KR20030005201A - 피부 외용제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종래의 멜라닌 생성 억제제와는 다른 멜라닌 생성 억제제로 제제화된 피부 외용제로서, 열과 산화에 대하여 안정하고, 외용제 중에서 시간이 경과해도 분해 또는 색소침착이 일어나지 않으며, 인간 티로시나아제에 대하여 우수한 억제 활성을 나타내는 하이드로퀴논-α-글루코피라노사이드를 멜라닌 생성 억제제로서 포함한다.

Description

피부 외용제{SKIN PREPARATIONS FOR EXTERNAL USE}

피부 미백(피부 흑화 예방)시키고 자외선에 과도하게 노출되어 발생되는 기미(liver spot), 주근깨 및 기타 피부 트러블의 예방 및 개선을 위해 다양한 멜라닌 생성 억제제가 사용되어 왔다. 예를 들어, 이들의 대표적인 예로는 하이드로퀴논, 하이드로퀴논의 페놀성 OH기에 대한 글루코오스의 β-결합(β-binding) 결과로 얻어지는 알부틴(arbutin), 비타민 C와 그의 유도체 및 코지산을 들 수 있다.

그러나, 비타민 C, 하이드로퀴논 및 코지산은 특히 수중에서 열과 산화에 대하여 매우 불안정하고, 피부 외용제에서 사용되는 시간을 초과하면 분해 및 착색과같은 문제가 나타난다.

L-아스코르빌 마그네슘 포스페이트와 같은 비타민 C의 유도체는 열과 산화에 대하여 보다 안정하지만, 이들의 효능이 반드시 만족스러울 정도인 것은 아니다.

본 발명의 목적은 종래의 멜라닌 생성 억제제가 가진 문제점을 완전히 또는 부분적으로 해결하는 멜라닌 생성 억제제의 피부 외용제를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 하이드로퀴논의 OH기 중 하나에 글루코오스를 α-결합(α-binding)시킨 결과로서 얻어지는 화합물인 하이드로퀴논-α-D-글루코피라노사이드를 함유하는 피부 외용제에 관한 것이다.

피부 외용제로는 크림, 로션, 에센스, 안면 마스크, 콜드 크림 및 메이크업 베이스와 같은 기초적인 피부 보호 제품, 파운데이션, 블러셔(blusher), 아이 섀도우, 아이 라이너 및 네일 락카와 같은 메이크업 화장품, 샴푸 및 헤어 토닉과 같은 모발 보호 제품 및 안면 스크럽, 바디 비누, 목욕제(bath agent), 비누 및 향수와 같은 신체 보호 제품을 포함한다.

도 1은 마우스 피부 상에서 본 발명의 α-알부틴 및 β-알부틴의 안정성과 관련하여 얻은 대조 실험 결과들을 나타내는 그래프.

도 2는 마우스 피부 상에서 본 발명의 α-알부틴 및 β-알부틴의 안정성과 관련하여 얻은 대조 실험 결과들을 나타내는 그래프.

상기한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 외용제로 안정하고, 종래의 물질들보다 안전하고 더욱 효과적인 물질을 조사하던 중, 다음과 같은 사실을 알아내었다:

(1) 첫째, 상기 목적에 부합되는 화합물로서 하이드로퀴논-α-D-글루코피라노사이드(이하, α-알부틴으로 칭함)이 있다.

(2) α-알부틴은 인간의 티로시나아제를 특이적으로 강하게 억제한다.

(3) α-알부틴은 보다 안정해서, 시판되는 미백제인 β-알부틴보다 더욱 안정하므로 안전하다.

본 발명의 피부 외용제는 상기 사실을 기초로 하며, 상기 제제는 인간의 티로시나아제에 대해 탁월한 억제 활성을 나타내는 α-알부틴을 함유하는 것을 특징으로 한다.

통상, 하이드로퀴논-β-글루코피라노사이드를 알부틴으로 칭하며, 하기 화학식으로 표시되는 하이드로퀴논-α-D-글루코피라노사이드는 이 알부틴과는 완전히다른 구조를 가진다. 그러나, 본 발명에서는 앞에서 언급한 알부틴과의 차이를 분명히 하기 위하여, 하이드로퀴논-α-D-글루코피라노사이드를 α-알부틴으로, 하이드로퀴논-β-글루코피라노사이드를 β-알부틴으로 칭할 것이다.

