KR20230010681A - 트랜스글루타미나제 변이체 및 그의 사용 적용분야 - Google Patents

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KR20230010681A
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윌리엄 쉰델
카밀 에스. 게데온
에리카 엠. 밀제크
시몬 에이. 코스타
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큐리 컴퍼니 인코포레이티드
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Abstract

스트렙토마이세스 모바라엔시스 트랜스글루타미나제 효소의 변이체가 제공된다. 개시되는 변이체는 야생형 효소 대비 적어도 약 2-배 증가된 효소 활성을 나타낸다. 살생물 사용 적용분야, 그리고 관심 단백질 또는 재료에의 소형 유기 분자의 공유 결합을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 유효량의 개시되는 변이체 효소를 제품에 혼입하는 것에 의한 개인 관리, 가정용 및 산업용 제품과 같은 제품의 저장-수명 증가 방법이 제공된다. 상기 트랜스글루타미나제 변이체는 UV-차단 분자, 염료 또는 색소와 같은 기능성 성분을 단백질에 공유 결합시키는 데에 사용될 수도 있다. 상기 트랜스글루타미나제 효소 및 기능성 성분은 피부, 모발 또는 손발톱 단백질 또는 피부-유래 단백질, 예컨대 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴을 변형시키기 위하여 화장품 제제에 혼입될 수도 있다.

Description

트랜스글루타미나제 변이체 및 그의 사용 적용분야
[관련 출원의 상호-참조]
본 출원은 2020년 5월 13일자 U.S. 가출원 제63/024,398호 및 2020년 9월 3일자 63/074,288호의 우선권을 주장하며, 이들 둘 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
[발명의 분야]
본 발명은 2개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 조작된 변이체 미생물 트랜스글루타미나제 폴리펩티드, 및 그를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 상기 변이체는 예컨대 국소적 사용 적용분야에서 단백질, 펩티드 또는 소형 분자를 야생형 스트렙토마이세스 모바라엔시스 ( Streptomyces mobaraensis ) 트랜스글루타미나제에 비해 증가된 비활성(specific activity)과 연계시키는 데에 사용될 수 있다. 상기 변이체는 또한 광범위한 미생물 억제를 위한 작용제로서 사용하기 위한 활성 살생물 효소 및 그의 제제로 사용될 수 있다.
트랜스글루타미나제 (Tgase, EC 2.3.2.13)는 펩티드 결합 글루타민 잔기의 γ-카르복시-아미드 기가 아실 공여체인 아실 전달 반응을 촉매할 수 있는 효소이다. 다양한 화합물들의 일차 아미노 기가 이후의 펩티드 결합 글루타민의 단일치환 γ-아미드 형성을 동반하여 아실 수용체로서 기능할 수 있다. 펩티드 사슬 중 리신 잔기의 ε-아미노 기가 아실 수용체로서 작용하는 경우, Tgase는 분자내 또는 분자간 γ-글루타밀-ε-리실 가교결합을 형성시킨다. 촉매 반응은 효소 활성 부위에서의 글루타민 탈아미노화 및 단백질-글루타밀-티오에스테르의 형성을 통하여 진행된다. 티오에스테르 중간물 카르보닐 잔기에서의 두 번째 단백질의 리실 ε-아미노 기에 의한 친핵성 공격은 일반적인 펩티다제들에 의한 단백질분해에 대하여 대단히 내성인 이소펩티드-가교결합 단백질을 생성시킨다 (문헌 [Mariniello, et al. (2007) J Agr Food Chem . 55:4717-4721]). Tgase에 의해 형성되는 결합은 단백질분해성 분해 (단백질분해)에 대하여 고도의 내성을 나타낸다. 미생물 기원의 Tgase들은 칼슘-비의존성으로서, 이는 그의 실제 사용시 커다란 장점을 나타낸다.
Tgase는 생물공학 및 식품 가공 산업에서 많은 적용분야를 찾아내었는데, 거기에서 그것은 "고기 접착제(meat glue)"라는 별명을 얻고 있다. 펩티드 가교결합 활성은 식품 가공, 생물공학, 약제학, 의료 장치, 개인 및 가정용 용품, 그리고 가죽 및 직물 가공을 망라하는 다양한 산업적 목적에 유용한 것으로 나타나 있다. 가장 흔하게 사용되는 Tgase는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 도시된 아미노산 서열을 가지며 이하 Tgase로 지칭되는 스트렙토마이세스 모바라엔시스 유래의 미생물 트랜스글루타미나제이다.
리실 옥시다제 (LOX) (단백질-리신 6-옥시다제로도 알려져 있음)는 콜라겐 및 엘라스틴 전구체 중 리신 잔기로부터의 알데히드의 형성을 촉매하는 구리-의존성 효소이다. 이러한 알데히드는 고도로 반응성이어서, 다른 리실 옥시다제-유래 알데히드 잔기 또는 변형되지 않은 리신 잔기와의 자발적인 화학 반응을 겪는다. 이는 콜라겐 및 엘라스틴을 가교-결합시키는 것으로 이어진다. LOX 단백질은 동물, 기타 진핵생물, 그리고 세균 및 고세균에서 확인되어 있다 (문헌 [Grau-Bove, et al. (2015) Scientific Reports 5: Article number: 10568]에 고찰되어 있음).
그의 일상적인 일과에 적은 노력을 투입하고자 하는 소비자들 사이에서 반-영구 개인 관리 제품들이 점점 더 인기를 얻고 있다. 또한, 적용된 화장 및 염료의 장기-지속 효과를 달성하기 위하여, 소비자 및 제품 고안자들에 의해 방수 및 방한 화장품이 오랫동안 탐색되어 왔다. 이와 같은 맥락에서 더 오래 지속되는 효과를 달성하는 데에는 소수성 실리콘의 사용이 광범위하게 사용되어 왔다. 화장품의 단점은 처음에 또는 새로 적용된 외관이 적용 후 지속되는 능력의 부재이다. 액체 또는 분말 화장으로 적용된 제품은 피부 상부에 안착하며, 그에 따라 피부, 입술 및/또는 모발로부터 그것이 접촉하게 되는 물품, 예컨대 유리제품, 컵, 직물, 또는 기타 피부상으로 쉽게 전달되는 경향을 가지고 있다. 장기-지속 립스틱, 글로스 및 염색제는 피부를 염색하는 데에 브롬산(bromoacid)을 이용하는데, 이는 피부를 건조하게 할 수 있으며, 자극할 수 있다. 또한, 적용된 제품의 이동성은 종종 제품이 피부 및/또는 입술의 잔금, 주름, 접힘부 및/또는 모공으로 용이하게 이동하고/거나 농축됨으로써, 바람직하지 않은 비-균일 외관을 초래하도록 한다.
통상적인 화장용 파운데이션은 보통 액체, 반-액체 또는 크림, 또는 분말 형태로 판매된다. 분말-유형 제제는 액체-유형 제제에 비해 더 짧은 유효 수명을 가지는 것으로 (즉 원하는 화장상의 이점을 그렇게 오래 제공하지 못하는 것으로) 느껴지고/거나 피부로부터 또 다른 표면으로의 바람직하지 않은 전달에 더 민감할 수 있다. 이는 분말-유형 파운데이션 제품이 본질적으로 그것이 문질러 제거되거나 닦여나가는 것을 적게 방지하거나 방지하지 못하면서 피부 표면상에 놓이는 개별 고체 입자라는 사실에 기인한다. 하루 일정 내내, 제품은 피지 (피부에 의해 생성됨), 수분 (땀, 눈물, 습기, 비, 세척) 및 오일 (피부 관리 제품, 기타 화장품 제품)에 노출된다. 따라서, 통상적인 액체 및 반-액체 제품은 1일을 초과하는 동안 피부상에 머무르는 데에 적합하지 않다. 통상적인 컨실러 및 파운데이션들이 공유하고 있는 한 가지 결점은 그것이 의도치 않게 다른 표면 (예컨대 의복, 가구, 모발 및 다른 신체 영역)으로 전달될 수 있다는 것이다. 그와 같은 전달은 의류, 가구 또는 다른 표면이 화장품으로 오염되는 것으로 이어질 수 있고/거나, 그것이 화장의 유효 수명을 감소시킬 수 있다. 다양한 메커니즘들이 피부로부터의 화장품의 원치 않는 전달에 기여할 수 있다. 예를 들어, 피부상에서 발견되는 피지 또는 기타 왁스질/오일계 물질들은 피부에 부착하는 파운데이션 또는 콘실러의 능력을 방해할 수 있다. 일부 경우에서, 표면을 문지르는 것은 피부로부터 콘실러 또는 파운데이션을 벗겨지도록 할 수 있다. 바람직하지 않은 전달이라는 결점을 극복하고/거나 제품의 유효 수명을 증가시키기 위한 것으로서, "장기-착용(long-wear)" 또는 "무-전달(transfer-free)" 제품들이 알려져 있다. 그러나, 통상적인 장기-착용 또는 무-전달 제품들조차도 24시간을 초과하는 동안 적합한 수준의 차폐 및/또는 미용 강화를 제공하거나 통상적인 일상 활동 동안 피부가 직면하는 벗겨짐에 대하여 적합한 내성을 제공할 수는 없다.
또한, 화장품 및 기타 개인 관리 제품들은 통상적으로 동일한 일자 동안 적용 및 제거된다. 이는 소비자의 인생에 그들이 제품의 이점을 누릴 수 없는 많은 시점들을 남긴다.
따라서, 24시간 초과 동안 사용시 제품이 통상적으로 마주하게 되는 환경에 의한 손상을 견딜 수 있는 반-영구적 화장품 제품을 제공한다면 바람직할 것이다. 우수함 벗겨짐 내성을 나타내는 반-영구적 화장품 제제를 제공하는 것 또한 바람직할 것이다. 샤워 및 안면 세척 동안 물 및 비누에 대한 노출을 견딜 수 있는 반-영구적 화장품 제제를 제공하는 것 역시 바람직할 것이다.
화장품 및 개인 관리 제품에 관한 하기의 새로운 범주가 요구되고 있다: 수시간 또는 수일 동안 제품이 처음에 적용되었을 때와 동일한 효과를 제공하는 반-영구적 기술. 그와 같은 제품은 통상적인 기술의 매일 적용 또는 빈번한 잔손질을 필요로 하지 않는다.
장기-지속 효과를 위하여 기능성이거나 활성인 성분을 피부에 결합시키는 것에도 상당한 관심이 존재한다. 한 가지 그와 같은 적용분야는 장기-지속 보호 및 성분의 감소된 피부 침투를 위한 피부 단백질 또는 외인성 단백질에의 일광차단 성분의 결합에 의해 UV 보호를 연장하는 것이다.
고분자량의 화장용으로 허용되는 펩티드 또는 단백질에 관심 성분을 고정하는 것에 의해 국소 활성 또는 기능성 성분이 피부에 침투하는 것을 방지하는 것에도 상당한 관심이 존재한다. 예를 들면, 국소 적용 전 또는 그 시점에 단백질 또는 펩티드에 화학적 일광차단 분자를 결합시키는 것은 혈류로의 이러한 성분의 침투 및 흡수를 방지하게 된다 (도 1). 최근 FDA 논문상의 결정은 단일 적용 후 허용을 초과하는 혈류 중 농도를 나타낸 12종의 화학적 일광차단제들을 지정하였다 (https://www.fda.gov/news-events/fda-voices/shedding-more-light-sunscreen-absorption). 이러한 일광차단 성분을 고분자량 단백질 또는 펩티드에 고정하는 것은 피부를 통한 그의 흡수 및 혈류로의 흡수를 방지함으로써 소비자용 화학적 일광차단제의 안전성을 향상시키고 규제 요건을 충족하게 된다.
인간 피부에서 발견되는 것과 동일한 단백질 (예컨대 콜라겐, 케라틴, 엘라스틴) 또는 유사한 자연 유래 구조 단백질 (예컨대 실크)로 구성되는 동물-기재 제품에 색상을 부가하거나 그것을 염색하는 것에도 상당한 관심이 존재한다. 예를 들면, 바람직하지 않은 수축, 말림 또는 늘어짐을 야기함으로써 관심 자연 섬유를 손상시킬 가능성이 있는 통상적인 염색 기술을 사용하지 않고 가죽, 실크, 울 또는 이들의 직물 블렌드에 색상을 영구적으로 결합시키는 능력은 바람직할 것이다. 또한, 이러한 직물들을 염색하는 과정은 환경 오염의 주된 근원으로, 직물 및 패션 산업이 적합한 대안적인 방법을 찾도록 유도하고 있다. 패션 및 시각상 눈길을 끄는 의류 및 기타 직물을 디자인하기 위하여 제조자가 관심 직물을 염색할 수 있도록 하는 것 역시 중요하다.
특히 그것이 고기 및 가공 고기 제품에 속할 때, 최종 제조되는 제품에서 전달되거나 누출되지 않는 자연 염료를 사용하여 식품 제품의 색상을 강화하는 능력에도 상당한 관심이 존재한다. 동물 기원의 피부 섬유 조성물 (콜라겐)로 제조되는 식용 식품 외피는 프랑크푸르트 소시지 및 비엔나 소시지의 제조에 점점 더 많이 사용되고 있는 바, 그의 제조에 대해서는 예를 들면 독일 특허 제972,854호에 기술되어 있다. 그와 같은 콜라겐 소시지 외피는 사실상 무색으로부터 옅은 황색을 망라하는데, 시각적으로 눈길을 끌거나 식욕을 돋우지는 못하고 있다. 외피가 소비 예정인 소시지, 그리고 특히 보크부르스트(bockwurst)와 같은 다양한 매우 뜨거운 소시지의 경우에서, 강하게 착색된 소시지에 대한 점점 더 큰 소비자의 선호도는 분명해지고 있다. 이에 따라, 미국, 프랑스 및 영국과 같은 일부 나라에서는, 핫도그와 같은 특정 소시지가 적색으로 염색되어 시판되고 있다.
그와 같은 염색 방법은 몇 가지 단점을 가지고 있다. 먼저, 대단히 어렵게만 균일한 염색이 수득될 수 있다. 소시지들이 얼마나 서로 가깝게 배열되는지 및 그들이 얼마나 적정하게 습윤화되는지에 따라, 외피에는 더 약하게 염색되거나 전혀 염색되지 않는 영역이 나타난다. 또한, 염료는 누출되어 나오는 것 및 또한 소시지 재료로 이동하는 것 둘 모두의 경향이 있다. 소시지 외피를 염색하기 위한 개선된 방법이 바람직할 것이다.
[발명의 개요]
본원에서는, 트랜스글루타미나제 (Tgase) 효소가 제공된다. 상기 효소는 스 트렙토마이세스 모바라엔시스 Tgase (서열식별번호: 1)의 변이체이다. 상기 변이체들 중 일부는 야생형 스트렙토마이세스 모바라엔시스 효소에 비해 적어도 약 1.2-배 또는 적어도 약 2-배, 예컨대 약 1.2-배 내지 약 10-배 더 큰 아미드교환 활성의 향상 (효소 활성에 있어서의 적어도 약 20 %, 50 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 %, 또는 1000 % 중 어느 것 이상의 향상)을 나타낸다.
아미드교환 반응에서 글루타민-공여체 기질을 아민 기질과 가교-결합시키는 데에 더 적은 양의 효소를 가능하게 함으로써 더 낮은 제품 발생 비용을 가능하게 하도록, 트랜스글루타미나제는 높은 비활성을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 더 짧은 반응 시간을 달성하도록 더 높은 최초 속도를 나타내는 트랜스글루타미나제의 돌연변이 변이체를 식별하는 것이 유익하다. 그와 같은 변이체는 미생물 억제와 같은 사용 적용분야에서 빠른 가교-결합을 촉진할 수 있다. 일 예는 보존으로서, 단백질, 예컨대 세포 표면 단백질의 빠른 가교결합이 비제한적으로 더 빠르거나 더 효과적인 미생물 사멸 속도와 같은 탁월한 미생물 억제로 이어진다. 다른 실시양태에서, 트랜스글루타미나제 변이체는 장기-지속성의 국소적으로 적용되는 제품 중 기능성 성분, 색상, 염료 또는 색소의 반-영구적이거나 영구적인 적용을 위한 결합제와 같은 콜라겐, 케라틴, 엘라스틴, 및/또는 제품 제제 또는 피부, 모발 또는 손발톱 표면상에서 발견될 수 있는 기타 구조적이거나 부속적인 피부, 모발 또는 손발톱 단백질 또는 펩티드에의 염료 분자 또는 색소의 결합과 같은 적용분야에서 사용될 수 있다.
일 측면에서는, 스트렙토마이세스 모바라엔시스 Tgase 효소의 변이체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체는 야생형 효소 서열 (서열식별번호: 1) 대비 (i) S199G 및 S299V (서열식별번호: 2); (ii) H289V 및 S299A (서열식별번호: 3); (iii) N292M, H289T, 및 S299V (서열식별번호: 4); (iv) N282E, H289V, 및 S299K (서열식별번호: 5); (v) S284D, H289L, 및 S299K (서열식별번호: 6); (vi) N282E, H289I, 및 S299K (서열식별번호: 7); (vii) N282K, G283A, 및 S299V (서열식별번호: 8); (viii) N282Q, S284P, H289E, 및 S299V (서열식별번호: 9); (ix) N282K, G283A, S284P, 및 S299V (서열식별번호: 10); (x) N282R, G283A, S284E, H289Q, 및 S299V (서열식별번호: 11); (xi) S199A 및 S299A (서열식별번호: 12); (xii)S199A 및 S299E (서열식별번호: 13); (xiii) S199A 및 S299K (서열식별번호: 14); (xiv) S199A 및 S299V (서열식별번호: 15); (xv) S199G 및 S299A (서열식별번호: 16); (xvi)S199G 및 S299K (서열식별번호: 17); (xvii) S2P, S199A, 및 S299A (서열식별번호: 18); (xviii) S2P, S199A, 및 S299E (서열식별번호: 19); (xix) S2P, S199A, 및 S299K (서열식별번호: 20); (xx) S2P, S199A, 및 S299V (서열식별번호: 21); (xxi) S2P, S199G, 및 S299A (서열식별번호: 22); (xxii) S2P, S199G, 및 S299E (서열식별번호: 23); (xxiii) S2P, S199G, 및 S299K (서열식별번호: 24); (xxiv) S2P, S199G, 및 S299V (서열식별번호: 25); (xxv) N292D, G283A, S284A, 및 S299V (서열식별번호: 26); 또는 (xxvi) S199G 및 S299E (서열식별번호: 27)를 포함하거나, 그것으로 이루어지거나, 또는 상기 개시 돌연변이와 나머지 아미노산 서열 내에서의 하나 이상의 보존성 치환을 가지는데, 예를 들면 상기 개시 돌연변이를 포함하며 개시된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 % 또는 적어도 약 98 %의 서열 동일성을 가지거나, 또는 상기 개시 돌연변이를 포함하는 변이체의 원형 퍼뮤턴트(permutant)이다.
서열식별번호: 1에 도시된 Tgase 서열의 변이체가 제공되며, 위치 199에서의 아미노산 잔기 A 또는 G 및 위치 299에서의 아미노산 잔기 A, E, K 또는 V의 치환을 포함하거나, 그것으로 이루어지거나, 또는 상기 개시 돌연변이와 나머지 아미노산 서열 내에서의 하나 이상의 보존성 치환을 가지는데, 예를 들면 상기 개시 돌연변이를 포함하며 개시된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 % 또는 적어도 약 98 %의 서열 동일성을 가지거나, 또는 상기 개시 돌연변이를 포함하는 변이체의 원형 퍼뮤턴트이다.
서열식별번호: 1에 도시된 Tgase 서열의 변이체가 제공되며, 위치 2에서의 아미노산 잔기 C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y, 위치 199에서의 A 또는 G 및 위치 299에서의 아미노산 잔기 A, E, K 또는 V의 치환을 포함하거나, 그것으로 이루어지거나, 또는 상기 개시 돌연변이와 나머지 아미노산 서열 내에서의 하나 이상의 보존성 치환을 가지는데, 예를 들면 상기 개시 돌연변이를 포함하며 개시된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 % 또는 적어도 약 98 %의 서열 동일성을 가지거나, 또는 상기 개시 돌연변이를 포함하는 변이체의 원형 퍼뮤턴트이다.
서열식별번호: 1에 도시된 Tgase 서열의 변이체가 제공되며, 위치 282에서의 아미노산 잔기 E 또는 M, 위치 289에서의 아미노산 잔기 I, T 또는 V 및 위치 299에서의 아미노산 잔기 K 또는 V의 치환을 포함하거나, 그것으로 이루어지거나, 또는 상기 개시 돌연변이와 나머지 아미노산 서열 내에서의 하나 이상의 보존성 치환을 가지는데, 예를 들면 상기 개시 돌연변이를 포함하며 개시된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 % 또는 적어도 약 98 %의 서열 동일성을 가지거나, 또는 상기 개시 돌연변이를 포함하는 변이체의 원형 퍼뮤턴트이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 변이체는 추가로 C-말단 폴리히스티딘 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 변이체는 추가로 N-말단 메티오닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 N-말단 메티오닌 잔기를 임의적으로 추가 포함하는 본원에서 기술되는 아미노산 서열 중 어느 것의 원형 퍼뮤턴트이다. 일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제 효소는 추가로 전구-서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 바와 같은 변이체, 또는 개시되는 돌연변이를 포함하며 개시되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 % 또는 적어도 약 98 %의 서열 동일성을 가지는 변이체, 또는 개시되는 돌연변이를 포함하는 변이체의 원형 퍼뮤턴트인 변이체는 서열식별번호: 1에 도시된 아미노산 서열을 가지는 야생형 효소에 비해 적어도 약 2-배 더 큰 트랜스글루타미나제 효소 활성을 가진다.
