300 Glu Ala Leu Ala Arg Leu Arg Asp Arg Ile Ala Pro Val Leu Gln Val 305 310 315 320 Ser Glu Leu Arg Thr Val Ala Ala Asp Asp Leu Trp Leu Ser Pro Ala 325 330 335 His Gly Arg Asp Ser Val Ala Phe His Phe Thr Trp Val Pro Asp Ala 340 345 350 Ala Ala Val Ala Pro Val Ala Gly Ala Ile Glu Glu Ala Leu Ala Pro 355 360 365 Phe Gly Ala Arg Pro His Trp Gly Lys Val Phe Ser Thr Ala Pro Glu 370 375 380 Val Leu Arg Thr Leu Tyr Pro Arg Tyr Ala Asp Phe Glu Glu Leu Val 385 390 395 400 Gly Arg His Asp Pro Glu Gly Thr Phe Arg Asn Ala Phe Leu Asp Arg 405 410 415 Tyr Phe Arg Arg 420 <210> 2 <211> 418 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 2 Met Gly Asp Ile Thr Val Thr Asn Trp Ala Gly Asn Ile Thr Tyr Thr 1 5 10 15 Ala Lys Glu Leu Leu Arg Pro His Ser Leu Asp Ala Leu Arg Ala Leu 20 25 30 Val Ala Asp Ser Ala Arg Val Arg Val Leu Gly Ser Gly His Ser Phe 35 40 45 Asn Glu Ile Ala Glu Pro Gly Asp Gly Gly Val Leu Leu Ser Leu Ala 50 55 60 Gly Leu Pro Ser Val Val Asp Val Asp Thr Ala Ala Arg Thr Val Arg 65 70 75 80 Val Gly Gly Gly Val Arg Tyr Ala Glu Leu Ala Arg Val Val His Ala 85 90 95 Arg Gly Leu Ala Leu Pro Asn Met Ala Ser Leu Pro His Ile Ser Val 100 105 110 Ala Gly Ser Val Ala Thr Gly Thr His Gly Ser Gly Val Gly Asn Gly 115 120 125 Ser Leu Ala Ser Val Val Arg Glu Val Glu Leu Val Thr Ala Asp Gly 130 135 140 Ser Thr Val Val Ile Ala Arg Gly Asp Glu Arg Phe Gly Gly Ala Val 145 150 155 160 Thr Ser Leu Gly Ala Leu Gly Val Val Thr Ser Leu Thr Leu Asp Leu 165 170 175 Glu Pro Ala Tyr Glu Met Glu Gln His Val Phe Thr Glu Leu Pro Leu 180 185 190 Ala Gly Leu Asp Pro Ala Thr Phe Glu Thr Val Met Ala Ala Ala Tyr 195 200 205 Ser Val Ser Leu Phe Thr Asp Trp Arg Ala Pro Gly Phe Arg Gln Val 210 215 220 Trp Leu Lys Arg Arg Thr Asp Arg Pro Leu Asp Gly Phe Pro Tyr Ala 225 230 235 240 Ala Pro Ala Ala Glu Lys Met His Pro Val Pro Gly Met Pro Ala Val 245 250 255 Asn Cys Thr Glu Gln Phe Gly Val Pro Gly Pro Trp His Glu Arg Leu 260 265 270 Pro His Phe Arg Ala Glu Phe Thr Pro Ser Ser Gly Ala Glu Leu Gln 275 280 285 Ser Glu Tyr Leu Met Pro Arg Glu His Ala Leu Ala Ala Leu His Ala 290 295 300 Met Asp Ala Ile Arg Glu Thr Leu Ala Pro Val Leu Gln Thr Cys Glu 305 310 315 320 Ile Arg Thr Val Ala Ala Asp Ala Gln Trp Leu Ser Pro Ala Tyr Gly 325 330 335 Arg Asp Thr Val Ala Ala His Phe Thr Trp Val Glu Asp Thr Ala Ala 340 345 350 Val Leu Pro Val Val Arg Arg Leu Glu Glu Ala Leu Val Pro Phe Ala 355 360 365 Ala Arg Pro His Trp Gly Lys Val Phe Thr Val Pro Ala Gly Glu Leu 370 375 380 Arg Ala Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Asp Phe Gly Ala Leu Ala Gly Ala 385 390 395 400 Leu Asp Pro Ala Gly Lys Phe Thr Asn Ala Phe Val Arg Gly Val Leu 405 410 415 Ala Gly <210> 3 <211> 47 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 3 Met Thr Glu Val Ser Arg Arg Lys Leu Met Lys Gly Ala Ala Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Leu Ala Leu Pro