KR101881248B1

KR101881248B1 - 미나리아재비 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101881248B1
Application number: KR1020170020379A
Authority: KR
Inventors: 조재열; 김성규; 홍요한; 유슬기; 한상윤; 정성구; 정덕
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2017-02-15
Publication date: 2018-07-23

Abstract

본 발명은 미나리아재비 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미나리아재비 추출물은, 시클로옥시게나제 2(COX-2), 티로시나아제(tyrosinase), 및 마이크로프탈미아 연관 전사인자(MITF)의 mRNA 발현을 억제하고, 시르투인1(Sirt1), 및 히알루로난 신타아제2(HAS-2)의 mRNA 발현을 증가시키는 것이 확인되었으며, 이에 본 발명의 조성물은 피부에서 피부노화 억제 효과, 보습효과 및 미백 효과를 가진다는 것이 확인되어, 화장품의 구성 성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

미나리아재비 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic or pharmaceutical compositions comprising extract of Ranunculus bulumei}

본 발명은 미나리아재비 추출물을 유효성분으로 함유하는, 항노화, 미백 또는 보습용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부의 붉은 반점·주근깨 등의 색소 침착은 호르몬 이상이나 자외선, 피부 국소의 염증이 원인이 되어 멜라닌(melanin)이 지나치게 형성되어, 이것이 피부 내에 침착하는 것으로 판단되고 있다. 피부의 색소 침착의 원인이 되는 이 멜라닌은, 표피 기저층에 있는 색소 세포(멜라노사이트; melanocyte) 내의 멜라노솜(melanosome)이라고 불리는 소기관에서 생성되고, 생성된 멜라닌은 주위 각화 세포(케라티노사이트; keratinocyte)에 수용된다.

이 멜라노사이트 내에서의 멜라닌은, 티로신(tyrosine)이 효소 티로시나아제(tyrosinase)의 작용에 의해 도파-퀴논(dopaquinone)을 거쳐 효소적 또는 비효소적인 산화 반응에 의해 흑색의 멜라닌으로 변화되어 생성되는 것으로, 이에 제1 단계의 반응인 티로시나아제의 활성을 억제하는 것이 멜라닌의 생성을 억제하는 데에 있어서 중요하다.

상기와 같은 색소 이상의 예방·개선을 목적으로 하여 미백 작용을 갖는 물질, 즉, 멜라닌 생성을 억제하는 물질이 주로 이용되고 있으며, 예컨대, 비타민 C을 대량으로 경구 투여하는 방법, 글루타치온(glutathione) 등을 주사하는 방법, 혹은 코직산(Kojic Acid), 비타민 C 및 그 유도체, 시스테인(cysteine) 등을 연고, 크림, 로션 등의 형태로 국소에 도포하는 방법 등이 알려져 있다.

그러나, 티로시나아제의 활성을 억제하는 화합물은 히드로퀴논을 제외하고는 그 효과의 발현이 매우 완만하기 때문에, 피부 색소 침착의 개선 효과가 충분하지 못하며, 히드로퀴논은 효과가 우수하지만, 감작성이 있어 일반적인 사용은 제한되어 있다.

노화는 모든 생명체가 겪는 반응으로, 수명, 생존과 직결되어 있는 요소이다. 노화에 관련된 가장 기본적이고, 근원적인 원인으로는 free radical에 따른 산화적 스트레스에 의한 세포 손상이다. 세포 내에는 다양한 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)이 존재하며, 이를 억제하기 위해 SOD (superoxide dismutase)의 효소들이 작용하여 세포의 산화적 스트레스, 장기적으로는 세포의 노화를 방지한다.

최근 연구 결과로, NAD+는 NADPH의 효소반응을 증대시키고, 세포 수준에서의 에너지 대사 효율을 증대시켜 노화에 관련된 주요인자인 SIRT1의 활성을 증대시키는 등 노화에 대한 새로운 연구 방향이 제시되기도 하였다(Cell 155, 16241638, 2013).

피부노화는 근본적으로는 위와 같은 영향에 의해 노화가 조절되지만, 다른 신체 조직과는 달리 외부 환경에 직접적으로 영향을 받는 특성이 있다. 특히 시각적으로 노화가 일어난 정도를 주름이나 피부의 탄력 등으로 평가될 수 있고, 현대인의 사회활동에 외적인 요소가 크게 작용하므로 이에 대한 관심이 고조되고 있다. 피부의 노화 반응은 일반적으로 자연노화에 의한 세포단위에서의 노화 뿐만 아니라 자외선에 의한 광노화(photoageing)에 의하여 발생할 수 있으며, 피부노화의 결과로는 주름생성 및 피부의 탄력성 감소로 인한 외관상으로 부정적인 영향을 끼친다.