상기 α-알부틴은 예를 들어, 박테리아로부터 얻은 효소를 사용하는 하이드로퀴논의 글리코사이다이제이션(glycosidization)을 통해 수득한다. 이 효소는 α-아밀라아제이며, 일본 특허 제2662667에 기재된 아밀라아제 X-23이 될 수도 있다.

티로시나아제 효소는 색소침착의 원인이 되는 멜라닌의 생성에 있어서 대단히 중요한 역할을 한다. 주근깨를 방지하고 기미를 개선시키기 위하여 고안된 최근 이용되는 미백제 및 기타 외용제의 대부분은 티로시나아제 억제제를 함유한다.

티로시나아제 억제 활성의 강도는 상기 대상들이 얻어지는 정도와 밀접하게 연관된다. 티로시나아제 억제 활성이 클수록, 미백 효과가 커지고 주근깨를 방지하고 기미를 개선시키는 효과가 커지는 것을 기대할 수 있다.

티로시나아제 억제 활성을 평가하기 위해서는 버섯 유래의 티로시나아제를 사용하는 것이 일반적이다.

그러나, Biochem. Biotech. Biochem., 59,143(1995)에 기재된 자료에 따르면, 종래의 평가법에서는 α-알부틴은 버섯 유래의 티로시나아제에 대한 억제 효과가 나타나지 않는다.

또한, Tokkaihei(일본 공개 특허 공보) No.5-932에는 α-알부틴이 버섯 유래의 티로시나아제 활성을 억제하기보다는 촉진하며, 썬태닝제(suntanning agent)와 같은 효과가 있다고 결론을 내린다.

Tokkaihei No.6-153976에 따르면, 이 공보에는 α-알부틴이 버섯 유래의 티로시나아제를 억제하는데 효과가 있다고 기재되어 있다.

반면에, 열쇠와 열쇠구멍처럼, 효소는 매우 특이하며, 특이 기질(specific substrate)과만 상호 작용한다. 효소 억제제에 대해서도 마찬가지이다. 예를 들면, Agric. Biol. Chem., 44, 1683(1980)에는, 동물 유래의 α-아밀라아제에는 작용을 하지만, 식물 또는 미생물(microorganism) 유래의 α-아밀라아제에는 작용하지 않는 α-아밀라아제 억제제가 기재되어 있다. 이들 α-아밀라아제 억제제에 의해 알려진 바와 같이, 특정 효소를 억제하는 물질은 다른 기원에서 유래된 다른 효소를 억제하지 않을 수 있다.

따라서, 버섯 유래의 티로시나아제를 이용한 α-알부틴 티로시나아제에 대한 억제 효과의 평가는 상반되는 결과가 보고되어 있지만, 버섯 유래의 티로시나아제를 이용한 평가법을 다른 동물 및 식물 유래의 티로시나아제에 대한 효과를 평가하는 데 사용할 수 없다는 것은 명백하다.

본 발명자들은 효소 화학적 관점에서 효소의 특이성에 관심을 가지고, 상기언급한 바와 같이, 버섯 유래의 티로시나아제를 사용하는 종래의 억제 효과 평가법이 미백제 및 인간에 사용을 위해 의도되는 제제를 부여하는데 적합하지 않다고 생각하였다. 미백제 및 기타 제제들이 인간에게 사용되기 때문에, 본 발명자들은 본 발명의 α-알부틴의 억제 효과는 인간 유래의 티로시나아제를 사용하여 평가되어야 한다고 결정하여, 인간 유래의 티로시나아제를 사용하는 연구를 진행하였다.

특히, 문명화된 인간의 피부 세포에서 얻은 티로시나아제를 정제하, 인간 티로시나아제에 대한 α-알부틴의 억제 활성을 평가하였다. 관측된 결과들은 α-알부틴이 인간 유래의 티로시나아제에 대하여 특이적으로 매우 강력한 억제 효과를 미친다는 것을 나타내었다.

이것에 근거하여, 본 발명자들은 본 발명에 따라 α-알부틴을 함유하는 피부 외용제를 사용하여 미백 효과(피부 흑화(skin blackening) 예방) 및 기미를 개선시키는지 아닌지를 결정하기 위하여, 자원자들에 대해 임상적인 시도 행하였다. 본 발명의 α-알부틴을 함유하는 피부 외용제들은 멜라닌 생성을 억제하기 위하여 사용되었던 종래의 약제들에 비해 대단히 큰 효과를 나타내었다.

