PL206561B1

PL206561B1 - Sposób ekstrakcji białka z komórki bakterii, drożdży lub grzyba, sposób skriningu zmutowanych transformowanych komórek oraz zastosowanie kompozycji do ekstrakcji błon

Info

Publication number: PL206561B1
Application number: PL356129A
Authority: PL
Inventors: Claus Lindvald Johansen; Søren Kjaerulff; Susan Mampusti Madrid; Henrik Pedersen; Charlotte Horsmans Poulsen; Masoud Rajabi Zargahi
Original assignee: Danisco; Danisco A/S
Priority date: 1999-11-24
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2010-08-31
Also published as: DK1232269T3; BRPI0015823B1; CN1425069B; JP2003514563A; EP1944373A2; DE60041517D1; CA2391522C; AU783526B2; NZ518660A; PL356129A1; ATE494379T1; EP1232269B1; EP1944373B1; DK1944373T3; AU1877001A; GB9927801D0; BR0015823A; WO2001038544A1; DE60045495D1; JP4781588B2

Description

(21) Numer zgłoszenia: 356129 (22) Data zgłoszenia: 24.11.2000 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

24.11.2000, PCT/IB00/001886 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

31.05.2001, WO01/38544 (11) 206561 (13) B1 (51) Int.Cl.

C12P 21/06 (2006.01)

C12N 9/04 (2006.01)

C12R 1/78 (2006.01)

C12N 1/15 (2006.01)

C12N 1/19 (2006.01)

C12N 1/21 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważ one błędy

Sposób ekstrakcji białka z komórki bakterii, drożdży lub grzyba, (54) sposób skriningu zmutowanych transformowanych komórek oraz zastosowanie kompozycji do ekstrakcji błon

	(73) Uprawniony z patentu: DANISCO A/S, Copenhagen K, DK
(30) Pierwszeństwo: 24.11.1999, GB, 9927801.2	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	CLAUS LINDVALD JOHANSEN, H0jbjerg, DK S0REN KJAERULFF, Hillerad, DK SUSAN MAMPUSTI MADRID, Vedaek, DK
14.06.2004 BUP 12/04	HENRIK PEDERSEN, 0stbrik, DK
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	CHARLOTTE HORSMANS POULSEN, Braband, DK MASOUD RAJABI ZARGAHI, Abyh0j, DK
31.08.2010 WUP 08/10	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska

PL 206 561 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób ekstrakcji rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) z komórki bakterii, drożdży lub grzyba, sposób skriningu zmutowanych lub transformowanych komórek produkujących podwyższone poziomy rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego białka będącego przedmiotem zainteresowania oraz zastosowanie kompozycji do ekstrakcji błon.

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu uwalniania wewnątrzkomórkowego rekombinowanego białka, będącego przedmiotem zainteresowania (ang. protein of interest, POI), w którym rekombinowanym POI jest enzym - oksydaza heksozowa (HOX) albo antagonista receptora interleukiny 1 IL-1ra. W szczególności, wynalazek dotyczy sposobu uwalniania rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego rekombinowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) przy użyciu kompozycji do ekstrakcji błon, która uczestniczy w uwalnianiu POI, przy czym POI to enzym oksydaza heksozowa (HOX) albo antagonista receptora interleukiny 1 IL-1ra.

Stan techniki

W tradycyjnym sposobie otrzymywania wewną trzkomórkowego POI, takiego jak enzym, wykorzystywano metodę rozbijania mechanicznego (Naglak i wsp., 1990), takiego jak szklanymi paciorkami lub przy pomocy homogenizatora, działającego na zasadzie „prasy francuskiej”. Jednakże, tego typu metody mechanicznego rozbijania posiadają wadę związaną ze zużyciem energii i niską skutecznością, a homogenizatory komórek lub podobny im sprzęt wymagany do mechanicznego rozbijania są drogie. Ponadto, metody mechaniczne narażają komórkę, a przez to i ekstrahowane POI, na trudne warunki, w szczególności dlatego, że większość białek ulegnie denaturacji wywołanej przez wysoką temperaturę, jeśli aparat taki i/lub homogenat nie zostaną skutecznie schłodzone. Dodatkowo, pewne komórki, takie jak komórki drożdżowe (jak komórki Hansenula) są trudne do mechanicznego rozbicia i wymagany jest wię cej niż jeden pasaż przez homogenizator. Homogenat komórkowy moż e takż e zawierać fragmenty ściany komórkowej i DNA, co powoduje znaczną lepkość próby. Oznacza to, że oddzielenie pozostałości komórkowych od POI może okazać się trudną operacją. Ponadto, uzyskany bezkomórkowy homogenat może zawierać nie tylko wewnątrzkomórkowe POI, lecz również olbrzymią ilość (czasem kilka tysięcy) różnych wewnątrzkomórkowych białek i enzymów związanych z ogólnym metabolizmem komórki. Wiąże się to z tym, ż e tak otrzymany bezkomórkowy homogenat może być nie tylko trudny do zatężenia drogą ultrafiltracji, ale także może stwarzać problemy związane z uzyskaniem prawidłowego handlowego stężenia danego POI.

W celu minimalizowania potencjalnego działania szkodliwego pewnych mechanicznych sposobów rozbijania, do zwiększania przepuszczalności komórek drożdżowych stosuje się metody chemiczne, przykładowo wykorzystujące detergenty. Przykładowo, stosuje się detergenty niejonowe, polietoksylowane oktylofenole, komercyjnie dostępne jako Triton-100, które są wykorzystywane samodzielnie lub w połączeniu z cyklicznym zamrażaniem-rozmrażaniem (patrz Naglak i wsp. 1990). Ponadto, patent US nr 5 124 256 (Crahay i wsp. 1992) ujawnia sposób, w którym białka są ekstrahowane z drożdży Saccharomyces poprzez traktowanie drożdży wodnym środowiskiem obojętnych rozpuszczalnych w wodzie soli mineralnych i niejonowego rozpuszczalnego w wodzie polietoksylowanego alkilofenolowego surfaktanta posiadającego Hydrofilowy Równoważnik Lipofilowy (HLB) od 8 do 15. Jednakże, niejonowe surfaktanty rozpuszczalne w wodzie polietoksylowanego alkilofenolu obejmujące polietoksylowane oktylofenole, nonylofenole i tributylofenole (zwłaszcza te dostępne komercyjnie pod nazwami TritonX-100, Nonidet P-40 i Sapogenat T-080) posiadają następujące wady: (i) nie posiadają dostatecznego działania ekstrakcyjnego, gdy są stosowane samodzielnie oraz (ii) surfaktanty te mogą wpływać na pomiary aktywności enzymatycznej POI.

Kilka rozpuszczalników organicznych wykorzystano zarówno do zwiększania przepuszczalności komórek drożdży w testach in situ, jak i do usuwania białek z drożdży. Przykładami takich rozpuszczalników są bez ograniczenia toluen, octan etylu, dimetylosulfotlenek i benzen łączony z glicerolem (Naglak i wsp. 1990). Jednakże, te rozpuszczalniki są nieatrakcyjne w stosowaniu na skalę przemy₃ słową, gdy wymagana jest objętość fermentora przekraczająca 200 m³.