Ala Leu Gly Ala Pro Pro Ala Thr Ala 20 25 30 Ala Pro Ala Ala Gly Pro Glu Asp Leu Pro Gly Pro Ala Ala Ala 35 40 45 <210> 4 <211> 468 <212> PRT <213> Streptomyces sp. H7775 <400> 4 Met Gly Thr Glu Val Ser Arg Arg Lys Leu Met Lys Gly Ala Ala Val 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ala Leu Ala Leu Pro Ala Leu Gly Ala Pro Pro Ala Thr 20 25 30 Ala Ala Pro Ala Ala Gly Pro Glu Asp Leu Pro Gly Pro Ala Ala Ala 35 40 45 Met Thr Pro Ala Glu Lys Asn Trp Ala Gly Asn Ile Thr Phe Gly Ala 50 55 60 Lys Arg Leu Cys Val Pro Arg Ser Val Arg Glu Leu Arg Glu Thr Val 65 70 75 80 Ala Ala Ser Gly Ala Val Arg Pro Leu Gly Thr Arg His Ser Phe Asn 85 90 95 Thr Val Ala Asp Thr Ser Gly Asp His Val Ser Leu Ala Gly Leu Pro 100 105 110 Arg Val Val Asp Ile Asp Val Pro Gly Arg Ala Val Ser Leu Ser Ala 115 120 125 Gly Leu Arg Phe Gly Glu Phe Ala Ala Glu Leu His Ala Arg Gly Leu 130 135 140 Ala Leu Ala Asn Leu Gly Ser Leu Pro His Ile Ser Val Ala Gly Ala 145 150 155 160 Val Ala Thr Gly Thr His Gly Ser Gly Val Gly Asn Arg Ser Leu Ala 165 170 175 Gly Ala Val Arg Ala Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Arg 180 185 190 Thr Leu Arg Arg Thr Asp Glu Asp Phe Ala Gly Ala Val Val Ser Leu 195 200 205 Gly Ala Leu Gly Val Val Thr Ser Leu Glu Leu Asp Leu Val Pro Ala 210 215 220 Phe Glu Val Arg Gln Trp Val Tyr Glu Asp Leu Pro Glu Ala Thr Leu 225 230 235 240 Ala Ala Arg Phe Asp Glu Val Met Ser Ala Ala Tyr Ser Val Ser Val 245 250 255 Phe Thr Asp Trp Arg Pro Gly Pro Val Gly Gln Val Trp Leu Lys Gln 260 265 270 Arg Val Gly Asp Glu Gly Ala Arg Ser Val Met Pro Ala Glu Trp Leu 275 280 285 Gly Ala Arg Leu Ala Asp Gly Pro Arg His Pro Val Pro Gly Met Pro 290 295 300 Ala Gly Asn Cys Thr Ala Gln Gln Gly Val Pro Gly Pro Trp His Glu 305 310 315 320 Arg Leu Pro His Phe Arg Met Glu Phe Thr Pro Ser Asn Gly Asp Glu 325 330 335 Leu Gln Ser Glu Tyr Phe Val Ala Arg Ala Asp Ala Val Ala Ala Tyr 340 345 350 Glu Ala Leu Ala Arg Leu Arg Asp Arg Ile Ala Pro Val Leu Gln Val 355 360 365 Ser Glu Leu Arg Thr Val Ala Ala Asp Asp Leu Trp Leu Ser Pro Ala 370 375 380 His Gly Arg Asp Ser Val Ala Phe His Phe Thr Trp Val Pro Asp Ala 385 390 395 400 Ala Ala Val Ala Pro Val Ala Gly Ala Ile Glu Glu Ala Leu Ala Pro 405 410 415 Phe Gly Ala Arg Pro His Trp Gly Lys Val Phe Ser Thr Ala Pro Glu 420 425 430 Val Leu Arg Thr Leu Tyr Pro Arg Tyr Ala Asp Phe Glu Glu Leu Val 435 440 445 Gly Arg His Asp Pro Glu Gly Thr Phe Arg Asn Ala Phe Leu Asp Arg 450 455 460 Tyr Phe Arg Arg 465 <210> 5 <211> 1415 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide seqeunce of fusion between signal seqeunce and SEQ ID No 1 <400> 5 ccatgggcac cgaggtctcc cgccgcaagc tgatgaaggg cgcggcggtg tcgggcggcg 60 cgctggcgct gccggccctc ggcgccccgc ccgccaccgc ggcgccggcc gccggccccg 120 aggacctccc gggccccgcc gccgccatga ccccggccga gaagaactgg gccggcaaca 180 tcaccttcgg cgccaagcgc ctgtgcgtcc cgcgctccgt