특히, 자외선 자극에 의한 피부노화는 활성산소종의 생성을 증대시켜 만성적인 노화를 일으킬뿐만 아니라, 자외선에 의한 직접적인 콜라겐 분해 및 MMPs (matrix metalloproteinases)의 활성 증가로 인한 콜라겐 분해를 야기시켜 피부노화에는 자외선과 같은 외적인 요소가 주요하게 작용하기도 한다.

한편, 미나리아재비는 약용식물로 사용되고 있는 식물로, 쌍떡잎식물 미나리아재비목 미나리아재비과의 여러해살이풀이고, 산과 들의 볕이 잘 들고 습기가 있는 곳에서 자란다. 미나리아재비에는 다소 독성이 있으나 연한 순은 식용하기도 하며, 한방에서는 뿌리를 제외한 식물체 전부를 모랑이라는 약재로 쓰는데 간염으로 인한 황달을 개선하는 효과가 알려져 있다.

본 발명자들은 미나리아재비 추출물의 항노화, 미백 및 보습 효과에 대해 연구하던 중, 각질형성세포에서 미아리아재비 추출물의 처리에 의해 UVB에 의해 증가된 COX2를 전사수준(mRNA level)에서 억제시키며 UVB에 의해 감소된 항노화 관련 유전자인 시르투인1(Sirtuin 1, Sirt1)을 전사 수준에서 증가시킨다는 것을 확인하였고, 보습인자인 히알루로난 신타아제-2(hyaluronan synthase: HAS-2)를 전사 수준에서 활성화시킨다는 것을 확인하였는 바, 항노화 및 보습 효과가 있음을 확인하였다.

또한, 멜라닌세포에서 미아리아재비 추출물의 처리에 의해 멜라닌세포자극호르몬(Alpha-Melanocyte-stimulating hormone : a-MSH)으로 멜라닌 형성을 유도한 뒤 해당 추출물을 처리하여 멜라닌 형성의 핵심 효소인 티로시나아제 활성을 감소시키고, 멜라닌 형성에 영향을 미치는 티로시나아제(tyrosinase), 및 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia associated transcription factor, MITF)가 전사 수준에서 억제되어 미백 효과를 보인다는 것을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 미나리아재비 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부 항노화, 보습, 또는 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미나리아재비 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부노화 억제, 보습, 또는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 미나리아재비 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 아세톤, 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 용매는 메탄올인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 시클로옥시게나제 2(Cyclo oxygenase-2, COX-2), 티로시나아제(tyrosinase), 및 마이크로프탈미아 연관 전사인자(microphthalmia associated transcription factor, MITF)의 mRNA 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 시르투인1(Sirtuin 1, Sirt1), 및 히알루로난 신타아제-2(hyaluronan synthase 2, HAS-2)의 mRNA 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 조성물은 티로시나아제(tyrosinase) 활성화를 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 피부노화는 자외선(UVB)에 의한 광노화(Photoaging)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 미나리아재비 (Ranunculus bulumei) 추출물은 각질형성세포에서 미아리아재비 추출물의 처리에 의해 UVB에 의해 증가된 COX-2를 전사수준(mRNA level)에서 억제시키며 UVB에 의해 감소된 항노화 관련 유전자인 시르투인1(Sirt1)을 전사 수준에서 증가시킨다는 것을 확인하였고, 보습인자인 히알루로난 신타아제2(HAS-2)를 전사 수준에서 활성화시킨다는 것이 확인되었는 바, 피부 노화 억제 및 보습을 위한 화장품 소재로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 미나리아재비 (Ranunculus bulumei) 추출물은 멜라닌세포에서 멜라닌세포자극호르몬(a-MSH)으로 멜라닌 형성을 유도한 뒤 상기 추출물을 처리하여 멜라닌 형성의 핵심 효소인 티로시나아제 활성을 감소시키고, 멜라닌 형성에 영향을 미치는 티로시나아제(tyrosinase), 및 마이크로프탈미아 연관 전사인자(MITF)가 전사 수준에서 억제되어 미백 효과를 보인다는 것이 확인된 바, 미백을 위한 화장품 소재로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 Rb-ME의 RAW264.7 cells에 대한 세포독성 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 Rb-ME의 HaCaT cells에 대한 세포독성 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 Rb-ME의 B16F10 cells에 대한 세포독성 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 Rb-ME가 RAW264.7 cells의 Lipopolysaccharide (이하 LPS)에 의한 니트릭 옥사이드 (NO) 생산을 저해하는 효과를 가진다는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 Rb-ME를 RAW264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 유도성 산화질소 생성효소 (iNOS)의 mRNA 발현을 줄이는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 Rb-ME를 RAW264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 시클로 옥시게나제 2 (COX-2)의 mRNA 발현을 줄이는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 Rb-ME를 RAW264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 종양괴사인자-알파 (TNF-a)의 mRNA 발현을 줄이는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 Rb-ME를 RAW264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 인터루킨-1베타 (IL-1b)의 mRNA 발현을 줄이는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 Rb-ME를 RAW264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 인터루킨-6 (IL-6)의 mRNA 발현을 줄이는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 Rb-ME를 HEK293 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 nuclear factor kappa B (NF-kB) 프로모터 활성화를 줄이는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 Rb-ME를 HaCaT cells에 처리하였을 때 UVB에 의해 증가된 COX2의 mRNA levels을 줄이는 효과 및 UVB에 의해 감소된 항노화 관련 유전자인 Sirt1의 mRNA levels을 증가시키는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 Rb-ME를 HaCaT cells에 처리하였을 때 보습 관련 유전자인 HAS-2의 mRNA levels을 증가시키는 효과를 확인한 결괄르 나타낸 도면이다.
도 13은 Rb-ME를 B16F10 cells에 처리하였을 때 a-MSH에 의해 증가된 melanin contents를 감소시키는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 Rb-ME를 B16F10 cells에 처리하였을 때 melanin 합성을 증가시키는 tyrosinase activity를 감소시키는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 Rb-ME를 B16F10 cells에 처리하였을 때 melanin 합성을 증가시키는 tyrosinase, MITF, TYRP-1의 mRNA levels을 감소시키는 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 미나리아재비 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 미나리아재비 추출물과 관련하여 실험한 결과 HaCaT cell (각질형성세포)에서 자외선 UVB에 의해 증가되는 COX-2의 mRNA 발현량이 감소하고, 항노화 유전자로 알려져 있는 Sirt1의 mRNA 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 또한, 보습인자인 HAS-2의 mRNA 발현량이 증가한다는 것을 확인함으로써, 본 발명의 조성물이 피부노화 억제 및 보습 효과가 있다는 것을 확인하였다.