또 다른 측면에서는, 제품의 저장 수명을 증가시키고/거나 악취를 제거하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 조성물을 포함하지 않는 동일한 제품에 비해 1종 이상 미생물의 성장을 방지하거나 감소시키는 데에 효과적인 양으로 본원에서 기술되는 바와 같은 트랜스글루타미나제 변이체를 생성물에 혼입하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서는, 효소를 포함하지 않는 동일한 제품에 비해 제품의 저장 수명을 증가시키는 데에 효과적인 양으로 본원에서 기술되는 바와 같은 트랜스글루타미나제 변이체를 포함하는 제품이 제공된다. 예를 들면, 상기 제품은 개인 관리, 가정용, 산업용, 식품, 약제, 화장품, 건강관리, 해양, 페인트, 코팅, 에너지, 플라스틱, 포장 또는 농업용 제품일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제품은 막대 비누, 액체 비누, 손 살균제, 수술전 피부 소독제, 세척용 와이프(wipe), 소독용 와이프, 바디 워시, 여드름 치료 생성물, 항진균 기저귀 발진 크림, 항진균 피부 크림, 샴푸, 컨디셔너, 화장용 탈취제, 항미생물 크림, 바디 로션, 핸드 크림, 국소용 크림, 애프터셰이브 로션, 스킨 토너, 구강 세척제, 치약 또는 일광차단 로션이다. 다른 실시양태에서, 제품은 상처 치유 연고, 크림 및 로션, 상처 피복제, 화상 상처 크림, 붕대, 테이프 또는 스테리-스트립(steri-strip)에서 선택되는 상처 관리 제품이다.
또 다른 측면에서는, 하기를 포함하는 효소 조성물이 제공된다: (i) 본원에서 기술되는 바와 같은 트랜스글루타미나제 변이체 효소, 서열식별번호: 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 이루어지는 트랜스글루타미나제 효소, 를 포함하거나 그것으로 이루어지는 트랜스글루타미나제 효소; 및 (ii) 트랜스글루타미나제 효소의 기질, 예컨대 일광차단 분자, 기능성 성분, 색소 또는 염료 분자. 일부 실시양태에서, 상기 일광차단 분자, 기능성 성분, 색소 또는 염료 분자는 유리 아미노 기를 포함하는 분자에 접합되어 있다 (도 2). 예를 들면, 유리 아미노 기를 포함하는 분자는 리신, 카다베린, 푸트레씬, 히드라진, 아디프산 디히드라지드, 세바스산 디히드라지드 또는 헥사메틸렌디아민과 같은 링커를 사용한 유도체화로부터 유래할 수 있다 (도 4).
일부 실시양태에서, 유리 아미노 기를 포함하는 분자는 화학식 R(CH2)n(NH2)의 지방족 아민으로부터 유래하며, 여기서 n은 1 내지 30의 정수이거나, n은 5 내지 10사이의 정수이고, R은 기능성 성분이다. 이와 같은 화학 관능기에서의 지금까지의 시도는 도 4A에 제시되어 있는 화학식의 페놀계 산소에서 카르바메이트를 제조하는 데에 초점이 맞추어져 있었다 (예컨대 U.S. 특허 제5,490,980호 참조). 그러나, 이들 화합물은 트랜스글루타미나제의 기질인 것으로 나타난 바가 없다. 본 개시내용은 n이 1 내지 30 사이 또는 5 내지 10의 정수인 (CH2)n에 의해 분리되어 있는 디아민과의 옥시벤존 또는 아보벤존의 카르보닐에서의 시프(Schiff) 염기 반응을 통하여 (도 4B-4C의 화학식) 성공적으로 링커를 구현하였다. 본 개시내용은 이러한 아민 함유 일광차단 분자가 트랜스글루타미나제의 기질이라는 것을 입증하고 있다.
일부 실시양태에서, 일광차단 분자, 색소 또는 염료 분자는 자유로운 글루타민 측쇄를 가지는 아미노산, 펩티드 또는 단백질에 접합되어 있다 (도 3). 상기 효소 조성물을 포함하는 화장품 조성물도 제공된다.
또 다른 측면에서는, 관심 재료 또는 단백질에 색상을 결합시키기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 관심 재료 또는 단백질을 본원에서 기술되는 바와 같은 트랜스글루타미나제 변이체 효소, 및 색소 또는 염료 분자와 접촉시키는 것으로서, 트랜스글루타미나제 변이체 효소가 관심 재료 또는 단백질에 색소 또는 염료 분자를 공유 결합시키는 데에 효과적인 양으로 존재하는 것을 포함한다 (도 7 및 도 8). 일 실시양태에서, 상기 관심 단백질은 피부에 존재하는 단백질이다. 예를 들면, 피부에 존재하는 상기 단백질은 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴일 수 있다.
또 다른 측면에서는, 제품과 접촉되었을 때 관심 단백질 또는 단백질-, 펩티드- 또는 아미노산-함유 재료상에 색상 분자를 부가하는 데에 효과적인 양으로 본원에서 기술되는 바와 같은 트랜스글루타미나제 변이체 효소를 포함하는 제품이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 제품은 개인 관리, 화장품, 가죽, 식품 또는 농업용 제품일 수 있다. 관심 단백질 또는 재료를 상기 제품과 접촉시키는 것을 포함하는, 관심 단백질 또는 재료의 색상 변형 방법도 제공된다.
또 다른 측면에서는, 1종 이상 항미생물 효소, 펩티드 또는 단백질과의 조합으로 본원에서 기술되는 바와 같은 트랜스글루타미나제 변이체 효소를 포함하며, 보존, 살생물, 항미생물 또는 살바이러스 활성을 보유하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 항미생물 효소, 펩티드 또는 단백질은 리소자임, 키티나제, 리파제, 리신, 리소스타핀, 글루카나제, DNase, RNase, 락토페린, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 락토나제, 아실라제, 디스페르신 B, a-아밀라제, 셀룰라제, 니신, 박테리오신, 시데로포어, 폴리믹신 또는 데펜신이다.
또 다른 측면에서는, 본원에서 기술되는 바와 같은 트랜스글루타미나제 변이체 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 박테리오파지가 제공된다. 일 실시양태에서는, 박테리오파지를 포함하는 조성물이 항미생물 활성을 제공한다. 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 개재되어 그의 일부를 구성하는 첨부 도면은 개시되는 방법 및 조성물의 몇 가지 실시양태들을 예시하며, 상세한 설명과 함께 개시 방법 및 조성물의 원리를 설명하는 기능을 한다.
도 1은 일광차단제-링커-콜라겐을 산출하기 위하여 트랜스글루타미나제 또는 리실 옥시다제에 의해 촉매되는, 예시적인 단백질인 콜라겐에의 지방족 디아민 (CH2)n(NH2)2에 접합된 옥시벤존 또는 아보벤존인 일광차단제의 공유 부가를 개략적으로 보여준다. 효소는 일광차단 분자상의 아민 기와 콜라겐상 Gln 측쇄 (트랜스글루타미나제) 또는 Lys 측쇄 (리실 옥시다제) 중 어느 하나 사이의 가교-결합을 촉매한다. 효소는 봉입되거나 봉입되지 않을 수 있다.
도 2는 일광차단제-링커-콜라겐을 산출하기 위하여 트랜스글루타미나제에 의해 촉매되는, 예시적인 단백질 콜라겐에의 일광차단제-링커-NH2의 공유 부가를 개략적으로 보여준다. 효소는 링커 분자상 아민 기와 콜라겐상 Gln 측쇄 사이의 가교-결합을 촉매한다. 효소는 봉입되거나 봉입되지 않을 수 있다.
도 3은 일광차단제-링커-콜라겐을 산출하기 위하여 트랜스글루타미나제에 의해 촉매되는, 예시적인 단백질 콜라겐에의 일광차단제-링커-Gln의 공유 부가를 개략적으로 보여준다. 효소는 링커 분자상 Gln 기와 콜라겐 Lys 잔기상 가용 아민 사이의 가교-결합을 촉매한다. 효소는 봉입되거나 봉입되지 않을 수 있다.
도 4A-4C는 일광차단제-링커 부가물을 생성시키기 위하여 조합될 수 있는 일광차단제 및 링커 분자들의 화학식을 도시한다. 도 4A는 트랜스글루타미나제와 반응성을 가지는 것으로 입증되지는 않았으나, 페놀계 알콜에서의 카르바메이트 형성을 통하여 옥시벤존을 기능성화하기 위한 방법을 보여준다. 도 4B는 옥시벤존의 카르보닐을 통한 이민 형성이 트랜스글루타미나제 상용성 아민 공여체를 생성시킨다는 것을 보여준다. 도 4C는 아보벤존의 카르보닐을 통한 이민 형성이 2종 트랜스글루타미나제 상용성 아민 공여체의 혼합물을 생성시킨다는 것을 보여준다.
도 5는 일광차단제-링커-단백질을 산출하기 위하여 트랜스글루타미나제에 의해 촉매되는, 1,6-헥산 디아민 (HMDA)의 옥시벤존과의 반응 후 이어지는 예시 단백질 Cbz-Gln-Gly에의 옥시벤존-링커 부가물의 공유 부가를 도시한다. 효소는 디펩티드상 Gln 측쇄와 일광차단제-링커상 가용한 아민 기 사이의 가교-결합을 촉매한다. 효소는 봉입되거나 봉입되지 않을 수 있다.
도 6은 Cbz-Gln-Gly에 대한 옥시벤존-링커의 Tgase 촉매 커플링 반응 생성물의 특성화를 보여준다. 본 도면은 야생형 Tgase, Tgase 변이체 서열식별번호: 28 및 Tgase 부재하의 음성 대조군 사이에서 일광차단제-링커-단백질 생성물의 양을 비교한다. Tgase 서열식별번호: 28은 야생형 Tgase에 비해 11-배 더 많은 생성물을 함유한다. Tgase의 부재하에서는, 일광차단제-링커-단백질 생성물이 관찰되지 않는다.
도 7은 염료-콜라겐을 산출하기 위하여 트랜스글루타미나제에 의해 촉매되는, 콜라겐에의 염료-NH2 (TAMRA-카다베린)의 공유 부가를 개략적으로 보여준다. 효소는 염료 분자상 아민 기와 콜라겐상 Gln 측쇄 사이의 가교-결합을 촉매한다. 효소는 봉입되거나 봉입되지 않을 수 있다.
도 8은 염료-콜라겐을 산출하기 위하여 트랜스글루타미나제에 의해 촉매되는, 콜라겐에의 염료-Gln의 공유 부가를 개략적으로 보여준다. 효소는 염료상 Gln 측쇄 (ZQG-TAMRA)와 콜라겐상 Lys, N-말단 또는 다른 아민 기 사이의 가교-결합을 촉매한다. 효소는 봉입되거나 봉입되지 않을 수 있다.
도 9는 Tgase 변이체 서열식별번호: 28 (0 내지 0.33 %w/v)에 의해 촉매되는, 콜라겐 플레이트에 공유 결합되는 용액 중 TAMRA-카다베린 (1.7 g/L)의 효소 투여량 반응을 보여준다. 염료 (TAMRA-카다베린)는 Tgase 변이체 서열식별번호: 28의 양을 증가시키는 것 (좌측에서 우측으로)에 의해 콜라겐 플레이트에 결합되었다. 최종 컬럼의 음성 대조군으로는, Tgase를 소 혈청 알부민 (BSA, 0.33 % w/v)으로 대체하였다. 저부 행은 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 사용한 세척 과정을 통하여 잔류 비결합 염료를 제거한 후의 콜라겐-결합 염료를 보여준다.
도 10은 Tgase 변이체 서열식별번호: 28에 의해 촉매되는, 콜라겐 플레이트에의 용액 중 짧은 염료 표지 펩티드 Cbz-Gln-Gly-TAMRA (2.5 g/L)의 공유 부가를 보여준다. 컬럼 1은 Tgase의 존재 또는 부재하에서 콜라겐 플레이트에 첨가된 완충제 중 염료 (Cbz-Gln-Gly-TAMRA)를 도시한다. 컬럼 2는 인큐베이션 후의 과량 반응 혼합물의 제거를 도시한다. 컬럼 3은 비결합 염료를 제거하기 위한 PBS를 사용한 세척 단계를 나타낸다. 컬럼 4는 과량 비결합 염료 제거 후의 콜라겐에 결합된 염료를 나타낸다. 염료는 Tgase의 존재하에서는 콜라겐에 결합되었으며, Tgase의 부재하에서는 결합이 최소한으로 관찰되거나, 관찰되지 않았다.
본원에서는, Tgase 효소가 제공된다. 상기 효소는 Tgase (서열식별번호: 1)의 변이체로서, 야생형 스트렙토마이세스 모바라엔시스 효소에 비해 적어도 약 1.2-배, 적어도 약 2-배, 적어도 약 10-배, 또는 적어도 약 11-배 더 큰 아미드교환 활성의 향상을 나타낸다.
역시 본원에서 제공되는 것은 유리 R-NH2와 같은 친핵체를 포함하는 기능성 성분과 반응시키기 위하여 예를 들면 콜라겐과 같은 화장용으로 적격인 단백질상에 반응성 알데히드를 형성시키는 데에 이용될 수 있는 리실 옥시다제 (LOX) 효소의 사용 적용분야이다.
본원에서 개시되는 가교-결합 효소는 건강관리 제품, 개인 관리 또는 화장품 제제, 포장 (예컨대 식품, 화장품 및 약제), 직물 및 가죽 제조, 페인트 및 코팅, 그리고 수 처리 및 정제를 포함한 해양 적용분야에서 적용성을 가지는 미생물 억제를 위한 신규 살생물제로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 Tgase 효소는 염료 또는 단백질을 사용하여 관심 단백질, 예컨대 비제한적으로 케라틴 및 콜라겐을 영구적으로 변형시키는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, Tgase 효소는 보존제로서 사용될 수 있다.
본원에서는, 스트렙토마이세스 모바라엔시스 Tgase의 돌연변이 형태인 Tgase 효소가 개시된다. 구체적으로, 본원에서 기술되는 효소는 야생형 Tgase의 폴리펩티드 서열 또는 그의 원형 퍼뮤턴트 중 적어도 2개의 아미노산을 돌연변이시키고, 글루타민 아미노산 잔기와 아민 (또는 히드록실아민) 수용체 사이의 트랜스글루타미나제 아미드교환 활성을 관찰하는 것에 의해 수득되는 단백질이다.
돌연변이성 치환을 가지는 단백질의 재조합 발현 방법들이 이미 예를 들면 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Press (1989)], [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)] 등에서 기술된 바 있다. 점 돌연변이 효소는 위치-지정 돌연변이유발 또는 관련 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 그와 같은 방법에는 비제한적으로 키트 및 시중에서 구입가능한 반응물들을 사용하는 것, 예컨대 쿤켈법(Kunkel method), KLD법, 또는 간극 이중법(Gapped duplex method)이 포함될 수 있으며, 상기 키트의 예는 예를 들면 퀵체인지(QuickChange)™ 부위-지정 돌연변이유발 키트 (스트라타진(Stratagene) 사), 진아트(GeneArt)™ 부위-지정 돌연변이유발 시스템 (인비트로겐(Invitrogen) 사), Q5® 부위-지정 돌연변이유발 시스템 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 사), 타카라(TaKaRa) 부위-지정 돌연변이유발 시스템 (프라임 스타(Prime STAR)® 돌연변이유발 기본 키트), 또는 뮤타-디렉트(Muta-Direct)™ 부위 지정 돌연변이유발 키트 (인트론(iNtRON) 사) 등이다.
본원에서는, 일광차단제 및/또는 색상 적용 및 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴과 같은 피부 및 피부-유래 단백질 및 펩티드에의 결합, 그리고 색상 적용 및 식용 식품 외피와 같은 식품 제품에의 결합을 위한, 화장용 및/또는 일광차단 제품과 같은 사용 적용분야에서의 단백질 및 펩티드에의 UV-차단 분자 및/또는 색상 생성 분자 (예컨대 염료 및 색소 분자)와 같은 기능성 성분의 공유 결합을 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
I. 정의
달리 표시되지 않는 한, 각각 핵산은 5' → 3' 방향의 좌측에서 우측으로 기재되며; 아미노산 서열은 아미노 → 카르복시 방향의 좌측에서 우측으로 기재된다.
본원에서 제공되는 숫자 범위는 범위를 한정하는 숫자들을 포괄하는 것이다.
"하나"는 문맥상 분명하게 달리 지정되지 않는 한 복수의 언급을 포함한다.
본원에서, "약"이라는 용어는 값의 더하기 또는 빼기 10 퍼센트 (10 %)를 의미하는 데에 사용된다. 예를 들어, "약 100"은 90과 110 사이 임의의 수를 말한다.
본원의 명세서 및 청구범위에서 사용될 때, "및/또는"이라는 구는 그렇게 연계되는 요소들, 즉 일부 경우에서는 합동으로 존재하며 다른 경우에서는 분리되어 존재하는 요소들 중 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 임의적으로는, 분명하게 반대로 표시되지 않는 한, 구체적으로 식별되는 요소들과 관련되어 있는지 또는 무관한지에 관계없이, "및/또는" 문구에 의해 구체적으로 식별되는 요소들이 아닌 다른 요소들이 존재할 수 있다. 이에 따라, 비-제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방-종료형 언어와 함께 사용될 경우, "A 및/또는 B"라는 언급은 일 실시양태에서는 B가 없는 A를 (임의적으로는 B가 아닌 다른 요소는 포함); 또 다른 실시양태에서는 A가 없는 B를 (임의적으로는 A가 아닌 다른 요소는 포함); 또 다른 실시양태에서는 A 및 B 둘 모두를 (임의적으로는 다른 요소 포함) 지칭할 수 있는 등이다.
"아미노산"이라는 용어는 알파-탄소로 지정된 탄소에 결합되어 있는 아민 기 및 카르복실 기 둘 모두를 함유하는 분자를 지칭한다. 적합한 아미노 30 산에는 비제한적으로 자연 발생 아미노산들의 D- 및 L-이성질체 둘 모두는 물론, 유기 합성 또는 다른 대사 경로에 의해 제조되는 비-자연 발생 아미노산도 포함된다. 일부 실시양태에서, 단일 "아미노산"은 연장된 지방족 또는 방향족 백본 스캐폴드로 가용한 바와 같은 다수의 측쇄 잔기를 가질 수 있다. 문맥상 구체적으로 달리 표시되지 않는 한, 본원에서 사용될 때의 아미노산이라는 용어는 아미노산 유사체를 포함하고자 한다.
본원에서 사용될 때, "항미생물제"는 예를 들면 환경 보호국(Environmental Protection Agency) (EPA)에 따른 세균, 진균 및 바이러스를 사멸시키거나 그의 성장을 억제하고자 하는 물질을 지칭한다.
본원에서 사용될 때의 "염기 쌍" 또는 "bp"라는 용어는 이중 가닥 DNA 분자에서의 아데닌 (A)과 티민 (T) 또는 시토신 (C)과 구아닌 (G)의 연합 (즉 수소 결합 쌍 형성)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 염기 쌍은 예를 들면 DNA/RNA 이중체에서의 우라실 (U)과 쌍을 형성한 A를 포함할 수 있다.
"비드"는 본원에서 기술되는 바와 같은 중합체를 포함하거나 그것으로 이루어지는 고체 입자를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "살생물제"는 예를 들면 환경 보호국 (EPA)에 따른 미생물을 사멸시키는 물질을 지칭한다.
"생분해성(Biodegradable)"은 미생물 (예컨대 세균) 또는 다른 살아있는 생물체에 의한 분해를 할 수 있는 물질을 지칭한다.
"Cbz"는 벤질옥시카르보닐의 약어이다.
"촉매"라는 용어는 반응물 또는 반응물들이 생성물 또는 생성물들로 전환되는 화학 반응이 이루어지는 속도를 가속하는 분자 또는 거대분자 구조와 같은 화학적 작용인자를 지칭하지만, 화학 반응 완료시에 촉매 자체가 생성물로 전환되거나, 달리 변화 또는 소비되는 것은 아니다. 촉매가 1회의 화학 반응에 참여한 후에도, 그것은 변화되지 않기 때문에, 추가적인 화학 반응에 그것이 참여하여 추가적인 반응물에 작용함으로써 추가 생성물을 생성시킬 수 있다. 화학 반응을 가속하기 위하여, 촉매는 반응 경로에 걸친 활성화 에너지 장벽을 감소시킴으로써, 더 낮은 온도에서, 또는 주어진 온도에서 더 빠르게 그것이 이루어지도록 한다. 이와 같은 방식으로, 화학적 평형에의 시스템의 더 빠른 접근이 달성될 수 있다. 촉매에는 단백질 촉매인 효소가 포괄된다.
"원형 퍼뮤턴트"는 그의 아미노산 서열에 있어서 참조 서열에 비해 변화된 아미노산 순서를 가지는 단백질을 지칭한다. 결과는 참조 단백질에 비해 상이한 연결성을 가지나 전체적으로 유사한 3-차원 (3D) 형상을 가지는 단백질 구조이다. 예를 들면, N-말단 단편이 단백질 아미노산 서열의 C-말단 단부로 이동될 수 있다.
"착색제" 또는 "색상 생성 분자"는 포유동물 (예컨대 인간) 피부, 모발 또는 손발톱에 색상을 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 착색제에는 염료 및/또는 색소가 포함될 수 있다. 착색제의 비제한적인 예에는 페놀, 나프톨 및 히드록시 아조 유도체가 포함된다. 본원에서 논의될 때, 착색제는 착색제에 직접적인 것, 또는 착색제에 결합되는 링커를 통한 간접적인 것 중 어느 하나로 결합되는 아미노 기 (예컨대 알킬아미노, 알킬히드라진, 알킬히드라지드 또는 알콕시아민 잔기)를 포함하도록 변형될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "조성물"이라는 용어는 2종 이상 물질의 조합, 예를 들면 본원에서 기술되는 바와 같은 1종 이상의 가교-결합 효소, 및 1종 이상의 발색단, 예컨대 UV-차단 분자, 염료, 색소 또는 기타 색상-생성 분자를 포함하는 조합을 지칭한다.
폴리펩티드와 관련한 "보존성 변형" 또는 "보존성 치환"은 유사한 측쇄를 가지는 또 다른 아미노산을 사용한 그 내부 아미노산의 대체를 의미한다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 계열에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있다. 그와 같은 계열에는 염기성 측쇄 (리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 분지형 측쇄 (트레오닌, 발린, 이소류신), 소형 측쇄 (글리신, 알라닌, 세린), 사슬 방향 변화 측쇄 (글리신, 프롤린) 및 방향족 측쇄 (티로신, 페닐알라닌, 트립토판)를 가지는 아미노산들이 포함된다.
"~로부터 유래하는"이라는 용어는 "~로부터 기원하는", "~로부터 수득되는", "~로부터 수득가능한", "~로부터 단리되는", "~로부터 정제되는" 및 "~로부터 생성되는"이라는 용어들을 포괄하는데, 일반적으로 일 특정 재료가 또 다른 특정 재료에서 그의 기원이 발견되거나 또 다른 특정 재료와 관련하여 기술될 수 있는 특징을 가진다는 것을 표시한다.