Digitonina i inne naturalnie występujące saponiny posiadają również zdolność zwiększania przepuszczalności licznych komórek eukariotycznych (patrz Joshi i wsp. 1989). Pomimo tego, że dokładny mechanizm zwiększania przepuszczalności za pomocą digitoniny nie jest poznany, uznaje się, że digitonina tworzy kompleksy z cholesterolem obecnym w błonie komórkowej i czyni błonę przePL 206 561 B1 puszczalną. Zwiększanie przepuszczalności digitoniną komórek drożdżowych może następować także w efekcie kompleksowania z ergosterolami błony droż dż owej. Joshi i wsp. (1989) stosował digitoninę (0,1%) do zwiększania przepuszczalności drożdży Kluyveromyces, co ułatwia wewnątrzkomórkową katalizę laktozy do glukozy i galaktozy. Niejonowy detergent, saponina, z Quillaja Bark, jest innym czynnikiem kompleksującym cholesterol, który zwiększa przepuszczalność co najmniej komórek ssaczych (Naglak i wsp. 1990). Podobnie jak w przypadku detergentów niejonowych opisanych powyżej, stosowanie digitoniny i innych występujących w przyrodzie saponin może być nie zalecane, ponieważ stosowane samodzielnie, mogą one nie posiadać dostatecznego działania ekstrakcyjnego.

Do ułatwienia ekstrakcji enzymów wewnątrzkomórkowych stosowano również czynniki chaotropowe. Przykładowo, patent US nr 3 801 461 (Miyake i Shiosaka 1974) ujawnia sposób ekstrakcji wewnątrzkomórkowych enzymów produkowanych w grzybniach lub komórkach grzybów lub bakterii za pomocą roztworów chaotropowych, takich jak roztwór mocznika. Patent US nr 4 683 293 (Craig 1987) ujawnia także sposób selektywnej ekstrakcji białek lipofilowych z komórek transformowanych rodzaju Pichia poprzez lizę komórek w obecności soli chaotropowych, takich jak tiocyjanian sodu, jodek sodu, podchloryn sodu, bromek litu, chlorowodorek guanidyny i mocznik. Jednakże, czynniki chaotropowe posiadają taką wadę, że wystawianie POI na działanie czynnika chaotropowego, takiego jak mocznik, może spowodować utratę aktywności enzymatycznej poprzez denaturację POI.

Obok wad opisanych powyżej, opisane tu znane ze stanu techniki metody odnoszą się jedynie do zwiększania przepuszczalności komórek gospodarza wobec cząsteczek o małej masie cząsteczkowej i pozwalając POI na pozostanie nie zmienionym w komórkach. Przykładowo, żaden z opisanych sposobów nie opisuje ekstrakcji towarzyszących błonie wewnątrzkomórkowych POI w warunkach nie wpływających na naturę i/lub aktywność POI. W szczególności, żaden z opisanych sposobów nie jest sposobem pozwalającym na uwalnianie towarzyszących błonie wewnątrzkomórkowych POI, które są uwięzione i nie są możliwe do wydzielania z komórek gospodarza.

Niniejszy wynalazek poszukuje rozwiązania tych problemów towarzyszących sposobom ekstrakcji znanym ze stanu techniki.

Wynalazek dostarcza sposobu uwalniania rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego rekombinowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) z organizmu gospodarza, przy czym jako rekombinowane POI stosuje się enzym oksydazę heksozową (HOX) albo antagonistę receptora interleukiny 1 IL-1ra.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób ekstrakcji rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego rekombinowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) z komórki bakterii, droż dży lub grzyba, przy czym jako rekombinowane POI stosuje się albo enzym oksydazę heksozową (HOX), albo antagonistę receptora interleukiny 1 IL-1ra, polegający na tym, że obejmuje etapy, w których:

(a) dostarcza się komórkę bakterii, drożdży lub grzyba zawierającą rozpuszczalne lub związane z bł oną wewną trzkomórkowe rekombinowane POI, przy czym jako komórkę bakterii, droż d ż y lub grzyba stosuje się komórkę transformowaną;

(b) uwalnia się rekombinowane POI z tej komórki poprzez kontaktowanie tej komórki z kompozycją do ekstrakcji błon zawierającą czwartorzędowy związek amoniowy w stężeniu pomiędzy 0,05% a 0,6% wagowych, w warunkach wystarczają cych do uwolnienia rekombinowanego POI w postaci rozpuszczalnej i (c) odzyskuje się rekombinowane POI z kompozycji do ekstrakcji błon.

Korzystnie, ekstrahuje się wewnątrzkomórkowe rekombinowane POI wytworzone z użyciem technik rekombinacji DNA.

Korzystnie, jako komórkę stosuje się komórkę drożdży.

Korzystnie, stosuje się czwartorzędowy związek amoniowy wybrany z grupy składającej się z bromku lauroilotrimetyloamonu (LTAB), chlorku mirystylotrimetyloamonu (MTAC), chlorku cetylotrimetyloamonu (CTAC), cetrymidu, bromku cetylotrimetyloamonu (CTAB), chlorku stearoilotrimetyloamonu (STAC), bromku stearoilotrimetyloamonu (STAB), chlorku benzalkonium (chlorku alkilodimetylobenzyloamonu), bromku N-cetylopirydyny (bromku N-heksadecylopirydyny), chlorku N-cetylopirydyny (chlorku N-heksadecylopirydyny), chlorku benzylodimetylotetradecyloamonu, chlorku benzylodimetyloheksadecyloamonu i kombinacji jakichkolwiek dwóch lub więcej z wymienionych składników.

Korzystnie, komórkę bakterii, drożdży lub grzyba kontaktuje się z kompozycją do ekstrakcji błon w temperaturze od 4°C do 40°C.

PL 206 561 B1

Korzystnie, komórkę bakterii, drożdży lub grzyba kontaktuje się z kompozycją do ekstrakcji błon w pH od 2,0 do okoł o 11,0.

Korzystnie, gdy jako rekombinowane POI stosuje się enzym HOX, to ten enzym HOX obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID No: 22 lub jej wariant, homolog, pochodną lub fragment, które wykazują co najmniej 90% identyczność z sekwencją aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 22.

Korzystnie, gdy jako rekombinowane POI stosuje się enzym HOX, to ten enzym HOX kodowany jest przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariant, homolog, pochodną lub fragment, które wykazują co najmniej 90% homologię z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22.

Korzystniej, gdy jako rekombinowane POI stosuje się enzym HOX, to ten enzym HOX kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzacji z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariantem, homologiem, pochodną lub fragmentem, które wykazują co najmniej 90% homologię z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22, lub sekwencję komplementarną z sekwencją, która ulega hybrydyzacji.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób skriningu zmutowanych komórek lub transformowanych komórek produkujących podwyższone poziomy rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego rekombinowanego POI, przy czym jako rekombinowane POI stosuje się albo enzym oksydazę heksozową (HOX) albo antagonistę receptora interleukiny 1 IL-1ra, polegający na tym, że obejmuje etapy, w których:

(a) hoduje się zmutowane lub transformowane komórki w 30°C;

(b) inkubuje się zmutowane lub transformowane komórki z kompozycją do ekstrakcji błon zawierającą czwartorzędowy związek amoniowy w stężeniu pomiędzy 0,05% a 0,6% wagowych;

(c) odzyskuje się pożywkę pozbawioną komórek;

(d) poddaje się skriningowi pożywkę pozbawioną komórek pod kątem podwyższonych poziomów wewnątrzkomórkowego rekombinowanego POI;

przy czym obecność wewnątrzkomórkowego rekombinowanego POI w pożywce pozbawionej komórek wskazuje na uwolnienie wewnątrzkomórkowego rekombinowanego POI;

i przy czym jako zmutowaną lub transformowaną komórkę stosuje się komórkę bakterii, drożdż y lub grzyba.