아울러 B16F10 cells(멜라닌세포)에서 a-MSH로 멜라닌 형성을 유도한 뒤 해당 추출물을 처리하여 멜라닌 형성에 미치는 영향을 확인하였으며 멜라닌 형성에 핵심적인 효소인 티로시나제 활성을 측정한 결과, 그 활성이 억제된다는 것을 확인하였다. 또한 멜라닌 형성에 영향을 미치는 tyrosinase, 및 MITF의 mRNA 발현이 억제된다는 것을 확인하여, 미백 효과가 있음을 확인하였다.

이에 본 발명은 미나리아재비 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것에 그 목적이 있다.

본 발명의 미나리아재비 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 미나리아재비 추출물 제조에 사용될 수 있는 추출용매로는 예를 들면, 물, 탄소수 1-6개의 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3 부틸렌 글리콜 등의 추출용매를 단독으로 또는 혼합하여 사용 가능하며, 바람직하게는 메탄올이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 추출 용매의 적합한 양은 미나리아재비 건조 중량의 1 내지 10배 정도이며, 더욱 바람직하게는 5 내지 8배이며, 가장 바람직하게는 5배이다. 또한, 추출방법으로는 열 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등을 사용할 수 있으며, 1회 또는 다수회 반복하여 추출시켜 사용할 수 있다. 또한, 추출온도는 미나리아재비 유용성분의 유효활성이 제거되지 않을 정도의 온도이면, 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 상온에서 침적시켜 추출한다.

본 발명의 추출물은 화장료 조성물로서, 피부의 피부노화 억제(주름 개선), 미백, 또는 보습을 목적으로 화장품에 첨가될 수 있는 것으로, 상기 피부노화는 자외선에 의한 광노화(Photoaging)인 것으로, 상기 광노화에 의해 형성된 주름을 개선하는 것일 수 있다. 상기 자외선은 UVA 및 UVB를 모두 포함한다.