종래의 멜라닌 생성 억제제로서 β-알부틴의 분해 결과 생성되는 하이드로퀴논은 β-알부틴에 비해 약 400 배 이상의 독성이 있다고 보고되어 왔다.

α-알부틴은 종래부터 사용되고 있는 β-알부틴에 비해 더 안정하다고 확인되어 왔으며, 하이드로퀴논을 그리 쉽게 형성하지 않는다. 따라서, β-알부틴보다 안전하다.

한 편, α-알부틴의 제조방법으로서, 본 발명자들은 Bacillus subtilis(예를들면, 기탁된 균주 P-13560의 X-23(Seikoken(National Institute of Bioscience and Human-Technology) 유래의) α-아밀라아제(예를 들면, 아밀라아제 X-23)을 효소로서 사용하고, 맥아 올리고-사카라이드, 아밀로오스, 아밀로펙틴 및 다양한 형태의 스타치와 같은 α-1,4 결합을 가지는 글루칸을 당 공여체(sugar donor)로서 사용하는 방법을 제안하였다(일본 특허 공보 No.2662667 참조).

이 공보에 기재된 방법을 사용하여 얻은 α-알부틴은 상기한 종래의 β-알부틴보다 더욱 더 강력하게 인간 유래의 티로시나아제의 활성을 억제한다. 또한, 다음의 실시예들에 나타나는 바와 같이, α-알부틴은 인간에게 사용될 때 β-알부틴에 비하여 훨씬 안전하고, 공기 및 물 속에서 열 및 산화에 대해 대단히 안정하다. α-알부틴이 피부 외용제로 사용될 때, 시간이 경과함에 따라 분해되지 않고 색소침착을 일으키지도 않는다.

α-알부틴은 인간 유래의 티로시나아제에 대하여 강력한 억제 활성을 발휘하고, 인체에 안전하고, 공기 및 물 속에서 열과 산화에 대하여 안정하고, 상기한 대로 피부 외용제로 시간이 경과하여도 변질되지 않으며, 예를 들면 다음과 같은 조건 하에서, 상기 α-아밀라아제 및 당 공여체(공업적 규모에서 유리하게 얻기 위해서는 가용성 스타치)를 사용하여 공업적으로 대량생산이 가능하다.

1 내지 20 중량%, 바람직하게는 1 내지 15 중량%의 하이드로퀴논 및 1 내지 20 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 가용성 당 공여체를, pH 4 내지 pH 9, 바람직하게는 pH 5 내지 pH 8의 용매(인산, 아세트산 등을 함유하는 수용액)에서 용해시키고, 이로부터 수득한 용액을 실온 내지 90℃로, 바람직하게는 30℃ 내지70℃로 가열하고, 1 내지 100 단위량, 바람직하게는 5 내지 80 단위량으로 α-아밀라아제를 첨가하여, 이 용액을 1 내지 48 시간 동안, 바람직하게는 5 내지 24 시간 동안 상기 온도에서 반응시킨다.

가용성 스타치의 초기 투입량은 상기량의 10 내지 50%를 우선 첨가시키고, 반응 도중에 나머지량을 점진적으로(예를 들면, 계획한 시점의 매 1 내지 5 시간마다) 첨가하거나, 또는 초기투입량을 상기량의 50%로 첨가하고, 반응시간의 1/2이 경과한 시점에서 나머지 50%를 첨가하는 등으로 수율의 향상을 도모할 수가 있다.

본 발명은 상기한 바와 같이 수득되며 위에서 언급한 바와 같은 특징들을 나타내는 α-알부틴을 함유하는 피부 외용제에 관한 것으로서, 이들 제제는 연고, 크림, 로션 등을 포함하나, 이들 제형에 국한되지 않는다.

본 발명의 피부 외용제는, 상기 α-알부틴의 함량이 피부 외용제 총량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.05 내지 2 중량%일 때, 좋은 미백 효과(피부 흑화의 예방)를 나타내며, 효과적으로 주근깨를 예방하고 기미를 개선시키지만, 이러한 α-알부틴의 함량이 본 발명을 엄격하게 정의하는 것은 결코 아니다.