Korzystnie, jako czwartorzędowy związek amoniowy w kompozycji do ekstrakcji błon stosuje się związek wybrany z grupy obejmującej bromek lauroilotrimetyloamonu (LTAB), chlorek mirystylotrimetyloamonu (MTAC), chlorek cetylotrimetyloamonu (CTAC), cetrymid, bromek cetylotrimetyloamonu (CTAB), chlorek stearoilotrimetyloamonu (STAC), bromek stearoilotrimetyloamonu (STAB), chlorek benzalkonium (chlorek alkilodimetylobenzyloamonu), bromek N-cetylopirydyny (bromek N-heksadecylopirydyny), chlorek N-cetylopirydyny (chlorek N-heksadecylopirydyny), chlorek benzylodimetylotetradecyloamonu, chlorek benzylodimetyloheksadecyloamonu i kombinacje jakichkolwiek dwóch lub więcej z wymienionych składników.

Korzystnie, gdy jako rekombinowane POI stosuje się enzym HOX, to ten enzym HOX kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzacji z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariantem, homologiem, pochodną lub fragmentem, które wykazują co najmniej 90% homologię z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22, lub sekwencję komplementarną z sekwencją, która ulega hybrydyzacji.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie kompozycji do ekstrakcji błon, zawierającej czwartorzędowy związek amoniowy w stężeniu pomiędzy 0,05% a 0,6% wagowych, do ekstrakcji rekombinowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) z transformowanej komórki bakterii, drożdży lub grzyba, przy czym jako rekombinowane POI stosowany jest albo enzym oksydaza heksozową (HOX), albo antagonista receptora interleukiny 1 IL-1ra.

PL 206 561 B1

Korzystnie, gdy jako rekombinowane POI stosowany jest enzym HOX, to ten enzym HOX obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariant, homolog, pochodną lub fragment, które wykazują co najmniej 90% identyczność z sekwencją aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 22.

Korzystnie, gdy jako rekombinowane POI stosowany jest enzym HOX, to ten enzym HOX kodowany jest przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariant, homolog, pochodną lub fragment, które wykazują co najmniej 90% homologię z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22.

Zgodnie z wynalazkiem opisano tu sposób prowadzenia uwalniania rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego rekombinowanego POI, które jest uwięzione i/lub nie może być wydzielane z komórki gospodarza. Ekstrakcja wewnątrzkomórkowego POI za pomocą sposobu tu opisanego została porównana z tradycyjnymi sposobami rozbijania komórek i procedurami ekstrakcyjnymi stosującymi inne jonowe/niejonowe detergenty i emulgatory. Sprawdzono także kombinacje detergentów z proteazą i solami. Wyniki wskazują, że ekstrakcja rozpuszczalnych lub towarzyszących błonie wewnątrzkomórkowych POI za pomocą sposobu tu opisanego jest dogodna ponieważ:

(i) można uniknąć tradycyjnych technik rozbijania komórek;

(ii) wewnątrzkomórkowe POI mogą być odzyskiwane w stanie wolnym jod zanieczyszczeń DNA i fragmentów ś ciany komórkowej, (iii) wewnątrzkomórkowe POI mogą być odzyskiwane z komórek gospodarza eukariotycznego, takiego jak drożdże, zanim nastąpi glikozylacja. Nadmierna glikozylacja wydzielanego białka jest znanym problemem zwłaszcza w przypadku eukariotycznych gospodarzy, takich jak drożdże. Ta wada związana z drożdżowym układem ekspresyjnym może prowadzić do uniemożliwienia stosowania drożdży w układach produkcji białek, pomimo tego, że wektory drożdżowe pozwalają na wysoki poziom ekspresji białka i wysoką biomasę, a ponadto drożdże są dopuszczone do stosowania w żywności. Poprzez ekspresję POI wewnątrzkomórkowo i następnie ekstrakcję POI sposobem tu opisanym, uzyskiwane POI pozostaje nie glikozylowane, ponieważ POI nie przechodzi przez ścieżkę sekrecyjną, w trakcie której nastę puje glikozylacja;

(iv) procedury fermentacyjne poprzedzające sposób tu opisany mogą być prowadzone w dowolnym pH odpowiednim dla komórek gospodarza. Powszechnie wiadomo, że wydzielane POI może być uszkodzone przez działanie pH zewnątrzkomórkowej pożywki do hodowli. Dotychczas konieczne było utrzymywanie pH pożywki hodowlanej dla organizmu gospodarza w pobliżu obojętnego pH, ponieważ fermentacja w takim pH była uznana za konieczną dla zachowania stabilności wydzielanego POI, pomimo tego, że zwiększa to ryzyko powstania zanieczyszczeń bakteryjnych. W sposobie tu opisanym POI nie jest wydzielane. Zatem, pH pożywki hodowlanej jest nieistotne tak długo jak pH wewnątrzkomórkowe pozostaje stałe niezależnie od pH pożywki. Pozwala to zatem na wzrost mikroorganizmu gospodarza (takiego jak drożdże) w niższym pH (takim jak pH 4,0), co zmniejsza ryzyko powstania zanieczyszczeń bakteryjnych bez wpływu na jego biomasę lub wytwarzanie POI; i (v) sposób tu opisany może być stosowany w celu zapobiegania kontaktowi wewnątrzkomórkowego POI z zewnątrzkomórkowym podłożem wzrostowym. Jest to zalecane w przypadku, gdy POI jest niestabilne w zewnątrzkomórkowym podłożu, ze względu, na przykład, na wrażliwość na proteazy. Poprzez wewnątrzkomórkową ekspresję i późniejszą ekstrakcję sposobem tu opisanym, unika się kontaktu ze środowiskiem zewnątrzkomórkowym.

Streszczenie realizacji

W szerokim aspekcie opisano tu sposób uwalniania z komórki białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI). Sposób ten obejmuje etapy: dostarczenia komórki zawierającej rozpuszczalne lub towarzyszące błonie wewnątrzkomórkowe POI; kontaktu komórki z kompozycją do ekstrakcji błon i wywoł anie uwolnienia POI: z komórki, w warunkach wystarczają cych do uwolnienia POI; oraz w jego postaci rozpuszczalnej. W niniejszym wynalazku POI może być będącym przedmiotem zainteresowania białkiem wewnątrzkomórkowym i/lub POI może być oksydazą heksozową (D-heksoza: O2-oksydoreduktaza, EC 1.1.3.5).

PL 206 561 B1

Szczegółowy opis realizacji

W jednej z realizacji dostarczony jest sposób uwalniania rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) z transformowanej komórki, obejmujący etapy: dostarczenia transformowanej komórki zawierającej rozpuszczalne lub towarzyszące błonie wewnątrzkomórkowe (POI); kontaktu transformowanej komórki z kompozycją do ekstrakcji błon; i wywołania uwolnienia POI z transformowanej komórki, w warunkach wystarczających do specyficznego uwolnienia POI oraz w jego postaci rozpuszczalnej.

W innej realizacji dostarczony jest sposób uwalniania enzymu HOX z transformowanej komórki, obejmujący etapy: dostarczenia transformowanej komórki zawierającej enzym HOX; kontaktu transformowanej komórki z kompozycją do ekstrakcji błon; i wywołania uwolnienia enzymu HOX z transformowanej komórki, w warunkach wystarczających do specyficznego uwolnienia enzymu HOX oraz w jego postaci rozpuszczalnej.

W innej realizacji dostarczony jest sposób uwalniania antagonisty receptora interleukiny 1 (IL-1ra) z transformowanej komórki, obejmujący etapy: dostarczenia transformowanej komórki zawierającej IL-1ra; kontaktu transformowanej komórki z kompozycją do ekstrakcji błon; i wywołania uwolnienia IL-1ra z transformowanej komórki, w warunkach wystarczających do specyficznego uwolnienia IL-1ra oraz w jego postaci rozpuszczalnej.