상기 화장료 조성물의 제형은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 또는 바디클렌저의 형태일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 더 포함할 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01-5% 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01-3% 중량 백분율로 배합된다.

본 발명의 제형이 로션, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 미나리아재비( Ranunculus bulumei ) 추출물 및 세포 준비

1.1. 미나리아재비( Ranunculus bulumei ) 추출물의 제조

미나리아재비(Ranunculus bulumei) 메탄올 추출물(Rb-ME)을 제조하기 위해, 미나리아재비(Ranunculus bulumei)의 지상부를 건조시키고, 분쇄하여 미세분말 샘플을 만든 후, 상기 샘플 30-40g에 200ml의 메탄올을 첨가한 뒤 50℃에서 1500psi의 압력으로 3일간 추출하였다. 추출된 물질은 Modul spin 건조 및 농축 시스템(Biotron Corporation)으로 40℃에서 24시간동안 농축하였다. 농축된 Rb-ME는 100% dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해시켜 0-300μg/ml의 농도로 희석해서 세포 실험에 쓰거나 0.5% Carboxymethyl cellulose (CMC)에 용해시켜서 동물실험에 사용했다.

1.2. 세포 배양

Murine 대식세포주인 RAW264.7 세포를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 100 mm cell culture dish에 70-80%의 밀도로 배양하였다. 멜라닌 세포주인 B16F10 세포를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 DMEM 배지를 이용하여 100 mm cell culture dish에 70-80%의 밀도로 배양하였다. 각질형성세포주인 HaCaT 세포와 embryonic kidney cell인 HEK293 세포를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 5%의 FBS를 함유하는 DMEM 배지를 이용하여 100 mm cell culture dish에 70-80%의 밀도로 배양하였다.

실시예 2: Rb -ME의 세포 독성 측정

Rb-ME의 대식세포주, 각질형성 세포주 및 멜라닌세포에서 세포 독성을 측정하기 위해 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphinyltetrazolium bromide) assay법을 이용하여 분석하였다. 96-well plate에 1 × 10⁶ cell/ml의 세포를 plating하고 37℃에서 각 면역실험 조건에 상응하는 배양시간 동안 CO₂ incubator에서 배양하였고, 이후 10 ㎕ MTT 용액 (stock concentration : 5 mg/ml)을 첨가하고 3시간 동안 추가반응을 유도하였다. 반응 종료 및 formazan crystal 용해를 위해 각 well에 100 ㎕ MTT stopping solution (10% Sodium dodecyl sulfate in 0.01M HCl)을 추가적으로 첨가하였다. 세포 생존율은 MTT가 formazan으로 환원된 양을 570 nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 OD 값을 통해 산출하였다.

그 결과를 도 1 내지 3에 나타내었으며, 상기 도 1 내지 3에서 확인할 수 있는 것과 같이 본 발명의 미나리아재비 추출물은 대식세포주, 각질형성세포주, 및 멜라닌세포주에서 모두 세포 독성을 거의 보이지 않았다.

실시예 3: Rb -ME의 산화질소(NO) 생성 저해 활성 확인

염증발생의 주요 원인인 산화질소(NO) 생성 저해 활성을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 1×10⁶ cell/ml의 농도로 조절한 후, 96 well plate에 접종하였고, 5% CO₂ 및 37℃에서 18시간 동안 전배양하였다. 이후 배지를 제거하고 4배 농도로 조제된 Rb-ME 추출물 50 μl와 50 μl의 LPS(최종농도 1 μg/ml) 함유 배지를 동시에 처리하여 배양하였다. 24시간 후 상층액을 100 μl씩 또 다른 96 well plate에 옮기고 NO 정량은 Griess 용액 (0.5% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 5% sulfanilamide, 25% H₃PO₄)을 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다. 표준물질로 sodium nitrite (0 에서 100 μM) 를 사용하여 검량선을 작성하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있는 것과 같이 Rb-ME의 농도가 높아질수록, RAW264.7 cell에서의 LPS에 의한 NO 생성 농도가 낮아진다는 것을 확인하였다.