ccgcgagctg cgcgagaccg 240 tggccgcctc cggcgccgtg cgcccgctgg gcacccgcca ctcgttcaac accgtcgccg 300 acacctccgg cgaccacgtg tcgctggccg gcctgccgcg cgtcgtcgac atcgacgtcc 360 cgggccgggc cgtgtccctg tccgccggcc tgcgcttcgg cgagttcgcc gccgagctgc 420 acgcccgcgg cctggccctg gccaacctgg gctccctgcc gcacatctcc gtggcgggcg 480 cggtcgccac cggcacccac ggctccggcg tcggcaaccg ctccctggcg ggcgccgtcc 540 gcgccctgtc cctggtcacc gccgacggcg agacccgcac cctgcgccgc accgacgagg 600 acttcgccgg cgccgtcgtg tccctgggcg ccctgggcgt cgtcacctcc ctggagctgg 660 acctggtccc ggccttcgag gtccgccagt gggtctacga ggacctgccc gaggccaccc 720 tggccgcccg cttcgacgag gtcatgtccg ccgcctactc cgtgtccgtg ttcaccgact 780 ggcgcccggg cccggtcggc caggtctggc tgaagcagcg cgtcggcgac gagggcgccc 840 gctccgtcat gccggccgag tggctgggcg cccgcctggc cgacggcccg cgccacccgg 900 tccccggcat gcccgccggc aactgcaccg cccagcaggg cgtcccgggc ccgtggcacg 960 agcgcctgcc gcacttccgc atggagttca ccccgtccaa cggcgacgag ctgcagtccg 1020 agtacttcgt cgcccgcgcg gacgccgtcg cggcctacga ggcgctggcc cgcctgcgcg 1080 accgcatcgc cccggtcctg caggtctccg agctgcgcac cgtcgccgcc gacgacctgt 1140 ggctgtcccc ggcccacggc cgcgactccg tcgccttcca cttcacctgg gtcccggacg 1200 ccgccgccgt cgccccggtc gccggcgcca tcgaggaggc cctggccccg ttcggcgccc 1260 gcccgcactg gggcaaggtg ttctccaccg cccccgaggt cctgcgcacc ctgtacccgc 1320 gctacgccga cttcgaggag ctggtcggcc gccacgaccc cgagggcacc ttccgcaacg 1380 ccttcctcga ccgctacttc cgccgctgag gatcc 1415 <210> 6 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 6 gcgctagccg gccccccggc acaggccatg accccggccg agaagaactg gg 52 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 7 caggaaacag ctatgac 17 <210> 8 <211> 1370 <212> DNA <213> Nucleotide sequence encoding fusion between signal seqeunce and SEQ ID No 1 with introduced RE sites <400> 8 gcgctagccg gccccccggc acaggccatg accccggccg agaagaactg ggccggcaac 60 atcaccttcg gcgccaagcg cctgtgcgtc ccgcgctccg tccgcgagct gcgcgagacc 120 gtggccgcct ccggcgccgt gcgcccgctg ggcacccgcc actcgttcaa caccgtcgcc 180 gacacctccg gcgaccacgt gtcgctggcc ggcctgccgc gcgtcgtcga catcgacgtc 240 ccgggccggg ccgtgtccct gtccgccggc ctgcgcttcg gcgagttcgc cgccgagctg 300 cacgcccgcg gcctggccct ggccaacctg ggctccctgc cgcacatctc cgtggcgggc 360 gcggtcgcca ccggcaccca cggctccggc gtcggcaacc gctccctggc gggcgccgtc 420 cgcgccctgt ccctggtcac cgccgacggc gagacccgca ccctgcgccg caccgacgag 480 gacttcgccg gcgccgtcgt gtccctgggc gccctgggcg tcgtcacctc cctggagctg 540 gacctggtcc cggccttcga ggtccgccag tgggtctacg aggacctgcc cgaggccacc 600 ctggccgccc gcttcgacga ggtcatgtcc gccgcctact ccgtgtccgt gttcaccgac 660 tggcgcccgg gcccggtcgg ccaggtctgg ctgaagcagc gcgtcggcga cgagggcgcc 720 cgctccgtca tgccggccga gtggctgggc gcccgcctgg ccgacggccc gcgccacccg 780 gtccccggca tgcccgccgg caactgcacc gcccagcagg gcgtcccggg cccgtggcac 840 gagcgcctgc cgcacttccg catggagttc accccgtcca acggcgacga gctgcagtcc 900 gagtacttcg tcgcccgcgc ggacgccgtc gcggcctacg