본원에서 "이중체"라는 용어는 2개 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 존재하는 상보성 영역을 지칭한다. "이중체 영역"이라는 용어는 2개 올리고뉴클레오티드 또는 단일 올리고뉴클레오티드의 2개 부분 사이에 존재하는 서열 상보성의 영역을 지칭한다.
"염료"는 통상적으로 수-용성 유기 분자인, 무언가에 색상을 부가하거나 그의 색상을 변화시키는 데에 사용되는 착색된 물질, 예컨대 자연 또는 합성 물질을 지칭한다.
본원에서 사용될 때의 "유효량"은 미생물 성장을 방지하거나 억제하는 데에 충분한 본원에서 개시되는 바와 같은 보존제 조성물의 양 (예컨대 최소 억제 농도 (MIC))을 지칭한다. 본원에서 기술되는 보존제 조성물은 그램 양성 세균, 그램 음성 세균, 효모 및/또는 곰팡이에 대하여 활성일 수 있다.
"완화제"는 피부를 유연화하거나 진정시키는 외부 적용 작용제로서, 그에 대해서는 일반적으로 관련 기술분야에 알려져 있으며, 문헌 ["Handbook of Pharmaceutical Excipients", 4th Ed., Pharmaceutical Press, 2003]과 같은 개론서에 열거되어 있다.
"에멀션"은 또 다른 것 중에서의 일 액체의 현탁을 촉진하고, 오일 및 물과 같은 소수성 물질과 친수성 물질의 안정한 혼합물 또는 에멀션의 형성을 촉진하는 표면 활성 물질이다.
본원에서 사용될 때의 "봉입하다(Encapsulate)" 또는 "봉입"은 매트릭스 중에의 효소의 포착 또는 봉입을 지칭한다. 상기 매트릭스는 중합체 단독, 또는 중합체 또는 매트릭스의 다공성 중합체성 네트워크 구조 또는 효소를 함유하는 반-투과성 멤브레인 코팅에 효소를 공유 결합시키는 가교-결합제를 동반하는 중합체일 수 있다.
본원에서 사용될 때, "발현"이라는 용어는 유전자의 핵산 서열을 바탕으로 폴리펩티드가 생성되는 과정을 지칭한다. 상기 과정에는 전사 및 번역 둘 모두가 포함된다.
"기능성 성분"은 소비자에에 이점을 제공하기 위하여 제품 내에서 특정 기능을 수행하거나 실행하는 성분을 지칭한다. 예를 들면, 일광차단 분자는 UV 방사선을 차단하며, 색소 또는 염료 분자는 피부, 모발 또는 손발톱 색상을 변형시킨다.
"유전자"는 폴리펩티드를 생성시키는 데에 연관되어 있는 DNA 분절을 지칭하는 것으로서, 코딩 영역에 선행하는 영역 및 후속하는 영역은 물론, 개별 코딩 분절들 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론)도 포함한다.
"가정용 제품"은 개별 소비자에 의해 사용되게 되는 개인 관리 제품이 아닌 다른 제품이다.
"혼성화" 및 "어닐링(annealing)"은 뉴클레오티드 잔기 염기들 사이의 수소 결합을 통해 하나 이상의 폴리뉴클레오티드들이 반응하여 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기 쌍형성, 후그스타인(Hoogstein) 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 이루어질 수 있다. 복합체는 이중체 구조를 형성하는 2개의 핵산 가닥, 다중-가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-혼성화 가닥 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)의 개시, 결찰 반응, 서열분석 반응 또는 절단 반응, 예컨대 리보자임에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소적 절단과 같은 더 광범위한 과정 중의 일 단계를 구성할 수 있다. 제2 서열 뉴클레오티드 잔기 염기와의 수소 결합을 통하여 안정화될 수 있는 제1 핵산 서열은 제2 서열에 "혼성화가능한" 것으로 지칭된다. 그와 같은 경우, 제2 서열 역시 제1 서열에 혼성화가능한 것으로 지칭될 수 있다. "혼성화된"이라는 용어는 뉴클레오티드 잔기 염기들 사이의 수소 결합을 통하여 안정화된 복합체 중 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
"산업용 제품"은 산업에서 사용되는 제품을 지칭한다.
본원에서 사용될 때의 "단리된", "정제된", "분리된" 및 "회수된"이라는 용어는 예를 들면 그것이 함유되어 있는 샘플 중 적어도 90 중량%, 또는 15 적어도 95 중량%, 또는 적어도 98 중량%의 농도로 그것이 자연상에서 연관되어 있는 적어도 하나의 구성요소로부터 제거된 재료 (예컨대 단백질, 핵산 또는 세포)를 지칭한다. 예를 들면, 이들 용어는 예컨대 무손상인 생물학적 시스템과 같은 그의 자연 상태에서 발견될 때 보통 거기에 동반되는 구성요소가 실질적으로 또는 본질적으로 없는 재료를 지칭할 수 있다. 단리된 핵산 분자에는 일반적으로 핵산 분자를 발현하는 세포에 함유되어 있으나 세포외로 존재하거나 그의 자연상 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하는 핵산 분자가 포함된다.
"성숙한" 폴리펩티드, 단백질 또는 효소는 그의 전구-서열의 절단 후 또는 전구-서열 부재하에서의 효소원 또는 전구단백질의 활성화된 형태를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 성숙한 효소는 번역-후 프로세싱 (활성화) 단계를 배제하기 위하여 전구-서열과 별도의 폴리펩티드로서 생성될 수 있다.
"미세비드(microbead)"는 그의 최대 치수가 1 밀리미터 미만인 비드를 지칭한다.
"미생물(microorganism)" 및 "미생물(microbe)"이라는 용어는 세균, 원생동물, 진균, 조류, 아메바, 바이러스 및 곰팡이의 생명 형태를 포함할 수 있다.
본원에서 "돌연변이"라는 용어는 비제한적으로 그에 의해 "돌연변이체"를 생성시키는 치환, 삽입 및 결실 (감축 포함)을 포함한, 모체 서열에 도입된 변화를 지칭한다. 돌연변이의 결과에는 모체 서열에 의해 코딩되는 단백질에서는 발견되지 않는 새로운 특징, 특성, 기능, 표현형 또는 특질의 야기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 "뉴클레오티드"라는 용어는 당 잔기 (5탄당), 포스페이트 및 질소성 헤테로고리형 염기로 구성되는 DNA 또는 RNA의 단량체 단위를 지칭한다. 염기는 글리코시드 탄소 (5탄당의 1' 탄소)를 통하여 당 잔기에 연결되는데, 염기와 당의 그와 같은 조합은 뉴클레오시드이다. 뉴클레오시드가 5탄당의 3' 30 또는 5' 위치에 결합된 포스페이트 기를 함유하는 경우, 그것은 뉴클레오티드로 지칭된다. 중합체성의 작용가능하게 연결된 뉴클레오티드들의 서열은 본원에서 통상적으로 "염기 서열", "뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드 서열", "올리고뉴클레오티드 서열" 또는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 "가닥"으로 지칭되는데, 본원에서는 그의 좌측에서 우측 배향이 각각 중합체 서열 "5'" 및 "3'" 말단의 말단 5' 포스페이트 기 및 말단 3' 히드록실 기를 말하는 5'-말단에서 3'-말단으로의 통상적인 방향인 화학식으로 표현된다.
"임의적인" 또는 "임의적으로"는 이어져 기술되는 사례, 상황 또는 재료가 발생하거나 존재할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다는 것, 그리고 그 설명이 상기 사례, 상황 또는 재료가 발생하거나 존재하는 경우 및 그들이 발생하거나 존재하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
본원의 명세서 및 청구범위에서 사용될 때, "또는"은 상기에서 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록의 항목들을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것, 즉 수많은 요소 또는 요소 목록 중 적어도 하나를 포함하나 하나 초과도 포함하며 임의적으로는 열거되지 않은 추가적인 항목도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "~중 오로지 하나" 또는 "~중 정확하게 하나", 또는 청구범위에서 사용될 때의 "~로 구성되는"과 같이 분명하게 반대로 표시되는 유일 용어들은 수많은 요소 또는 요소 목록 중 정확하게 하나 요소의 포함을 지칭하게 된다. 일반적으로, "~중 어느 하나", "~중 하나", "~중 오로지 하나" 또는 "~중 정확하게 하나"와 같은 배제성의 용어가 선행하는 경우, 본원에서 사용될 때의 "또는"이라는 용어는 오로지 배제적인 대안들 (즉 "하나 또는 다른 것, 그러나 둘 모두는 아님")을 표시하는 것으로 해석되어야 한다. 청구범위에서 사용될 때, "본질적으로 ~로 구성되는"은 특허법 분야에서 사용될 때의 그의 일반적인 의미를 가져야 한다.
본원에서 사용될 때, "병원체"는 인간, 동물 및/또는 식물에서 질환을 야기할 수 있는 미생물 (예컨대 세균, 바이러스 또는 기생충)을 지칭한다.
"펩티드"는 사슬로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 구성되며 각 산의 카르복실 기가 유형 R-OC-NH-R'의 결합에 의해 다음 것의 아미노 기에 연결되어 있는, 예를 들면 약 2 내지 약 50개 아미노산의 화합물을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "영구적인"은 물리적 침착 또는 흡착보다는 화학 공유 결합을 통한 표면 또는 단백질 분자에의 일광차단 분자, 또는 염료 또는 색소 분자와 같은 색상 분자 중 어느 하나의 결합 적용을 지칭한다.
"색소"는 색상을 제공하는 재료, 예를 들면 통상 비제한적으로 무기질 또는 금속염과 같은 수불용성 무기 물질인, 파장-선택성 흡착의 결과로서 반사되거나 투과되는 광의 색상을 변화시키는 재료를 지칭한다.
"폴리머라제"라는 용어는 본원에서 뉴클레오티드들의 중합을 촉매하는 (즉 폴리머라제 활성) 효소를 지칭한다. 폴리머라제라는 용어는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 및 리버스 트랜스크립타제를 포괄한다. "DNA 폴리머라제"는 데옥시리보뉴클레오티드들의 중합을 촉매한다. "RNA 폴리머라제"는 리보뉴클레오티드들의 중합을 촉매한다. "리버스 트랜스크립타제"는 RNA 주형에 대하여 상보성인 데옥시리보뉴클레오티드들의 중합을 촉매한다.
"폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 호환가능하게 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체 중 어느 하나인 임의의 길이를 가지는 중합체 형태의 뉴클레오티드들을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3-차원 구조를 가질 수 있으며, 알려지거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있고, 단일- 또는 다중-가닥 (예컨대 단일-가닥, 이중-가닥, 삼중-나선 등)일 수 있으며, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및/또는 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 또는 이들의 유사체를 포함한 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 유사체 또는 변형된 형태를 함유할 수 있다. 유전자 코드가 축퇴성이어서, 1종을 초과하는 코돈이 특정 아미노산을 코딩하는 데에 사용될 수 있기 때문에, 본 발명은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 포괄한다. 폴리뉴클레오티드가 사용 조건하에서 원하는 기능성을 보유하는 한, 뉴클레아제 내성을 증가시키는 변형을 포함하여 (예컨대 데옥시, 2'-O-Me, 포스포로티오에이트 등) 어떠한 유형의 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체도 사용될 수 있다. 검출 또는 포획을 목적으로, 표지, 예를 들면 방사성 또는 비방사성 표지 또는 앵커(anchor), 예컨대 바이오틴이 도입될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드라는 용어는 또한 펩티드 핵산 (PNA)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 자연 발생 또는 비-자연 발생의 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA 또는 둘 모두, 및/또는 이들의 변형된 형태 및/또는 유사체를 함유할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성요소에 의해 개재될 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결이 대안적인 연결 기에 의해 대체될 수도 있다. 이러한 대안적인 연결 기에는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")에 의해 대체되는 실시양태가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니며, 여기서 각 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 임의적으로 에테르 (--O--) 연결을 함유하는 치환 또는 비치환의 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜이다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 유전자간 DNA, 연결 분석으로부터 한정되는 좌위들 (좌위), 엑손, 인트론, 전령 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은-헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 소형 핵소체 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 어댑터 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드에는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체가 포함될 수 있다. 존재할 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성요소에 의해 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대 표지화 구성요소, 태그, 반응성 잔기 또는 결합 상대물과의 접합에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 제공될 경우, 폴리뉴클레오티드 서열은 달리 언급되지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 열거된다.
본원에서 사용될 때, "폴리펩티드"는 아미노산으로 구성되며 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 단백질로 인식되는 조성물을 지칭한다. 본원에서는, 아미노산 잔기의 통상적인 1-문자 또는 3-문자 코드가 사용된다. "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 임의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하는 데에 호환가능하게 사용된다. 상기 중합체는 선형이거나 분지형일 수 있으며, 그것이 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그것이 비-아미노산에 의해 개재될 수 있다. 상기 용어들은 또한 자연적으로 또는 개재; 예를 들면 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 구성요소와의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 정의 내에 포함되는 것은 예를 들면 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들면 비자연 아미노산 등 포함)를 함유하는 폴리펩티드는 물론, 관련 기술분야에 알려져 있는 기타 변형체이다.
본원에서 사용될 때, "보존제"는 1종 이상 효용의 저하를 포함하여 제품을 손상시키거나 악화시키는 미생물의 성장 또는 바람직하지 않은 화학 반응 (예컨대 산화 또는 악취 생성)의 발생을 (일부 시간 기간 동안) 방지하기 위하여 본원에서 기술되는 바와 같은 제품에 첨가되는 작용제이다.
본원에서 사용될 때, "제품"이라는 용어는 소비자 포장 제품과 같이 특정 효용을 가지는 조제물 또는 조성물을 지칭하고자 하는 것이다. 예로는 개인 관리 제품, 가정용 제품, 화장품, 오버 더 카운터(over the counter) 치료제, 약제 제제, 페인트, 코팅, 접착제, 그리고 소비자 구매용 제제들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 제품에는 일광차단 분자 (발색단), 염료 또는 색소를 결합시키거나 화장품 또는 국소 적용 제품과 같은 일광차단 또는 색상-생성 분자를 사용하여 단백질을 변형시키기 위한 조성물이 포함된다.
"프로모터"는 RNA 폴리머라제에 의한 유전자의 전사를 개시하는 데에 연관되어 있는 조절 서열을 지칭한다. 프로모터는 유도성 프로모터 또는 상시성 5 프로모터일 수 있다. "유도성 프로모터"는 환경 또는 발생상의 조절 조건하에서 활성인 프로모터이다.
"전구-서열"은 효소와 같은 활성 단백질을 생성시키기 위하여 통상적으로 단백질로부터 절단되는, 트랜스글루타미나제와 같이 발현되는 단백질, 예컨대 효소원 또는 전구단백질 내 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 전구-서열은 단백질의 올바른 폴딩에 필수적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전구-서열의 절단은 불활성 효소의 활성 효소로의 전이를 초래한다. 일부 실시양태에서, 전구-서열은 전구단백질 서열 내의 다수의 지점에서 절단될 수 있으며, 그것은 자연상의 성숙한 효소 서열 대비 향상된 효소 활성 또는 안정성으로 이어질 수 있다.
"재조합"이라는 용어는 예컨대 변경된 폴리펩티드를 생성시키도록 코딩 서열을 돌연변이시키는 것, 또 다른 유전자의 것에 코딩 서열을 융합시키는 것, 다른 프로모터의 조절하에 유전자를 위치시키는 것, 이종 생물체에서 유전자를 발현시키는 것, 감소되거나 상승된 수준으로 유전자를 발현시키는 것, 그의 자연상 발현 프로파일과 다른 방식으로 조건부 또는 상시성으로 유전자를 발현시키는 것 등에 의해 그의 서열 또는 발현 특징이 변경되도록 변형된 유전 재료 (즉, 핵산, 그것이 코딩하는 폴리펩티드, 그리고 그와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포)를 지칭한다. 일반적으로, 재조합 핵산, 폴리펩티드, 및 이들을 기반으로 하는 세포는 자연에서 발견되는 관련 핵산, 폴리펩티드 및 세포와 그들이 동일하지 않도록 조작되어 있다. 재조합 세포는 "조작된" 것으로 지칭될 수도 있다.
"가역적으로 가용성인 중합체"는 비제한적으로 pH, 온도 또는 이온 강도와 같은 환경 중 조절가능한 자극에 반응하여 용액 중에서 가용성으로부터 불용성 재료로 상 전이를 할 수 있는 중합체를 지칭한다. 이와 같은 전이 과정은 상들 사이에서 반복가능하게 순환될 수 있다.
"저장 수명"은 일 항목 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 제품)이 사용가능하거나, 소비용으로 적합하거나, 또는 판매가능하게 유지되는 시간의 길이를 지칭한다.
적어도 2종 핵산의 맥락에서 "실질적으로 유사한" 및 "실질적으로 동일한"이라는 구는 통상적으로 폴리뉴클레오티드가 참조 (예컨대 야생형) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와의 비교시 적어도 약 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 심지어는 99.5 %의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 서열 동일성은 표준 파라미터를 사용하는 블라스트(BLAST), 얼라인(ALIGN) 및 클러스탈(CLUSTAL)과 같은 공지의 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다 (예컨대 문헌 [Altshul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; [Henikoff et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:10915]; [Karin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873]; 및 [Higgins et al. (1988) Gene 73:237] 참조). 블라스트 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통하여 공적으로 가용하다. 또한, 파스타(FASTA) (문헌 [Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448.])를 사용하면, 데이터베이스를 탐색할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 동일한 핵산 분자들은 엄격 (예컨대 중간 내지 고 엄격도 범위 내) 조건하에서 서로 혼성화된다. 핵산 "합성"은 본원에서 주형 의존성인 방식으로 새로운 폴리뉴클레오티드 가닥을 제조하거나 기존 폴리뉴클레오티드 (즉 DNA 또는 RNA)를 연장하기 위한 임의의 시험관내 방법을 지칭한다. 본 발명에 따른 합성에는 폴리머라제를 사용하여 폴리뉴클레오티드 주형 서열의 복제물 수를 증가시키는 증폭이 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 합성 (예컨대 증폭)은 폴리뉴클레오티드에 뉴클레오티드를 도입함으로써 (예컨대 프라이머로부터의 연장) 폴리뉴클레오티드 주형에 대하여 상보성인 새로운 폴리뉴클레오티드 분자를 형성시키는 것을 초래한다. 형성되는 폴리뉴클레오티드 분자 및 그의 주형은 추가적인 폴리뉴클레오티드 분자를 합성하기 위한 주형으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "DNA 합성"은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 예컨대 프로브 및 올리고뉴클레오티드 프라이머, 또는 폴리뉴클레오티드 서열분석 용으로의 표지된 뉴클레오티드의 사용을 포함할 수 있다. "전사 조절하에서"는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사가 전사의 개시에 기여하거나 그것을 촉진하는 요소에 그것이 작용가능하게 연결되어 있음에 의존한다는 것을 표시하는, 관련 기술분야에 잘 이해되어 있는 용어이다.
"계면활성제"는 표면 장력을 낮춤으로써 제품의 에멀션화, 발포, 분산, 확산 및 습윤 특성을 증가시키는 표면-활성 작용제이다.
"일광차단제"라는 용어는 자외선 A (UVA) 및/또는 자외선 B (UVB) 방사선으로부터 인간 피부를 보호하고 차단할 수 있는 유기 화합물 또는 유기 화합물 혼합물을 지칭한다. UV-흡수성 일광차단 화합물의 비제한적인 예에는 벤조에이트, 옥시벤존 및 신남산이 포함된다. 예시적인 유기 일광차단제에는 파라-아미노벤조산, 트롤아민 살리실레이트, 시녹세이트, 디옥시벤존, 엔술리졸, 호모살레이트, 메라디메이트, 옥티녹세이트, 옥티살레이트, 옥토크릴렌, 파디메이트 O, 술리소벤존, 옥시벤존 및 아보벤존이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일광차단제는 UVA 및/또는 UVB 방사선을 차단할 목적으로 식품 의약국(Food and Drug Administration) (FDA) 또는 기타 국제 규제체에 의해 승인될 수 있다. 일광차단제는 UVA 및/또는 UVB 보호를 제공하나 아직 UVA 및/또는 UVB 방사선을 차단할 목적으로 FDA 또는 기타 국제 규제체에 의해 승인되지는 않은 분자일 수도 있다. 일광차단제는 FDA 또는 기타 국제 규제체에 의해 승인되어 있는 것들과 유사한 구조를 가지며 역시 UVA 및/또는 UVB 보호를 제공하는 분자 (일광차단제 유사체)일 수도 있다. 일광차단제는 링커 및/또는 기타 소형 분자에 의해 변형될 수 있으며, 링커가 결합된 채 또는 가수분해 후 중 어느 하나로 여전히 UVA 및/또는 UVB 보호를 제공할 수도 있다 (일광차단제-링커 부가물). 본원에서, "일광차단제"는 일광차단 분자, 일광차단제 유사체 및/또는 일광차단제-링커 부가물을 지칭할 수 있다. 본원에서 논의될 때, 일광차단 분자는 일광차단 분자에 직접적인 것, 또는 일광차단 분자에 결합되는 링커 (예컨대 링커의 일부로서)를 통한 간접적인 것 중 어느 하나로 결합되는 아미노 기 (예컨대 알킬아미노, 알킬히드라진, 알킬히드라지드 또는 알콕시아민 잔기)를 포함하도록 변형될 수 있다.
"TAMRA"는 카르복시테트라메틸로다민의 약어이다.
관련 (및 유도체) 단백질은 "변이체" 단백질을 포괄한다. 변이체 단백질은 적은 수의 아미노산 잔기만큼 또 다른 (즉 모체) 단백질 및/또는 서로와 다르다. 그것이 유래하는 모체 단백질과 비교하였을 때, 변이체는 하나 이상의 아미노산 돌연변이 (예컨대 아미노산 결실, 삽입 또는 치환)를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 더하여, 변이체는 예컨대 블라스트, 얼라인 및 클러스탈 (하기 참조)과 같은 서열 정렬 툴(tool)을 사용하여 측정하였을 때 참조 단백질 또는 핵산과 특정한 서열 동일성 정도를 가질 수 있다. 예를 들면, 변이체 단백질 또는 핵산은 참조 서열과 적어도 약 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 심지어는 99.5 %의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.
"효소원" 또는 "전구효소"는 효소의 불활성인 전구체를 지칭하는 것으로서, 촉매 작용에 의해, 예컨대 전구-서열의 단백질분해 절단을 통하여 활성인 효소로 전환될 수 있다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 연계되어 사용되는 과학 및 기술 용어들은 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가지게 된다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하게 되며, 복수 용어는 단수를 포함하게 된다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 통상적인 방법에 따라 수행된다. 일반적으로, 연계되어 사용되는 명명법, 그리고 본원에서 기술되는 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학, 및 단백질 및 핵산 화학, 그리고 혼성화의 기술들은 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며 통상적으로 사용되는 것들이다. 달리 표시되지 않는 한, 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반 및 더 특수한 참고문헌에 기술되어 있는 바와 같은 통상적인 방법에 따라 수행된다.
