KR102108836B1

KR102108836B1 - 지오바실러스 속 js12 균주 유래 폴리펩티드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102108836B1
Application number: KR1020180147480A
Authority: KR
Inventors: 전숭종; 박대규
Original assignee: 동의대학교 산학협력단
Priority date: 2018-11-26
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2020-05-11

Abstract

본 발명은 지오바실러스 속 JS12 균주에서 유래된 것으로 신규한 폴리펩티드와 이의 피부 미백 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 폴리페놀 산화 효소 또는 라카아제 효소로의 활성이 뛰어날 뿐만 아니라, 피부에 표출된 각질층의 멜라닌을 직접 탈색 및 분해하여 단기간에 미백효과를 볼 수 있고, 또한 멜라닌에 특이적으로 작용하기 때문에 부작용 및 독성 효과를 방지할 수 있다.

Description

지오바실러스 속 JS12 균주 유래 폴리펩티드 및 이의 용도{Novel polypeptide derived from Geobacillus sp. JS12 strain and use thereof}

본 발명은 지오바실러스 속 JS12 균주 유래 신규한 폴리펩티드와 이의 다양한 용도에 관한 것이다.

피부는 신체조직 중 직접적으로 외부환경에 노출되어 있으며, 인체의 내부와 외부환경 사이의 방어벽 역할을 하여 화학물질이나 자외선을 포함한 외부 환경오염 물질 및 미생물의 침입을 방어함으로써 주위환경으로부터 생체를 보호한다. 또한 피부는 멜라닌, 헤모글로빈(hemoglobin), 카로틴(carotene) 등에 의해 색이 결정되는데 이 중에서도 멜라닌이 가장 중요한 역할을 한다. 멜라닌은 사람의 피부색을 결정하는 것 이외에도 자외선 흡수 작용, 자유 라디칼 소거제(free radical scavenger) 등과 같은 피부 보호 작용을 수행한다. 그러나 자외선의 과다 노출, 대기 오염, 스트레스 등과 같은 외부의 환경 변화에 의하여 멜라닌이 과다하게 생성되면 피부 내에서 색소 침착 현상을 일으켜 피부의 흑화(melanism) 또는 기미, 주근깨 등의 원인이 된다. 멜라닌이 국소적으로 과도하게 합성되거나, 피부 병변 및 노화에 따른 피부의 생리 기능이 떨어지게 되면, 멜라닌이 피부 표면에 침착되어 기미, 주근깨 및 다양한 색소 침착을 유발하게 된다. 상기한 바와 같이 피부 흑화의 원인과 기작이 밝혀지면서, 미백 화장료의 제조에 있어 피부 흑화 과정에 관여하는 효소인 티로시나아제의 활성 저해 효과를 갖는 물질들을 화장료에 배합하거나, 또는 멜라닌 생성 과정 중에서 일부 반응을 저해함으로써 멜라닌의 생성을 감소시키는 방법이 일반적으로 사용되고 있다

멜라닌(melanine)은 동물, 식물, 곤충, 세균 및 곰팡이에 널리 존재하며 주로 외부 스트레스로부터 세포를 보호하는 기능을 수행한다. 구체적으로, 상기 동물의 경우 자외선으로부터 피하조직을 보호하고, 식물의 경우 세포벽의 구성 성분에 해당하며 곤충의 경우 표피 강화제로서 기능하며, 세균의 경우 항생제 저항성을 갖도록 하고 곰팡이의 경우 식물병 발생원으로서 기능하는 것으로 보고되어 있다. 상기 멜라닌은 멜라노사이트(melanocyte)의 멜라노솜(melanosome)으로부터 생성된다. 상기 멜라노솜에 생성된 멜라닌 과립은 멜라노솜 내에 포함된 상태로 수지상돌기의 말단으로 이동하며, 멜라노솜이 함유된 수상돌기의 말단은 각질형성세포(keratinocyte)의 식세포작용에 의해 각질형성세포로 전달된 후, 상기 각질형성세포의 핵 주위에 축적된다. 상기 멜라닌 과립의 이동 과정에 영향을 미치는 요인은 호르몬 및 자외선 등이 존재하나 일차적으로 유전적인 영향이 크게 작용한다.

피부 미백제는 알부틴, 식물유래 추출물인 감초 추출물, 닥나무 추출물 등의 티로시나제(tyrosinase) 저해제가 대부분을 차지하고, 항산화제(비타민 C), 활성산소 제거제(코엔자임 Q10, SOD, 비타민 E) 등의 기존 고시 미백제들이 제품화되고 있지만, 미백 효과를 보기 위해서는 오랜 기간(1~2개월)이 소요되고, 최근에는 이들 성분들은 멜라닌 생성 억제작용 외에 피부괴사, 피부 세포 독성, 색소 세포 변성, 피부 자극 유발 등의 심각한 부작용을 동반하는 것으로 알려져 있다.

이에, 피부에 더욱 안전하고 멜라닌 구조에 근거한 특이적 고활성을 지닌 신규 피부 미백제가 필요로 되는 실정이다.