aggcgctggc ccgcctgcgc 960 gaccgcatcg ccccggtcct gcaggtctcc gagctgcgca ccgtcgccgc cgacgacctg 1020 tggctgtccc cggcccacgg ccgcgactcc gtcgccttcc acttcacctg ggtcccggac 1080 gccgccgccg tcgccccggt cgccggcgcc atcgaggagg ccctggcccc gttcggcgcc 1140 cgcccgcact ggggcaaggt gttctccacc gcccccgagg tcctgcgcac cctgtacccg 1200 cgctacgccg acttcgagga gctggtcggc cgccacgacc ccgagggcac cttccgcaac 1260 gccttcctcg accgctactt ccgccgctga ggatccgagc tccagctttt gttcccttta 1320 gtgagggtta attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 1370 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 9 gcccatatga gcgacatcac ggtcacc 27 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 10 ggatcctcag cccgcgagca cccc 24 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 11 gccatgggcg acatcacggt caccaac 27 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PCR primer <400> 12 atggatcctc agcccgcgag cacccc 26 <210> 13 <211> 1268 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Streptomyces lividans and Streptomyces coelicolor SOX with the addition of the NCO1 cloning site at the start methionine <400> 13 gccatgggcg acatcacggt caccaactgg gccggcaaca tcacgtacac ggcgaaggaa 60 ctgctgcggc cgcactccct ggacgcgctg cgggccctgg tggcggacag cgccagggtg 120 cgggtgctgg gcagcgggca ctccttcaac gagatcgccg agccgggcga cgggggtgtc 180 ctgctgtcgc tggcgggcct gccgtccgtg gtggacgtgg acacggcggc ccgtacggtg 240 cgggtcggcg gcggtgtgcg gtacgcggag ctggcccggg tggtgcacgc gcggggcctg 300 gcgctgccga acatggcctc gctgccgcac atctcggtcg ccgggtcggt ggccaccggc 360 acccacggtt cgggggtggg caacggttcg ctggcctcgg tggtgcgcga ggtggagctg 420 gtcaccgcgg acggttcgac cgtggtgatc gcgcggggcg acgagcggtt cggcggggcg 480 gtgacctcgc tcggcgcgct gggcgtggtg acgtcgctca cactcgacct ggagccggcg 540 tacgagatgg aacagcacgt cttcaccgag ctgccgctgg ccgggttgga cccggcgacg 600 ttcgagacgg tgatggcggc ggcgtacagc gtgagtctgt tcaccgactg gcgggcgccc 660 ggtttccggc aggtgtggct gaagcggcgc accgaccggc cgctggacgg tttcccgtac 720 gcggccccgg ccgccgagaa gatgcatccg gtgccgggca tgcccgcggt gaactgcacg 780 gagcagttcg gggtgccggg gccctggcac gagcggctgc cgcacttccg cgcggagttc 840 acgcccagca gcggtgccga gttgcagtcg gagtacctga tgccccggga gcacgccctg 900 gccgccctgc acgcgatgga cgcgatacgg gagacgctcg cgccggtgct ccagacctgc 960 gagatccgca cggtcgccgc cgacgcgcag tggctgagcc cggcgtacgg gcgggacacc 1020 gtggccgcgc acttcacctg ggtcgaggac acggcggcgg tgctgccggt ggtgcggcgg 1080 ctggaggagg cgctcgtccc cttcgcggcc cgtccgcact gggggaaggt gttcaccgtc 1140 ccggcgggcg agctgcgtgc gctgtacccg cggctggccg acttcggggc gctggccggg 1200 gcgctggacc cggcggggaa gttcaccaac gcgttcgtgc gcggggtgct cgcgggctga 1260 ggatccat 1268

Claims (71)

  1. 첫 번째 옥시다제, 첫 번째 기질, 및 최소 하나의 추가 효소를 포함하는 조성물로서, 첫 번째 기질은 첫 번째 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소와 두 번째 기질을 형성하고; 두 번째 기질은 최소 하나의 추가 효소에 의해 변화되어 생성물을 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 첫 번째 기질은 폴리올인 것인 조성물.