W innej realizacji dostarczony jest sposób skriningu mutantów produkujących dużą ilość rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego POI, obejmujący etapy: hodowli zmutowanych komórek w 30°C; inkubacji zmutowanych komórek wraz z kompozycją do ekstrakcji błon, odzyskania podłoża pozbawionego komórek; skriningu podłoża pozbawionego komórek pod kątem wysokiego poziomu wewnątrzkomórkowego POI; tak, że obecność podłoża pozbawionego komórek z wewnątrzkomórkowym POI wskazuje, że wewnątrzkomórkowe POI zostało uwolnione.

W innej realizacji dostarczona jest kompozycja do ekstrakcji bł on, odpowiednia do uwolnienia rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego POI, która to kompozycja kontaktowana jest z komórką w następujących warunkach: procent wagowy czwartorzędowego związku amoniowego wynosi od około 0,05% do około 0,6% (bardziej zalecane od około 0,1% do około 0,5%, w szczególności od około 0,2% do okoł o 0,45%, zwłaszcza około 0,4%); optimum pH od okoł o 2,0 do około 11,0 (bardziej zalecane od około 5,0 do około 7,0, w szczególności około 6,3); optimum temperatury od około 4°C do 40°C (bardziej zalecane od około 20°C do około 30°C, w szczególności około 25°C).

W innej realizacji dostarczona jest kompozycja do ekstrakcji błon zawierająca czwartorzędowy związek amoniowy, odpowiedni do uwolnienia rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego POI.

W innej realizacji istotnie nie glikozylowane POI uwalniane jest z organizmu eukariotycznego gospodarza.

Inne realizacje i korzyści z niniejszego wynalazku przedstawiono w załączonych zastrzeżeniach i dyskusji. Zagadnienia te zaprezentowano w oddzielnych nagłówkach podrozdziałów. Jednakż e, należy przyjąć, że wskazówki w tych podrozdziałach nie są koniecznie ograniczone do tych nagłówków.

Szczegółowy opis

Niniejszy wynalazek oparty jest na stwierdzeniu, że kompozycja do ekstrakcji błon, zawierająca czwartorzędowe związki amoniowe może być wykorzystana do przeprowadzenia szybkiej, specyficznej, taniej ekstrakcji rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego POI, bez potrzeby stosowania tradycyjnych technik rozbijania komórek. Dogodnie i nieoczekiwanie, uzyskany w ten sposób ekstrakt komórkowy zawiera bardzo mało zanieczyszczającego, wewnątrzkomórkowego DNA i jest względnie pozbawiony fragmentów ścian komórkowych, co ułatwia jakiekolwiek dalsze etapy oczyszczania, którym poddane jest POI. Stanowi to przeciwieństwo wobec wcześniejszych metod ekstrakcji mechanicznej.

Białko wewnątrzkomórkowe

Stosowany termin „wewnątrzkomórkowe” POI oznacza POI występujące wewnątrz lub w środku komórki lub komórek. Wewnątrzkomórkowe POI może być położone w środku komórki (tak jak w cytoplazmie komórki), nawet, jeśli posiada mechanizm sygnałowy dla wydzielania. W tym znaczeniu, wewnątrzkomórkowe POI może być POI, które nie jest aktywnie wydzielane z komórki lub które jest niezdolne do bycia wydzielonym przez komórkę, nawet, jeśli posiada mechanizm sygnałowy dla wydzielania. Alternatywnie, wewnątrzkomórkowe POI może być naturalnie wydzielanym POI, zmienioPL 206 561 B1 nym tak, aby zapobiec jego wydzielaniu z komórki. Alternatywnie, POI może być białkiem chimerycznym zawierającym domenę wiążącą z błoną komórkową.

Sposób tu opisany stanowi przeciwieństwo sposobu opisanego przez Ahlstrom i Edebo (1994

FEMS Microbiology Letters 119 7-12), gdzie opisano uwalnianie β-laktamazy z periplazmy E. coli za pomocą tetradecylobetainy. Periplazma jest regionem w komórce bakteryjnej między błoną komórkową a ścianą komórkową, β-laktamaza z periplazmy E. coli jest więc zlokalizowana na zewnątrz błony komórkowej i nie jest enzymem cytoplazmatycznym. Przeciwnie, POI zgodnie z wynalazkiem jest wewnątrzkomórkowym POI znajdującym się wewnątrz lub w środku komórki bądź komórek.

POI towarzyszące błonie

Stosowany termin „POI towarzyszące błonie” oznacza POI, które może być zlokalizowane w sąsiedztwie błony, ale może nie być istotnie towarzyszące błonie komórkowej lub plazmatycznej. Zatem, enzym towarzyszący błonie nie jest białkiem istotnie związanym z błoną, albo enzym towarzyszący błonie nie jest istotnie związany z błoną komórkową. POI towarzyszące błonie może stać się rozpuszczalne w wyniku mechanicznego działania homogenizatora komórkowego.

POI związane z błoną

Stosowany termin „POI związane z błoną” dotyczy białka, które nie staje się rozpuszczalne w wyniku mechanicznego działania homogenizatora komórkowego.

Specyficzne uwalnianie

Stosowany termin „specyficzne uwalnianie” oznacza, że specyficzna aktywność POI jest wyższa niż mierzona po ekstrakcji z użyciem mechanicznych środków - jak przy zastosowaniu młynków z paciorkami lub homogenizatora komórek działającego na zasadzie prasy francuskiej.

Transformowana komórka

Stosowany termin „transformowana komórka” obejmuje komórki transformowane drogą technik rekombinacyjnych DNA. Transformacja następuje zazwyczaj poprzez wstawienie jednej lub więcej sekwencji nukleotydowych do podlegającej transformacji komórki. Wstawiona sekwencja nukleotydową może być heterologiczną sekwencją nukleotydową (tj. sekwencją nie występującą naturalnie w transformowanej komórce). Ponadto, lub alternatywnie, wstawiona sekwencja nukleotydową może być homologiczną sekwencją nukleotydową (tj. sekwencją występującą naturalnie w transformowanej komórce) tak, że komórka otrzymuje jedną lub więcej dodatkowych kopii sekwencji nukleotydowej już w niej obecnej.

Kompozycja do ekstrakcji błon

Stosowany termin „kompozycja do ekstrakcji błon” oznacza kompozycję zdolną do oddziaływania na składniki błony komórkowej, w taki sposób, że wewnątrzkomórkowe POI związane z błoną i/lub towarzyszące błonie ulega wystarczającej dysocjacji, i/lub uwolnieniu ze składnika błony, a POI jest łatwe do odzyskania, i/lub uzyskania z kompozycji do ekstrakcji błon. POI może być również rozpuszczalnym POI. W bardzo zalecanych realizacjach stosowana tu kompozycja do ekstrakcji błon zawiera jeden lub więcej czwartorzędowych związków amoniowych lub ich kombinacje.

Czwartorzędowe związki amoniowe

Stosowany w niniejszym termin „czwartorzędowy związek amoniowy” oznacza związek możliwy do uzyskania z wodorotlenku amonu lub soli amoniowej przez zastąpienie wszystkich czterech atomów wodoru jonu NH4⁺ grupami organicznymi, takimi samymi lub różnymi, zwykle jedną z grup organicznych jest długołańcuchowa grupa (C8-C18)alkilowa, a pozostałe trzy są alkilami o krótszych łańcuchach bądź innymi grupami.

W zalecanej realizacji, związki te posiadają strukturę: CH3-(CH2)n-N(CH3)⁺3, gdzie n jest liczbą grup metylenowych w łańcuchu a przeciwjon może być halogenem, takim jak jon chlorkowy lub bromkowy. Związki te posiadają właściwości detergentów kationowych i są silnymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi.