본 발명의 일 목적은 폴리페놀 산화 효소의 활성을 갖는 지오바실러스 속 JS12 균주 유래 신규한 폴리펩티드를 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 폴리펩티드를 포함하는 폴리페놀 산화 효소(polyphenol oxidase)를 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 폴리펩티드를 포함하는 라카아제(laccase) 효소를 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 폴리펩티드를 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 폴리펩티드를 포함하는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 지오바실러스 속 JS12 균주(Geobacillus sp. JS12 strain)로부터 유래된 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 폴리펩티드는 폴리페놀 산화 효소(polyphenol oxidase) 또는 라카아제(laccase) 효소의 활성을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체를 의미하며, 보통 소수의 아미노산이 연결된 형태를 펩티드라 부르고 많은 아미노산이 연결되면 단백질로 부른다. 단백질을 이루고 있는 약 20 종류의 아미노산들이 화학결합을 통해 서로 연결되어 폴리펩티드를 만든다. 본 발명의 폴리페놀 산화 효소(polyphenol oxidase) 또는 라카아제(laccase) 효소의 활성을 가지는 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리페놀 산화 효소(polyphenol oxidase; PPO)"는 모노페놀 모노옥시제네이즈 또는 클로로플라스틱이라고도 불리우며, 벤젠 고리에 하나의 하이드록실 치환기를 포함하는 모노페놀 분자의 o-하이드록실레이션(o-hydroxylaiton)을 촉매화한다. 상기 폴리페놀 산화 효소는 o-디페놀을 산화하여 o-퀴논을 형성하기도 한다. 아미노산 티로신은 단일 페놀 고리를 포함하고 있는데, 이는 상기 폴리페놀 산화 효소에 의해 산화되어 o-퀴논을 형성할 수 있다. 따라서, 상기 폴리페놀 산화 효소를 티로시네이즈로 간주한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "라카아제(Laccases)(EC 1.10.3.2)"는 구리를 포함하는 산화 효소로, 식물, 진균 및 미생물에서 발견된다. 라카아제는 페놀 또는 그 유사 화합물에 대하여 작용하여 하나의 전자 산화(one-electron oxidations)를 수행한다. 라카아제는 자연적으로 발생하는 페놀계에 해당하는 모노리그놀(monolignols)의 산화적 커플링을 촉진하여 리그닌을 형성한다. 하지만, 플레우로투스 오스트게아투스(Pleurotus ostreatus)로부터 생산되는 다른 라카아제의 경우 리그닌을 파괴하는 바, 리그닌-변형 효소로 분류된다. 라카아제는 효소 활성을 위하여 2차 기질로 산소를 요구한다.

본 발명에서 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 천연형 아미노산 서열을 갖는 펩티드뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 펩티드의 변이체란, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 펩티드를 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press,New York, 1979).

또한, 본 발명에서 경우에 따라서는 상기 폴리펩티드가 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 펩티드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and MolecularPrinciples, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989). 또한 본 발명의 펩티드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩티드'라 함은 본 발명에 따른 펩티드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.

본 발명에서 상기 유전공학적 방법에 의해 제조된 폴리펩티드 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드는 예를 들면 추출법, 재결정법, 다양한 크로마토크래피(겔 여과법, 이온 교환, 침전, 흡착, 역전상), 전기영동, 역류 분배법 등 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명에서 상기 폴리펩티드는 금속 이온을 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 금속 이온은 코발트 이온(Co²⁺) 또는 구리 이온(Cu²⁺)인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 코발트 이온(Co²⁺)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현 에에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "폴리뉴클레오티드"란 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로, 일반적으로 일정한 길이 이상의 DNA(deoxyribonucleic acid)나 RNA(ribonucleic acid) 가닥을 의미한다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그럼으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는, 플라스미드가 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주 세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.

본 발명에서는 상기 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "형질 전환"은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 용어, "형질 전환된 숙주 세포"은 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함된다. 상기 미생물은 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주, 보다 상세하게는 에스케리치아 콜라이(대장균, Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillussubtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포이거나, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichiapastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라크라사(Neurosporacrassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 숙주 세포로부터 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기와 같이 발현된 폴리펩티드를 CuSO₄ 또는 CoSO₄로 전처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서 상기 CuSO₄ 또는 CoSO₄는 상기 폴리펩티드에 대하여 1 내지 10 등가물(equivalents)의 양으로 첨가될 수 있고, 바람직하게는 3 내지 7 등가물의 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는 폴리페놀 산화 효소에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 지오바실러스 속 JS12 균주(Geobacillus sp. JS12 strain), 이의 배양물, 이의 배양액 또는 상기 배양액 유래 추출물을 유효 성분으로 포함하는 폴리페놀 산화 효소에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "배양물"이란 미생물을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 미생물이 포함되는 개념이다.

본 발명에서 배양물은 본 발명의 균주를 배지에서 배양시킨 후 얻어진 산물로서, 상기 배지는 방선균 배양에 사용되는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 GYSM 배지, 흄산 한천 배지(Humic acid agar medium), 베네트 한천 배지(Bennett's agar medium) 또는 맥아 추출 한천 배지(Malt extract agar medium)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 "배양액"이란 미생물을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 미생물이 포함되지 않는 개념이다.

본 발명에서 배양액은 소정의 균주를 배지에서 배양시킨 후 여과 또는 원심분리 등을 통해 균체를 제거한 액상의 산물로서, 상기 배지는 방선균 배양에 사용되는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 선택될 수 있으며, 예를 들어 GYSM 배지, 흄산 한천 배지(Humic acid agar medium), 베네트 한천 배지(Bennett's agar medium)일 수 있다.