II. 트랜스글루타미나제 변이체
본원에서는, Ca2 +-비의존성 미생물 트랜스글루타미나제 (Tgase) 스트렙토마이 세스 모바라엔시스의 변이체인 Tgase 효소가 제공된다. 본원에서는, 스트렙토마이세스 모바라엔시스 유래의 야생형 효소 (서열식별번호: 1) 대비 효소 활성에 있어서 적어도 약 1.2-배 (20 %) 또는 2-배 (100 %) 향상을 나타내는 Tgase 변이체가 개시된다.
야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제공되어 있다. 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체는 야생형 Tgase의 폴리펩티드 서열 중 적어도 2개의 아미노산을 돌연변이시키고, 글루타민 아미노산 잔기와 아민 (또는 히드록실아민) 수용체 사이의 트랜스글루타미나제 아미드교환 활성을 관찰하는 것에 의해 수득될 수 있다. 돌연변이 치환을 사용한 단백질의 재조합 발현 방법에 대해서는 이미 기술되어 있으며, 예를 들면 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Press (1989)], [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)] 등으로 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 점 돌연변이의 조합은 오류-빈발(error-prone) PCR, 유전자 뒤섞기(gene shuffling), 분자 육종(molecular breeding) 등을 포함한 수많은 방법들을 사용하여 생성될 수 있다.
서열식별번호: 1에 제시되어 있는 야생형 아미노산 서열에 대비한 Tgase 변이체들의 아미노산 서열이 야생형 효소 (서열식별번호: 1)에 대비한 효소 활성 향상과 함께 표 3에 개시되어 있다.
M2로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase (서열식별번호: 1)의 서열 대비 이중 돌연변이 (S199G 및 S299V)를 가진다. 변이체 M2의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 나타내었다.
M3로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 이중 돌연변이 (H289V 및 S299A)를 가진다. 변이체 M3의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3에 나타내었다.
M4로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (N282M, H289T 및 S299V)를 가진다. 변이체 M4의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4에 나타내었다.
M5로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (N282E, H289V, 및 S299K)를 가진다. 변이체 M5의 아미노산 서열은 서열식별번호: 5에 나타내었다.
M6로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (S284D, H289L, 및 S299K)를 가진다. 변이체 M6의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6에 나타내었다.
M7으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (N282E, H289I, 및 S299K)를 가진다. 변이체 M7의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7에 나타내었다.
M8으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 사중 돌연변이 (N282K, G283A, 및 S299V)를 가진다. 변이체 M8의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8에 나타내었다.
M9으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 사중 돌연변이 (N282Q, S284P, H289E, 및 S299V)를 가진다. 변이체 M9의 아미노산 서열은 서열식별번호: 9에 나타내었다.
M10으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 사중 돌연변이 (N282K, G283A, S284P, 및 S299V)를 가진다. 변이체 M10의 아미노산 서열은 서열식별번호: 10에 나타내었다.
M11으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 5개-돌연변이 (N282R, G283A, S284E, H289Q, 및 S299V)를 가진다. 변이체 M11의 아미노산 서열은 서열식별번호: 11에 나타내었다.
M12로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 이중 돌연변이 (S199A 및 S299A)를 가진다. 변이체 M12의 아미노산 서열은 서열식별번호: 12에 나타내었다.
M13으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔 시스 Tgase의 서열 대비 이중 돌연변이 (S199A 및 S299E)를 가진다. 변이체 M13의 아미노산 서열은 서열식별번호: 13에 나타내었다.
M14으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 이중 돌연변이 (S199A 및 S299K)를 가진다. 변이체 M14의 아미노산 서열은 서열식별번호: 14에 나타내었다.
M15으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 이중 돌연변이 (S199A 및 S299V)를 가진다. 변이체 M15의 아미노산 서열은 서열식별번호: 15에 나타내었다.
M16으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 이중 돌연변이 (S199G 및 S299A)를 가진다. 변이체 M16의 아미노산 서열은 서열식별번호: 16에 나타내었다.
M17으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 이중 돌연변이 (S199G 및 S299K)를 가진다. 변이체 M17의 아미노산 서열은 서열식별번호: 17에 나타내었다.
M18으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (S2P, S199A, 및 S299A)를 가진다. 변이체 M18의 아미노산 서열은 서열식별번호: 18에 나타내었다.
M19으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (S2P, S199A, 및 S299E)를 가진다. 변이체 M19의 아미노산 서열은 서열식별번호: 19에 나타내었다.
M20로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (S2P, S199A, 및 S299K)를 가진다. 변이체 M20의 아미노산 서열은 서열식별번호: 20에 나타내었다.
M21으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (S2P, S199A, 및 S299V)를 가진다. 변이체 M21의 아미노산 서열은 서열식별번호: 21에 나타내었다.
M22로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (S2P, S199G, 및 S299A)를 가진다. 변이체 M22의 아미노산 서열은 서열식별번호: 22에 나타내었다.
M23로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (S2P, S199G, 및 S299E)를 가진다. 변이체 M23의 아미노산 서열은 서열식별번호: 23에 나타내었다.
M24로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (S2P, S199G, 및 S299K)를 가진다. 변이체 M24의 아미노산 서열은 서열식별번호: 24에 나타내었다.
M25로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 삼중 돌연변이 (S2P, S199G, 및 S299V)를 가진다. 변이체 M25의 아미노산 서열은 서열식별번호: 25에 나타내었다.
M26로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 사중 돌연변이 (N282D, G283A, S284A, 및 S299V)를 가진다. 변이체 M26의 아미노산 서열은 서열식별번호: 26에 나타내었다.
M27으로 지정된 본 발명의 한 가지 Tgase 변이체는 야생형 에스 . 모바라엔시스 Tgase의 서열 대비 이중 돌연변이 (S199G 및 S299E)를 가진다. 변이체 M27의 아미노산 서열은 서열식별번호: 27에 나타내었다.
변이체 M2-M27은 그에 대한 보존성 치환을 가질 수 있는 바, 그의 하기 각 고유 치환이 각각 보존된다는 것을 전제로 한다: (i) S199G/S299V, (ii) H289V/S299A, (iii) N292M/H289T/S299V, (iv) N282E/H289V/S299K, (v) S284D/H289L/S299K, (vi) N282E/H289I/S299K, (vii) N282K/G283A/S299V, (viii) N282Q/S284P/H289E/S299V, (ix) N282K/G283A/S284P/S299V, (x) N282R/G283A/S284E/H289Q/S299V, (xi) S199A/S299A, (xii) S199A/S299E, (xiii) S199A/S299K, (xiv) S199A/S299V, (xv) S199G/S299A, (xvi) S199G/S299K, (xvii) S2P/S199A/S299A, (xviii) S2P/S199A/S299E, (xix) S2P/S199A/S299K, (xx) S2P/S199A/S299V, (xxi) S2P/S199G/S299A, (xxii) S2P/S199G/S299E, (xxiii) S2P/S199G/S299K, (xxiv) S2P/S199G/S299V, (xxv) N292D/G283A/S284A/S299V, 또는 (xxvi) S199G/S299E. 변이체 M2-M27의 그와 같은 보존성으로 변형된 버전들은 본 발명의 영역에 포함된다. 복수의 보존성인 치환/변형들이 존재할 수 있다. 변이체 M2-M27의 보존성으로 변형된 버전들은 그의 각 비변형 서열과 적어도 약 90 %, 95 % 또는 98 % 동일할 수 있으며, 야생형 트랜스글루타미나제 (서열식별번호: 1)에 비해 적어도 약 2-배 더 큰 트랜스글루타미나제 효소 활성을 가질 수 있다.
본원에서 개시되는 Tgase 변이체 (예컨대 M2-M27)는 추가로 서열식별번호: 29의 아미노산 잔기 334-339로 예시되는 바와 같이 그의 C-말단에 폴리히스티딘 펩티드 연장체를 포함할 수 있다. 상기 폴리히스티딘 펩티드는 정제 목적으로 유용한 태그로서, 효소 활성에는 영향을 주지 않는다. 통상적으로, 폴리히스티딘 펩티드는 6-8개 잔기 길이이다.
본원에서 개시되는 Tgase 변이체 (예컨대 M2-M27)는 추가로 그의 N-말단에 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 성숙한 야생형 스트렙토마이세스 모바라엔시스 Tgase 효소에는 효소를 코딩하는 유전자 서열에 의해 코딩되는 N-말단 메티오닌 잔기가 결핍되어 있다. 일부 실시양태에서, Tgase 변이체는 N-말단 메티오닌 잔기가 없는 성숙한 스트렙토마이세스 모바라엔시스 Tgase의 변이체로서 발현된다. 다른 실시양태에서, Tgase는 Tgase가 발현되는 발현 벡터에 의해 제공될 수 있는, 추가적인 N-말단 메티오닌 잔기가 있는 성숙한 Tgase로서 발현된다.
본원의 Tgase 변이체는 추가로 전구-서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체는 변이체 폴리펩티드 서열 (예컨대 표 3에 기술되어 있는 아미노산 서열의 연장체로서의 추가적인 아미노산 서열)의 일부 또는 별도의 폴리펩티드 중 어느 하나로서 전구-서열과 함께 발현된다. 일부 실시양태에서, 성숙한 변이체 폴리펩티드는 폴리펩티드 Tgase 전구-서열의 존재하에 발현된다. 일 실시양태에서는, 전구-서열을 코딩하는 DNA 서열과 성숙한 Tgase 변이체를 코딩하는 DNA 서열이 동일한 DNA 주형으로부터 별개의 폴리펩티드 서열로 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 성숙한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 제1 DNA 주형으로부터 발현되며, 전구-서열을 코딩하는 DNA 서열은 별도의 제2 DNA 주형으로부터 발현된다. 또 다른 실시양태에서는, 전구-서열이 화학적으로 합성된 후, 성숙한 폴리펩티드의 발현 전, 동안 또는 후에 발현 시스템에 첨가된다. 일 예에서, Tgase 변이체는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 제US20/49226호에 개시되어 있는 바와 같은 무세포 발현 시스템 중에서 발현될 수 있다.
일부 실시양태에서, Tgase 변이체는 동종 전구-서열, 즉 Tgase 효소의 자연상 전구-서열, 즉 동일한 생물체 유래 야생형 Tgase 효소의 전구-서열과 함께 발현, 예컨대 재조합으로 발현된다. 다른 실시양태에서, Tgase 변이체는 이종 전구-서열, 즉 동일 효소이나 상이한 생물체로부터 유래하는 전구-서열 또는 동일하거나 상이한 생물체로부터 유래하는 다른 효소의 전구-서열과 함께 발현, 예컨대 재조합으로 발현된다.
일부 실시양태에서, Tgase 변이체는 본원에서 기술되는 Tgase 변이체 (예컨대 표 3에 기술되어 있는 변이체)의 원형 퍼뮤턴트일 수 있다. 일부 실시양태에서, Tgase 변이체는 임의적으로 N-말단 메티오닌 잔기를 추가로 포함하는, 표 3에 기술되어 있는 바와 같은 Tgase 변이체의 원형 퍼뮤턴트일 수 있다. 원형 퍼뮤턴트는 모체 효소, 즉 야생형 효소 또는 개시되는 변이체, 예컨대 표 3에 나타낸 바와 같은 것 대비 신규한 기질 특이성, 제품 프로파일 및 반응 동역학을 제공할 수 있다. 원형 퍼뮤턴트는 모체 효소의 동일한 기본적 폴딩을 보유하나, 상이한 위치에 N-말단을 가지며, 원래의 N- 및 C-말단은 임의적으로 연결 서열에 의해 연결되어 있다. Tgase 야생형 또는 변이체 원형 퍼뮤턴트에서, 야생형 또는 변이체 효소의 N-말단 잔기는 자연상 N-말단이 아닌 다른 단백질 부위에 위치한다.
III. 항미생물 조성물
개시되는 것은 본원에서 기술되는 바와 같은 1종 이상의 Tgase 변이체 효소, 예컨대 임의적으로 그의 원형 퍼뮤턴트를 포함하여 N-말단 메티오닌 잔기를 가지며 임의적으로 본원에서 기술되는 바와 같은 전구-서열을 가지는 표 3에 개시되어 있는 변이체들 중 어느 것을 포함하는 조성물, 예컨대 살생물, 보존제, 항미생물, 항-세균 및 항바이러스 (살바이러스) 조성물이다. 이와 같은 조성물은 예를 들면 미생물 억제를 위하여 보존될 제품에, 또는 그와 함께 (예컨대 그 내부에 또는 그와 연관되어) 포함될 수 있다. 상기 Tgase 변이체 효소는 단백질상 아미노산 잔기의 반응을 촉매함으로써, 예를 들면 단백질 가교-결합을 수행하거나 단백질에 관심 분자를 결합시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 보존될 제품 중에서 미생물 (예컨대 세균) 성장을 억제하는 데에, 예를 들면 미생물 성장을 80 % 내지 100 %, 또는 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 % 중 어느 것으로 억제하는 데에 효과적인 양으로 예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 1종 이상의 Tgase 변이체를 포함하거나 그것으로 이루어지는 1종 이상의 Tgase 변이체 효소를 포함한다.
보존제는 미생물 오염물의 성장을 억제하고 그의 양을 감소시키는 것에 의해 제품의 미생물학적 안전성을 유지하기 위하여 제품 제제에 첨가되는 항미생물 성분이다. US 약전은 화장품 및 개인 관리 제품 중 보존제에 대하여 허용가능한 미생물 생존율에 대한 프로토콜을 공표하고 있다. 관심 시험에는 USP 51 (항미생물 효과성 시험) 및 USP 61 (미생물 한계 시험)이 포함된다 (https://www.fda.gov/files/about%20fda/published/Pharmaceutical-Microbiology-Manual.pdf).
본원에서 개시되는 보존제 시스템의 효과성은 비제한적으로 그램 양성 세균, 그램 음성 세균, 효모 및/또는 곰팡이 (예컨대 이. 콜리 (E. coli ) DH10ß, 이. 콜리 ATCC 8739, 비. 서브틸리스 (B. subtilis ) BGSC 1A976, 씨. 알비칸스 (C. albicans ) ATCC 10231 및/또는 에이. 브라실리엔시스 (A. brasiliensis ) ATCC 16404를 포함한 다양한 미생물들에 대한 MIC (최소 억제 농도)를 기준으로 측정된다. 최소 억제 농도 (MIC)는 미생물의 성장을 억제하게 되는 항미생물제의 최저 농도로 정의된다. 미생물 성장은 예를 들면 분광광도측정법 (600 nm에서의 광학 밀도)에 의해, 또는 세포 생존율 검정 (박타이터 글로(BacTiter Glo), 프로메가(Promega) 사)을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 추가적인 살생물 효소, 예컨대 가교-결합 효소, 옥시다제, 뉴클레아제, 히드롤라제, 프로테아제 및/또는 용해 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 추가로 1종 이상의 살생물 화학물질, 예컨대 비제한적으로 키토산, 폴리리신 및/또는 사차 암모늄 화합물을 포함한다. 살생물 효소, 조성물 및 제제, 그리고 그의 사용 방법의 예시적이나 비제한적인 예들이 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT/US20/21211호에 개시되어 있다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니나, 살생물 효소의 사용은 추가적인 항미생물 작용 메커니즘을 제공하는 것에 의해 살생물 화학물질의 항미생물 특성을 강화한다. 예를 들면, 키토산은 세포 멤브레인을 붕괴시켜, 세포 내용물의 유출로 이어진다. 가교-결합성인 Tgase 효소는 세포의 표면 및 세포 내 둘 모두에서 세포 기능에 필수적인 단백질들을 가교-결합시킬 수 있다. 두 재료의 이와 같은 상호 조합은 요구되는 재료의 양을 감소시키며, 효소에 추가적인 안정성을 제공함으로써 시간이 지나면서 더 큰 활성을 가능하게 하고 (더 적은 키토산 및 더 적은 효소), 살생물제 키토산의 사용에 동반할 수 있는 바람직하지 않은 효과를 감소시킨다.
A. 살생물 단백질 및 펩티드
일부 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 항미생물 펩티드를 포함한다. 항미생물 펩티드의 예에는 니신 및 페디오신이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 항미생물 단백질을 포함한다. 항미생물 단백질의 예에는 카세인이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소와의 조합으로 포함될 수 있는 알려져 있는 살생물 효소 및 항미생물 펩티드의 비제한적인 예들을 표 1에 나타내었다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소는 표 1에 기술되어 있는 항미생물 효소, 펩티드 또는 단백질 중 1종 이상과의 조합으로 살생물, 보존제, 항-세균 또는 항-바이러스 (살바이러스) 조성물에서 이용될 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
B. 살생물 화학물질
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체는 예를 들면 살생물, 보존제, 항-세균 또는 항-바이러스 (살바이러스) 조성물로서 사용하기 위하여, 비제한적으로 키토산, 폴리리신 또는 사차 암모늄 화합물을 포함한 1종 이상의 살생물 화학물질과 함께 제제화될 수 있다. 살생물 화학물질의 비제한적인 예를 표 2에 나타내었다.
Figure pct00003
Figure pct00004
1. 사차 암모늄 화합물
키토산 및 그의 더 아세틸화된 형태인 키틴과 같은 생체중합체를 함유하는 사차 암모늄 화합물은 그의 항미생물 활성에 대하여 잘 알려져 있다 (문헌 [Kong, et al. (2010) Int . J. of Food Microbiol . 144: 51-63]). 세균, 효모 및 진균과 같은 여러 미생물 군에 대한 키틴, 키토산 및 이들의 유도체의 항미생물 활성이 알려져 있다.
사차 암모늄 화합물 (비-제한적인 예로는 세틸 피리디늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 폴리아미노프로필 비구아니드가 포함됨)은 다른 화장품 성분과의 특정한 부적합성으로 인하여 개인 관리 산업에 대해서는 제한된 용도를 가진다.
론자(Lonza) 사의 지오가드(Geogard) 시리즈 보존제 블렌드들은 그의 새로운 제품 (지오가드 233S, 지오가드 233S, 지오가드 233S, 지오가드 361)에서의 파라벤의 사용을 기피하지만, 이들 항미생물 조성물은 국소용 개인 관리 제제의 중요한 부분을 형성하는 많은 음이온 성분들에 의해 비활성화되는 양이온성 벤즈에토늄 클로라이드를 기재로 한다.
2. 알데히드 & 알데히드-방출 화합물
포름알데히드는 범주 3 CMR (발암원성, 돌연변이원성 및 생식성 독성)으로 분류된다. 그러나, 포름알데히드를 천천히 방출하는 몇 가지 항미생물제가 여전히 사용되고 있으며 시중에서 제조되고 있는 것으로 알려져 있는 것은 흥미롭다. 효과적이며 충분히-허용성인 항미생물제의 부족으로 인하여, 업계는 DMDM 히단토인 (CAS 6440-58-0), 이미다졸리디닐 우레아 및 디아졸리디닐 우레아 (CAS 39236-46-9)와 같은 포름알데히드 공여체를 계속 사용할 것을 압박받고 있다. 이들 물질에 의해 방출되는 포름알데히드는 그의 매우 반응성인 알데히드 카르보닐 관능기를 통하여 몇 가지 화장품 성분과 반응할 수 있다. 예를 들면, 유일하게 가용하며 전세계적으로 승인되어 있는 UV-A 흡수제인 아보벤존(Avobenzone)은 포름알데히드 유도체에 의해 방출되는 포름알데히드와 반응한다. 이는 일광차단 제제에서는 상당한 단점이다. 보존제 블렌드인 클라리안트(Clariant) 사의 니아파가드(Niapaguard) PDU 및 코그니스(Cognis) 사의 엘레스탑(Elestab) 305, ISP 사의 게르마벤(Germaben) II, 게르마벤 H-E는 파라벤의 디아졸리디닐 우레아와의 조합을 활용한다. ISP 사의 게르말 플러스(Germall Plus) 및 론자 사의 글리단트 플러스(Glydant Plus)는 아이오도프로피닐 부틸 카르바메이트 (IPBC)와 함께 디아졸리디닐 우레아를 이용한다. 맥킨타이어(McIntyre) 사의 파라곤(Paragon) 시리즈는 DMDM 히단토인, 그리고 파라벤, 페녹시 에탄올 및 IPBC와 같은 다른 항미생물제를 포함한다. 심라이즈(Symrise) 사의 네오-드라고시드(Neo-Dragocide) 및 토르(Thor) 사의 마이크로케어(Microcare) IMP는 파라벤과 이미다졸리디닐 우레아 사이의 상승작용을 활용한다.
3. 파라벤
파라벤은 p-히드록시 벤조산의 에스테르이다. 파라벤 화합물에는 구체적으로 메틸-파라벤 (CAS 99-76-3), 에틸-파라벤 (CAS 120-47-8), 프로필-파라벤 (CAS 94-13-3), 부틸-파라벤 (CAS 94-26-8), 이소프로필-파라벤 (CAS 4191-73-5), 및 벤질-파라벤 (CAS 94-18-8)이 포함된다. 클라리안트 사의 '페노닙(Phenonip)'은 그 중 5종이 파라벤인 6종 항미생물제의 블렌드이다. 동사는 '니파스타트(Nipastat) 및 '니파셉트(Nipasept)'로서 파라벤만의 블렌드를 제공하고 있다. 코그니스 사의 엘레스탑 FL 15, 엘레스탑 48, 엘레스탑 50J, 엘레스탑 305, 엘레스탑 388, 엘레스탑 3344, 엘레스탑 4112, 엘레스탑 4121, 엘레스탑 4150 리포(Lipo)는 모두 항미생물제의 그 내부의 적어도 1종 파라벤과의 블렌드이다. 인두켐(Induchem) 사의 유니펜(Uniphen) P23, ISP사의 게르마벤 및 리쿠아파르(LiquaPar) 시리즈 블렌드는 수종의 파라벤을 함유한다. 갤럭시 서팩탄츠(Galaxy Surfactants) 사는 페녹시 에탄올과의 각각 4 및 5종 파라벤 블렌드를 기재로 하는 갈가드(Galguard) NK1 및 갈가드 NK2 블렌드를 제공한다. 그의 '파라곤' 시리즈에 속하는 맥킨타이어/로디아(Rhodia) 사의 5종 블렌드는 수종의 파라벤을 포함한다. 롬 앤 하스(Rohm and Haas) 사의 네올론(Neolone) MXP는 메틸 이소티아졸리논과 함께 파라벤을 포함한다. 심라이즈 사의 네오-드라고시드 시리즈 블렌드는 파라벤을 포함한다. 슐케 앤 마이어(Schulke and Mayr) 사의 육실(Euxyl) K 300은 5종의 파라벤을 포함한다. 토르 사의 마이크로케어 PM4 및 마이크로케어 PM5는 각각 4종 및 5종의 파라벤을 포함한다. 파라벤은 페놀 유도체로서; 모든 페놀계 항미생물제는 10의 pKa를 가지는 매우 산성인 수소를 보유하는 매우 반응성인 유기 관능기인 페놀계 '히드록실' 기를 가진다.