  3. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 폴리올은 펜티톨 또는 헥시톨인 것인 조성물.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 폴리올은 헥시톨, 펜티톨, 소르비톨, 크실리톨, 말티톨, 만니톨, 갈락티톨, 이소말트, 락티톨, 아라비톨, 에리스리톨, 및 리비톨로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 폴리올은 크실리톨인 것인 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 폴리올은 소르비톨인 것인 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 기질은 당인 것인 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 당은 모노사카라이드 또는 디사카라이드인 것인 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 당은 글루코스, 크실로스, 말토스, 만노스, 갈락토스, 이소말토스, 락토스, 아라비노스, 에리스로스 및 리보스로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 당은 크실로스 또는 글루코스인 것인 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 옥시다제는 폴리올 옥시다제인 것인 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 첫 번째 옥시다제는 헥시톨 옥시다제, 펜티톨 옥시다제, 소르비톨 옥시다제, 크실리톨 옥시다제, 말티톨 옥시다제, 만니톨 옥시다제, 갈락티톨 옥시다제, 이소말트 옥시다제, 락티톨 옥시다제, 아라비톨 옥시다제, 아라비톨 옥시다제, 에리스리톨 옥시다제, 및 리비톨 옥시다제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 첫 번째 옥시다제는 각각의 폴리올 기질을 이용할 때, 최소 5 유니트/g 단백질의 폴리올 옥시다제 (특이적) 활성을 갖는 것인 조성물.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리올 옥시다제는 소르비톨 옥시다제 또는 크실리톨 옥시다제인 것인 조성물.
  15. 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리올 옥시다제는 대응하는 당에 비하여 각각의 폴리올에 대하여 1 이상인 특이적 활성 비를 갖는 것인 조성물.
  16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리올 옥시다제는 글루코스에 비하여 각각의 폴리올에 대하여 1 이상인 특이적 활성 비를 갖는 것인 조성물.
  17. 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리올 옥시다제는 크실리톨에 비하여 소르비톨에 대한 높은 특이적 활성을 갖는 것인 조성물.
  18. 제 11 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리올 옥시다제는 스트렙토미세스(Streptomyces) 또는 크산토모나스(Xanthomonas ) 균주로부터 유래하는 것 인 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 옥시다제는 폴리펩티드 서열 SEQ ID NO 1 또는 SEQ ID NO 2 또는 이들의 동족체, 변이체 또는 단편을 포함하는 것인 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 첫 번째 옥시다제는 폴리펩티드 서열 SEQ ID NO 1 또는 SEQ ID NO 19로 이루어진 것인 조성물.
  21. 제 11 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물에 존재하는 (또는 조성물에 추가된) 첫 번째 옥시다제 활성 농도(level)는 상기 조성물의 kg당 약 0.1 내지 약 200,000 유니트인 것인 조성물.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 최소 하나의 추가 효소는 추가 산화환원효소인 것인 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 두 번째 기질은 추가 산화환원효소에 의해 산화되어 과산화수소와 상기 생성물을 형성하는 것인 조성물.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에서, 추가 산화환원효소는 당 옥시다제인 것인 조성 물.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에서, 당-옥시다제는 카보하이드레이트 옥시다제, 올리고사카라이드 옥시다제, 말토스 옥시다제, 헥소스 옥시다제, 글루코스 옥시다제, 만노스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 이소말툴로스 옥시다제, 락토스 옥시다제, 아라비노스 옥시다제, 에리스로스 옥시다제, 펜토스 옥시다제, 크실로스 옥시다제, 및 트리오스 옥시다제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  26. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 당-옥시다제는 EC 1.1.3.4 글루코스 옥시다제, EC 1.1.3.5 헥소스 옥시다제, EC 1.1.3.9 갈락토스 옥시다제, EC 1.1.3.10 피라노스 옥시다제, EC 1.1.3.11 L-소르보스 옥시다제, 및 EC 1.1.3.40 D-만니톨 옥시다제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  27. 제 22 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 각각의 수의 효소 유니트에 의해 측정할 때, 최소 하나의 추가 산화환원효소의 양은 상기 조성물에 존재하는 폴리올 옥시다제를 비롯한 첫 번째 옥시다제의 양과 비교해서 1 이상인 것인 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 기질로부터 생성된 생성물의 존재는 첫 번째 옥시다제에 의한 첫 번째 기질 산화로부터 유래한 과산화 수소 생성 속도를 감소시키지 않는 것인 조성물.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 두 번째 기질로부터 생성된 생성물은 락톤, 디알도스 또는 디히드로 당인 것인 조성물.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 먹을 수 있는 것인 조성물.