본 발명에서 상기 여과의 방법은 특별히 제한하지 않으며 예를 들면 1 회내지 10회, 1회 내지 5회 또는 1회 내지 3회 수행될 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 여과는 포어 사이즈가 5 내지 10 μm인 여과지를 사용하여 수행될 수 있고, 혹은 포어 사이즈가 0.1 내지 1.0 μm인 필터를 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 배양액 추출물은 당업계에 공지된 통상의 추출 방법, 예를 들어 용매 추출법을 사용하여 제조될 수 있다. 여기서, 상기 용매 추출법에 이용되는 추출 용매는 물, 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) 또는 이들의 혼합물인 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 다이에틸에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 다이클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이중 물, 알코올, 함수 알코올, 다이에틸에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 클로로포름 또는 헥산에서 선택될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 상기 추출 용매로 함수 알코올을 사용하는 경우 알코올 함량은 50~90%인 것이 바람직하고, 60~85%인 것이 더 바람직하다. 한편, 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 배양액 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 본 발명에서 상기 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 다른 추출 방법을 통해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 이산화탄소를 이용한 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리 또는 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등과 같이 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

본 발명에서 상기 지오바실러스 속 JS12 균주(Geobacillus sp. JS12 strain), 이의 배양물, 이의 배양액 또는 상기 배양액 유래 추출물은 효소 활성을 높이기 위하여, CuSO₄ 또는 CoSO₄로 전처리된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는 라카아제 효소에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 지오바실러스 속 JS12 균주(Geobacillus sp. JS12 strain), 이의 배양물, 이의 배양액 또는 상기 배양액 유래 추출물을 유효 성분으로 포함하는 라카아제 효소에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 지오바실러스 속 JS12 균주의 배양물, 배양액 또는 배양액 유래 추출물은 상기 본 발명의 폴리페놀 산화 효소에 기재한 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는 항산화제에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "항산화"라 함은 세포 내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 지오바실러스 속 JS12 균주(Geobacillus sp. JS12 strain), 이의 배양물, 이의 배양액 또는 상기 배양액 유래 추출물을 유효 성분으로 포함하는 항산화제에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 폴리펩티드는 피부에 표출된 각질층의 멜라닌을 직접 탈색 및 분해하여 단기간에 미백효과를 볼 수 있고, 또한 멜라닌에 특이적으로 작용하기 때문에 부작용 및 독성 효과를 방지할 수 있다.

본 발명에서, "예방"은 본 발명의 조성물을 이용하여 항산화, 피부 미백 또는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명에서, "개선"은 본 발명의 조성물을 이용하여 항산화, 피부 미백 또는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 조성물을 이용하여 항산화, 피부 미백 또는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 피부 색소 질환은 과다색소침착에 기인한 질환으로, 피부 또는 손발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검거나 어둡게 되는 질환을 의미한다. 바람직하게는 상기 피부 색소 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 잡티, 모반 또는 일광흑색증(solar lentigines) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 약학, 화장료 또는 식품 조성물의 다양한 용도로 이용될 수 있으며, 바람직하게는 약학 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 지오바실러스 속 JS12 균주(Geobacillus sp. JS12 strain), 이의 배양물, 이의 배양액 또는 상기 배양액 유래 추출물을 유효 성분으로 포함하는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 과다색소침착에 기인한 색소 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 잡티, 모반 또는 일광흑색증(solar lentigines) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "피부 개선"은 피부 미백 효과를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "미백 효과"라 함은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 말한다.

본 발명에서 상기 피부 미백용 조성물은 약학, 화장료 또는 식품 조성물의 다양한 용도로 이용될 수 있으며, 바람직하게는 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 지오바실러스 속 JS12 균주(Geobacillus sp. JS12 strain), 이의 배양물, 이의 배양액 또는 상기 배양액 유래 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 피부 개선은 피부 미백, 주름 개선, 탄력 증진, 및/또는 피부 보습 효과를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 피부 미백일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기한 바와 같이 본 발명에 따른 각 용도의 조성물은 약학 조성물로 사용할 수 있다. 여기서 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.

본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기한 바와 같이 본 발명에 따른 각 용도의 조성물은 화장료 조성물로 사용할 수 있다. 여기서 상기 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.

상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.

지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.

그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.

본 발명에 있어서, 상기한 바와 같이 본 발명에 따른 각 용도의 조성물은 식품 조성물로 사용할 수 있다. 여기서 상기 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.

여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.

그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에서 제공하는 폴리펩티드는 폴리페놀 산화 효소 또는 라카아제 효소로의 활성이 뛰어날 뿐만 아니라, 피부에 표출된 각질층의 멜라닌을 직접 탈색 및 분해하여 단기간에 미백효과를 볼 수 있고, 또한 멜라닌에 특이적으로 작용하기 때문에 부작용 및 독성 효과를 방지할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 지오바실러스 속 JS12 균주 유래 단백질 서열과, 아녹시바실러스 플라비터모스(Anoxybacillus avithermus)(GenBank accession No., OAO77760) 유래 MCO, 지오바실러스 속 12AMORI(Geobacillus sp. 12AMORI)(GenBank accession No., AKM18217) 유래 MCO, 지오바실러스 스테아로터모필러스(Geobacillus stearothermophilus)(GenBank accession No.,WP033009147) 유래 MCO를 Clustal W 온라인 툴(Clustal W online tool)을 이용하여 다중 서열 배치 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 박스 표시는 2dMCO의 쿠프레독신(cupredoxin) 도메인을 나타낸 것이고, 별표(*)는 그 위치에서 잔기가 정확히 같은 것을 의미하며, 콜론(:)은 그 위치에서 잔기가 매우 유사한 것을 의미하고, 점(.)은 잔기가 더 혹은 덜 유사한 것을 의미한다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 본 발명의 폴리펩티드(GPPO)의 발현과 정제를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 레인 M은 분자량 마커이고, 레인 1은 조추출물 유래 세포이며; 레인 2는 70℃에서 20분 동안 열 처리 후 얻어진 조추출물의 상청액이고; 레인 3은 고정화 금속 친화 크로마토그래피의 피크 분율(peak fraction)에 관한 것이다. 겔은 쿠바시 브릴리언트 블루 R-250으로 염색되었다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 구리 또는 코발트에 대한 효소 활성의 의존도를 나타낸 것으로, 분석 조건은 50mM 소디움 아세테이트, pH 4.5, 1mM ABTS, 및 이 양이온의 농도는 다양하게 조절하였다. 여기서 ○는 Cu²⁺의 결과이고; ●는 Co²⁺의 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 pH 및 온도에 대한 효소 활성의 의존도를 나타낸 것으로, 도 4(A)는 효소 활성의 pH 의존도를 나타낸 것이며, 여기서 ●는 ABTS 결과이고; ○는 DMP 결과이다. 도 4(B)는 효소 활성의 온도 의존도를 나타낸 것이며, 여기서 ●는 ABTS 결과이고; ○는 DMP 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 본 발명의 재조합 폴리펩티드(GPPO)의 열 안정성을 나타낸 것으로, 도 5(A)는 효소를 1mM CuSO₄의 존재 하에서, 도 5(B)는 효소를 1 mM CoSO₄의 존재 하에서, 65℃(●), 70℃(■), 75℃(◆), 80℃(▲), 85℃(▼), 90℃(★)의 온도 하에서 다양한 시간 동안 배양한 결과이다. 여기서 시료의 잔류 활성은 70℃ 및 pH 4.5의 조건 하에서 측정되었다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 본 발명의 폴리펩티드(GPPO)를 합성 멜라닌과 37℃에서 8일간 반응시키면서 멜라닌 탈색율을 나타낸 결과이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