[α-알부틴의 제조예]

하이드로퀴논(10 중량%) 및 말트펜토오스(maltpentose)(20 중량%)을 20 mM 아세트 산 수용액(pH 5.5)에 용해하였고, 60 단위의 α-아밀라아제(아밀라아제 X-23)을 함유하는 10 mL(이하, 밀리리터는 "mL"로 기재하고, 리터는 "L"로 기재함)의 효소 용액을 10mL의 수득한 용액에 첨가하였다.

상기 수득 혼합물을 40℃에서 16 시간 동안 유지하였고, 이 용액의 3 배의 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 이 혼합물을 격렬하게 흔들고, 수성 분액을 채집하기 전에 실온에서 30 분 동안 방치하였다. 이 과정을 3 회 반복하고, 수성 분액은 반응하지 않는 하이드로퀴논을 완전히 제거한 후, 감압 하에 건조하였다.

수득한 건조물을 정제수에 용해하고, 정제수에서 평형화된 활성탄 칼럼(column)에 글리코사이드를 흡착시켰다. 이런 다음, 이 칼럼을 우선 20 % 메탄올로 처리하여 그 칼럼에 흡착된 미반응의 당을 용출시킨 후, 글리코사이드를 추출하기 위해 100% 메탄올로 처리하였다.

이 100% 메탄올 분액은 감압하에 건조되었고, 다시 정제수에 용해된 다음, 동결 건조되었다.

이 과정을 통하여, 약 200 ㎎의 하이드로퀴논의 글리코사이드가 수득되었다.

이 경우, 당 전이율(sugar transfer)은 약 27%였다. 출발 반응 6 시간 후, 말트펜토오스가 상기 아세트산 수용액에 약 5 중량%로 첨가되었을 때, 당 전이율은 약 40%로 증가하였다.

[피부 외용제의 제조예]

제형예 1

표 1에 나타낸 조성의 제제를 제조하기 위하여, 상기 실시예에서 제조된 α-알부틴(이하, " α-알부틴"은 항상 이 α-알부틴을 의미하는 것임), 메틸 파라하이드록시벤조에이트 및 부틸 파라하이드록시벤조에이트가 정제수 및 프로필렌 글리콜의 혼합물에 첨가되었고, 이 혼합물을 용해시키기 위하여 80℃까지 가열하였다.

80℃까지 가열함으로써 균일하게 용해하여 수득한 표 1에 나타낸 기타 성분들의 혼합물을 상기 용액에 조금씩 첨가하였고, 수득한 혼합물은 호모-믹서(homo-mixer)를 사용하여 높은 속도로 유화시켰다.

유화반응 후, 연고를 제조하기 위하여, 이 혼합물을 교반과 함께 30℃까지 조금씩 냉각시켰다.

표 1

중량%

α-알부틴바셀린(Vaseline)스테아릴 알코올(stearly alcohol)액체 파라핀POE(20) 세틸 에테르글리세릴 모노스테아레이트메틸 파라하이드록시벤조에이트부틸 파라하이드록시벤조에이트프로필렌 글리콜정제수

2.04.05.017.04.02.00.10.15.0잔량

제형예 2

표 2에 기재된 조성물의 제제를 제조하기 위하여, α-알부틴을 정제수에 첨가하여 70℃에서 용해시켰다. 수득한 용액은 이 온도에서 유지되었다.

한 편, 표 2에 나타낸 기타 성분들을 70 ℃에서 혼합하여 유지시켰다. 상기 70 ℃에서 유지된 α-알부틴 및 정제수의 혼합물을 70℃에서 유지되었던 기타 성분들의 혼합물에 첨가시켰고, 수득한 혼합물은 크림을 제조하기 위하여 교반과 함께 냉각되었다.

표 2

중량%

α-알부틴폴리에틸렌 글리콜 이소스테아레이트세탄올(Cetanol)액체 파라핀이소프로필 미리스테이트디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르파라하이드록시벤조에이트 에스테르프로필렌 글리콜정제수

1.07.51.07.57.510.50.55.0잔량

제형예 3

표 3에 기재된 조성물의 제제를 제조하기 위하여, α-알부틴을 정제수에 첨가하여 70℃에서 용해하였다. 수득한 용액은 이 온도에서 유지되었다.