Przykłady czterowartościowych związków amoniowych obejmują nieograniczajaco: bromek lauroilotrimetyloamonu (LTAB), chlorek mirystylotrimetyloamonu (MTAC), chlorek cetylotrimetyloamonu (CTAC), bromek cetylotrimetyloamonu (CTAB), cetrymid (lub Cetrymidum zawierającego mieszaninę bromków alkiloamoniowych, głównie CTAB), chlorek stearoilotrimetyloamonu (STAC), bromek stearoilotrimetyloamonu (STAB), chlorek benzalkonium (chlorek alkilodimetylobenzyloamonu), bromek N-cetylopirydyny (bromek N-heksadecylopirydyny), chlorek N-cetylopirydyny (chlorek N-heksadecylopirydyny), chlorek benzylodimetylotetradecyloamonu i chlorek benzylodimetyloheksadecyloamonu.

PL 206 561 B1

Na przykład, strukturę pewnych związków zilustrowano następująco. Związki te wymieniono w kolejności wzrastają cych grup metylowych:

LTAB oznacza H3C-(CH2)11-N(CH3)3Br MTAC oznacza H3C-(CH2)13-N(CH3)3Cl CTAC oznacza H3C-(CH2)15-N(CH3)3Cl CTAB oznacza H3C-(CH2)15-N(CH3)3Br STAC oznacza H3C-(CH2)17-N(CH3)3Cl STAB oznacza H3C-(CH2)17-N(CH3)3Br.

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest chlorek cetylopirydyny (CPC, C21H38NCl). Struktura CPC zilustrowana została następująco:

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest bromek cetylopirydyny (CPB, C21H38NBr). Struktura CPB zilustrowana została następująco:

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest chlorek benzylodimetylotetradecyloamonu (BDTAC: C23H42NCI). Struktura BDTAC zilustrowana została następująco:

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest chlorek benzylodimetyloheksadecyloamonu (BDHAC: C25H45NCI). Struktura BDHAC: zilustrowana została następująco:

PL 206 561 B1

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest chlorek benzalkonium (chlorek alkilodimetylobenzyloamonu). Struktura chlorku benzalkonium. zilustrowana została następująco:

C12H25N(CH3)2C7H7CI

Porównanie struktury CTAB i chlorku benzalkonium (zwanego również chlorkiem alkilodimetylobenzyloamonu - w dalszym tekście odnoszący się do nazwy zastrzeżonej Rodalon) zilustrowano następująco:

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest bromek lauroilotrimetyloamonu (LTAB).

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest chlorek cetylotrimetyloamonu (CTAC).

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest bromek cetylotrimetyloamonu (CTAB).

Wykazano, że kationowy detergent CTAB jest zdolny do zmiany przepuszczalności komórek drożdży, prawdopodobnie w wyniku tworzenia transbłonnych porów, w sposób podobny do mechanizmu dwóch innych detergentów niejonowych, takich jak Pluronic F-68 i Triton X-100 (King i wsp. 1991). Zmiana przepuszczalności komórkowej, uzyskana dzięki zastosowaniu detergentów, takich jak CTAB, ułatwia pomiar aktywności enzymu wewnątrzkomórkowego w całych komórkach (Sekhar i wsp. 1999). Ponadto, osiągnięcie zwiększonej przepuszczalności komórek dzięki CTAB, jest użyteczne w katalizie enzymów wewnątrzkomórkowych, na przykład, w komórkach szczepów drożdży, takich jak Saccharomyces cerevisiae (Gowda i wsp. 1991) i Kluyveromyces fragilis (Joshi i wsp. 1987). W badaniach tych, istotne było, że detergent CTAB zwiększa przepuszczalność komórek drożdży dla cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej (takich jak substraty, produkty, kofaktory), natomiast wewnątrzkomórkowe enzymy i inne POI pozostają niezmienione w komórce. W przeciwieństwie do sposobu tu ujawnionego, żadne z powyżej wymienionych badań nie ujawniło ani nie sugerowało, że detergent CTAB (lub pokrewne czwartorzędowe związki amoniowe, takie jak LTAB lub CTAC) może być zastosowany do uwalniania rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego POI z komórki gospodarza.

Kationowy detergent CTAB również był powszechnie stosowany w metodach izolacji cząsteczek DNA/RNA. Na przykład, cząsteczki DNA mogą być izolowane w wyniku traktowania komórek CTAB w wysokich temperaturach (około 65°C) i niskich stężeniach soli (mniej niż 0,6 M NaCl), tak, że następuje wtrącanie DNA-CTAB i możliwe jest łatwe odzyskanie DNA. Detergent CTAB jest także często stosowany do ekstrakcji kwasów nukleinowych z roślin, gdzie koprecypitacja obojętnych polisacharydów w etanolu lub izopropanolu może stwarzać duży problem. CTAB był również wykorzystany do bezpośredniej lizy i wytrącania DNA z nadsączu hodowli E. coli zainfekowanej fagiem nitkowatym (patrz Ishaq i wsp., 1990, Biotechniques 9 (1): 19-20, 22, 24; Kambouris i wsp., 1999: FEMS Immunol. Med. Microbiol. 25 (3): 255-64; Kuipers i wsp., 1999 Ann. Rheum. Dis. 58.(2): 103-8; Velegraki i wsp., 1999 Med. Mycol. 37 (1) 69-73; White i wsp., 1998 Med. Mycol. 36 (5): 299-303; Woodhead I wsp. 1998 Mol. Biotechnol. 9 (3): 243-6; Mito i Detschart 1998 Parasitol. Res. 84 (7) 596-7; Zhang i wsp., 1998) J. Virol. Methods 71 (1) 45-50; Reineke i wsp., 1998 Insect. Mol. Biol. 7 (1) 95-9).

PL 206 561 B1

Wszystkie te metody, oparte na zastosowaniu CTAB w izolacji cząsteczek DNA, polegają na wykorzystaniu właściwości CTAB do wytrącenia kwasu nukleinowego i kwaśnych polisacharydów w roztworze, zachowując pozostałe białka i obojętne polisacharydy w roztworze. Zaskakująco i nieoczekiwanie, sposób tu opisany ułatwia nie tylko wytrącanie, ale i również zatrzymuje wewnątrzkomórkowe DNA. W konsekwencji, sposób tu opisany ułatwia selektywne uwalnianie wewną trzkomórkowego POI.

Uwalnianie

Zgodnie ze sposobem tu opisanym, rozpuszczalne lub towarzyszące błonie wewnątrzkomórkowe POI uwalniane jest z komórki lub komórek gospodarza, w wyniku kontaktu komórek z kompozycją do ekstrakcji błon w warunkach wystarczających do uwalniania wewnątrzkomórkowego POI.

Zalecane warunki wystarczające do uwalniania POI (I) % czwartorzędowych związków amoniowych

Kompozycja do ekstrakcji błon zawiera od około 0,05% do około 0,6% wagowych czwartorzędowego związku amoniowego, w szczególności, od około 0,1% do około 0,5% wagowych czwartorzędowego związku amoniowego, zwłaszcza, od około 0,2% do około 0,45% wagowych czwartorzędowego związku amoniowego, w szczególności około 0,4% wagowych czwartorzędowego związku amoniowego.

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest LTAB.

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest CTAC.

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest CTAB.

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest chlorek benzalkonium (C12H25N(CH3)2C7H7Cl).

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest chlorek cetylopirydyny (CPC, C21H38NCl).

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest bromek cetylopirydyny (CPB, ^C21^H38^NBr).

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest chlorek benzylodimetylotetradecyloamonu (BDTAC: C23H42NCl).

Korzystnie, czwartorzędowym związkiem amoniowym jest chlorek benzylodimetyloheksadecyloamonu (BDTAC: C25H46NCl).

(II) Temperatura

Korzystnie komórka gospodarza kontaktowana jest z kompozycją do ekstrakcji błon w temperaturze od około 4°C do około 40°C.