화학 물질, 균주 및 플라스미드의 준비

DNA 프라이머(primer)와 기질(substrate)은 Bioneer (Daejeon, Korea)로부터 준비하였다. Taq DNA 폴리머라제(Taq DNA polymerase)는 Takara (Tokyo)로부터 구매하였으며, 라카아제(laccase) 활성을 분석하는데 사용되는 화학 물질들은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 얻었다. E. coli DH5α 및 SoluBL21(DE3)™ (Novagen, Inc., San Diego, CA, USA) 각각은 클로닝과, 발현 숙주 세포로 사용되었다. 플라스미드 pET-21a는 Novagen으로부터 구입하였고, 라카아제를 위한 발현 벡터로 사용되었다.

효소의 구조

Geobacillus sp. JS12 균주는 J. Biotechnol. 230 (2016) 28-29에 개시된 바에 따라 배양하였다. Geobacillus sp. JS12의 염색체 DNA(chromosomal DNA)는 GeneAll® GENEx 게놈 키트 (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 준비하였다. 상기 Geobacillus sp. JS12 균주로부터 라카아제-유사 유전자를 얻기 위하여, 2가지 프라이머 (프라이머 1: 5′-TGGGTTCAAATGGGACGG CAG-3′; 및 프라이머 2: 5′-CCGCTCGAGTCAGCGTAGAAAAACTGA AAG-3′, 프라이머 2에서 Xho I 부위는 밑줄 친 부분에 해당한다)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 여기서 상기 2가지 프라이머는, Geobacillus sp. JS12 균주의 게놈으로부터 라카아제-유사 단백질(laccase-like protein)(GeneBank accession No. AMQ19926)의 개방형 판독 틀(open reading frame; ORF)에 근거하여 설계하였다. PCR 증폭은 Pfu DNA 폴리머라제를 이용하여, 95℃에서 20초, 60℃에서 20초를 30회 반복하고, 72℃에서 30초, 30회 반복 하며 수행되었다. 그 후, 플라스미드 pET-21a를 Nde I로 처리하고, 점착 말단(cohesive ends) 부분을 채우기 위하여 T4 DNA 폴리머라제를 처리한 뒤, Xho I으로 처리하였다. 증폭된 PCR 산물 (0.47-kbp)을 Xho I (Xho I 부위는 프라이머 2의 밑줄 친 부분에 해당한다)로 처리하고, pET-21a 벡터에 삽입시켰다. 삽입된 유전자의 뉴클레오티드 서열은 ABI 3730XL DNA 분석기 (Thermo Fisher Scientic, USA)를 이용하여 다시금 확인하였다.

재조합 단백질의 발현 및 정제

발현 플라스미드를 하버링(harboring)하는 E. coli SoluBL21(DE3)™ 세포를 암피실린 (100μgml1)을 포함하는 Luria-Bertani (LB) 배지에서 OD600가 대략 0.5가 되도록 배양한 뒤, 0.3mM 이소프로필 β-D-티오갈락토시드(isopropyl β-D-thiogalactoside; IPTG)를 이용하여 25℃에서 16 시간 동안 유전자 발현을 유도하였다. 재조합 효소를 발현하는 E. coli 세포는 원심 분리하여 수확한 뒤, -70℃에서 냉동시켰다. 그 후, 재부유 버퍼(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 500mM NaCl)에서 초음파 분해에 의해 해동된 세포를 파괴시켰다. 파괴된 세포의 현탁액은 27,000 × g에서 30분간 원심 분리한 뒤, 상청액 분획(supernatant fraction)을 70℃에서 20분 동안 열처리 하면서 재원심 분리(recentrifugation)하였다. 이후, 상청액을 코발트 기반 고정화 금속 친화 크로마토그래피(immobilized metal anity chromatography; IMAC) (HiTrap TALON crude, GE Healthcare)에 적용한 뒤, 재부유 버퍼의 적어도 5 컬럼 부피(column volumes; CV)로 세척하였다. AKTAstart (GE Healthcare)를 사용하여 재부유 버퍼에서 0-250mM 이미다졸(imidazole)의 순차적 농도 구배에 의해 2mlmin1의 유속으로 GPPO 단백질을 추출하였다. 각 분획의 부분 표본(aliquot)을, 70℃의 온도 하에서 소디움 아세테이트 버퍼(sodium acetate buer) (pH 4.5), 2,2′-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid))(ABTS) 및 1mM CoSO₄를 포함하는 반응 혼합물 1ml 내에서 반응시켰다. 활성 분획을 풀링(pooling)하고, 농축한 뒤 GPPO 몰당 CuSO₄ 또는 CoSO₄의 5 등가물로 30분간 반응시켰다. 초과의 구리 또는 코발트는 용액을 SephadexG-25 컬럼(PD 10columns; GE healthcare)을 통과시켜 제거하였다. 단백질의 순도는 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)으로 확인하였다. Bio-Rad 단백질 분석 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)에 의해 단백질의 농도를 정량하였다.