한 편, 표 3에 나타낸 로커스트 빈 검(locust bean gum)을 제외한 기타 성분들이 혼합되어 70 ℃에서 혼합되어 유지되었다.

상기 70 ℃에서 유지된 α-알부틴 및 정제수의 혼합물이 70℃에서 유지되었던 기타 성분들의 혼합물에 첨가되었다. 수득한 혼합물은 충분히 교반되어 50℃로 냉각되었고, 균일화되어, 30℃로 더욱 냉각되었다.

로커스트 빈 검을 30℃로 냉각된 이 혼합물에 첨가시켰고, 수득한 혼합물을교반하여, 로션을 제조하기 위해 냉각시켰다.

표 3

중량%

α-알부틴폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트소르비탄 모노스테아레이트글리세린 모노스테아레이트세탄올(Cetanol)이소프로필 미리스테이트파라하이드록시벤조에이트 에스테르프로필렌 글리콜로커스트 빈 검정제수

0.055.03.02.02.58.00.52.02.0잔량

[피부 외용제의 평가예]

평가예 1

티로시나아제에 대한 α-알부틴의 억제효과를 인간 세포로부터 얻은 티로시나아제를 사용하여 평가하였다.

버섯 유래의 티로시나아제 대신 인간 유래의 티로시나아제를 사용하여 Funayama et al.[Biosci. Biotech. Biochem., 57(10) 1666-1669(1993)]의 방법에 따라, 억제 효과가 평가되었다. β-알부틴(Nisshin Flour Milling Co. 제조)이 대조군으로서 사용되었다.

얻어진 결과는 표 4에 나타내었다.

표 4

	IC50(mM)
α-알부틴β-알부틴	1.0 mM9.0 mM

IC₅₀(Mm): 티로시나아제 활성을 50%까지 억제하는 시험 물질의 농도.

표 4에 분명히 나타난 바와 같이, 본 발명의 α-알부틴의 IC₅₀수치가 β-알부틴의 것에 비하여 9 배 작으므로, 인간 유래의 티로시나아제에 대하여 매우 강한 억제 효과를 나타내었다.

평가예 2

α-알부틴 함량이 0.5 중량%이고, 대조예의 크림 조성물이 α-알부틴 대신 β-알부틴이 1.0 중량%로 사용된 것을 제외하고, 실시예 2에서 약술한 바와 동일한 방법으로 제조된 본 발명의 크림을 사용하여, 임상적 시도가 진행되었다.

12 명의 건강한 지원자(남자 6 명과 여자 6명, 모두 23 내지 55 세 사이의 12인)가 두 군으로 나뉘었다. 이들 중 반(남자 3 명과 여자 3명, 총 6 명)은 오른쪽 팔의 중간 쪽에 본 발명의 크림을 발랐고, 반면에 나머지 반의 자원자들은 같은 부위에 β-알부틴을 함유하는 대조 크림을 발랐다.

적용은 하루에 3 회(매 8 시간 마다) 7일 연속하여 이루어졌다. 이 적용 부위는 UVB 광원을 사용하여, 적용 첫 날을 시작으로 하여 하루에 총 3회, 1 MED(최소 홍반량: minimal erythema dose)의 UV선에 노출되었다.

두 군의 동일성을 확증하기 위하여, 이 실험의 완료 30일 후에, 대상자들이 교체(cross)되어 오른쪽 팔의 또 다른 부위를 사용하여 같은 실험이 반복되었다.

상기 시험은 이중맹검(double-blind)으로 실시되었다.

피부 흑화 예방 효과는, UV 조사를 시작하기 전에 관찰되는기준선(baseline)에 UV 조사를 시작한 뒤 14일 째에 육안으로 피부색을 비교함으로써 평가되었다. 하기 5-등급 척도가 사용되었다: 매우 효과적임, 효과적임, 조금 효과적임, 효과없음 및 악화됨.

결과들을 표 5에 나타내었다.

표 5

	(β-알부틴 1.0 중량%를 함유하는)대조군 크림	(α-알부틴 0.5 중량%를 함유하는)본 발명의 크림
매우 효과적임효과적임조금 효과적임효과없음악화됨	1 (8.3%)3 (25.0%)5 (41.6%)3 (25.0%)0	2 (16.6%)5 (41.6%)4 (33.3%)1 (8.3%)0

표 5로부터 명백하듯이, 0.5 중량%의 α-알부틴을 함유하는 본 발명의 크림이 1.0 중량%의 β-알부틴을 함유하는 대조군 크림에 비하여 피부 흑화 예방에 보다 효과적이다.