Komórka gospodarza kontaktowana jest z kompozycją do ekstrakcji błon, w szczególności w temperaturze od około 20°C do około 30°C.

Komórka gospodarza kontaktowana jest z kompozycją do ekstrakcji błon, zwłaszcza w temperaturze około 25°C.

Dogodnie powyższy zakres temperaturowy jest wyższy, gdy POI jest termostabilnym POI.

(III) pH

Korzystnie, komórka gospodarza kontaktowana jest z kompozycją do ekstrakcji błon w pH od około 2,0 do około 11, 0.

Komórka gospodarza kontaktowana jest z kompozycją do ekstrakcji błon, w szczególności w pH od około 5,0 do około 7,0.

Komórka gospodarza kontaktowana jest z kompozycją do ekstrakcji błon, zwłaszcza w pH około 6,3.

Bardzo zalecana jest procedura fermentacji, która poprzedza opisany tu sposób i która może być przeprowadzana w jakimkolwiek pH odpowiednim dla komórki gospodarza. W dziedzinie wiadomo, że na wydzielanie POI może wpływać pH jego zewnątrzkomórkowego podłoża hodowlanego. Dotychczas, często niezbędne było utrzymywanie pH podłoża hodowlanego organizmu gospodarza na poziomie w przybliżeniu neutralnego pH, ze względu na to, że fermentacja w takim pH była niezbędna do zachowania stabilności wydzielanego POI, nawet, jeżeli wiązało się to zazwyczaj ze wzrostem ryzyka zakażenia bakteryjnego. W sposobie tu opisanym POI nie jest wydzielane. Zatem, pH podłoża hodowlanego organizmu gospodarza nie ma znaczenia, ponieważ wewnątrzkomórkowe pH pozostaje stałe, niezależnie od pH podłoża. Zgodnie z tym, sposób tu opisany pozwala na wzrost organizmu gospodarza (takiego jak drożdże) w niższym pH (takim jak pH 4,0), co redukuje ryzyko zanieczyszczenia bakteriami, bez wpływu na biomasę ani na produkcję POI.

PL 206 561 B1

Kolejną zaletą sposobu tu opisanego jest to, że może być on zastosowany do zapobiegania kontaktowi wewnątrzkomórkowego POI z zewnątrzkomórkowym podłożem wzrostowym. Stanowi to duży plus, jeżeli POI jest niestabilne w zewnątrzkomórkowym podłożu, z powodu, na przykład, wrażliwości na proteazę. Wewnątrzkomórkowa ekspresja białka, a następnie ekstrakcja sposobem tu opisanym, pozwala uniknąć kontaktu z zewnątrzkomórkowym podłożem.

Odzyskanie POI

Wewnątrzkomórkowe POI, ekstrahowane zgodnie ze sposobem tu opisanym, może następnie być poddane znanym specjalistom w dziedzinie technikom w celu dalszego zatężenia i oczyszczania POI. Zatem, wyekstrahowane wewnątrzkomórkowe POI może zostać zatężone, na przykład, poprzez ultrafiltrację, przepuszczenie przez żywicę z odwróconą fazą, po czym elucję minimalną objętością rozpuszczalnika, precypitację, ultrafiltrację i liofilizację. Dostępne techniki do dalszego oczyszczania POI obejmują, lecz nie są ograniczone do zastosowania żywic ekskluzyjnych, frakcjonujących na podstawie wielkości, wysokosprawnej chromatografii cieczowej, chromatografii jonowymiennej i chromatografii hydrofobowej.

POI

Stosowany termin „POI” obejmuje nie ograniczająco białko, polipeptyd lub peptyd, włączając w tym lecz bez ograniczenia biał ko strukturalne, enzym, cytokinę (taką jak interferon i/lub interleukina), antagonistę receptora interleukiny (takiego jak IL-1ra), antybiotyk, przeciwciało poliklonalne lub monoklonalne lub ich skuteczną część, taką jak fragment Fv, które to przeciwciało lub jego część może być naturalne, syntetyczne lub humanizowane, hormon peptydowy, antygen (taki jak antygen bakteryjny/wirusowy/pierwotniaków/pasożytów), antygen nowotworowy, receptor, ligand, czynnik regulacyjny, cząsteczkę sygnałową, neuroprzekaźnik, czynnik krzepnięcia lub jakiekolwiek inne białko, w tym lecz bez ograniczenia białko związane z błoną i/lub białko towarzyszące błonie.

W sposobie tu opisanym, ekspresja POI zachodzi wewnątrzkomórkowe, czyli jest to wewnątrzkomórkowe POI.

POI może zostać otrzymane technikami rekombinacji DNA z użyciem będącej przedmiotem zainteresowania sekwencji nukleotydowej (NOI).

NOI

Stosowany termin „NOI” obejmuje DNA i RNA, zarówno syntetycznego, jak i naturalnego pochodzenia, które mogą zawierać zmodyfikowane lub niezmodyfikowane dezoksy- lub didezoksynukleotydy lub rybonukleotydy lub ich analogi. Kwas nukleinowy może występować jako jedno- lub dwuniciowy DNA lub RN A, heterodupleks RNA/DNA lub kopolimer RNA/DNA, przy czym termin „kopolimer” dotyczy jednoniciowego kwasu nukleinowego, zawierającego zarówno rybonukleotydy, jak i dezoksyrybonukleotydy. NOI może nawet być kodonem optymalizowanym dla dalszego zwiększenia ekspresji.

Synteza

Stosowany termin „syntetyczny” zdefiniowany jest jako produkt otrzymany in vitro drogą chemicznej lub enzymatycznej syntezy. Obejmuje, lecz nie jest ograniczony do NOI otrzymanych z optymalnym kodonem dla organizmów gospodarza, takiego jak metylotroficzne drożdże Pichia i Hansenula.

Konstrukty

NOI może być operacyjnie związany z regulacyjnymi elementami transkrypcyjnymi i translacyjnymi aktywnymi w odpowiedniej komórce gospodarza. NOI może także kodować białko fuzyjne obejmujące sekwencje sygnałowe, takie jak, na przykład, pochodzące z genu glukoamylazy z Schwanniomyces occidentalis, genu α-czynnika typu dopasowującego z Saccharomyces cerevisiae i TAKA amylazy z Aspergillus oryzae. Alternatywnie, NOI może kodować białko fuzyjne zawierające domenę wiązania z błoną.

Wektor ekspresyjny

Z użyciem wektora ekspresyjnego możliwa jest ekspresja NOI na pożądanym poziomie w organizmie gospodarza.

Wektor ekspresyjny obejmujący NOI tu opisane może być jakimkolwiek wektorem zdolnym do ekspresji genu kodującego NOI w wybranym organizmie gospodarza, a wybór wektora zależy od komórki gospodarza, do której jest wprowadzany. Zatem, wektor może być autonomicznie replikującym wektorem, tj. wektorem stanowiącym episomalną całość, którego replikacja jest niezależna od replikacji chromosomalnej, tak jak, na przykład, plazmid, bakteriofag lub element episomalny, minichromosom lub sztuczny chromosom. Alternatywnie, wektor tu opisany, jest wektorem, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza ulega integracji z genomem gospodarza i replikuje wraz z chromosomem.