초원심분리(ultracentrifugation)에 의한 분석

GPPO (1.0mgml1)의 침강 계수 분포(sedimentation coecient distribution)를 분석하기 위하여, 50mM Tris-HCl (pH 7.5) 및 1mM CoSO₄에서 4-홀 An-60Ti 로터를 포함하는 Beckman Coulter Proteome Lab XL-I (Beckman Coulter, Inc.)의 분석용 초원심분리기를 사용하였다. 12-mm 더블-섹터 셀(double-sector cells)에서 35,000rpm, 20℃ (측정된 셀의 반경은 5.9cm 내지 7.15cm에 해당함), 흡광도 280nm에서 침강을 측정하기 위하여 연속적 스캔 모드(continuous scan mode)를 적용하였다. c(s) 모드에서 데이터를 프로그램 Sedfit로 분석하여 침강 계수 분포를 나타내었다.

UV-가시 스펙트라(UV-visible spectra) 및 ICP-MS 분석

정제된 단백질을 (1.0mgml1) 구리 및 코발트 포함 버퍼(50mM Tris-HCl, pH 7.5)에 대하여 투석하였다. 투석된 단백질의 자외선-가시 (UV-Vis) 흡광도 스펙트라를 상온에서 UV-Vis 분광 광도계(spectrophotometer)(UV-1800, Shimadzu, Japan)를 이용하여 측정하였다. 투석된 효소 내 구리 및 코발트의 양은 효소 50μg을 0.5% (v/v) HNO₃ 5ml로 희석시켜 확인하였다. 용액은 한국 기초과학지원연구소(Seoul center, KBSI)에서 유도 결합 플라즈마 질량 분석기(inductively coupled plasma mass spectrometry; ICP-MS)로 분석하였다.

효소 분석

ABTS (ε420 = 36,000M1cm1), 2,6-디메톡시페놀(2,6-dimethoxyphenol) (DMP) (ε468 =35,645M1cm1), 시린갈다진(syringaldazine)(SGZ) (ε525=65,000M1cm1) 및 구아이아콜(guaiacol)(ε465=12,000M1cm1)의 산화로 인하여 파장에서 흡광도의 증가를 모니터링하며 라카아제의 활성을 분석하였다. 효소 용액의 등가물은 소디움 아세테이트 버퍼 (pH 4.5-5.5), 기질 및 1mM 금속 이온 (CuSO₄ 또는 CoSO₄)를 포함하는 반응 혼합물 1ml에서 70℃의 온도 하에서 반응시켰다. 효소 활성의 한 단위는 분당 기질 1μM을 산화시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다. 모든 분석은 3회 반복하여 수행하였다.

최적의 온도 및 pH 조절

활성의 온도 의존성은 온도 30 내지 100℃에서 50mM 소디움 아세테이트, pH 4.5 및 5.5, ABTS 및 DMP 각각을 이용하여 분석하였다. 반응의 최적 pH는 이하의 버퍼를 사용하여 1.0 내지 9.0 pH 하에서 활성을 모니터링하며 분석하였다: pH 1.0-2.5를 위한 50mM의 염산-포타슘 버퍼; pH 2.5-3.0를 위한 50mM의 글리신(glycine)-HCl 버퍼; pH 3.0-5.5를 위한 50mM의 소디움 아세테이트 버퍼; pH 5.5-7.0를 위한 50mM의 소디움 포스페이트 버퍼; pH 7.0-9.0를 위한 50mM의 Tris-HCl. 효소의 열 안정성은 효소 용액을, 기질을 포함하는 50mM 소디움 아세테이트 버퍼 (pH 4.5) 및 1mM CuSO₄ 또는 CoSO₄에서 다양한 온도 하에서 전-처리함으로써 측정하였다. 또한 기질로 ABTS를 사용하여 라카아제 활성 분석 하에서 잔류 활성(residual activities)을 분석하였다.

동적 계산(kinetic calculations)

기질 산화의 비율을 다양한 기질의 몰당 소멸 계수(molar extinction coecients)를 사용하여 분광 광도계(spectrophotometry)를 이용하여 측정하였다. 여기서, 상기 다양한 기질의 몰당 소멸 계수는 70℃의 온도 하에서 50mM 소디움 아세테이트 버퍼 (pH 4.5-5.5)에서 측정되었다. 본 실험에서 보고되는 동적 값(kinetic values)는 공기-포화된 용액에서 측정된 것이다. 동적 분석을 위하여, ABTS (0.005-1.5mM) 및 DMP (0.005-1.25mM)를 다양한 농도로 사용하였다. Km 값은 초기 속도(initial velocity)를 이용하여 측정하였고, apparent kcat은 kcatt = Vmax/[enzyme]로부터 측정하였다. 모든 동적 분석은 적어도 2번 수행하였고, 동적 데이터는 EZ-Fit 프로그램의 Michaelis-Menten 식(equation)에 의해 계산되었다.