4. 할로겐화 화합물
날코(Nalco) 사의 메르가드(Merguard) 시리즈 (4종 블렌드)는 할로겐화 분자인 메틸 디르브로모 글루타로니트릴 및 2-브로모-2-니트로-1,3-디올에 의존한다. 슐케 앤 마이어 사 육실 시리즈의 수종 블렌드는 클로로티아졸리논, 메틸 디브로모 글루타로니트릴, 2-브로모-2-니트로-1,3-디올 및 디아졸리디닐 우레아를 기재로 한다. 토르 사의 마이크로케어 시리즈는 파라벤, 2-브로모-2-니트로-1,3-디올, 아이오도프로피닐 부틸카르바메이트 (IPBC), 이미다졸리디닐 우레아 및 디아졸리디닐 우레아를 사용한다.
할로겐화 항미생물제의 다른 예는 클로르페네신 및 클로르헥시딘이다. 페놀계 화합물과 마찬가지로, 할로겐화 유기 분자가 상당 수준의 독성 효과를 나타낸다는 것은 상식이다. 예를 들면, IPBC는 그의 아이오딘 함량으로 인하여 갑상선 호르몬 교란의 위험성이 있다. 그것은 일본에서는 허용되어 있지 않으며, EU에서는 잔류(leave-on) 제품에 0.02 %까지만 허용되어 있다. 마찬가지로, EU는 유일하게 세정-제거 제품에서 0.1 %까지만 메틸 디르브로모 글루타로니트릴의 사용을 허용한다. 브로노폴인 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올은 일부 질소 함유 화장품 성분과의 상호작용에서의 발암원성인 니트로소아민의 생성에 연관되어 있다. 메틸 클로로 이소티아졸리논의 항미생물 효능은 너무 강력해서 세정-제거 제품에서만 15 ppm 농도로 그것이 허용되어 있다. 클로로메틸 이소티아졸리논은 매우 넓은 항-미생물 활성 범위를 가지고 있으나, 그와 같이 강력한 항-미생물 독성이 극히 높아서, 화장품 제조자들이 오랜 시간 동안 인간 피부상에 잔류하는 화장품에 이러한 종류의 강력한 항미생물제를 사용하는 것을 선호하지 않는다. 저농도 (ppm 수준)인 임의의 강한 살세균제는 인간 세포를 포함한 살아있는 생물체의 임의의 다른 세포에도 동일하게 치명적일 가능성이 있을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 이것이 일본에서 제품이 점막 멤브레인과 접촉될 예정인 경우 클로로메틸 이소티아졸리논이 보존용으로 허용되지 않는 정확한 이유이다.
할로겐화 화합물에는 2,4-디클로로벤질-알콜, 클로로크실렌올 (4-클로로-3,5-디메틸-페놀로도 알려져 있음), 브로노폴 (2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올로도 알려져 있음), 아이오도프로피닐 부틸 카르바메이트가 포함된다.
C. 벡터 전달
본원에서 기술되는 조성물은 본원에서 기술되는 바와 같은 1종 이상 살생물 효소(들) (예컨대 Tgase 변이체(들))를 코딩하는 유전 재료의 전달을 위하여 벡터 (예컨대 박테리오파지)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "박테리오파지" 및 "파지"는 게놈에서 적어도 약 90 %, 95 %, 99 %, 99.9 % 또는 그 이상 중 어느 것의 서열 동일성을 공유하는 것과 같이 단리물의 구성원들이 실질적으로 동일한 유전자 구성을 가지는 박테리오파지 단리물을 지칭하는 데에 호환가능하게 사용된다. "박테리오파지" 또는 "파지"는 모체 박테리오파지는 물론, 그의 자손 또는 유도체 (예컨대 유전자 조작된 버전)도 지칭한다. 박테리오파지는 자연 발생 파지 단리물, 또는 벡터를 포함한 조작된 파지, 또는 적어도 모든 필수 유전자들을 코딩하는 핵산, 또는 숙주 세균 내부에서의 파지의 생활 주기를 수행하기 위한 파지의 전체 게놈일 수 있다.
IV. 단백질에 기능성 분자를 가교-결합시키기 위한 조성물
개시되는 것은 UV-차단 일광차단제 및/또는 착색제 예컨대 색소 또는 염료를 포함한 기능성 성분들의 장기-지속 적용에 사용되도록 제품에 포함될 수 있는 효소 조성물이다. 개시되는 조성물은 피부 단백질 또는 기타 단백질-, 펩티드- 또는 아미노산-함유 재료상의 아미노산 잔기를 일광차단제, 또는 색상 생성 분자, 예컨대 색소 또는 염료와 같은 관심 분자와 반응시킬 목적으로 1종 이상의 가교-결합 효소, 예컨대 Tgase 효소 (예컨대 본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 서열식별번호: 1-29에 개시되어 있는 Tgase 효소들 중 어느 것 및/또는 리실 옥시다제 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Tgase 및/또는 리실 옥시다제 효소(들)는 활성 또는 기능성인 성분 (예컨대 일광차단 분자 또는 착색제)을 포유동물 (예컨대 인간) 피부, 모발 또는 손발톱의 단백질 또는 펩티드와 같은 단백질 또는 펩티드에 가교결합시키는 촉매로 작용한다. 일부 실시양태에서, 상기 트랜스글루타미나제 효소 (예컨대 Tgase 변이체 효소) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들)는 활성 또는 기능성인 성분 또는 링커의 아미노 기 (예컨대 알킬아미노, 알킬히드라진, 알킬히드라지드 또는 알콕시아민 잔기)를 피부, 모발 또는 손발톱 단백질 또는 펩티드 중 아미노산 (예컨대 글루타민 또는 리신 잔기의 측쇄)과 가교결합시키는 촉매로 작용한다.
피부, 모발 또는 손발톱 단백질의 예에는 콜라겐, 케라틴, 엘라스틴, 그리고/또는 인볼루크린, 로리크린, 소형 프롤린-풍부 단백질, 페리플라킨, 엔보플라킨 및 필락그린을 포함한 각화 세포 외피 단백질이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 펩티드의 예에는 가수분해된 콜라겐, 가수분해된 케라틴 및/또는 가수분해된 엘라스틴이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 조성물은 일광차단제와 같은 UV-차단 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 염료 또는 색소 분자와 같은 착색제 (색상 생성 분자)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 효소는 중합체성 지지체상에 고정되거나 거기에 봉입된다. 일부 실시양태에서, 효소는 트랜스글루타미나제 효소이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 조성물은 예를 들면 조성물이 대상체의 피부, 모발 또는 손발톱에 적용되었을 때 활성 또는 기능성인 성분 및 가교-결합 효소, 또는 단백질 또는 펩티드와 가교-결합된 활성 또는 기능성인 성분의 분배를 촉진하거나 용이하게 하기 위하여, 예를 들면 조성물 중 활성 또는 기능성인 성분 및 Tgase 및/또는 리실 옥시다제 효소(들), 또는 단백질 또는 펩티드와 가교-결합된 활성 또는 기능성인 성분의 희석제 또는 분산제로 작용하는 제약상 또는 화장용으로 허용되는 비히클 또는 캐리어를 포함한다. 상기 제약상 또는 화장용으로 허용되는 비히클 또는 캐리어는 물을 포함하거나 그것으로 구성될 수 있으며, 액체 또는 고체 완화제, 용매, 보습제, 증점제 및/또는 분말을 포함할 수 있고, 일부 실시양태에서는 조성물 중 약 10 중량% 내지 약 99.9 중량%, 또는 약 50 중량% 내지 약 99 중량%를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 에멀션의 형태로 존재하며, 조성물 중 약 90 부피% 이하, 또는 약 10 부피% 내지 약 80 부피%의 양으로 오일 또는 오일계 재료를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 에멀션화제 및/또는 1종 이상의 계면활성제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 활성 또는 기능성인 성분은 활성 또는 기능성인 성분상에 직접적인 것 또는 거기에 결합되는 (예컨대 공유 결합되는) 링커상에 간접적인 것 중 어느 하나로 적어도 1종의 알킬-아미노 (-RNH2), 히드라진, 히드라지드 또는 히드록실아민 잔기를 포함한다. 예를 들면, 상기 알킬 (R) 기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 탄화수소 사슬일 수 있다.
특정 실시양태에서는, 포유동물 (예컨대 인간) 피부, 모발 또는 손발톱에의 적용을 위한 조성물이 제공되며, 하기를 포함한다: (a) 유효량의 적어도 1종의 활성 또는 기능성인 성분 (예를 들자면 일광차단 분자 또는 착색제); 및 (b) 포유동물 (예컨대 인간) 피부, 모발 또는 손발톱 중 단백질 또는 펩티드에의 활성 또는 기능성인 성분의 가교결합을 촉매하는 데에 효과적인 양의 1종 이상 트랜스글루타미나제 효소 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 또는 서열식별번호: 1-29에 개시되어 있는 Tgase 효소들 중 어느 것, 및/또는 리실 옥시다제 효소). 일부 실시양태에서, 조성물은 포유동물 (예컨대 인간) 개체의 피부, 모발 또는 손발톱에 대한 국소 적용용으로 제제화되며, 특정 실시양태에서 하기를 함유할 수 있다: (c) 개체의 피부, 모발 또는 손발톱에 Tgase 및/또는 리실 옥시다제 효소(들), 및 활성 또는 기능성인 성분을 전달하는 데에 효과적인 양의 제약용이거나 허용가능한 캐리어. 예를 들면, 상기 활성 또는 기능성인 성분은 활성 또는 기능성 성분상에 직접적인 것 또는 거기에 결합되는 (예컨대 공유 결합되는) 링커상에 간접적인 것 중 어느 하나로 적어도 1종의 알킬아미노 (-RNH2), 히드라진, 히드라지드 또는 히드록실아민 잔기를 포함할 수 있다.
A. 색상 분자
본원에서 기술되는 조성물은 표면에 적용하여 결합시키기 위한, 예컨대 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴과 같은 피부 표면상 1종 이상의 단백질에 결합시키거나 소시지 외피와 같은 식품 제품의 식용가능한 외피에 결합시키기 위한 1종 이상의 색상 생성 분자, 예컨대 염료 또는 색소 분자를 함유할 수 있다. 색상 생성 분자의 비제한적인 예는 문헌 ["Summary of Color Additives for Use in the United States in Foods, Drugs, Cosmetics, and Medical Devices," US Food and Drug Administration, https://www.fda.gov/industry/color-additive-inventories/summary-color-additives-use-united-states-foods-drugs-cosmetics-and-medical-devices]에 기술되어 있다.
B. 일광차단 분자 및 링커
본원에서 기술되는 조성물은 제품 제제 내 또는 피부 표면상 단백질 또는 펩티드, 예컨대 콜라겐, 케라틴, 엘라스틴, 가수분해된 콜라겐, 가수분해된 케라틴 및/또는 가수분해된 엘라스틴에 적용하여 결합시키기 위한 1종 이상의 UV-차단 분자(들), 예컨대 일광차단 분자를 함유할 수 있다.
일광차단제 및/또는 일광차단제 유사체 분자의 비제한적인 예에는 파라-아미노벤조산, 트롤아민 살리실레이트, 시녹세이트, 디옥시벤존, 엔술리졸, 호모살레이트, 메라디메이트, 옥티녹세이트, 옥티살레이트, 옥토크릴렌, 파디메이트 O, 술리소벤존, 옥시벤존, 아보벤존 및 벤조페논 히드라존이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 일광차단제는 단백질 또는 펩티드에의 효소 결합을 위한 기질 취급성을 제공하도록 링커 분자를 사용하여 관능화된다. 이와 같은 관능화의 비-제한적인 예는 일광차단 분자와 링커 사이의 쉬프 염기 (Schiff base) 형성을 통하여 이루어질 수 있다. 이와 같은 관능화의 비-제한적인 예는 일광차단 분자와 링커 사이의 카르바메이트 연결 형성을 통하여 이루어질 수도 있다. 상기 링커는 일차 아민, 히드라진, 히드라지드 또는 알콕시아민 잔기의 형태로 효소 인식에 가용한 아민을 포함할 수 있다. 링커는 효소 인식을 위한 글루타민 잔기를 포함할 수도 있다. 링커는 일광차단제-링커 분자의 제자리 형성을 위한 가변 길이의 지방족 탄소 사슬에 의해 연결된 2개의 관능성 화학 말단 기로 구성될 수 있다. 링커의 비제한적인 예로는 카다베린, 푸트레씬, 히드라진, 아디프산 디히드라지드, 세바스산 디히드라지드 및 헥사메틸렌디아민이 포함된다.
일부 실시양태에서, 일광차단제-링커 부가물은 관심 단백질 또는 펩티드에 결합되며, 이어서 가수분해에 의해 일광차단제가 방출될 수 있다. 일 실시양태에서, 일광차단 분자는 링커로부터 가수분해가능하거나 달리 방출가능하다. 일부 실시양태에서, 일광차단제-링커 부가물은 단백질 또는 펩티드, 예컨대 피부상에 존재하는 단백질 또는 펩티드에 결합되어 유지되면서 UV-차단 보호를 제공한다.
C. 단백질 및 펩티드
본원에서 기술되는 조성물은 일광차단, 피부 관리 및/또는 화장품 제품 또는 사용 적용분야를 위하여 1종 이상의 관심 단백질 또는 펩티드를 함유할 수 있다. 피부 관리 제품 및 화장품용인 관심 단백질 및 펩티드의 비제한적인 예는 하기이다: 콜라겐, 가수분해된 콜라겐, 케라틴, 가수분해된 케라틴, 엘라스틴, 가수분해된 엘라스틴, 실크, 가수분해된 실크, 실크 피브로인 펩티드, 아세틸 헥사펩티드-3, 아세틸 헥사펩티드-8, 아세틸 테트라펩티드-5, 아세틸 테트라펩티드-9, 아세틸아르기닐트립토필 디페닐글리신, 구리 트리펩티드-1, CT-2, 디펩티드-2, 헵타펩티드-7, 헥사노일 디펩티드-3 노르류신 아세테이트, 헥사펩티드-9, 헥사펩티드-11, 망가니즈 트리펩티드-1, 미리스토일 헥사펩티드-16, 미리스토일 헥사펩티드-16, 미리스토일 펜타펩티드-17, 노나펩티드-1, 팔미토일 디펩티드-5 디아미노부티로일 히드록시트레오닌, 팔미토일 디펩티드-5 디아미노히드록시부티레이트, 팔미토일 헥사펩티드-12, 팔미토일 헥사펩티드-14, 팔미토일 헥사펩티드-6, 팔미토일 펜타펩티드-4, 팔미토일 테트라펩티드-7, 팔미토일 트리펩티드-1, 팔미토일 트리펩티드-3, 팔미토일 트리펩티드-38, 펜타펩티드-3, 펜타펩티드-18, sh-올리고펩티드-1, sh-올리고펩티드-2, sh-폴리펩티드-1, sh-폴리펩티드-11, sh-폴리펩티드-9, 대두 펩티드, 테트라펩티드 PKEK, 테트라펩티드-21, 트리펩티드-1, 트리펩티드-10 시트룰린, 및 헤모글로빈, 쌀, 콩, 밀 단백질, 옥수수, 피브로넥틴, 레티큘린, 혈청 단백질, 밀 글루텐의 변형된 가수분해물.
본원에서 기술되는 조성물은 1종 이상의 관심 모델 펩티드를 함유할 수 있다. 관심 모델 펩티드의 한 가지 비-제한적인 예로는 Cbz-Gln-Gly가 포함된다.
V. 중합체성 지지체
특정 실시양태에서, 본원에서 기술되는 조성물은 중합체성 지지체를 포함한다. 본원에서 기술되는 바와 같은 1종 이상의 Tgase 효소 (예컨대 Tgase 변이체 효소) 및/또는 리실 옥시다제 효소는 링커가 있거나 없이 지지체상에 고정되거나, 또는 비제한적으로 키토산, 카르복시메틸키토산 또는 폴리리신을 포함한 가역적으로 가용성인 중합체와 같은 중합체성 지지체 내에 봉입된다. 중합체성 지지체의 비제한적인 예에는 하기가 포함된다: 키틴, 키토산, 카르복시메틸키토산, 산화된 셀룰로스, 사차 암모늄 셀룰로스, 알기네이트, 펙틴 및 카르복시셀룰로스. 중합체성 지지체의 예 및 그에 대한 가교-결합 효소의 고정 또는 봉입에 대해서는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT/US20/21211호에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, Tgase (예컨대 본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들)는 입자, 예를 들면 키토산 입자, 예컨대 비드, 예컨대 키토산 비드 (예컨대 미세비드) 또는 나노입자상에 고정된다. 예를 들면, 상기 비드 (예컨대 미세비드)는 생분해성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소는 예를 들면 링커를 이용하여 유리 단량체 (예컨대 키토산 또는 카르복시메틸키토산 단량체)를 사용한 봉입에 의해 고정될 수 있다.
키토산은 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민 단위의 선형 아미노폴리사카라이드이며, 새우 및 게와 같은 갑각류의 외골격은 물론 일부 진균의 세포 벽으로부터 추출되는 키틴의 알칼리 탈아세틸화에 의해 수득된다. 키틴은 (1→4)-연결된 2-아세트아미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노스 (GlcNAc; A-단위)의 선형 중합체로서, 수성 용매 중에서 불용성이다. 그것은 또한 단량체의 입체형태 및 디이쿼토리알(diequatorial) 글리코시드 연결과 같은 셀룰로스와의 많은 구조적 유사성을 가지고 있다. 키토산은 (1→4)-연결된 A-단위와 2-아미노-2-데옥시-β-D-글루코피라노스 (GlcN; D-단위)의 선형 이원 공중합체 계열로 간주될 수 있다. 카르복시메틸키토산 (예컨대 진균 기원의 것), 예컨대 N,O-카르복시메틸키토산은 카르복실 기에 의해 >80 % 치환된다.
키토산 및 그의 더 아세틸화된 형태인 키틴과 같은 사차 암모늄 함유 생체중합체들은 그의 항미생물 활성에 대해 잘 알려져 있다 (문헌 [Kong, et al. (2010) Int. J. of Food Microbiol . 144: 51-63]). 세균, 효모 및 진균과 같은 여러 미생물 군에 대한 키틴, 키토산 및 이들의 유도체들의 항미생물 활성이 알려져 있다.
키틴, 키토산 및 기타 관련 중합체들은 효소를 고정하기에 뛰어난 골격이 된다 (문헌 [Muzzarelli (1980) Enzyme Microb . Technol . 2:177-184]). 티로시나제가 산업 폐기물의 탈페놀화용 (문헌 [Dincer, et al. (2012) Int . J. Biol . Macromol . 50:815-820]) 및 페놀 화합물의 광학적 검출용으로 (문헌 [Abdullah, et al. (2006) Sensors 및 Actuators B: Chemical 114:604-609]) 키토산상에 고정된 바 있다. 이들 예에서, 티로시나제는 링커 없이 키토산 지지체에 직접적으로 결찰되는 것, 또는 키토산상에 효소를 고정하기 위한 링커로서 글루타르알데히드를 사용하는 것 중 어느 하나이다. 또한, 티로시나제-키토산 생체촉매가 L-DOPA 제조용으로 연구되었었다 (문헌 [Carvalho, et al., Appl . Biochem . Biotechnol . (2000) 84-86:791-800]). 미생물 트랜스글루타미나제는 링커로서의 글루타르알데히드와 함께 중합체성 지지체용으로 키토산의 미세비드 형태인 키토펄(Chitopearl) 3007을 사용하여, 식품 단백질의 탈아미드화를 목적으로 링커로서 글루타르알데히드를 사용하여 키토산상에 고정된 바 있다 (문헌 [Nonaka, et al. (1996) Biosci , Biotechnol, and Biochem. 60:532-533]). 중합체성 지지체의 예는 예를 들면 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Nonaka, et al. (1996) Biosci , Biotechnol , and Biochem . 60:532-533] 및 [Hayashi, T et al. (1991) J Appl Polymer Sci 42: 85-92]에 제공되어 있다.
A. 중합체성 지지체상에의 효소 고정을 위한 링커
일부 실시양태에서, 1종 이상의 Tgase 효소 (예컨대 본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소) 및/또는 리실 옥시다제 효소는 중합체에 효소를 공유로 연결시키는 화학 링커를 통하여 중합체상에 고정된다. 일부 실시양태에서, 상기 링커는 알킬렌 (예컨대 메틸렌), 디이민 (1,5-디이민), 디아민 (1,5-디아민), 디카르보닐 (예컨대 1,4-디카르보닐), 아미드 결합, 폴리펩티드, 알킬 링커이거나, 또는 페닐 기, 융합된 헤테로고리 또는 방향족 기를 포함한다.
링커를 제공하는 데에 사용될 수 있는 반응물의 예에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 포름알데히드, 글루타르알데히드, 숙시네이트 무수물, 페놀계 화합물, 제니핀, 카르보디이미드 반응물, 단백질 또는 펩티드 (예컨대 제인, 젤라틴, 콜라겐).
일부 실시양태에서, 연결 반응물은 제네핀, 에피클로로히드린, 포름알데히드 또는 글루타르알데히드이다.
일부 실시양태에서, Tgase (예컨대 Tgase 변이체 효소) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들)는 링커의 사용 없이 캐리어 (중합체성 지지체)에 공유로 연결된다.