실시예 4: Rb -ME의 염증 관련 사이토카인 발현 억제 효능 확인

Rb-ME가 염증 반응을 유도하는 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험을 실시하였다

즉, 사이토카인의 발현 정도를 전사수준에서 조사하기 위해 RAW264.7 cell에 Rb-ME(최종농도 25, 50, 100 μg/ml) 30분 전처리 후 LPS(최종농도 1 μg/ml)를 6시간 동안 처리하고 Trizol reagent를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA를 First strand cDNA synthesis kit (Thermo scientific)를 사용하여 cDNA를 제조한 다음, 동량의 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 표적단백질의 sense 및 antisense primer 염기서열은 표 1에 나타내었고, 대조군 유전자로는 GAPDH을 사용한다. PCR amplication은 SYBR green kit (Philekorea)을 사용하여 각 실험군 cDNA와 표적단백질들의 sense 및 antisense primers, 대조군 GAPDH primers를 dNTP 250 uM, Tris-HCL(pH 8.3) 10 mM, KCl 50 mM, NgCl₂ 1.5 mM를 포함한 SYBR green kit 25ul에서 시행하였다. PCR은 95 ℃에서 10초 간 denaturing, 58 ℃에서 15초 간 annealing 그리고 72 ℃에서 1분간 extension 하는 조건으로 시행하며, 총 30 cycles을 수행하였다. PCR로 증폭된 DNA는 1.5 % agarose gel에서 전기영동 하였고 분획된 DNA band의 intensuty를 측정하였다.

도 5 내지 9에 나타낸 바와 같이, Rb-ME를 RAW264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.

표적유전자	염기서열 (5' → 3')
iNOS	sense CCC TTC CGA AGT TTC TGG CA (서열번호 1) antisense GGC TGT CAG AGC CTC GTG GC (서열번호 2)
COX-2	sense CAC TAC ATC CTG ACC CAC TT (서열번호 3) antisense ATG CTC CTG CTT GAG TAT GT (서열번호 4)
TNF-α	sense TGC CTA TGT CTC AGC CTC TT (서열번호 5) antisense GAG GCC ATT TGG GAA CTT CT (서열번호 6)
IL-1β	sense GTG AAA TGC CAC CTT TTG ACA GTG (서열번호 7) antisense CCT GCC TGA AGC TCT TGT TG (서열번호 8)
IL-6	sense GAC AAA GCC AGA GTC CTT CAG AGA (서열번호 9) antisense CTA GGT TTG CCG AGT AGA TCT C (서열번호 10)
GAPDH	sense CAA TGA ATA CGG CTA CAG CA (서열번호 11) antisense AGG GAG ATG CTC AGT GTT GG (서열번호 12)

실시예 5: Rb -ME의 Luciferase gene promotor 발현 확인

Human embryonic kidney 세포주인 HEK293를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 DMEM 배지를 이용해서 1×10⁶ cell/ml의 농도로 조절한 후, 5% CO₂ 및 37℃에서 18시간 동안 전 배양하여, 배양 후 세포가 70% 밀도가 되었을 때 실험을 진행하였다. Lipofectamine 2000을 이용하여 NF-kappaB Luciferase DNA와 beta-galactosidase 그리고 MyD88 DNA를 각기 co-transfection 하였다. Lipofectamine 2000은 DNA 1 μg과 Lipofectamine 2000 1 μg을 배지에 각각 희석해 준 후 상온에서 20분 동안 배양 한 후 DNA 희석액과 Lipofectamine 2000 희석액을 혼합하여 다시 상온에서 20분 배양하는 방법으로 진행하였고, 배양 후 혼합액을 세포가 분주된 24 well plate에 넣어준 후 24시간 배양 후 시험물질을 농도별로 처리한 후 18시간동안 배양하였다. 배양 후 lysis buffer를 이용하여 세포를 용해시키고 substrate와 1:1로 반응 시키고, 반응 후 바로 Luminometer로 흡광도를 측정하였으며, beta-galactosidase의 경우 X-gal과 1:1로 반응시킨 후 37 ℃ 배양기에서 5분 배양한 후 405 nm로 흡광도를 측정하였다.

그 결과는 도 10에 나타내었는데, 도 10에서 확인할 수 있는 것과 같이, Rb-ME를 RAW264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 NF-kappa B 프로모터의 활성화를 감소시킨다는 것을 확인하였다.