효소 활성에 있어 억제제 및 금속 이온의 영향

효소 활성에 있어 잠재적 억제제의 영향은 50mM 소디움 아세테이트 버퍼 (pH 4.5) 내에서 1mM ABTS를 기질로 사용하고, 억제제의 존재 하에서 분석하였다. 효소의 활성에 있어 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), L-시스테인(L-cysteine), 소디움 아자이드(sodium azide; NaN₃), 트로폴론(tropolone), p-쿠마리산(p-coumaric acid), 및 에틸렌 디아민 테트라아세트산(ethylene diamine tetraacetic acid; EDTA)의 영향은 효소를 상기 다양한 억제제와 70℃에서 10분 동안 반응시킨 뒤 측정하였다. 효소의 활성에 있어 금속 이온의 영향은 각각의 금속 이온(1mM)을 포함하는 정제된 효소를 50mM 소디움 아세테이트 버퍼 (pH 4.5) 내에서 25℃에서 1시간 동안 전-반응 시킨 뒤 측정하였다. 이후, 기질인 ABTS (1mM)를 첨가한 뒤 효소 활성을 전술한 표준 조건 하에서 측정하였다.

합성멜라닌의 탈색

멜라닌 탈색 활성은 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.5) 0.8 ml, 합성멜라닌 (0.2 mg/ml) 0.1 ml 및 효소액 0.1 ml을 혼합하여 37°C 에서 8 일간 반응하였다. 멜라닌의 탈색율은 540 nm 에서 흡광도를 측정하여 다음 공식에 따라 구하였다.

탈색 (%)=[(초기 흡광도)-(반응후 흡광도)]/(초기 흡광도)X100

라카아제 유사 유전자의 동정

Geobacillus sp. JS12 게놈 서열에서, 가상 단백질(hypothetical protein)을 코딩하는 개방형 판독 틀(ORF)(No. AMQ19926)을 확인하였다. 유전자는 예상 분자량이 17.2kDa이고 등전점이 4.79인 156개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코딩하였다. 감소된 아미노산 서열은 Geobacillus stearothermophilus, Geobacillus sp. 12AMORI 및 Anoxybacillus flavithermus의 비특정된 멀티구리 산화 효소(multicopper oxidases; MCOs)와 유사하였다(도 1; Geobacillus stearothermophilus (80.1%), Geobacillus sp. 12AMORI (79.5%), 및 Anoxybacillus flavithermus (72.0%)). 하지만, 비록 유사할지라도 본 실험에서 확인한 단백질은 다른 박테리아의 MCOs 보다 작은 것을 확인할 수 있었다(도 1). 본 단백질의 감소된 아미노산 잔기는 4가지 특징적인 히스티딘-풍부 구리 결합 모티브를 포함하지 않았다. 하지만, 본 단백질은 박테리아의 두 도메인 멀티코퍼 산화 효소(two domain multicopper oxidases; 2dMCOs)의 두 컵레독신(cupredoxin) 도메인을 포함하는 것을 볼 수 있었다(도 1). ORF에 따르면 폴리페놀 산화 효소 (GPPO) 유전자에 해당하는 것으로 MCO 패밀리의 멤버로 분류될 수 있다. 이에, 하기 실험에서 본 단백질이 라카아제 활성을 가지는 지 실험하였다. 라카아제 활성 유무를 평가하기 위하여, E. coli 세포에서 GPPO를 클로닝하고 발현하도록 한 뒤, 생화학적 특성을 조사하였다.

분자적 특성

재조합 GPPO는 E. coli SoluBL21(DE3)™ 세포에서 발현되었고, 열처리 및 IMAC를 통하여 정제하였다. SDS-PAGE를 이용하여 정제된 GPPO의 ∼17kDa 정도의 단일 밴드를 확인하였다(도 2). GPPO의 분자량(대략 17.2kDa)은 SDS-PAGE에 의한 분석에서 얻어진 값과 유사하였다. 라카아제의 특정 두 도메인은 작은 분자량(30-40kDa)을 갖는 반면, 라카아제의 3개의 도메인의 분자량은 대략 50-70kDa 또는 이상에 해당한다. 따라서, GPPO는 현재까지 알려진 MCO 패밀리의 멤버 중에 가장 작은 단백질에 해당한다. 분석용 초원심분리기에 의해 얻어진 침전 계수 데이터를 이용하여 재조합 GPPO의 분자량을 측정하였다. 분석용 초원심분리는 단백질의 분자량과 크기를 측정하는 고전적 방법에 해당한다. 실험 결과, 이러한 방법으로 얻어진 데이터는 171.6kDa과 일치하는 침전 계수 5.775 s의 주된 성분(91%)으로 단일 플럿(mono disperse plot)을 나타내었다. 분석용 초원심분리 분석 결과, GPPO는 자연 상태에서 동일십합체(homodecamer)로 존재하였다. 대부분의 진균 라카아제는 모노머 단백질로 이러한 효소는 다이머, 트리머 및 테트라머 서브 유닛으로 구성된다. 박테리아 라카아제는 사이즈가 27-180kDa로 다양하며, 모노머, 트리머 및 테트라머로 존재하기도 한다. 본 실험 결과, GPPO는 올리고머 형상에 있어 진균류 또는 박테리아의 라카아제와는 전혀 구분되는 것이다.