VI. 제품
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 제품에는 제품 중에서 항미생물 작용제, 예컨대 보존제로서 작용하는 데에 효과적인 양, 예를 들면 약 0.0001 % w/v 내지 약 5 % w/v의 본원에서 기술되는 바와 같은 1종 이상의 Tgase 변이체 효소 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 그의 조성물을 포함하는, 임의적으로 중합체성 지지체상에 고정되거나 거기에 봉입되어 있는 개인 관리 제품, 가정용 제품, 산업용 식품, 약제, 화장품, 건강관리, 해양, 페인트, 코팅, 접착제, 에너지, 플라스틱, 포장 또는 농업용 제품이 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 제품에는 표면에 일광차단 분자 또는 색상을 결합시키는 데에, 예컨대 피부 표면 또는 제품 제제 내 중 어느 하나에 1종 이상의 피부-유래 단백질 또는 펩티드, 예컨대 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴에 공유 결합시키는 데에 효과적인 양으로, 임의적으로 중합체성 지지체상에 고정되거나 거기에 봉입되어 있는 1종 이상의 Tgase 효소 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소) 및/또는 리실 옥시다제 효소, 그리고 일광차단 및/또는 색상 생성 분자를 포함할 수 있는 1종 이상의 활성 또는 기능성인 성분을 포함하는 조성물인 본원에서 기술되는 조성물을 포함하는 화장품 및 개인 관리 제품이 포함된다. 일부 실시양태에서, 제품 조성물은 서열식별번호: 1-29에 개시되어 있는 Tgase 효소들 중 어느 것 및/또는 리실 옥시다제 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, Tgase (예컨대 Tgase 변이체(들)) 및/또는 리실 옥시다제의 유효량은 조성물 중 약 0.0001 % 내지 약 5 % w/v, 예컨대 약 0.001 중량% 내지 약 1 중량% 또는 약 0.01 중량% 내지 0.1 중량%의 범위이다. 일부 실시양태에서, 활성 또는 기능성인 성분 (예컨대 일광차단 분자 또는 착색제)은 예를 들면 조성물이 국소적으로 적용되는 개체의 모발, 피부 또는 손발톱 단백질 또는 펩티드에, 또는 모발, 피부 또는 손발톱에 UV 보호 이점, 또는 화장용 또는 미적 이점과 같은 이점을 제공하는 데에 효과적인 양으로 조성물 중에 존재한다. 일부 실시양태에서, 활성 또는 기능성인 성분 (예컨대 일광차단 분자 또는 착색제)의 유효량은 조성물 중 약 0.1 중량% 내지 약 70 중량%, 예컨대 약 1 중량% 내지 약 35 중량%의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 1종 이상의 Tgase 변이체는 개인 관리 제품, 예컨대 비제한적으로 막대 비누, 액체 비누 (예컨대 손 비누), 손 살균제 (세정 제거 및 잔류형 알콜 기재 및 수-기재 손 소독제 포함), 수술전 피부 소독제, 세척용 와이프, 소독용 와이프, 바디 워시, 여드름 치료 제품, 항진균 기저귀 발진 크림, 항진균 피부 크림, 샴푸, 컨디셔너, 화장품 (비제한적으로 액체 또는 분말 파운데이션, 액체 또는 고체 아이라이너, 마스카라, 크림 아이 섀도우, 착색 분말, 건조하거나 가습된 메이크 업 제거 제품 등으로 사용될 "팬케이크" 유형 분말 포함), 탈취제, 항미생물 크림, 바디 로션, 핸드 크림, 국소용 크림, 애프터셰이브 로션, 스킨 토너, 구강 세척제, 치약, 일광차단 로션, 그리고 유아용 제품 예컨대 비제한적으로 세척용 와이프, 유아용 샴푸, 유아용 비누 및 기저귀 크림에 포함된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 Tgase 변이체는 상처 관리 물품, 예컨대 비제한적으로 상처 치유 연고, 크림 및 로션, 상처 피복제, 화상 상처 크림, 붕대, 테이프 및 스테리-스트립, 그리고 의료 물품 예컨대 의료용 가운, 모자, 안면 마스크 및 신발-덮개, 수술용 드롭(drop) 등에 포함된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 Tgase 변이체는 구강 관리 제품, 예컨대 구강 세정제, 치약, 또는 치과용 치실 코팅, 수의과 또는 애완동물 관리 제품, 보존제 조성물, 또는 표면 소독제, 예컨대 소독제 용액, 스프레이 또는 와이프에 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 1종 이상의 Tgase 변이체는 예를 들면 보존제 물질로서 가정용 또는 산업용 제품에 혼입된다. 예를 들면, Tgase 변이체(들)는 가정용 세척제, 예컨대 농축된 액체 세척제 또는 스프레이 세척제, 세척용 와이프, 접시 세척 액체, 접시 세척제 세제, 스프레이-대걸레 액체, 가구 광택제, 실내용 페인트, 실외용 페인트, 먼지제거 스프레이, 세탁물 세제, 직물 유연제, 양탄자/직물 세척제, 창문 및 유리 세척제, 변기 세척제, 액체/크림 세척제 등에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 Tgase 변이체는 예를 들면 소비, 포장 및 식품 코팅 전에 과실 및 채소를 세척하도록 고안되는 식품 세척 제품에 포함될 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체가 혼입될 수 있는 다른 제품으로는 식품, 약제, 화장품, 건강관리, 해양, 페인트, 코팅, 에너지 (예컨대 수압파쇄(fracking) 액체), 플라스틱, 포장 및 농업용 제품이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, Tgase 변이체는 HVAC 시스템, 냉각지(cooling pond), 수 정제 시스템에 혼입될 수 있거나, 또는 비제한적으로 펄프 및 종이 가공과 같은 산업 적용분야에서 사용될 수 있다.
본원에서 개시되는 제품에는 색상을 표면에 결합시키는 데에, 예컨대 1종 이상의 피부 단백질, 예컨대 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴에, 또는 식품 제품의 단백질, 예컨대 가공된 식품 제품의 식용가능한 외피, 예컨대 소시지 외피에 공유 결합시키는 데에 효과적인 양으로 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 효소 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소, 또는 이들의 조성물, 및 1종 이상의 색상 생성 분자를 포함하는 화장품 및 개인 관리 제품이 포함된다. 일부 실시양태에서, 제품 조성물은 서열식별번호: 1-29에 개시되어 있는 Tgase 효소들 중 어느 것 및/또는 리실 옥시다제 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, Tgase 효소 (예컨대 Tgase 변이체 효소) 및/또는 리실 옥시다제 효소의 유효량은 약 1 % w/v까지이다.
본원에서 개시되는 제품은 표면에 일광차단 및/또는 색상 분자를 결합시키는 데에 효과적인 양으로, 임의적으로 중합체성 지지체상에 고정되거나 거기에 봉입되어 있는 1종 이상의 Tgase 변이체 효소(들), 그리고 일광차단 및/또는 색상 생성 분자를 포함한 1종 이상의 기능성 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제품은 제품 제제 내에서 발견되는 피부-유래 단백질, 예컨대 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴에 일광차단 분자를 공유 결합시킨다. 일부 실시양태에서, 제품은 피부 단백질, 예컨대 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴에 일광차단 분자를 공유 결합시킨다. 일부 실시양태에서, 제품은 피부 단백질, 예컨대 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴에 색상을 공유 결합시킨다. 일부 실시양태에서, 제품은 피부 표면상의 자연 효소와 반응하여 피부 단백질에 가교결합시키기에 충분한 링커를 보유하는 기능성 성분을 함유한다. 일부 실시양태에서, 제품은 식품 제품의 단백질, 예컨대 가공된 식품 제품의 식용가능한 외피, 예컨대 소시지 외피에 색상을 공유 결합시킨다. 일부 실시양태에서, 가교-결합 효소 (예컨대 트랜스글루타미나제 효소)의 유효량은 조성물 중 약 0.001 내지 약 20 % w/v, 예컨대 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량% 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체를 포함하는 제품 또는 조성물은 추가로 아실 트랜스퍼아제, 알파-아밀라제, 베타-아밀라제, 알파-갈락토시다제, 아라비노시다제, 아릴 에스테라제, 베타-갈락토시다제, 카라기나제, 카탈라제, 셀로비오히드롤라제, 셀룰라제, 콘드로이티나제, 큐티나제, 엔도-베타-1,4-글루카나제, 엔도-베타-만나제, 에스테라제, 엑소-만나나제, 갈락타나제, 글루코아밀라제, 헤미셀룰라제, 히알루로니다제, 케라티나제, 락카제, 락타제, 리그니나제, 리파제, 리폭시제나제, 만나나제, 옥시다제, 펙테이트 리아제, 펙틴 아세틸 에스테라제, 펙티나제, 펜토사나제, 퍼옥시다제, 페놀옥시다제, 포스파타제, 포스포리파제, 피타제, 폴리갈락투로나제, 베타-글루카나제, 탄나제, 크실란 아세틸-에스테라제, 크실라나제, 크실로글루카나제, 크실로시다제, 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제 또는 이들의 조합에서 선택되는 1종 이상의 추가적인 효소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 임의적으로 그의 원형 퍼뮤턴트를 포함하여 N-말단 메티오닌 잔기를 가지며 임의적으로 본원에서 기술되는 바와 같은 전구-서열을 가지는 표 3에 개시되어 있는 변이체들 중 어느 것과 같은 Tgase 변이체 효소, 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 그의 조성물은 적어도 약 0.0001 % w/v, 0.0005 % w/v, 0.001 % w/v, 0.005 % w/v, 0.01 % w/v, 0.05 % w/v, 0.1 % w/v, 0.5 % w/v, 1 % w/v, 1.5 % w/v, 2 % w/v, 2.5 % w/v, 3 % w/v, 3.5 % w/v, 4 % w/v, 4.5 % w/v, 또는 5 % w/v 중 어느 것의 농도로 본원에서 개시되는 제품 중 어느 것에 항미생물 작용제로서 포함된다. 일부 실시양태에서, 그의 조성물 중 Tgase 변이체 효소는 약 0.0001 % w/v 내지 약 0.0005 % w/v, 약 0.001 % w/v 내지 약 0.005 % w/v, 약 0.005 % w/v 내지 약 0.01 % w/v, 약 0.01 % w/v 내지 약 0.05 % w/v, 약 0.05 % w/v 내지 약 0.1 % w/v, 약 0.1 % w/v 내지 약 0.5 % w/v, 약 0.5 % w/v 내지 약 1 % w/v, 약 1 % w/v 내지 약 1.5 % w/v, 약 1.5 % w/v 내지 약 2 % w/v, 약 2 % w/v 내지 약 2.5 % w/v, 약 2.5 % w/v 내지 약 3 % w/v, 약 3 % w/v 내지 약 3.5 % w/v, 약 3.5 % w/v 내지 약 4 % w/v, 약 4 % w/v 내지 약 4.5 % w/v, 약 4.5 % w/v 내지 약 5 % w/v, 약 0.0001 % w/v 내지 약 0.001 % w/v, 약 0.001 % w/v 내지 약 0.01 % w/v, 약 0.01 % w/v 내지 약 0.1 % w/v, 약 0.1 % w/v 내지 약 1 % w/v, 약 1 % w/v 내지 약 2.5 % w/v, 약 2.5 % w/v 내지 약 5 % w/v, 또는 약 1 % w/v 내지 약 5 % w/v 중 어느 것의 농도로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소 또는 그의 조성물이 항미생물 작용제로서 포함되는 제품은 석유화학적으로 유래하는 보존제 물질, 예컨대 비제한적으로 파라벤, 포름알데히드 및 포름알데히드 방출제, 이소티아졸리논, 페녹시에탄올 및/또는 유기 산 (예컨대 소듐 벤조에이트)은 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 단독, 또는 살생물 화학물질, 예컨대 키토산과의 조합으로의 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소는 제품 중 유일한 항미생물 작용제, 예컨대 항세균제 또는 보존제이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소는 비제한적으로 1종 이상의 석유화학적으로 유래하는 보존제 물질(들)과 같은 1종 이상의 추가적인 항미생물 작용제(들)과의 조합으로 항미생물 작용제로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소는 비제한적으로 1종 이상의 석유화학적으로 유래하는 보존제 물질(들)과 같은 1종 이상의 추가적인 항미생물 작용제(들)과의 조합으로 항미생물 작용제로 포함된다.
일부 실시양태에서, 보존제 블렌드는 제품과 상용성이며, 산화제 또는 환원제, 그리고 다양한 생성물들의 정상 pH 범위 (4.5 내지 8.0)에 대하여 안정하다.
본원에서 기술되는 Tgase 변이체가 혼입될 수 있는 제품의 비-제한적인 예는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 제PCT/US20/21211호, 및 U.S. 가출원 제63/075,763호에 기술되어 있다.
A. 개인 관리 제품
본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소 또는 그의 조성물, 예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 보존제 조성물은 임의의 개인 관리 제품에 혼입될 수 있다. 개시되는 Tgase 변이체 효소 조성물이 혼입될 수 있는 개인 관리 제품에는 막대 비누, 액체 비누 (예컨대 손 비누), 손 살균제 (세정 제거 및 잔류형 알콜 기재 및 수-기재 손 소독제 포함), 수술전 피부 소독제, 세척용 와이프, 소독용 와이프, 바디 워시, 여드름 치료 제품, 항진균 기저귀 발진 크림, 항진균 피부 크림, 샴푸, 컨디셔너, 화장품 (비제한적으로 액체 또는 분말 파운데이션, 액체 또는 고체 아이라이너, 마스카라, 크림 아이 섀도우, 착색 분말, 건조하거나 가습된 메이크 업 제거 제품 등으로 사용될 "팬케이크" 유형 분말 포함), 탈취제, 항미생물 크림, 바디 로션, 핸드 크림, 국소용 크림, 애프터셰이브 로션, 스킨 토너, 구강 세척제, 치약, 일광차단 로션, 그리고 유아용 제품 예컨대 비제한적으로 세척용 와이프, 유아용 샴푸, 유아용 비누 및 기저귀 크림이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 주제는 상처 관리 물품, 예컨대 비제한적으로 상처 치유 연고, 크림 및 로션, 상처 피복제, 화상 상처 크림, 붕대, 테이프 및 스테리-스트립, 그리고 의료 물품 예컨대 의료용 가운, 모자, 안면 마스크 및 신발-덮개, 수술용 드롭(drop) 등에 적용될 수도 있다. 추가적인 개인 관리 제품에는 용액, 스프레이 또는 와이프를 포함한 구강 제품, 예컨대 구강 세정제, 치약, 치과용 치실 코팅, 수의과 또는 애완동물 관리 제품, 보존제 조성물, 및 표면 소독제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일반적으로, 본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소는 피부의 외관을 변형시키는 데에 사용하도록 예정되는 임의의 적합한 개인 관리 제품, 예컨대 화장품 제품 (예컨대 립스틱, 파운데이션, 블러시 또는 아이 메이크업)에 혼입될 수 있다. 개시되는 조성물이 혼입될 수 있는 화장품 제품에는 액체 또는 분말 파운데이션, 액체 또는 고체 아이라이너, 블러시, 아이 섀도우, 착색 분말, 건조하거나 가습된 립 색상, 또는 메이크 업 설정 스프레이 등으로 사용될 "팬케이크" 유형 분말이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 개시되는 조성물은 브론저(bronzer) 또는 인공 태닝 제품에 혼입될 수도 있다. 또한, 개시되는 조성물은 예를 들면 일광차단 발색단 (예컨대 비제한적으로 옥시벤존, 아보벤존, 옥티살레이트, 옥토크릴렌, 호모살레이트, 또는 옥티녹세이트, 또는 이들의 유도체)을 피부 단백질에 결합시키기 위하여 일광차단 제품, 예컨대 화학적 일광차단제에 혼입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시되는 효소 및 조성물에 의해 미생물 오염으로부터 보호되는 개인 관리 제품은 에멀션, 젤, 혈청, 용액, 토너, 로션, 크림, 스프레이, 젤, 분말, 스틱(stick) 및 세척제와 같은 임의 유형의 것일 수 있다.
개인 관리 제품 제제는 통상적으로 본 개시내용의 효소 조성물이 첨가되는 기제 제제를 포함한다. 기제 제제는 최종 사용 적용분야에 따라 수많은 서로 다른 성분들을 함유할 수 있다. 개인 관리 제품 제제는 예를 들면 용매, 계면활성제, 에멀션화제, 농밀도 인자, 컨디셔너, 완화제, 피부 관리 성분, 보습제, 증점제, 윤활제, 충전재, 항산화제, 다른 보존제, 활성 성분, 특히 피부학적으로 활성인 성분, 방향제 등은 물론, 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 본원에서 언급될 때의 활성 성분에는 예를 들면 항-염증제, 및 임의적으로 항-세균제, 항진균제 등의 작용제가 포함된다. 일부 실시양태에서는, 국소 적용용으로 적합한 활성 성분이 포함된다.
일부 실시양태에서, 개인 관리 제품은 석유화학 유래의 보존제 물질과 같은 임의의 추가적인 보존제는 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 개인 관리 제품은 본원에서 기술되는 효소 또는 효소/중합체 조성물 이외에 석유화학 유래의 보존제와 같은 1종 이상의 추가적인 보존제 물질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 개인 관리 제품은 개인 관리 제품에 통상적으로 포함되는 통상적인 항-세균 및/또는 항진균 "활성 작용제"는 포함하지 않는다. 손 비누에 사용되는 통상적인 항-세균제에는 하기가 포함된다: 클로플루카르반, 플루오로살란, 헥사클로로펜, 헥실레소르시놀, 아이오딘 착물 (암모늄 에테르 술페이트 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트), 아이오딘 착물 (알킬아릴옥시 폴리에틸렌 글리콜의 포스페이트 에스테르), 노닐페녹시폴리(에틸렌옥시) 에탄올아이오딘, 폴록사머-아이오딘 착물, 포비돈, 운데코일륨 클로라이드 아이오딘 착물, 메틸벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 페놀 16, 이차 아밀트리크레졸, 소듐 옥시클로로센, 트리브롬살란, 트리클로카르반, 트리클로산 및 삼중 염료. 소비자 제품 제제에 보존제로서 사용되는 통상적인 항미생물제에는 하기가 포함된다: 파라벤, 포름알데히드 및 포름알데히드 방출제, 이소티아졸리논, 페녹시에탄올 및 유기 산 (예컨대 소듐 벤조에이트).
일부 실시양태에서, 단독, 또는 비제한적으로 키토산을 포함한 살생물 화학물질과의 조합 (예컨대 블렌드)으로서의 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소는 제품 중 유일한 항세균제, 항진균제, 항미생물제 또는 보존제이다. 일부 실시양태에서, 단독, 또는 비제한적으로 키토산과 같은 살생물 화학물질과의 조합 (예컨대 블렌드)으로서의 Tgase 변이체 효소는 1종 이상의 추가적인 보존제 물질, 예컨대 1종 이상의 석유화학적으로 유래하는 보존제 물질과 조합된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 생체기반 보존제 (즉 본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소 또는 그의 조성물)는 1종 이상의 합성 보존제 (예컨대 석유화학적으로 유래하는 물질)와 조합되며, 생체기반 및 합성 보존제 사이에서 달성되는 보존 (예컨대 항미생물) 효과는 상가작용성 또는 상승작용성이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 생체기반 보존제 (즉 본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소 또는 그의 조성물)는 1종 이상의 추가적인 보존제 물질, 예를 들면 폴리리신, 키토산, 벤조에이트, 니신, 리소자임 및 키토산, 또는 이들의 임의 조합에서 선택되는 살생물 물질과 조합되며, 생체기반 보존제와 추가적인 보존제 물질(들) 사이에서 달성되는 보존 (예컨대 항미생물) 효과는 상가작용성 또는 상승작용성이다.
일부 실시양태에서, 개인 관리 제품은 완화제를 포함할 수 있다. 완화제에는 비제한적으로 아몬드 오일, 피마자 오일, 세라토니아 추출물, 세토스테아로일 알콜, 세틸 알콜, 세틸 에스테르 왁스, 콜레스테롤, 면실 오일, 시클로메티콘, 에틸렌 글리콜 팔미토스테아레이트, 글리세린, 글리세린 모노스테아레이트, 글리세릴 모노올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 라놀린, 레시틴, 경량 무기질 오일, 중간-사슬 트리글리세리드, 무기질 오일 및 라놀린 알콜, 바셀린, 바셀린 및 라놀린 알콜, 대두 오일, 전분, 스테아릴 알콜, 해바라기 오일, 크실리톨 및 이들의 조합이 포함된다. 일 실시양태에서, 완화제는 에틸헥실스테아레이트 및 에틸헥실 팔미테이트이다.
통상적인 에멀션화제는 하기이다: 금속 비누, 특정 동물 및 채소 오일, 그리고 다양한 극성 화합물들. 적합한 에멀션화제에는 아카시아, 음이온계 에멀션화 왁스, 칼슘 스테아레이트, 카르보머, 세토스테아릴 알콜, 세틸 알콜, 콜레스테롤, 디에탄올아민, 에틸렌 글리콜 팔미토스테아레이트, 글리세린 모노스테아레이트, 글리세릴 모노올레에이트, 히드록시프로필 셀룰로스, 하이프로멜로스, 수성 라놀린, 라놀린 알콜, 레시틴, 중간-사슬 트리글리세리드, 메틸셀룰로스, 무기질 오일 및 라놀린 알콜, 일염기성 소듐 포스페이트, 모노에탄올아민, 비이온계 에멀션화 확스, 올레산, 폴록사머, 폴록사머류, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자 오일 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 자가-에멀션화 글리세릴 모노스테아레이트, 소듐 시트레이트 탈수물, 소듐 라우릴 술페이트, 소르비탄 에스테르, 스테아르산, 해바라기 오일, 트라가칸트, 트리에탄올아민, 크산탄 검 및 이들의 조합이 포함된다. 일 실시양태에서, 에멀션화제는 글리세롤 스테아레이트이다.
적합한 비-이온계 계면활성제에는 에멀션화 왁스, 글리세릴 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자 오일 유도체, 폴리소르베이트, 소르비탄 에스테르, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 시클로덱스트린, 글리세린 모노스테아레이트, 폴록사머, 포비돈 및 이들의 조합이 포함된다. 일 실시양태에서, 비-이온계 계면활성제는 스테아릴 알콜이다.
적합한 항산화제에는 예를 들면 술파이트 (예컨대 소듐 술파이트), 토코페롤 또는 그의 유도체, 아스코르브산 또는 그의 유도체, 시트르산, 프로필 갈레이트, 키토산 글리콜레이트, 시스테인, N-아세틸 시스테인 더하기 아연 술페이트, 티오술페이트 (예컨대 소듐 티오술페이트), 폴리페놀 글루타치온, 디티오트레이톨 (DTT), 수퍼옥시드 디스뮤타제, 카탈라제 등이 포함된다.
에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA)과 같은 킬레이팅제가 포함될 수도 있다.