PL 206 561 B1

Składowe wektora ekspresyjnego

Wektor ekspresyjny zazwyczaj zawiera składniki wektora do klonowania, takie jak, na przykład, element pozwalający na autonomiczną replikację wektora w wybranym organizmie gospodarza i jeden lub więcej fenotypowo wykrywalnych markerów służących selekcji. Wektor ekspresyjny zawiera zazwyczaj kontrolną sekwencję nukleotydową, kodującą promotor, operator, miejsce wiążące rybosom, sygnał inicjacji translacji i dowolnie, gen represora lub jeden lub więcej genów aktywatora. Ponadto, wektor ekspresyjny może zawierać sekwencję kodującą sekwencję aminokwasową zdolną do ukierunkowania POI do organelli komórki gospodarza, takich jak peroksysom lub do poszczególnych przedziałów komórkowych. Taka sekwencja ukierunkowująca obejmuje nieograniczająco sekwencję SKL. W niniejszym kontekście, termin „sygnał ekspresji obejmuje jakąkolwiek z powyższych sekwencji kontrolnych, sekwencje represora lub aktywatora. W celu ekspresji pod kierunkiem sekwencji kontrolnych, NOI kodujący POI jest operacyjnie związany, w odpowiedni sposób, względem ekspresji z sekwencjami kontrolnymi.

Promotor

W wektorze, NOI kodują cy POI jest operacyjnie zwią zany z odpowiednią sekwencją promotorową. Promotor może być jakąkolwiek sekwencją DNA o aktywności transkrypcyjnej w wybranym organizmie gospodarza i może pochodzić z genów homologicznych lub heterologicznych dla organizmu gospodarza.

Promotory bakteryjne

Przykłady odpowiednich promotorów do ukierunkowanej transkrypcji zmodyfikowanej sekwencji nukleotydowej tu opisanej w gospodarzu bakteryjnym obejmują promotor operonu lac z E. coli, promotory dagA genu agarazy ze Streptomyces coelicolor, promotory genu α-amylazy (amyL) z Bacillus licheniformis, promotory genu amylazy maltogenicznej (amyM) z Bacillus stearothermophilus, promotory genu α-amylazy (amyQ) z Bacillus amyloliquefaciens, promotory genów xy1A i xy1B z Bacillus subtilis oraz promotor pochodny promotorom pochodzącym z Lactococcus sp., włączając promotor P170. Gdy gen kodujący POI tu opisane ulega ekspresji w gatunkach bakteryjnych, takich jak E. coli, możliwy jest wybór odpowiedniego promotora, na przykład z promotora bakteriofaga, włączając promotor T7 i promotor faga lambda.

Promotory grzybów

Przykładami użytecznych promotorów w transkrypcji w gatunkach grzybów są promotory pochodzące z genów kodujących TAKA-amylazę Aspergillus oryzae, proteinazę aspartylową Rhizomucor miehei, obojętną α-amylazę Aspergillus niger, stabilną w środowisku kwaśnym α-amylazę A. niger, glukoamylazę A. niger, lipazę Rhizomucor miehei, alkaliczną proteazę Aspergillus oryzae, izomerazę triozy fosforanowej Aspergillus oryzae czy acetamidazy Aspergillus nidulans.

Promotory drożdżowe

Przykłady promotorów odpowiednich do ekspresji w gatunkach drożdży obejmują nie ograniczająco promotory Gal 1 i Gal 10 z Saccharomyces cerevisiae i promotory A0X1 lub AOX2 z Pichia pastoris.

Organizmy gospodarza (I) Bakteryjne organizmy gospodarza

Przykładami odpowiednich bakteryjnych organizmów gospodarza są gatunki bakterii Gram-dodatnich, takie jak Bacillaceae, włączając Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium i Bacillus thuringiensis, gatunki Streptomyces, takie jak Streptomyces murinus, gatunki bakterii kwasu mlekowego, włączając Lactococcus spp., takie jak Lactococcus lactis, Lactobacillus spp., włączając Lactobacillus reuteri, Leuconostoc spp., Pediococcus spp. oraz Streptococcus spp. Alternatywnie, jako organizm gospodarza mogą zostać wybrane szczepy gatunków bakterii Gram-ujemnych, należących do Enterobacteriaceae, włączając E. coli lub Pseudomonadaceae.

(II) Drożdżowe organizmy gospodarza

Odpowiednie drożdżowe organizmy gospodarza mogą zostać wybrane spośród gatunków istotnych z punktu widzenia biotechnologii drożdży, takich jak, lecz bez ograniczania, Pichia sp., Hansenula sp. lub gatunki Kluyveromyces, Yarrovinia czy gatunki Saccharomyces, włączając Saccharomyces cerevisiae lub gatunki należące do Schizosaccharomyce, takie jak, na przykład, gatunki S. Piombe. Jako organizm gospodarza stosowany jest dogodnie szczep metylotroficznego gatunku drożdży Pichia pastoris. Zalecanym organizmem gospodarza jest gatunek Hansenula. Bardzo zalecane jest zaPL 206 561 B1 stosowanie sposobu tu opisanego do odzyskania wewnątrzkomórkowego POI z organizmu eukariotycznego gospodarza, takiego jak drożdże, przed zajściem glikozylacji. Nadmierna glikozylacja wydzielanych białek jest dobrze znanym problemem, szczególnie w przypadku eukariotycznych organizmów gospodarza, takich jak drożdże. Ta wada związana z drożdżowymi systemami ekspresji prowadzi do ograniczonego stosowania drożdży jako systemów produkcji, nawet, jeżeli drożdżowe wektory ekspresyjne pozwalają na produkcję białek na wysokim poziomie ekspresji wraz z dużą ilością biomasy, a ponadto, dopuszczone jest stosowanie drożdży w żywności. W wyniku ekspresji wewnątrzkomórkowej POI, a następnie ekstrakcji POI sposobem tu opisanym, uzyskane POI nie będzie glikozylowane, ponieważ białko to nie przechodzi przez ścieżkę wydzielniczą, obejmującą proces glikozylacji.

(III) Organizmy gospodarza wśród grzybów

Przykładami odpowiedniego organizmu gospodarza wśród grzybów nitkowatych są gatunki Aspergillus, np., Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori lub Aspergillus nidulans. Alternatywnie, jako organizmy gospodarza mogą być zastosowane szczepy gatunku Fusarium, np. Fusarium oxysporum lub gatunku Rhizomucor, takie jak Rhizomucor miehei. Inne, odpowiednie szczepy należą do gatunku Thermomyces i Mucor.

Zastosowanie na dużą skalę

W jednej z realizacji POI zastosowano w rozwią zaniu na dużą skalę .

Dogodnie, POI produkowane jest w ilości od 1 g na litr do około 2 g na litr całkowitej objętości kultury komórkowej, po hodowli organizmu gospodarza.

Dogodnie, POI produkowane jest w ilości od 100 mg na litr do około 900 mg na litr całkowitej objętości kultury komórkowej, po hodowli organizmu gospodarza.

Dogodnie, POI produkowane jest w ilości od 250 g na litr do około 500 mg na litr całkowitej objętości kultury komórkowej, po hodowli organizmu gospodarza.

Zastosowania w żywności

W jednej z zalecanych realizacji sposób tu opisany zastosowany jest do uwalniania POI wykorzystywanego w produkcji produktów żywnościowych, takich jak napoje.

W jednej z zalecanych realizacji sposób tu opisany zastosowany jest do uwalniania POI wykorzystywanego w otrzymywaniu detergentów.

W jednej z zalecanych realizacji sposób tu opisany zastosowany jest do uwalniania POI wykorzystywanego w piekarnictwie.

W jednej z zalecanych realizacji sposób tu opisany zastosowany jest do uwalniania POI wykorzystywanego jako środek ulepszający ciasto.

W jednej z zalecanych realizacji sposób tu opisany zastosowany jest do uwalniania POI wykorzystywanego do ulepszania właściwości masy mącznej, kompozycji ulepszających masę mączną i ulepszonych produktów żywnościowych (patrz WO 96/39851 i EP-B-0 833 563).

W korzystnej realizacji uwalniany POI jest oksydazą heksozową (D-heksoza: O2-oksydoreduktaza, EC 1.1.3.5).