이가 양이온(divalent cation)의 필요성

최근에 E. coli에서 라카아제 과발현 시 구리의 고갈(depletion)이 관찰된 바 있다. 금속 이온 없이 정제된 재조합 GPPO의 함량은 ICP-MS 분석에서 분석되었고, 구리 이온은 검출된 바 없었다. 라카아제 활성에 금속 이온의 효과를 분석하기 위하여, 금속 이온 없이 GPPO를 정제한 뒤, 각 금속 이온의 농도를 1mM로 사용하여 실험하였다. 그 결과, GPPO는 구리 또는 코발트 이온에 의존적으로 촉매적 활성을 나타냈다. 하지만, 그 외의 금속 이온(Ba²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Ni²⁺, 또는 Zn²⁺)에서는 라카아제 활성을 나타내지 않았다. 따라서 이러한 결과로부터 구리 또는 코발트가 효소의 활성 자리에 필수 구성 성분에 해당하는 것임을 알 수 있었다. 또한, 도 3에서 보는 바와 같이, 라카아제 활성은 Cu²⁺ 농도 의존적으로, 0.09mM에서 중점을 갖는 S자 플럿을 보였으며, Co²⁺ 농도에 대하여는 1mM에서 고점을 보이는 벨-모양의 활성 프로파일을 나타냈다. 효소는 반응 혼합물에서 양이온 농도의 변화에 대하여 매우 민감하게 반응하였다. 특히 Co²⁺의 농도가 1mM 이상에서 라카아제 활성은 현저히 저하되었다. 분석에 있어서, 자유 양이온은 고농도에서는 라카아제 활성을 억제할 수 있다. Co²⁺의 1mM 농도에서 효소 활성은 Cu²⁺의 같은 농도에서 보다 6배 이상 높은 것을 볼 수 있었다. GPPO에서 코발트 이온은 구리 이온과 같은 방법으로 전자 수용체(electron acceptor)로 작용할 수 있다. GPPO의 활성에 있어 다른 금속 이온의 영향을 분석하기 위하여, Cu²⁺ 또는 Co²⁺으로 전-처리된 효소에 Ba²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Ni²⁺, 또는 Zn²⁺ 이온을 1mM의 농도로 처리하여 실험하였다. 그 결과, Cu²⁺ 또는 Co²⁺을 포함하는 GPPO는 Fe²⁺를 제외하고 다른 금속 이온에 대하여 저항성을 가졌다. 효소 활성은 1mM Fe²⁺의 존재 하에서 완전히 억제되었다. 이러한 효과는 Fe²⁺가 라카아제의 전자 수송 시스템과 상호 작용을 하기 때문일 수 있다. GPPO의 촉매적 중심을 결정하기 위하여, Cu²⁺ 또는 Co²⁺을 포함하는 GPPO를 분광 광도기를 이용하여 분석하였다. Cu²⁺를 포함하는 GPPO의 UV-가시 흡광 스펙트럼은 Co²⁺을 포함하는 GPPO와 유사하였다. 재조합 GPPO는 "푸른(blue)" 라카아제의 전형적 가시 흡광 스펙트럼에 해당하는 600nm에서 최대 흡광도가 검출되지 않았고, 420nm에서 최대 흡광도가 검출 되었다. ICP-MS 분석 결과 GPPO 분자당 코발트 원자의 비율은 0.84 ± 0.07에 해당하였는 데, 이로부터 단백질 한 분자당 GPPO는 하나의 코발트 원자를 함유하는 것을 알 수 있었다. 이러한 분광 광도적 특성과 GPPO의 금속 함량을 통해, 본 실험에서 얻어진 단백질은 이전에 보고된 라카아제 또는 라카아제-유사 단백질과는 구분되는 폴리페놀 산화 효소에 해당하는 것임을 알 수 있었다.

촉매적 특정

산화 반응에서 전형적인 라카아제의 적정 pH는 기질에 따라 달라진다. ABTS 및 DMP와 GPPO의 적정 pH는 각각 4.5 및 5.5에 해당하였다(도 4A). 재조합 효소는 ABTS 및 DMP의 존재 시 70~80℃의 온도 범위 내에서 80% 이상의 활성을 나타내었으며, 특히 75℃에서 최대 활성을 나타내었다(도 4B). 1Mm의 Cu²⁺ 또는 Co²⁺의 존재에서 다양한 온도 하에서 열처리 후 잔류 라카아제 활성을 측정하여 효소의 열에 의한 불활성화를 분석하였다. 재조합 GPPO는 높은 열적 안정성을 보였으며, Cu²⁺ 또는 Co²⁺의 존재 하에서 각각 80℃에서 8분, 90℃에서 90분의 열 불활성화의 반감기를 보였다(도 5A, 5B). 이러한 결과로부터 Co²⁺는 Cu²⁺ 보다 GPPO의 열적 안정성을 증가시켰다. 이러한 결과는 Cu²⁺ 또는 Co²⁺의 결합에 의한 형태의 차이에 기한 것일 수 있다. 본 실험에서 얻어진 Co²⁺를 포함하는 GPPO는 일전에 보고된 Thermus thermophilus HJ6 유래 라카아제(85℃에서 50분) 또는 Bacillus subtilis 유래 라카아제(80℃에서 2시간) 보다 높은 열 안정성을 갖는 것을 알 수 있다.

기질 특이성

통상의 라카아제 기질에 해당하는 ABTS, DMP, SGZ 및 구아이아콜에 대하여 GPPO의 기질 특이성을 조사하였다. ABTS 및 DMP는 GPPO의 기질로서 작용하였지만, GPPO는 SGZ 및 구아이아콜은 산화시키지 못하였다. ABTS 및 DMP 산화를 위한 GPPO의 동적 파라미터는 Cu²⁺ 또는 Co²⁺의 존재 시 70℃의 온도 하에서 적정 pH에 해당하는 pH 4.5 및 5.5에서 결정하였다(표 1). Co²⁺를 포함하는 GPPO는 Cu²⁺를 포함하는 경우와 비교하여 DMP 기질에 있어서 매우 낮은 Km 값과, 매우 높은 촉매적 효율(kcat/Km)을 보였다. 유사하게 ABTS 산화에 있어, Co²⁺를 포함하는 GPPO는 Cu²⁺를 포함하는 경우와 비교하여 68배 높은 촉매적 효율을 보였다. 따라서, 이러한 동적 결과를 통해 GPPO는 기질 결합 및 산화 반응에서 Co²⁺가 Cu²⁺ 보다 바람직한 것을 알 수 있었다. 더욱이 상기 Co²⁺를 포함하는 GPPO의 Km 값은 ABTS 및 DMP 기질에 있어서 다른 박테리아 라카아제 보다 낮은 값을 나타냈고, 촉매적 효율(kcat/Km)은 현저히 높은 값을 나타내었다. 이를 통해 활성 부위에서의 금속의 변화는 동적 반응에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있다. Co²⁺를 포함하는 GPPO의 구분되는 구조적 특성은 촉매적 특성을 설명할 수 있다.