적합한 증점제에는 예를 들면 아크릴레이트/스테아레트-20 메타크릴레이트 공중합체, 카르보머, 카르복시메틸 전분, 세라 알바, 디메티콘/비닐 디메티콘 가교중합체, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 실리카, 실리카 디메틸 실릴레이트, 크산탄 검 및 수소화된 부틸렌/에틸렌/스티렌 공중합체가 포함된다.
적합한 보습제에는 예를 들면 부틸렌 글리콜, 세틸 알콜, 디메티콘, 디미리스틸 타르트레이트, 글루코스 글리세레트-26, 글리세린, 글리세릴 스테아레이트, 가수분해된 우유 단백질, 락트산, 락토스 및 기타 당, 라우레트-8, 레시틴, 옥트옥시글리세린, PEG-12, PEG 135, PEG-150, PEG-20, PEG-8, 펜틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 피탄트리올, 폴리 쿼터늄-39 PPG-20 메틸 글루코스 에테르, 프로필렌 글리콜, 소듐 히알루로네이트, 소듐 락테이트, 소듐 PCA, 소르비톨, 숙시노글리칸, 합성 밀랍, 트리-C14-15 알킬 시트레이트 및 전분이 포함된다.
일반적으로, 본원에서 개시되는 바와 같은 효소 조성물 (예를 들면 임의적으로 중합체성 지지체상에 고정되거나 거기에 봉입되어 있는 1종 이상의 Tgase 변이체 효소(들), 및 일광차단 또는 색상 생성 분자(들)을 포함하는 조성물)은 UV 노출로부터 피부를 보호하는 데에, 또는 피부의 외관을 변형시키는 데에 사용하도록 예정되는 임의의 적합한 개인 관리 제품, 예컨대 화장품 제품 (예컨대 립스틱, 파운데이션, 블러시 또는 아이 메이크업)에 혼입될 수 있다. 개시되는 조성물이 혼입될 수 있는 화장품 제품에는 액체 또는 분말 파운데이션, 액체 또는 고체 아이라이너, 블러시, 아이 섀도우, 착색 분말, 건조하거나 가습된 립 색상, 또는 메이크 업 설정 스프레이 등으로 사용될 "팬케이크" 유형 분말이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 개시되는 조성물은 브론저 또는 인공 태닝 제품에 혼입될 수도 있다. 또한, 개시되는 조성물은 예를 들면 일광차단 발색단 (예컨대 비제한적으로 옥시벤존, 아보벤존, 옥티살레이트, 옥토크릴렌, 호모살레이트, 또는 옥티녹세이트, 또는 이들의 유도체)을 피부 단백질에 결합시키기 위하여 일광차단 제품, 예컨대 화학적 일광차단제에 혼입될 수 있다.
B. 가정용/산업용 제품
단독, 또는 1종 이상의 추가적인 보존제 물질, 예컨대 1종 이상의 석유화학적으로 유래하는 보존제 물질과의 조합 중 어느 하나로서 개시되는 Tgase 변이체 효소 또는 본원에서 개시되는 바와 같은 그의 조성물을 보존제 물질로서 혼입할 수 있는 가정용/산업용 제품의 비-제한적인 실시양태에는 가정용 세척제, 예컨대 농축된 액체 세척제 및 스프레이 세척제, 세척용 와이프, 접시 세척 액체, 접시 세척제 세제, 스프레이-대걸레 액체, 가구 광택제, 실내용 페인트, 실외용 페인트, 먼지제거 스프레이, 세탁물 세제, 직물 유연제, 양탄자/직물 세척제, 창문 및 유리 세척제, 변기 세척제, 액체/크림 세척제 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 본원에서 기술되는 조성물은 예를 들면 소비 전에 과실 및 채소를 세척하도록 고안되는 식품 세척 제품에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 생체기반 보존제 (즉 본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소 또는 그의 조성물)는 1종 이상의 합성 보존제 (예컨대 석유화학적으로 유래하는 물질)와 조합되며, 생체기반 및 합성 보존제 사이에서 달성되는 보존 (예컨대 항미생물) 효과는 상가작용성 또는 상승작용성이다.
C. 가죽
일반적으로, Tgase 효소 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소) 및/또는 리실 옥시다제 효소는 임의의 자연 콜라겐 함유 제품에 혼입될 수 있거나, 또는 가죽 가공 동안 가죽 중 1종 이상의 단백질, 예컨대 동물 또는 비-동물 유래 콜라겐, 케라틴, 실크 및/또는 엘라스틴 단백질에 색상이 공유 결합되도록 가죽을 변형시키는 데에 사용될 수 있다.
D. 식품 제품
일반적으로, Tgase 효소 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소) 및/또는 리실 옥시다제 효소는 임의의 식품 단백질에 혼입될 수 있거나, 또는 식품 가공 동안 식품 단백질의 색상을 변형시키는 데에 사용될 수 있다. Tgase 및/또는 리실 옥시다제 효소(들)가 혼입될 수 있는 식품 제품에는 콜라겐 또는 젤라틴 (가수분해된 콜라겐)을 함유하는 동물-유래 제품이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기에는 젤라틴 제품, 고기 제품 또는 고기 유사체 제품 예컨대 소시지 외피, 돼지고기 껍질, 또는 동물의 피부 층 및/또는 콜라겐을 포함한 임의의 고기 또는 해양 제품이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 효소 조성물은 비-동물 유래 콜라겐-함유 제품 또는 임의의 콜라겐-함유 제품에 혼입될 수 있다.
E. 기타 제품
개시되는 Tgase 변이체 효소 또는 본원에서 개시되는 바와 같은 그의 조성물이 혼입될 수 있는 기타 제품으로는 식품, 약제, 화장품, 건강관리, 해양, 페인트, 코팅, 접착제, 에너지 (예컨대 수압파쇄 액체), 플라스틱, 포장 및 농업용 제품이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 개시되는 효소 또는 본원에서 개시되는 효소-중합체 조성물은 HVAC 시스템, 냉각지, 수 정제 시스템에 혼입될 수 있거나, 또는 비제한적으로 펄프 및 종이 가공과 같은 산업 적용분야에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 살생물 효소, 즉 본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소는 1종 이상의 추가적인 보존제 물질, 예컨대 1종 이상의 석유화학적으로 유래하는 보존제 물질과 조합된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 생체기반 보존제 (즉 본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체 효소 또는 그의 조성물)는 1종 이상의 합성 보존제 (예컨대 석유화학적으로 유래하는 물질)와 조합되며, 생체기반 및 합성 보존제 사이에서 달성되는 보존 (예컨대 항미생물) 효과는 상가작용성 또는 상승작용성이다.
VII. 사용 방법
단백질 또는 펩티드의 가교결합이 요구되거나 유익한 다양한 사용 적용분야에서의 본원에서 개시되는 Tgase 변이체 (임의적으로 그의 원형 퍼뮤턴트를 포함하여 N-말단 메티오닌 잔기를 가지며 임의적으로 본원에서 기술되는 바와 같은 전구-서열을 가지는 표 3에 개시되어 있는 변이체들 중 어느 것 포함)의 사용을 위한 방법이 제공된다.
본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체는 비제한적으로 보존제, 항미생물제, 악취 억제제, 약제, 화장품, 국소용, 산업용, 에너지, 건강관리 또는 해양 적용분야와 같은 사용 적용분야에서 사용될 수 있다.
개시되는 변이체는 보존제를 필요로 하는 다양한 적용분야 예를 들면 개인 관리, 가정용, 산업용, 식품, 약제, 화장품, 건강관리, 해양, 페인트, 코팅, 에너지, 플라스틱, 포장 및 농업용 제품, 또는 본원에서 개시되는 제품 또는 시스템들 중 어느 것에서 비제한적으로 파라벤, 포름알데히드 및 글루타르알데히드와 같은 통상적인 보존제, 그리고 은 (상처 관리 제품에서 사용됨)을 포함한 통상적인 살생물제에 대한 대안으로 또는 그에 더하여 사용될 수 있다. 개시되는 변이체는 잠재적으로 유해한 세균, 진균 및/또는 기타 미생물의 성장을 억제하는 항-미생물 (예컨대 보존) 성분으로 사용될 수 있으며, 그에 따라 관심 제품에서 세균, 진균 및/또는 미생물 성장을 억제하는 유효량으로 보존될 제품에 첨가된다. 그와 같은 사용 적용분야의 비제한적인 예는 예를 들면 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT/US20/21211호에 기술되어 있다. Tgase 변이체는 건강관리 제품, 개인 관리 또는 화장품 제제, 포장 (식품, 화장품 및 약제), 직물 및 가죽 제조, 페인트 및 코팅, 그리고 수 처리 및 정제를 포함한 해양 적용분야에서 적용성을 가지는 항미생물 작용제로서 사용될 수 있다.
Tgase 변이체는 기능성 성분, 염료 또는 단백질을 사용하여 비제한적으로 케라틴 및 콜라겐과 같은 관심 단백질을 영구적으로 변형시키는 데에 사용될 수 있다. Tgase 효소 (예컨대 개시되는 변이체들 중 어느 것) 및/또는 리실 옥시다제 효소는 단백질 또는 펩티드에의 색상, 염료 또는 색소 분자의 공유 결합을 촉진하기 위하여 제품에 혼입될 수 있다. 방법은 관심 단백질 또는 재료를 1종 이상의 Tgase 효소 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소, 그리고 1종 이상의 색상-생성 분자, 예컨대 염료 또는 색소 분자와 접촉시키는 것을 포함한다. Tgase 및/또는 리실 옥시다제 효소(들)는 관심 단백질 또는 재료에 색상 분자(들)를 공유 결합시키기에 충분한 (즉 효과적인) 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 상기 관심 단백질은 피부에 존재하는 1종 이상의 단백질이며, Tgase 및/또는 리실 옥시다제 효소(들) 및/또는 색상 분자(들)는 화장품 또는 개인 관리 제품의 형태로 존재할 수 있다. 피부에 존재하는 단백질은 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴일 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 단백질 또는 재료는 가죽, 식품 제품 또는 농업용 제품, 또는 그 안의 관심 단백질이며, Tgase 효소(들) (예컨대 Tgase 변이체(들)) 및/또는 리실 옥시다제 및 색상 분자(들)는 가죽, 식품 제품 또는 농업용 제품, 또는 그 안의 관심 단백질을 변형시키거나 거기에 색상을 부가하는 데에 적합한 조성물의 형태로 존재한다.
A. 보존 방법
본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 (즉, 임의적으로 그의 원형 퍼뮤턴트를 포함하여 N-말단 메티오닌 잔기를 가지며 임의적으로 본원에서 기술되는 바와 같은 전구-서열을 가지는 표 3에 개시되어 있는 변이체들 중 어느 것)는 비제한적으로 파라벤, 포름알데히드 및 글루타르알데히드, 그리고 은 (상처 관리 제품에 사용됨)을 포함한 통상적인 살생물제와 같은 통상적인 보존제의 대안으로서, 또는 그에 더하여 보존제를 필요로 하는 다양한 적용분야, 예를 들면 개인 관리, 가정용, 산업용, 식품, 약제, 화장품, 건강관리, 해양, 페인트, 코팅, 접착제, 에너지, 플라스틱, 포장 및 농업용 제품에 사용될 수 있다. Tgase 변이체는 잠재적으로 유해한 세균, 진균 및/또는 기타 미생물의 성장을 억제하는 항미생물 (예컨대 보존제) 성분으로 사용될 수 있으며, 그에 따라 관심 제품에서 세균, 진균 및/또는 미생물 성장을 억제하는 데에 효과적인 양으로 보존될 제품에 첨가될 수 있다. 그와 같은 사용 적용분야의 비제한적인 예는 예컨대 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT/US20/21211호에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서는, USP <51> 통과 기준이 달성되며, 즉 범주 2 제품: 세균: 14일에서의 최초 계산 계수로부터의 2.0 log 이상 감소, 및 28일에서의 14일 계수로부터의 증가 없음; 효모 및 곰팡이의 경우: 14 및 28일에서의 최초 계산 계수로부터의 증가 없음이다. 일부 실시양태에서, 효소 및 효소-생체중합체 제제의 항미생물 거동은 미생물 성장의 대략 80-100 %, 또는 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 또는 99 % 중 어느 것만큼의 미생물 성장의 감소를 초래하는 그램-양성 및 그램-음성 세균은 물론 진균에 대한 MIC (최소 억제 농도)을 특징으로 한다.
본원에서 기술되는 바와 같은 제품, 예컨대 개인 관리, 가정용, 산업용, 식품, 약제, 화장품, 건강관리, 해양, 페인트, 코팅, 접착제, 에너지, 플라스틱, 포장 또는 농업용 제품과 조합될 경우, 또는 본원에서 개시되는 제품 또는 시스템들 중 어느 것에서, 예컨대 제제, 또는 제품 또는 시스템에의 혼입물에서 보존제로서 조성물은 광범위한 pH 범위에 걸쳐 효과적인 넓은 범위의 보존 활성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 개인 관리, 가정용, 산업용, 식품, 약제, 화장품, 건강관리, 해양, 페인트, 코팅, 접착제, 에너지, 플라스틱, 포장 또는 농업용 제품과 같은 제품 또는 시스템, 또는 본원에서 개시되는 제품 또는 시스템들 중 어느 것, 예컨대 제제, 또는 제품 또는 시스템에의 혼입물에 본원에서 기술되는 바와 같은 보존제 조성물 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체 또는 그의 조성물)을 첨가하는 것으로서, 상기 보존제 조성물을 함유하지 않는 동일 제품에 비해 미생물 성장이 감소되고/거나 제품의 저장 수명이 증가되는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비제한적으로 포름알데히드 및/또는 글루타르알데히드와 같은 다른 보존제는 제품 조성물에 포함되지 않는다.
일부 실시양태에서는, 개인 관리, 가정용 또는 산업용 제품과 같은 제품 조성물의 저장-수명, 완전성 또는 미생물이 없는 (예컨대 세균 및/또는 진균이 없는) 상태의 증가 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에서 기술되는 바와 같은 보존제 조성물의 유효량을 제품 (예컨대 개인 관리, 가정용 또는 산업용 제품)에 혼입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 유효량은 대략 80-100 % 만큼의 미생물 성장의 감소, 또는 본원에서 기술되는 바와 같은 미생물 성장의 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 또는 99 % 감소 중 어느 것을 초래하는, MIC (최소 억제 농도)으로 지칭되는 양일 수 있다.
본원에서 기술되는 방법 또는 조성물의 일부 실시양태에서, Tgase 변이체 효소는 약 .0001 % w/v 내지 약 1 % w/v, .0001 % w/v 내지 약 .01 % w/v, 약 .0001 % w/v 내지 약 2.5 % w/v, 약 .0001 % w/v 내지 약 5 % w/v, 약 .0001 % w/v 내지 약 .001 % w/v, 약 .001 % w/v 내지 약 .01 % w/v, 약 .01 % w/v 내지 약 .1 % w/v, 0.01 % w/v 내지 약 5 % w/v, 또는 적어도 약 0.01 % w/v, 0.05 % w/v, 0.1 % w/v, 0.5 % w/v, 1 % w/v, 1.5 % w/v, 2 % w/v, 2.5 % w/v, 3 % w/v, 3.5 % w/v, 4 % w/v, 4.5 % w/v 또는 5 % w/v 중 어느 것, 또는 약 0.01 % w/v 내지 약 0.05 % w/v, 약 0.1 % w/v 내지 약 0.5 % w/v, 약 1 % w/v 내지 약 1.5 % w/v, 약 1.5 % w/v 내지 약 2 % w/v, 약 2 % w/v 내지 약 2.5 % w/v, 약 2.5 % w/v 내지 약 3 % w/v, 약 3 % w/v 내지 약 3.5 % w/v, 약 3.5 % w/v 내지 약 4 % w/v, 약 4 % w/v 내지 약 4.5 % w/v, 약 4.5 % w/v 내지 약 5 % w/v, 약 0.01 % w/v 내지 약 0.1 % w/v, 약 0.1 % w/v 내지 약 1 % w/v, 약 1 % 내지 약 5 % w/v, 약 0.05 % w/v 내지 약 0.5 % w/v, 약 0.5 % w/v 내지 약 5 % w/v, 약 1 % w/v 내지 약 2.5 % w/v, 또는 약 2.5 % w/v 내지 약 5 % w/v 중 어느 것의 농도로 포함될 수 있다.
개시되는 Tgase 변이체 및 그의 조성물을 이용하는 보존 방법이 적용될 수 있는 개인 관리 제품의 비-제한적인 예에는 막대 비누, 액체 비누 (예컨대 손 비누), 손 살균제 (세정 제거 및 잔류형 알콜 기재 및 수-기재 손 소독제 포함), 수술전 피부 소독제, 세척용 와이프, 소독용 와이프, 바디 워시, 여드름 치료 제품, 항진균 기저귀 발진 크림, 항진균 피부 크림, 샴푸, 컨디셔너, 화장품 (비제한적으로 액체 또는 분말 파운데이션, 액체 또는 고체 아이라이너, 마스카라, 크림 아이 섀도우, 착색 분말, 건조하거나 가습된 메이크 업 제거 제품 등으로 사용될 "팬케이크" 유형 분말 포함), 탈취제, 항미생물 크림, 바디 로션, 핸드 크림, 국소용 크림, 애프터셰이브 로션, 스킨 토너, 구강 세척제, 치약, 일광차단 로션, 그리고 유아용 제품 예컨대 비제한적으로 세척용 와이프, 유아용 샴푸, 유아용 비누 및 기저귀 크림이 포함된다. 본 발명의 주제는 상처 관리 물품, 예컨대 비제한적으로 상처 치유 연고, 크림 및 로션, 상처 피복제, 화상 상처 크림, 붕대, 테이프 및 스테리-스트립, 그리고 의료 물품 예컨대 의료용 가운, 모자, 안면 마스크 및 신발-덮개, 수술용 드롭 등에도 적용될 수 있다. 추가적인 제품에는 구강 제품, 예컨대 구강 세정제, 치약, 및 치과용 치실 코팅, 수의과 및 애완동물 관리 제품, 보존제 조성물, 그리고 용액, 스프레이 또는 와이프를 포함한 표면 소독제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
개시되는 Tgase 변이체 및 그의 조성물을 이용하는 보존 방법이 적용될 수 있는 가정용/산업용 제품의 비-제한적인 예에는 가정용 세척제, 예컨대 농축된 액체 세척제 및 스프레이 세척제, 세척용 와이프, 접시 세척 액체, 접시 세척제 세제, 스프레이-대걸레 액체, 가구 광택제, 실내용 페인트, 실외용 페인트, 먼지제거 스프레이, 세탁물 세제, 직물 유연제, 양탄자/직물 세척제, 창문 및 유리 세척제, 변기 세척제, 액체/크림 세척제 등이 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명 주제의 보존 방법은 소비 전에 과실 및 채소를 세척하도록 고안되는 식품 세척 제품, 포장 및 식품 코팅에 사용될 수 있다.
B. 단백질 변형 방법
일부 실시양태에서, 1종 이상의 Tgase 효소 (예컨대 본원에서 개시되는 바와 같은 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소는 UV-차단 일광차단제 및/또는 착색제, 예컨대 색소 또는 염료를 포함한 장기-지속 기능성 성분 적용분야에 사용될 제품에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 서열식별번호: 1-29에 개시되어 있는 Tgase 효소들 중 어느 것 및/또는 리실 옥시다제 효소가 제품 조성물에 포함된다. 예를 들면, Tgase (예컨대 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들)는 포유동물 (예컨대 인간) 피부, 모발 또는 손발톱에의 비제한적으로 모발 섬유 표면의 영구 (공유) 색상 변형과 같은 활성 또는 기능성인 성분의 전달을 위한 조성물에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, Tgase (예컨대 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들)는 UV-차단 (일광차단) 제품 또는 화장품 제품과 같이 국소적으로 적용되며 개체의 피부에 결합되는 제품에 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, Tgase (예컨대 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들)는 가죽 가공과 같이 동물의 피부에 영구적인 색상 적용을 제공하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, Tgase (예컨대 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들)는 식품 가공에서 영구적인 색상 적용을 제공하는 데에 사용될 수 있다.
본원에서는, 관심 단백질 또는 재료에 대하여 색상을 변형시키거나 부가하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 관심 단백질, 펩티드 또는 재료를 1종 이상의 Tgase (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들), 그리고 일광차단제 및/또는 색상-생성 분자, 예컨대 염료 또는 색소 분자를 포함한 1종 이상의 기능성 성분과 접촉시키는 것을 포함한다. Tgase (예컨대 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들)는 관심 단백질, 펩티드 또는 재료에 일광차단 및/또는 색상 분자(들)를 공유 결합시키기에 충분한 (즉 효과적인) 양으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 상기 관심 단백질은 피부에 존재하는 1종 이상의 단백질이며, Tgase (예컨대 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들) 및 일광차단제(들) 및/또는 색상 분자(들)는 화장품 또는 개인 관리 제품의 형태로 존재할 수 있다. 피부에 존재하는 단백질은 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 관심 재료는 피부로부터 유래하는 1종 이상의 단백질 또는 펩티드이며, Tgase (예컨대 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들) 및/또는 일광차단제(들) 및/또는 색상 분자(들)는 화장품 또는 개인 관리 제품의 형태로 존재할 수 있다. 제품 제제에 존재하는 단백질은 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴일 수 있다. 제품 제제에 존재하는 펩티드는 가수분해된 콜라겐, 가수분해된 케라틴 및/또는 가수분해된 엘라스틴일 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심 단백질 또는 재료는 가죽, 식품 제품 또는 농업용 제품, 또는 그 안의 관심 단백질이며, Tgase (예컨대 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들) 및/또는 색상 분자(들)는 가죽, 식품 제품 또는 농업용 제품, 또는 그 안의 관심 단백질을 변형시키거나 거기에 색상을 부가하는 데에 적합한 조성물의 형태로 존재한다.