실시예 6: Rb -ME의 각질형성세포에서의 노화 억제 효과 확인

각질형성세포에서의 Rb-ME의 광노화 억제 효능을 확인하기 위해 노화 관련 단백질들의 발현 정도를 전사수준에서 조사하였다. Rb-ME(최종농도 50, 100 μg/ml) 30분 전처리 후 UVB 30 mJ/cm² 처리하여 광노화를 유도한 후, Trizol reagent를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA를 First strand cDNA synthesis kit (Thermo scientific)를 사용하여 cDNA를 제조한 다음, 동량의 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 표적단백질의 sense 및 antisense primer 염기서열은 표 2에 나타내었고, 대조군 유전자로는 GAPDH을 사용하였다. PCR amplication은 2X PCRBIO HS Taq premix kit (PCRBIO)을 사용하여 각 실험군 cDNA와 표적단백질들의 sense 및 antisense primers, 대조군 GAPDH primers를 dNTP 2mM, MgCl₂ 6 mM, HS Taq DNA polymerase 등을 포함한 PCR premix kit 10ul에서 시행하였다. PCR은 95 ℃에서 10초 간 denaturing, 58 ℃에서 15초 간 annealing 및 72 ℃에서 1분간 extension 하는 조건으로 시행하며, 총 30 cycles을 수행하였다.

그 결과를 도 11에 나타내었으며, Rb-ME를 HaCaT cells에 처리하였을 때 UVB에 의해 증가된 노화 관련 유전자인 COX2의 mRNA levels을 감소시키고, 항노화 관련 유전자인 Sirt1의 mRNA levels을 증가시키는 효과를 보인다는 것을 확인하였다.

표적유전자	염기서열 (5'→ 3')
MMP9	sense TCC CTG GAG ACC TGA GAA CC (서열번호 13) antisense GGC AAG TCT TCC GAG TAG TTT (서열번호 14)
Sirt1	sense CAG TGT CAT GGT TCC TTT GC (서열번호 15) antisense CAC CGA GGA ACT ACC TGA T (서열번호 16)
COX-2	sense CAA AAG CTG GGA AGC CTT CT (서열번호 17) antisense CCA TCC TTC AAA AGG CGC AG (서열번호 18)
GAPDH	sense CAA TGA ATA CGG CTA CAG CA (서열번호 11) antisense AGG GAG ATG CTC AGT GTT GG (서열번호 12)

실시예 7: Rb -ME의 각질형성세포에서의 보습 효과 확인

각질형성세포에서의 보습 효과를 확인하기 위해서, 해당 단백질들의 발현 정도를 전사수준에서 조사하기 위해 Rb-ME(최종농도 25, 50, 100, 200 μg/ml)와 Retinol(최종농도 10 μg/ml)을 24시간 동안 처리하고 Trizol reagent를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA를 First strand cDNA synthesis kit (Thermo scientific)를 사용하여 cDNA를 제조한 다음, 동량의 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 표적단백질의 sense 및 antisense primer 염기서열은 표 3에 나타내었고, 대조군 유전자로는 GAPDH을 사용하였다. PCR amplication은 2X PCRBIO HS Taq premix kit (PCRBIO)을 사용하여 각 실험군 cDNA와 표적단백질들의 sense 및 antisense primers, 대조군 GAPDH primers를 dNTP 2mM, MgCl₂ 6 mM, HS Taq DNA polymerase 등을 포함한 PCR premix kit 10ul에서 시행하였다. PCR은 95 ℃에서 10초 간 denaturing, 58 ℃에서 15초 간 annealing 및 72 ℃에서 1분간 extension 하는 조건으로 시행하며, 총 30 cycles을 수행하였다.

그 결과를 도 12에 나타내었으며, Rb-ME를 HaCaT cells에 처리하였을 때 보습 관련 유전자인 HAS-2의 mRNA levels을 증가시키는 효과를 보인다는 것을 확인하였다.

표적유전자	염기서열 (5'→ 3')
FLG	sense AGG GAA GAT CCA AGA GCC CA (서열번호 19) antisense ACT CTG GAT CCC CTA CGC TT (서열번호 20)
TGM	sense GAA ATG CGG CAG ATG ACG AC (서열번호 21) antisense AAC TCC CCA GCG TCT GAT TG (서열번호 22)
HAS-1	sense CCA CCC AGT ACA GCG TCA AC (서열번호 23) antisense CAT GGT GCT TCT GTC GCT CT (서열번호 24)
HAS-2	sense TTC TTT ATG TGA CTC ATC TGT CTC ACC GG (서열번호 25) antisense ATT GTT GGC TAC CAG TTT ATC CAA ACG (서열번호 26)
HAS-3	sense TAT ACC GCG CGC TCC AA (서열번호 27) antisense GCC ACT CCC GGA AGT AAG ACT (서열번호 28)
GAPDH	sense CAA TGA ATA CGG CTA CAG CA (서열번호 11) antisense AGG GAG ATG CTC AGT GTT GG (서열번호 12)