또한, 본 발명의 피부 외용제는 부작용을 일으키지 않아, 피부 흑화에 대한 뛰어난 예방제일 수 있음을 암시해 준다.

제조예 3

실시예 1의 제제 제형으로 얻은 연고 및 α-알부틴 대신 2.0 중량%의 β-알부틴을 이용한 것을 제외하고는 동일한 조성물의 대조군 연고를 사용하여 임상적인 시도가 진행되었다.

기미가 있는 여성 지원자 (40 내지 65세 사이 연령의 26 명)를 2개의 동일한군으로 나누었다. 본 발명의 연고가 한 군에 적용되었고, 그 나머지 군에 상기 β-알부틴 함유 대조군 연고가 적용되었으며, 두 군 모두 3 개월 동안 적용되었고, 기미에 대한 두 형태의 연고 효능이 비교되었다.

연고 연속 3개월 적용 후, 하기 5-등급 척도를 사용하여 기미 개선 효과가 육안으로 평가되었다: 눈에 띄게 향상됨, 향상됨, 조금 향상됨, 효과없음 및 악화됨.

결과는 표 6에 나타나 있다.

표 6

	(β-알부틴 2.0 중량%를 함유하는)대조군 연고	(α-알부틴 2.0 중량%를 함유하는)본 발명의 연고
매우 효과적임효과적임조금 효과적임효과없음악화됨	1 (7.6%)3 (23.0%)6 (46.1%)3 (23.0%)0	2 (15.3%)5 (38.4%)4 (30.7%)2 (15.3%)0

표 6으로부터 명백하듯이, 2.0 중량%의 α-알부틴을 함유하는 본 발명의 크림이, 같은 양의 β-알부틴을 함유하는 대조군 크림에 비하여 더욱 효과적이라는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 연고는 부작용을 일으키지 않아, 뛰어난 기미 개선제일 수 있음을 암시해 준다.

평가예 4

산성 영역 및 알칼리성 영역 내에서 α-알부틴의 안정성이 하이드로퀴논과 대조하여 평가되었다.

분해율은 산성(pH 5.5), 중성(pH 6.5) 및 알칼리성(7.5) 수용액(α-알부틴 및 하이드로퀴논 모두 0.045 M 및 37 ℃)에서 측정되었다.

결과는 표 7에 나타나 있다.

표 7

하이드로퀴논	α-알부틴
pH	분해율 상수	반감기(시간)	분해율 상수	반감기(시간)
5.56.57.5	0.0640.9031.117	10.80.80.6	00.0130.022	분해되지 않음*53.331.5

* 69 시간 후에 결정됨

표 7로부터 명백하듯이, 알칼리성 및 산성 영역에서 반감기는 0.6 내지 10.8 시간 같이 짧은 하이드로퀴논보다 α-알부틴이 더 길게 나타났고, α-알부틴이 매우 안정하다는 것을 암시한다.

따라서, 본 발명의 α-알부틴이 피부 외용제에서 우수한 안정성을 유지한다는 것을 확인할 수 있다.

평가예 5

β-알부틴과 대조하여 아래에 나타낸 바와 같이, 마우스 피부 상에서 α-알부틴의 지속성이 평가되었다.

24 주령의 마우스를 경추 탈골로 사망시킨 뒤, 등 피부를 탈모하고 박리시켰다. 이 피부 샘플들을 0.5 내지 2.0 g으로 칭량하여, 0.037 M α-알부틴 또는 β-알부틴(2.0 mL, pH 7.0)을 함유하는 소듐 시트레이트-포스페이트 완충액에 첨가하고, 37 ℃에서 배양하였다.

19 내지 40 시간 뒤에 이 샘플들을 원심분리하고, 그 상청액 내 α-알부틴 및 β-알부틴의 잔존율을 계산하기 위하여 이들의 양을 HPLC로 측정하였다.

각 샘플은 4 군 모두에 있어서 3중검체(n=3)로 시험되었고, 평균 잔존율을 계산하였다.