일부 실시양태에서는, 포유동물 (예컨대 인간) 피부, 모발 또는 손발톱 중 단백질 또는 펩티드에 활성 또는 기능성 성분 (예컨대 일광차단 분자 또는 착색제)을 전달하기 위한 방법이 제공된다. 예를 들면, 상기 방법은 포유동물 (예컨대 인간) 피부, 모발 또는 손발톱 중 단백질 또는 펩티드에의 본원에서 기술되는 바와 같은 조성물의 적용, 또는 포유동물 (예컨대 인간) 개체의 피부, 모발 또는 손발톱에의 조성물의 국소적 적용을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 포유동물 (예컨대 인간) 피부, 모발 또는 손발톱 중 단백질 및/또는 펩티드를 하기를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다: (a) 유효량의 적어도 1종 활성 또는 기능성 성분 (예를 들자면 일광차단 분자 또는 착색제); 및 (b) 포유동물 (예컨대 인간) 피부, 모발 또는 손발톱 중 단백질 또는 펩티드에의 활성 또는 기능성 성분의 가교결합을 촉매하는 데에 효과적인 양의 1종 이상 Tgase (예컨대 Tgase 변이체) 및/또는 리실 옥시다제 효소(들). 일부 실시양태에서, 상기 방법은 포유동물 (예컨대 인간) 개체의 피부, 모발 또는 손발톱에의 조성물의 국소적 적용을 포함하며, 특정 실시양태에서 상기 조성물은 하기를 함유할 수 있다: (c) 개체의 피부, 모발 또는 손발톱에 Tgase 변이체 효소 및 활성 또는 기능성 성분을 전달하는 데에 효과적인 양의 제약용이거나 허용가능한 캐리어.
예를 들면, 상기 활성 또는 기능성 성분은 활성 또는 기능성 성분상에 직접적인 것 또는 거기에 결합되는 (예컨대 공유 결합되는) 링커상에 간접적인 것 중 어느 하나로 적어도 1종의 알킬아미노 (-RNH2), 히드라진, 히드라지드 또는 히드록실아민 잔기를 포함할 수 있으며, 상기 방법은 활성 또는 기능성 성분의 아미노 기와 피부, 모발 또는 손발톱 중 단백질 또는 펩티드의 아미노 기 (예컨대 글루타민 및/또는 리신 아미노산 잔기 측쇄상 아미노 기) 사이를 가교결합시키는 (예컨대 공유 결합의 형성) 트랜스글루타미나제 효소에 의한 촉매를 포함한다.
하기 실시예는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니라, 예시하고자 하는 것이다.
[ 실시예 ]
실시예 1. Tgase 벡터 구성 및 돌연변이유발
무세포 단백질 합성 ( CFPS ) 벡터
전구-서열 및 성숙한 Tgase를 코딩하는 유전자를 공표되어 있는 아미노산 서열 (문헌 [Kanaji, et al. (1993) J. Biol . Chem . 268(16):11565-11572])을 바탕으로 이. 콜리(E. coli)에서의 발현용으로 코돈 최적화하고, 합성한 후, PCT/US20/49226호에 기술되어 있는 바와 같은 pUC19-유래 발현 벡터상에 클로닝하였다.
이. 콜리 벡터
전구-서열 및 성숙한 Tgase를 코딩하는 유전자를 공표되어 있는 아미노산 서열 (문헌 [Kanaji, et al. (1993) J. Biol . Chem . 268(16):11565-11572])을 바탕으로 이. 콜리에서의 발현용으로 코돈 최적화하고, PCT/US20/49226호에 기술되어 있는 바와 같이 합성하였다. 이 . 콜리에서의 발현을 위하여, T7 프로모터 조절하의 pET9a 벡터상에 DNA를 클로닝하였다.
Tgase 변이체의 생성
관련 기술분야에 알려져 있는 위치 지정 돌연변이유발 방법을 사용하여, 성숙한 Tgase 유전자에 돌연변이를 도입하였다.
실시예 2. 무-세포 단백질 합성을 사용한 Tgase 변이체들의 발현
시중에서 구입가능한 무-세포 단백질 합성 키트에서 제조자의 지침에 따라 PCT/US20/49226호에 기술되어 있는 바와 같이 전구-서열 및 성숙한 Tgase 변이체를 동시에 발현시켰다.
실시예 3. 이. 콜리 에서의 Tgase 변이체의 발현
Tgase 발현 플라스미드를 보유하는 이. 콜리 BL21(DE3)의 단일 콜로니를 선별하여, 96 딥웰(deep well) 플레이트에서 1 mL의 LB에 접종하는 데에 사용하였다. 개시 배양물을 37 ℃, 400 rpm에서 밤새 성장시켰다. 다음날 아침, 100 μL의 개시 배양물을 1 mL의 배지에 접종하는 데에 사용하고, 30 ℃, 400 rpm으로 인큐베이팅하였다. 6-8시간 후, 0.1 mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하고, 온도를 20 ℃로 감소시켰다. 밤새 계속 성장시키고, 배양물은 용해시켜, -80 ℃에서 저장하였다.
실시예 4. Tgase 비활성의 측정
본 실시예에서는, 비색 히드록사메이트 활성 검정 (문헌 [Folk and Cole (1965) J Biol Chemistry 240(7):2951-2960])을 사용하여 Tgase 비활성을 측정하였다. 간단하게 말하자면, 히드록사메이트 검정은 N-카르보벤즈옥시-L-글루타미닐글리신 (Z-Gln-Gly 또는 CBZ-Gln-Gly)을 아민 수용체 기질로, 히드록실아민을 아민 공여체로 사용한다. 트랜스글루타미나제의 존재하에서, 히드록실아민은 혼입되어 Z-글루타밀히드록사메이트-글리신을 형성하며, 그것은 37 ℃에서 5-60분 동안 인큐베이션 후 525 nm에서 검출가능한 철(III)과의 착색된 착물을 발현한다. 보정은 표준으로서 L-글루탐산 γ-모노히드록사메이트 (밀리포어 시그마(Millipore Sigma) 사)를 사용하여 수행하였다. 1 단위의 Tgase는 분 당 γ-글루타밀히드록실아민의 펩티드 유도체 1 μmol 형성을 촉매하는, 시중에서 구입가능한 ELISA 키트 (제디라(Zedira) E021)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정되는 효소의 양으로 정의된다.
실시예 5. 단백질 기능성화 검정
하기 2종의 방법들 중 하나에 의해 Tgase 변이체에 의한 단백질 기능성화를 측정하였다: (1) 모노단실카다베린을 사용한 카세인의 형광원성 표지화; 및 (2) 콜라겐 플레이트상에의 형광 기질의 공유 고정. 모든 결과는 ELISA를 사용한 Tgase 농도에 대해 표준화하였다.
형광원성 카세인-표지화 검정
단실카다베린에 의한 카세인의 Tgase-촉매 표지화 (예컨대 시중에서 구입가능한 키트인 형광원성 활성 검정 키트 제디라 T036)를 사용하여 시간 경과에 따른 형광의 증가를 측정하는 것에 의해, 단백질 기질에 대한 활성 돌연변이들의 최초 속도를 측정하였다.
형광 콜라겐-표지화 검정
아민 공여체 염료. 총 부피 60 μL의 pH 7.4 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 중 Tgase 변이체 (0-0.33 % w/v)인 점증량의 Tgase 서열식별번호: 28의 존재하에서 TAMRA-카다베린 (1.7 g/L)을 콜라겐 플레이트 (코닝 바이오코트(Corning BioCoat) 콜라겐 I 다중웰 플레이트)에 공유 결합시켰다. Tgase의 부재하에 소 혈청 알부민 (BSA, 0.33 % w/v)을 함유하는 음성 대조군을 동시에 전개하였다. 플레이트를 37 ℃에서 16시간 동안 인큐베이팅하였다.
반응의 개요를 도 7에 도시하였다. 결과는 도 9에 나타내었다. 색상 제거-전 (상부 행) 및 PBS를 사용한 세척-후 (저부 행)로 웰들을 나타내었다.
글루타민 공여체 염료. pH 7.4의 PBS 중에서 서열식별번호: 28에 도시된 아미노산 서열을 가지는 Tgase의 존재하에 (0.05-0.3 % w/v) Cbz-Gln-Gly-TAMRA (2.5 g/L)를 콜라겐 플레이트 (코닝 바이오코트 콜라겐 I 다중웰 플레이트)에 결합시켰다. BSA를 함유하는 음성 대조군 (0.33 % w/v) 및 BSA 또는 Tgase의 부재하의 음성 대조군을 동시에 전개하였다. 플레이트를 37 ℃에서 16시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, PBS를 사용하여 플레이트를 세척함으로써, 임의의 잔류 비결합 염료를 제거하였다.
반응의 개요를 도 8에 도시하였다. 결과는 도 10에 나타내었다. 색상 제거-전 및 PBS를 사용한 세척-후로 웰들을 나타내었다.
실시예 6. 항미생물 활성 검정
최소 억제 농도 ( MIC ) 검정
효모 또는 세균 개시 배양물을 30 ℃ - 37 ℃에서 밤새 성장시켰다. 다음날, OD600을 사용하여 포화된 배양물의 세포 밀도를 계산하고, 배양물을 mL 당 105-108개 세포로 희석하였다. 96 웰 플레이트에서 희석된 개시물로부터 배양물 (100 μL)을 제조하였다. 돌연변이 또는 야생형 Tgase를 0.0001-1 중량%로 각 배양물에 첨가하였다. 배양물을 30 ℃ - 37 ℃에서 밤새 성장시키고, 바이오테크 시너지(BioTek Synergy) 플레이트 판독기에 의해 성장 곡선을 측정하였다. 다음날, 박타이터 글로(BacTiter Glo) (프로메가(Promega) 사, 제조자의 프로토콜에 따름)와 같은 세포 생존율 검정을 사용하여 Tgase를 사용한 적용 후의 세포 생존율을 평가하였다. 발광의 감소는 세포 생존율의 감소를 표시한다. 결과를 표 3에 나타내었다.
세포 성장 (OD 측정)
1 mg/L - 250 mg/L 범위 농도의 야생형 Tgase 또는 Tgase 변이체 존재하에 이. 콜리를 배양하였다. 더 낮은 광학 밀도 (OD) 측정치는 야생형 Tgase에 대비한 항미생물 효능의 향상과 상관된다.
Figure pct00005
실시예 7. 일광차단제-링커의 형성
옥시벤존 (0.25 mol), 톨루엔 (100 mL) 및 빙초산 (1 액적)을 기계식 교반기, 열전쌍 및 딘 스타크 트랩(dean stark trap)이 구비된 250 mL 삼목 플라스크에 충전하였다. 용융된 1,6-헥산디아민 (0.25 mol)을 플라스크에 첨가하고, 반응물을 밤새 환류하여 물을 제거하였다. HPLC에 의해 반응을 모니터링하였다. 감압하에서의 회전 증발에 의해 생성되는 옥시벤존-이민을 단리하고, 진공하에서 추가로 건조함으로써, 거의 정량 수율인 황색의 고체로서 이민 생성물인 2-(((6-아미노헥실)이미노)(페닐)메틸)-5-메톡시페놀을 산출하였다 (m/z 327.3). 개요를 도 5에 나타내었다.
실시예 8. 단백질에의 일광차단제-링커의 공유 부가
실시예 7의 이민 생성물 (1.6 g/L) 및 Cbz-Gln-Gly 디펩티드 (1.65 g/L)을 0.1 M 트리스(Tris)-HCl pH 8.0에 용해시켰다. 이민의 용해를 돕는 데에는, 디메틸 술폭시드 중 10 % 1:1 디클로로메탄을 사용하였다. Tgase (0.01 중량%)를 현탁액에 첨가하고, 일정하게 교반하면서 밤새 37 ℃에서 반응물을 인큐베이팅하였다. LCMS에 의해 이민에 대한 디펩티드의 Tgase 촉매 공유 부가를 확인하였다 (m/z 647.25). Tgase의 부재하에서는, 공유 부가가 관찰되지 않았다. 개요를 도 5에 나타내고, 결과를 도 6에 나타내었다. Tgase 변이체인 서열식별번호: 28은 야생형 Tgase 대비 활성에 있어서 11-배 향상을 나타내었다. Tgase의 부재하 (음성 대조군)에서는 생성물이 관찰되지 않았다.
아미노산 서열
서열식별번호: 1 스트렙토마이세스 모바라엔시스로부터의 야생형 Tgase
Figure pct00006
서열식별번호: 2 S199G S299V
Figure pct00007
서열식별번호: 3 H289V S299A
Figure pct00008
서열식별번호: 4 N282M H289T S299V
Figure pct00009
서열식별번호: 5 N282E H289V S299K
Figure pct00010
서열식별번호: 6 S284D H289L S299K
Figure pct00011
서열식별번호: 7 N282E H289I S299K
Figure pct00012
서열식별번호: 8 N282K G283A S299V
Figure pct00013
서열식별번호: 9 N282Q S284P H289E S299V
Figure pct00014
서열식별번호: 10 N282K G283A S284P S299V
Figure pct00015
Figure pct00016
서열식별번호: 11 N282R G283A S284E H289Q S299V
Figure pct00017
서열식별번호: 12 S199A S299A
Figure pct00018
서열식별번호: 13 S199A S299E
Figure pct00019
서열식별번호: 14 S199A S299K
Figure pct00020
서열식별번호: 15 S199A S299V
Figure pct00021
서열식별번호: 16 S199G S299A
Figure pct00022
서열식별번호: 17 S199G S299K
Figure pct00023
서열식별번호: 18 S2P S199A S299A
Figure pct00024
서열식별번호: 19 S2P S199A S299E
Figure pct00025
서열식별번호: 20: S2P S199A S299K
Figure pct00026
Figure pct00027
서열식별번호: 21 S2P S199A S299V
Figure pct00028
서열식별번호: 22 S2P S199G S299A
Figure pct00029
서열식별번호: 23 S2P S199G S299E
Figure pct00030
서열식별번호: 24 S2P S199G S299K
Figure pct00031
서열식별번호: 25 S2P S199G S299V
Figure pct00032
서열식별번호: 26 N282D G283A S284A S299V
Figure pct00033
서열식별번호: 27 S199G S299E
Figure pct00034
서열식별번호: 28 S2P
Figure pct00035
서열식별번호: 29 폴리히스티딘 태그를 가지는 야생형 Tgase
Figure pct00036
SEQUENCE LISTING <110> CURIE CO. INC. <120> TRANSGLUTAMINASE VARIANTS AND APPLICATIONS OF USE THEREOF <130> 12527.006WO1 <140> PCT/US2021/032217 <141> 2021-05-13 <150> 63/074,288 <151> 2020-09-03 <150> 63/024,398 <151> 2020-05-13 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 331 <212> PRT <213> Streptomyces mobaraensis <400> 1 Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met 1 5 10 15 Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn 20 25 30 Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg 35 40 45 Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys 50 55 60 Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu 65 70 75 80 Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn 85 90 95 Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val 100 105 110 Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu 115 120 125 Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser 130 135 140 Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys 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Lys Ser Trp Asn 305 310 315 320 Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro 325 330 <210> 25 <211> 331 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Asp Pro Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met 1 5 10 15 Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn 20 25 30 Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg 35 40 45 Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys 50 55 60 Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu 65 70 75 80 Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn 85 90 95 Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val 100 105 110 Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu 115 120 125 Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser 130 135 140 Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala 145 150 155 160 Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser 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Synthetic peptide <400> 31 Pro Lys Glu Lys 1

Claims (33)

  1. 위치 199에서의 아미노산 잔기 A 또는 G 및 위치 299에서의 아미노산 잔기 A, E, K 또는 V의 치환을 포함하는, 서열식별번호: 1에 도시된 트랜스글루타미나제 효소 아미노산 서열의 변이체.
  2. 제1항에 있어서, N-말단 메티오닌 잔기, C-말단 히스티딘 폴리히스티딘 서열 및/또는 전구-서열을 추가로 포함하는 트랜스글루타미나제 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 위치 2에서의 아미노산 잔기 C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, Y의 치환을 추가로 포함하는 트랜스글루타미나제 변이체.
  4. 제3항에 있어서, N-말단 메티오닌 잔기, C-말단 히스티딘 폴리히스티딘 서열 및/또는 전구-서열을 추가로 포함하는 트랜스글루타미나제 변이체.
  5. 위치 282에서의 아미노산 잔기 D, E, K, M, R 또는 Q, 위치 289에서의 아미노산 잔기 E, I, L, T, Q 또는 V, 및 위치 299에서의 아미노산 잔기 A, E, K 또는 V의 치환을 포함하는, 서열식별번호: 1에 도시된 트랜스글루타미나제 효소 아미노산 서열의 변이체.
  6. 제5항에 있어서, N-말단 메티오닌 잔기, C-말단 히스티딘 폴리히스티딘 서열 및/또는 전구-서열을 추가로 포함하는 트랜스글루타미나제 변이체.
  7. 서열식별번호: 2-27 중 어느 것에 도시된 아미노산 서열을 포함하는, 서열식별번호: 1에 도시된 트랜스글루타미나제 효소 아미노산 서열의 변이체.
  8. 제7항에 있어서, N-말단 메티오닌 잔기, C-말단 히스티딘 폴리히스티딘 서열 및/또는 전구-서열을 추가로 포함하는 트랜스글루타미나제 변이체.
  9. 서열식별번호: 2-27에 도시된 아미노산 서열 중 어느 것에 대하여 적어도 약 90 %의 서열 동일성을 가지는 서열 또는 서열식별번호: 2-27에 도시된 아미노산 서열 중 어느 것의 원형 퍼뮤턴트를 포함하며, 변이체가 서열식별번호: 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 트랜스글루타미나제 효소에 비해 적어도 약 2-배 더 큰 트랜스글루타미나제 효소 활성을 포함하는 것인 트랜스글루타미나제 효소.
  10. 제9항에 있어서, N-말단 메티오닌 잔기, C-말단 히스티딘 폴리히스티딘 서열 및/또는 전구-서열을 추가로 포함하는 트랜스글루타미나제 변이체.
  11. 변이체를 포함하지 않는 동일한 제품에 비해 1종 이상 미생물의 성장을 방지하거나 감소시키는 데에 효과적인 양으로 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 트랜스글루타미나제 변이체를 제품에 혼입하는 것을 포함하는, 제품의 저장 수명을 증가시키는 방법.
  12. 변이체를 포함하지 않는 동일한 제품에 비해 제품의 저장 수명을 증가시키는 데에 효과적인 양으로 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 트랜스글루타미나제 변이체를 포함하는 제품.
  13. 제12항에 있어서, 개인 관리, 가정용, 산업용, 식품, 약제, 화장품, 건강관리, 상처 관리, 해양, 페인트, 코팅, 에너지, 플라스틱, 포장, 직물, 가죽 또는 농업용 제품인 제품.
  14. 제13항에 있어서, 막대 비누, 액체 비누, 손 살균제, 수술전 피부 소독제, 세척용 와이프, 소독용 와이프, 바디 워시, 여드름 치료 제품, 항진균 기저귀 발진 크림, 항진균 피부 크림, 샴푸, 컨디셔너, 화장품, 탈취제, 항미생물 크림, 바디 로션, 핸드 크림, 국소용 크림, 애프터셰이브 로션, 스킨 토너, 구강 세척제, 치약 및 일광차단 로션에서 선택되는 개인 관리 제품인 제품.
  15. 제13항에 있어서, 상처 치유 연고, 크림 및 로션, 상처 피복제, 화상 상처 크림, 붕대, 테이프 및 스테리-스트립에서 선택되는 상처 관리 제품인 제품.
  16. (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 트랜스글루타미나제 변이체, 서열식별번호: 1, 28 또는 29에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 트랜스글루타미나제 효소, 및/또는 리실 옥시다제 효소; 및 (ii) 일광차단 분자, 색소 또는 염료 분자, 또는 기능성 성분 분자를 포함하는, 트랜스글루타미나제 또는 리실 옥시다제 효소의 기질을 포함하는 효소 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 일광차단 분자, 색소 또는 염료 분자, 또는 기능성 성분 분자가 유리 아미노 기를 포함하는 분자에 접합된 것인 효소 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 유리 아미노 기를 포함하는 분자가 화학식 R(CH2)n(NH2)의 지방족 아민으로부터 유래되며, 여기서 n은 1 내지 30의 정수이고, R은 기능성 성분인 효소 조성물.
  19. 제18항에 있어서, n이 5 내지 10의 정수인 효소 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 유리 아미노 기를 포함하는 분자가 리신, 카다베린, 푸트레씬, 히드라진, 아디프산 디히드라지드, 세바스산 디히드라지드 및 헥사메틸렌디아민으로부터 유래되는 것인 효소 조성물.
  21. 제16항에 있어서, 일광차단 분자, 색소 또는 염료 분자, 또는 기능성 성분 분자가 유리 글루타민 측쇄를 가지는 아미노산, 펩티드 또는 단백질에 접합된 것인 효소 조성물.
  22. 제16항에 따른 효소 조성물을 포함하는 화장품 조성물.
  23. 관심 재료 또는 단백질을 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 트랜스글루타미나제 변이체, 서열식별번호: 1, 28 또는 29에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 트랜스글루타미나제 효소, 및/또는 리실 옥시다제 효소, 및 색소 또는 염료 분자와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 트랜스글루타미나제 또는 리실 옥시다제 효소는 관심 재료 또는 단백질에 색소 또는 염료 분자를 공유 결합시키는 데에 효과적인 양으로 존재하는 것인, 관심 재료 또는 단백질에 색상을 결합시키는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 관심 단백질이 피부에 존재하는 단백질인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 피부에 존재하는 단백질이 콜라겐, 케라틴 및/또는 엘라스틴을 포함하는 것인 방법.
  26. 제품과 접촉되었을 때 관심 단백질 또는 단백질-, 펩티드- 또는 아미노산-함유 재료상에 기능성 성분 또는 색상 분자를 부가하는 데에 효과적인 양으로 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 트랜스글루타미나제 변이체, 서열식별번호: 1, 28 또는 29에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 트랜스글루타미나제 효소, 및/또는 리실 옥시다제 효소를 포함하는 제품.
  27. 제26항에 있어서, 개인 관리, 화장품, 직물, 가죽, 식품 또는 농업용 제품인 제품.
  28. 관심 단백질 또는 재료를 제26항에 따른 제품과 접촉시키는 것을 포함하는, 관심 단백질 또는 재료의 색상을 변형시키는 방법.
  29. 1종 이상 항미생물 효소, 펩티드 또는 단백질과의 조합으로 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 트랜스글루타미나제 변이체를 포함하며, 보존, 살생물, 항미생물 또는 살바이러스 활성을 포함하는 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 항미생물 효소, 펩티드 또는 단백질이 리소자임, 키티나제, 리파제, 리신, 리소스타핀, 글루카나제, DNase, RNase, 락토페린, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 락토나제, 아실라제, 디스페르신 B, a-아밀라제, 셀룰라제, 니신, 박테리오신, 시데로포어, 폴리믹신 및 데펜신에서 선택되는 것인 조성물.
  31. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 트랜스글루타미나제 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 박테리오파지.
  32. 제31항에 따른 박테리오파지를 포함하며, 항미생물 활성을 포함하는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
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