실시예 8: Rb -ME의 멜라닌세포에서의 미백 효과 확인

8.1. 멜라닌세포에서의 멜라닌 생성량 억제 확인

멜라닌의 생성 수준을 조사하기 위해, Rb-ME(최종농도 50, 100, 200, 400 μg/ml), Arbutin(최종농도 1mM)와 α-MSH(최종농도 100nM)을 48시간 동안 처리하고 cell down 하여 E-tube로 수집하였다. Cell lysis buffer 20ul을 넣고 cell을 lysis 시킨 후 centrifuge을 통해 cell debris만을 모아 사진을 촬영하였다. melanin 측정을 위해 10% DMSO 1M NaOH 100ul을 E-tube에 넣고 75℃ 에 1시간 동안 incubation 시킨 뒤 96well에 각 well 당 100ul 씩 넣고 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 13에 나타내었으며, B16F10 cell (멜라닌형성세포주)에 α-MSH를 처리하여 melanin 형성을 유도한 뒤 Rb-ME를 처리하였을 때 멜라닌 생성량이 감소된 것을 확인하였다.

8.2. 멜라닌세포에서의 티로시나아제 활성 억제 확인

세포내 tyrosinase activity를 조사하기 위해 Rb-ME(최종농도 200, 400 μg/ml), Arbutin(최종농도 1mM)와 α-MSH(최종농도 100nM)을 48시간 동안 처리하고 tyrosinase의 생성 수준을 조사하기 위해 각 시료를 일정시간 동안 처리하고 cell down 하여 E-tube로 수집하였다. 수집된 시료에 Cell lysis buffer 50ul를 넣고 각 표본의 단백질 농도를 BSA를 표준으로 잡고 측정하였다. 이렇게 얻어진 값을 기준으로 단백질 농도가 1 ug/ul되는 100 ul 표본량을 96well plate에 넣고 2 mg/ml L-DOPA 100 ul을 넣은 뒤 37℃에 1시간 동안 incubation 시킨 뒤 475nm에서 흡광도를 측정하여 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 것과 같이, B16F10 cell (멜라닌형성세포주)에 α-MSH를 처리하여 melanin 형성을 유도한 뒤 melanin 합성에 중요한 역할을 하는 효소인 tyrosinase activity를 확인하였을 때 Rb-ME를 처리한 경우 tyrosinase activity가 감소된 것을 확인하였다. 이를 통해 Rb-ME는 tyrosinase activity를 조절함으로써 melanin 합성을 저해하는 것을 확인하였다

8.3. 멜라닌세포에서의 멜라닌 합성 관련 단백질의 억제 확인

멜라닌세포에서의 미백 효과를 확인하기 위해서, 멜라닌 합성 관련 단백질들의 발현 정도를 전사수준에서 조사하기 위해 Rb-ME(최종농도 200, 400 μg/ml), Arbutin(최종농도 1mM)와 α-MSH(최종농도 100nM)을 24시간 동안 처리하고 Trizol reagent를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA를 First strand cDNA synthesis kit (Thermo scientific)를 사용하여 cDNA를 제조한 다음, 동량의 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 표적단백질의 sense 및 antisense primer 염기서열은 표 4에 나타내었고, 대조군 유전자로는 GAPDH을 사용하였다. PCR amplication은 2X PCRBIO HS Taq premix kit (PCRBIO)을 사용하여 각 실험군 cDNA와 표적단백질들의 sense 및 antisense primers, 대조군 GAPDH primers를 dNTP 2mM, MgCl₂ 6 mM, HS Taq DNA polymerase 등을 포함한 PCR premix kit 10ul에서 시행하였다. PCR은 95 ℃에서 10초 간 denaturing, 58 ℃에서 15초 간 annealing 및 72 ℃에서 1분간 extension 하는 조건으로 시행하며, 총 30 cycles을 수행하였다.

그 결과를 도 15에 나타내었으며, B16F10 cell (멜라닌형성세포주)에 α-MSH를 처리하여 melanin 합성에 관여하는 tyrosinase, MITF, 및 TYRP-1의 발현량을 확인한 결과 MITF와 tyrosinase의 발현이 감소된 것을 확인하였다. 이를 통해 Rb-ME에 의한 melanin 합성의 저해는 MITF, tyrosinase의 발현의 감소에 의해 일어나는 것을 확인하였으며, 이로부터 본 발명의 조성물에 미백 효과가 있음을 확인하였다.