  31. 제 30 항에 따른 조성물을 포함하는 식용 조성물.
  32. 약제로서 사용을 위한 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 구강 관리 제품에 사용되는 최소 하나의 추가 성분을 포함하는 구강 관리 제품.
  34. 제 33 항에 있어서, 구강 관리 제품은 츄잉 검, 구강 세척제, 구강 스프레이, 파스틸(pastille), 로젠지(lozenge), 구강 청정제, 비강 스프레이 및 구강 페이스트로 이루어진 군에서 선택되는 형태인 것인 구강 관리 제품.
  35. 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서, 크실리톨 및/또는 소르비톨을 포함하는 것인 구강 관리 제품.
  36. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 화장품에 사용되는 최소 하나의 추가 성분을 포함하는 화장품.
  37. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 피부, 헤어 또는 치아 표백 및/또는 화이트닝 제품에 사용되는 최소 하나의 추가 성분을 포함하는, 피부, 헤어 또는 치아 표백 제품.
  38. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 33 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 따른 제품을 외부 포유동물 조직의 표백 및/또는 화이트닝에 적절한 양과 기간 동안 외부 포유동물 조직에 접촉하는 것을 포함하는, 외부 포유동물 조직의 표백 및/또는 화이트닝을 위한 화장 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 외부 포유동물 조직은 치아, 헤어 및 피부로 이루어진 군에서 선택되는 것인 화장 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 세제 또는 표백 제품에 사용되는 최소 하나의 추가 성분을 포함하는 비-생존 조직에 사용이 적합한 세제 또는 표백 제품
  41. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 페인트에 사용되는 최소 하나의 추가 성분을 포함하는 해양용, 장식 또는 보호 페인트를 비롯한 페인트 제품.
  42. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 살충제에 사용되는 최소 하나의 추가 성분을 포함하는 살충제.
  43. 과산화수소 생성을 위한 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 33 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 구강 관리 제품의 용도.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 용도는 사용 전 또는 사용 중 이로운 치아 표백 및/또는 화이트닝 효과, 및/또는 증가된 저장 기간, 및/또는 항균/항-박테리아 효과를 제공하는 구강 관리 제품에서 존재하는 것인 용도.
  45. 제 43 항에 있어서, 상기 용도는 개체 포유동물에 의해 소비될 때 이로운 프리바이오틱(prebiotic) 효과 및/또는 연장된 저장 기간을 제공하는 식용 제품에 존재하는 것인 용도.
  46. 제 43 항에 있어서, 상기 용도는 연장된 저장 기간을 제공하고/하거나, 외부 포유동물 조직을 표백 및/또는 화이트닝하고/하거나, 인간 피부에 적용될 때 항균/항-박테리아 효과를 갖는 화장품에 존재하는 것인 용도.
  47. 제 43 항에 있어서, 상기 용도는 비-생존 물질에 사용될 때, 세제의 표백, 화이트닝 또는 소독 능력을 증가시키는 세제에 존재하는 것인 용도.
  48. 제 43 항에 있어서, 상기 용도는 사용 전 또는 후 향상된 보존력을 나타내는 페인트 제품에 존재하는 것인 용도.
  49. 제 43 항에 있어서, 상기 용도는 미생물 유해물을 감소시키거나 죽이는 향상된 활성을 나타내는 살충제 제품에 존재하는 것인 용도.