기질	CuSO₄			CoSO₄
기질	Km(mM)	Kcat(s-1)	Km/Kcat (mM-1s-1)	Km(mM)	Kcat(s-1)	Km/Kcat (mM-1s-1)
ABTS	1.11 ± 0.50	84.28 ± 19.91	76.08 ± 40.10	0.04 ± 0.0096	206.58 ± 13.99	5181.69 ± 1463.16
DMP	0.81 ± 0.19	99.05 ± 11.38	122 ± 61.15	0.05 ± 0.0041	62.44 ± 1.52	1227.13 ± 367.59

억제제의 영향

몇몇의 추정되는 라카아제 억제제에 대한 GPPO의 민감도를 표 2에 나타내었다. Cu²⁺ 또는 Co²⁺의 존재 하에서 GPPO의 활성은 티올 화합물인 DTT, 2-머캅토에탄올, 및 L-시스테인의 낮은 농도(1mM) 하에서 현저히 억제되었다. 이는 산화 환원 시약의 설프하이드릴기(sulfhydryl group)에 의해 산화된 기질이 감소하여 라카아제의 활성이 억제된 것일 수 있다. EDTA, 트로폴론 또는 p-쿠마리산과 같은 금속 킬레이터 또한 Cu²⁺ 또는 Co²⁺의 존재 하에서 효소 반응을 강하게 억제하였다. Cu²⁺를 포함하는 GPPO는 10mM NaN₃에 의하여 완전히 억제되었지만, Co²⁺를 포함하는 GPPO는 10mM NaN₃에서 54%의 활성이 유지되는 것을 볼 수 있었다. NaN₃에 의한 활성 저해는 N³가 라카아제 내 2형 또는 3형 구리 중심과 결합함으로써 발생하게 된다. 유사하게, GPPO의 구리 중심은 하나의 구리 원자로 이루어지므로, NaN₃가 반응할 수 있다. 하지만, Co²⁺를 포함하는 GPPO가 나타내는 NaN₃에 대한 저항성으로부터 GPPO의 코발트 결합 중심은 NaN₃와 반응할 수 없는 것을 알 수 있다.

화합물	농도(mM)	억제(%)
화합물	농도(mM)	CuSO₄	CoSO₄
디티오트레이톨	1	100	99
2-머캅토에탄올	1	100	99
L-시스테인	1	100	99
p-쿠마린산	1	64	62
p-쿠마린산	10	79	92
트로폴론	1	91	55
트로폴론	10	98	95
EDTA	1	86	98
EDTA	10	94	99
소디움 아자이드	1	66	3
소디움 아자이드	10	100	46

멜라닌의 탈색 측정

멜라닌의 탈색율을 측정한 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드를 멜라닌과 반응할 때 반응시간이 경과함에 따라 멜라닌 탈색율이 조금씩 증가하여 8일 만에 65%의 탈색율을 나타내었다. 이와 같이 본 발명의 폴리펩티드는 멜라닌 탈색 효능이 매우 뛰어난 것을 알 수 있었다.

<110> Dong-eui University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel polypeptide derived from Geobacillus sp. JS12 strain and use thereof <130> WP183032 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 1 Met Gly Ser Asn Gly Thr Ala Gly Asp Tyr Val Ser Pro Leu Gly Ile 1 5 10 15 Gly Glu Ser Glu Ser Leu Ala Phe Phe Glu Phe Thr Ala Thr Val Pro 20 25 30 Gly Thr Tyr Trp Tyr His Ser His Gln Lys Ser Ala Glu Gln Val Asp 35 40 45 Lys Gly Leu Tyr Gly Thr Leu Ile Val Glu Pro Lys Asn Glu Glu Lys 50 55 60 Val Asp Arg Asp Tyr Thr Leu Val Phe Asp Glu Trp Met Ser Asp Pro 65 70 75 80 Asp Ala Glu Ser His Met Asp Met Asn Met Ser Ser Met Asn His Ser 85 90 95 His Met Gly His Gly Asn Ser Ser Asp Gly Gln Gln Met Asp Met Ser 100 105 110 Ser Met Gly His Asn Met Asn Met Tyr Asp Ile Phe Thr Ile Asn Gly 115 120 125 Lys Ser Gly Ala Ala Val Gln Pro Phe Ser Leu Ser Ser His His Thr 130 135 140 Leu Ala Leu Gln Ser Leu Leu Ser Val Phe Leu Arg 145 150 155

Claims

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서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는
피부 미백용 화장료 조성물.
제14항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 금속 이온을 더 포함하는
피부 미백용 화장료 조성물.
제15항에 있어서,
상기 금속 이온은 코발트 이온(Co²⁺) 또는 구리 이온(Cu²⁺)인
피부 미백용 화장료 조성물.
삭제
서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드를 유효 성분으로 포함하는 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제18항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 금속 이온을 더 포함하는, 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제19항에 있어서,
상기 금속 이온은 코발트 이온(Co²⁺) 또는 구리 이온(Cu²⁺)인, 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제18항에 있어서,
상기 과다색소침착에 기인한 색소 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 잡티, 모반 또는 일광흑색증(solar lentigines)인, 과다색소침착에 기인한 색소 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.