표적유전자	염기서열 (5'→ 3')
Tyrosinase	sense GTC CAC TCA CAG GGA TAG CAG (서열번호 29) antisense AGA GTC TCT GTT ATG GCC GA (서열번호 30)
MITF	sense AAC TCA TGC GTG AGC AGA TG (서열번호 31) antisense TAC CTG GTG CCT CTG AGC TT (서열번호 32)
TYRP-1	sense ATG GAA CGG GAG GAC AAA CC (서열번호 33) antisense TCC TGA CCT GGC CAT TGA AC (서열번호 34)
TYRP-2	sense CAG TTT CCC CGA GTC TGC AT (서열번호 35) antisense GTC TAA GGC GCC CAA GAA CT (서열번호 36)
GAPDH	sense CAA TGA ATA CGG CTA CAG CA (서열번호 11) antisense AGG GAG ATG CTC AGT GTT GG (서열번호 12)

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Cosmetic or pharmaceutical compositions comprising extract of Ranunculus bulumei <130> MP17-041 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 1 cccttccgaa gtttctggca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 2 ggctgtcaga gcctcgtggc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 forward primer <400> 3 cactacatcc tgacccactt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 reverse primer <400> 4 atgctcctgc ttgagtatgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a forward primer <400> 5 tgcctatgtc tcagcctctt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a reverse primer <400> 6 gaggccattt gggaacttct 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b forward primer <400> 7 gtgaaatgcc accttttgac agtg 24 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b reverse primer <400> 8 cctgcctgaa gctcttgttg 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer <400> 9 gacaaagcca gagtccttca gaga 24 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer <400> 10 ctaggtttgc cgagtagatc tc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 11 caatgaatac ggctacagca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 12 agggagatgc tcagtgttgg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9 forward primer <400> 13 tccctggaga cctgagaacc 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9 reverse primer <400> 14 ggcaagtctt ccgagtagtt t 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sirt1 forward primer <400> 15 cagtgtcatg gttcctttgc 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sirt1 reverse primer <400> 16 caccgaggaa ctacctgat 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 forward primer_2 <400> 17 caaaagctgg gaagccttct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 reverse primer_2 <400> 18 ccatccttca aaaggcgcag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLG forward primer <400> 19 agggaagatc caagagccca 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLG reverse primer <400> 20 actctggatc ccctacgctt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGM forward primer <400> 21 gaaatgcggc agatgacgac 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGM reverse primer <400> 22 aactccccag cgtctgattg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS-1 forward primer <400> 23 ccacccagta cagcgtcaac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS-1 reverse primer <400> 24 catggtgctt ctgtcgctct 20 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS-2 forward primer <400> 25 ttctttatgt gactcatctg tctcaccgg 29 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS-2 reverse primer <400> 26 attgttggct accagtttat ccaaacg 27 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS-3 forward primer <400> 27 tataccgcgc gctccaa 17 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS-3 reverse primer <400> 28 gccactcccg gaagtaagac t 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyrosinase forward primer <400> 29 gtccactcac agggatagca g 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyrosinase reverse primer <400> 30 agagtctctg ttatggccga 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF forward primer <400> 31 aactcatgcg tgagcagatg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MITF reverse primer <400> 32 tacctggtgc ctctgagctt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYRP-1 forward primer <400> 33 atggaacggg aggacaaacc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYRP-1 reverse primer <400> 34 tcctgacctg gccattgaac 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYRP-2 forward primer <400> 35 cagtttcccc gagtctgcat 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYRP-2 reverse primer <400> 36 gtctaaggcg cccaagaact 20

Claims

미나리아재비 추출물을 유효성분으로 함유하는, 자외선에 의한 피부노화 억제, 보습, 또는 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 미나리아재비 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 아세톤, 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하는 것을 특징으로 하는, 자외선에 의한 피부노화 억제, 보습, 또는 미백용 화장료 조성물.
제2항에 있어서, 상기 용매는 메탄올인 것을 특징으로 하는, 자외선에 의한 피부노화 억제, 보습, 또는 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 시클로옥시게나제 2, 티로시나아제, 또는 마이크로프탈미아 연관 전사인자의 mRNA 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 자외선에 의한 피부노화 억제, 보습, 또는 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 시르투인1, 또는 히알루로난 신타아제2의 mRNA 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 자외선에 의한 피부노화 억제, 보습, 또는 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 티로시나아제 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 자외선에 의한 피부노화 억제, 보습, 또는 미백용 화장료 조성물.
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