  50. 전술한 항들 중 어느 한 항에 따른 첫 번째 옥시다제, 전술한 항들 중 어느 한 항에 따른 첫 번째 기질, 전술한 항들 중 어느 한 항에 따른 최소 하나의 추가 산화환원효소 및 적절한 매트릭스를 혼합하는 것을 포함하는 조성물의 제조 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, 매트릭스는 먹을 수 있는 것인 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 조성물은 약제, 구강 관리 제품 및 음료로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 매트릭스는 세제 또는 표백 성분 또는 제품인 것인 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 매트릭스는 해양 또는 장식용 페인트를 비롯한 페인트인 것인 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 매트릭스는 살충제 매트릭스인 것인 방법.
  56. 잇몸질환, 잇몸염, 과민성 대장 증후군, 락토오스 불내증, 결장암, 고지혈증, 고혈압(high blood pressure), 고혈압(hypertension), 감염증, 염증 및 영양실조로부터 선택되는 의학적 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제 제조에 사용되는 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  57. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 33 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 구강 관리 제품을 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 의학 치료 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 잇몸질환, 잇몸염, 과민성 대장 증후군, 락토오스 불내증, 결장암, 고지혈증, 고혈압(high blood pressure), 고혈압(hypertension), 감염 증, 염증 및 영양실조로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 것인 방법.
  59. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 포장 제품으로서, 상기 조성물은 상기 포장된 제품 내에서 과산화수소 발생을 방지하거나 감소시킬 수 있도록 상기 포장 제품 내에서 산소 제한된 환경에서 유지되는 것인 제품.
  60. 다음의 성분: 첫 번째 효소, 최소 하나의 추가 효소 및 첫 번째 기질을 포함하는 부분들의 키트로서, 첫 번째 효소와 첫 번째 기질은 서로 분리되어 있는 것인 키트 부분.
  61. 첫 번째 옥시다제 활성에 의한 과산화수소와 두 번째 기질 모두의 발생에 적합한 조건 하에서 첫 번째 옥시다제, 및 첫 번째 기질, 및 최소 하나의 추가 효소 및 적절한 매트릭스를 혼합하는 것을 포함하는 과산화수소를 생성하는 방법으로서, 두 번째 기질은 최소 하나의 추가 효소에 의해 생성물로 변화되는 것인 방법.
  62. 제 61 항에 있어서, 최소 하나의 추가 효소는 두 번째 기질을 추가 과산화수소와 생성물로 변화시키는 추가 산화환원효소인 것인 방법.
  63. 제 61 항 또는 제 62 항에 있어서, 혼합 단계는 제 60 항에 따른 부분들의 키트의 구성성분을 혼합하는 것을 포함하는 것인 방법.
  64. 제 61 항 또는 제 62 항에 있어서, 제 59 항에 따른 포장된 제품 내에 포함된 조성물을 외부 공급의 산소에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
  65. 폴리올 옥시다제 및 첫 번째 기질을 포함하는 페인트 조성물로서, 첫 번째 기질은 폴리올 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소를 생성하는 것인 페인트 조성물.
  66. 폴리올 옥시다제 및 첫 번째 기질을 포함하는 화장품 조성물로서, 첫 번째 기질은 폴리올 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소를 생성하는 것인 화장품 조성물.
  67. 폴리올 옥시다제 및 첫 번째 기질을 포함하는 식품 또는 사료 조성물로서, 첫 번째 기질은 폴리올 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소를 생성하는 것인 식품 또는 사료 조성물.
  68. 제 59 항에 있어서, 우유, 크림, 치즈, 유장을 비롯한 유제품; 과일 주스를 비롯한 음료로 이루어진 군에서 선택되는 식품 또는 사료 조성물.
  69. 폴리올 옥시다제 및 첫 번째 기질을 포함하는 약제 조성물로서, 첫 번째 기질은 폴리올 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소를 생성하는 것인 약제 조성물.
  70. 제 66 항에 있어서, 첫 번째 기질은 크실리톨인 것인 약제 조성물.
  71. 폴리올 옥시다제 및 첫 번째 기질을 포함하는 살충제 조성물로서, 첫 번째 기질은 폴리올 옥시다제에 의해 산화되어 과산화수소를 생성하는 것인 살충제 조성물.
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