칼럼: ODS (4.6 × 250 ㎜)

용매: 메탄올-물 (20:80, v/v, 인산을 사용하여 pH 2.5로 조정됨)

검출: 280 ㎚

흐름 속도: 0.5 mL/min

온도: 40℃

결과는 도 1에 도시하였다.

도 1로부터 명백하듯이, 배양을 시작한 지 19 시간 뒤에는 α-알부틴 및 β-둘 다 거의 남아 있었지만, 배양을 시작한 지 40 시간 뒤에 모든 군에서 분해가 확인되었다. α-알부틴이 0.5 g의 피부 샘플에 첨가된 군에서 이 잔존율은 87.5%였다. 피부 샘플에 같은 양으로 β-알부틴이 첨가된 군에서 이 잔존율은 0%였고, 이는 β-알부틴이 완전하게 분해됨을 나타낸다.

2.0 g의 피부 샘플이 첨가되었던 군에서, 배양을 시작한 지 40 시간 뒤에α-알부틴은 잔존율이 β-알부틴의 잔존율에 비해 약 10 배 정도 크게 나타났고, 이는 α-알부틴이 β-알부틴에 비하여 쉽게 분해되지 않음을 암시한다.

평가예 6

평가예 5에서와 같이, 동일한 피부 샘플을 사용하여 α-알부틴 및 β-알부틴의 지속성이 평가되었다.

평가예 5에서 얻은 이 피부 샘플들은 2.6 g 칭량되어, 소듐 시트레이트-포스페이트 완충액(5.2 mL, pH 7.0)에 첨가되었고 균일화되었다. 균일해진 결과물은 피부 추출액으로 사용되었다.

이 피부 추출액과 1.0 M α-알부틴 또는 β-알부틴(5.2 mL, pH 7.0)을 함유하는 시트레이트-포스페이트 Na 완충액과 부피비 1:1 (v/v)로 혼합되고, 37℃에서 배양되었다.

4 내지 20 시간 뒤에 이 샘플들이 원심분리되었고, 그 상청액 내 α-알부틴 및 β-알부틴의 잔존율을 계산하기 위하여 이들의 양을 HPLC로 측정하였다.

각 샘플은 4 군 모두에 있어서 3중검체(n=3)로 시험되었고, 평균 잔존율이 계산되었다.

HPLC는 평가예 5에서 사용된 조건 하에 진행되었다.

결과는 도 2에 도시하였다.

도 2로부터 명백하듯이, α-알부틴 및 β-알부틴 모두 4시간 뒤에는 분해되지 않았지만, 20 시간 뒤에는 α-알부틴은 β-알부틴 군의 2 배 이상 높은 잔존율을 나타내었고, 이는 α-알부틴이 β-알부틴보다 더 안정하다는 것을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 α-알부틴을 함유하는 피부 외용제를 사용한다면, 하기 효과들이 얻어질 수 있다:

(1) 인간 티로시나아제를 사용하여 이들 효과를 측정하였을 때, 본 발명에 따르는 α-알부틴이 종래의 β-알부틴에 비하여 피부 흑화 예방 및 착색을 유도하는 멜라닌 생성에 관련이 있는 티로시나아제에 대하여 대단히 높은 억제 효과를 나타내었다.

(2) 건강한 지원자에 대한 임상적 실험에 있어서, 본 발명에 따르는 α-알부틴을 함유하는 피부 외용제가 종래의 β-알부틴을 함유하는 피부 외용제에 비하여 더 큰 미백 효과(피부 흑화 예방) 및 기미 개선 효과를 나타내었다. 부작용은 관찰되지 않았으며, 이는 안전성에 관련하여 문제가 없음을 암시한다. 따라서, 본 발명의 α-알부틴을 함유하는 피부 외용제는 피부 미백제 및 기미 개선제로서 효과적이다.

(3) 본 발명에 따르는 α-알부틴이 물 속에서 안정하기 때문에, 연고, 로션 및 크림과 같은 외용제로의 사용에 효과적이다.

(4) 본 발명의 α-알부틴은 마우스 피부 상에서 오랜 시간 동안 유지되기 때문에, 인간 대상의 피부 외용제로의 사용에 효과적이다.

Claims (1)

1. 인간 티로시나아제에 대하여 월등한 억제 활성을 가지는 하이드로퀴논-α-D-글루코피라노사이드를 함유하는 피부 외용제.