Enzym HOX

Oksydaza heksozową (D-heksoza: O2-oksydoreduktaza, EC 1.1.3.5) (zwana również jako HOX) jest enzymem, który w obecności tlenu utlenia D-glukozę i kilka innych cukrów redukujących, włączając maltozę, laktozę i celobiozę do odpowiadających im laktonów, które następnie ulegają hydrolizie do odpowiednich kwasów aldobionowych. Zgodnie z tym, HOX różni się od innej oksydoreduktazy, oksydazy glukozy, konwertującej jedynie D-glukozę, tym, że może wykorzystywać szerszy zakres substratów cukrowych. Utlenianie katalizowane przez HOX może być zilustrowane następująco:

D-glukoza + O₂ γ-D-glukonolakton + H₂O₂ lub D-galaktoza + O₂ γ-D-galaktonolakton + H₂O₂

HOX produkowany jest naturalnie przez kilka gatunków glonów morskich. Gatunki te należą

m.in. do rodziny Gigartinaceae. Stosowany termin „HOX” odnosi się do enzymu zdolnego do utlenienia substratów wybranych z grupy obejmującej D-glukozę, D-galaktozę, D-mannozę, maltozę, laktozę i celobiozę.

Produkcja HOX

Gen kodujący enzym HOX klonowano z wodorostów Chondrus crispus (Stougaard i Hansen 1996, Hansen i Stougaard, 1997). Do produkcji enzymu HOX (natywne białko oczyszczone z trawy morskiej (Poulsen i Hostrup, 1998)) wykorzystano także metylotroficzne drożdże Hansenula polymor14

PL 206 561 B1 pha (opracowane przez Rhein Biotech, Dusseldorf/Germany jako system ekspresji heterologicznych białek). W WO 96/40935 i WO 98/13478 również ujawniono klonowanie i ekspresję w rekombinowanych organizmach gospodarza genu kodującego białko o aktywności HOX.

W jednej z korzystnych realizacji, enzym HOX zawiera sekwencję wymienioną w SEQ ID NO: 22.

W jednej z korzystnych realizacji, enzym HOX zawiera sekwencję wymienioną w SEQ ID NO: 22 lub jej wariantach, homologach, pochodnych lub fragmentach.

Warianty/homologi/pochodne (sekwencji aminokwasowej)

Zalecane sekwencje aminokwasowe wymienione są w SEQ ID NO: 22 lub są sekwencjami możliwymi do uzyskania z enzymu HOX tu opisanego. Obejmują one jednak również sekwencje homologiczne otrzymane z jakiegokolwiek źródła, na przykład pokrewnych białek wirusowych/bakteryjnych, homologów komórkowych i syntetycznych peptydów, jak również ich wariantów lub pochodnych.

Opisano tu zatem warianty, homologi lub pochodne przedstawionej sekwencji aminokwasowej, jak również warianty, homologi lub pochodne sekwencji nukleotydowej kodującej te sekwencje aminokwasowe.

W tym kontekście, sekwencja homologiczna obejmuje sekwencję aminokwasową , identyczną przynajmniej w 75, 85 lub 90%, zwłaszcza przynajmniej w 95 lub 98% identyczną na poziomie aminokwasowym, na przykład wobec co najmniej sekwencji aminokwasowej wymienionej jako SEQ ID NO: 22 w załączonej liś cie sekwencji. W szczególnoś ci, homologia powinna być zazwyczaj rozpatrywana dla regionów sekwencji znanych jako istotne dla aktywności enzymu, a nie dla nieistotnych sekwencji z nim sąsiadujących. Rozpatrywane regiony obejmują, lecz nie ograniczają się do przypuszczalnych domen wiążących FAD w HOX, takich jak SGGH79C, LGGH146I oraz LGGH320A. Mimo, że homologia może być rozpatrywana w znaczeniu podobieństwa (tj. reszt aminokwasowych o podobnych właściwościach chemicznych/funkcjach), w tym kontekście zalecane jest wyrażenie homologii jako identyczności sekwencji.

Porównanie sekwencji może być dokonane wzrokowo, lub częściej, z pomocą łatwo dostępnych programów porównujących sekwencje. Tego typu handlowo dostępne programy komputerowe mogą obliczać% homologii między dwiema lub więcej sekwencjami.

% homologii może być obliczany poprzez ciągłość sekwencji, tj. sekwencje zestawione są razem i każdy z aminokwasów sekwencji jest bezpośrednio porównywany z odpowiadającym mu aminokwasem drugiej sekwencji, jedna reszta na raz. Porównanie to nazywane jest zestawieniem „ciągłym”. Zazwyczaj takie ciągłe zestawienia opracowuje się dla względnie niskiej liczby reszt.

Mimo że metoda ta jest bardzo prosta i logiczna, nie obejmuje, na przykład w inny sposób identycznych par sekwencji gdzie jedna insercja lub delecja powoduje wypadnięcie kolejnych reszt z zestawienia, zatem, potencjalnie wpływa na znaczny spadek % homologii, w przypadku całościowego zestawienia. W konsekwencji, większość metod porównywania sekwencji zaprojektowanych jest w celu uzyskania optymalnego zestawienia, brane są przy tym pod uwagę moż liwe insercje i delecje, co ogranicza przesadne przypisywanie kar w całym wyniku homologii. Uzyskuje się to poprzez wstawienie „przerw” w zestawionych sekwencjach w celu osiągnięcia maksymalnej, miejscowej homologii.

Jednakże, te bardziej złożone metody dotyczą przypisywania „kar za wprowadzenie przerw” każdej przerwie występującej w zestawieniu, tak, żeby dla tej samej liczby identycznych aminokwasów osiągnąć zestawienie sekwencji z jak najmniejszą liczbą przerw - odzwierciedlając wyższe pokrewieństwo między dwoma porównywanymi sekwencjami - co daje lepszy wynik, niż w przypadku wielu przerw. „Koszty afiniczne przerw” są zazwyczaj stosowane w celu nabicia względnie wysokich kosztów istnienia przerwy i mniejszego kosztu dla każdej kolejnej reszty w przerwie. Jest to najbardziej powszechnie stosowany system punktacji przerw. Wysokie kary za wprowadzenie przerw będą, oczywiście powodować optymalizację zestawienia z rzadszymi przerwami. Większość programów zestawiających dopuszcza modyfikację kar za wprowadzenie przerw. Jednakże, zalecane jest zastosowanie domyślnych wartości przy użyciu takiego oprogramowania do porównywania sekwencji. Na przykład, przy użyciu pakietu GCG Wisconsin Bestfit (patrz niżej) domyślne kary za przerwy dla sekwencji aminokwasowych wynoszą -12 dla przerwy i -4 dla każdego wydłużenia.

Obliczenie maksymalnego % homologii wymaga zatem po pierwsze uzyskania optymalnego zestawienia, biorąc pod uwagę kary za przerwy. Odpowiednim programem komputerowym do wykonania takiego zestawienia jest GCG Wisconsin Bestfit package (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux i wsp., 1984, Nucleic Acids Research, 12:387). Przykłady innych programów, za pomocą których możliwe jest porównanie sekwencji obejmują nieograniczająco pakiet BLAST (patrz Ausubel

PL 206 561 B1 i wsp. 1999, jak wyżej, rozdz. 18), FASTA (Atschul i wsp. 1990, J. Mol. Biol., 403-410) oraz pakiet narzędzi do porównywania GENEWORKS. Zarówno BLAST, jak i FASTA dostępne są do badań „offline” i „online” (patrz Ausubel i wsp. 1999, jak wyżej, str. 7-58 do 7-60). Jednakże zalecane jest zastosowanie programu GCG Bestfit.

Mimo, że końcowy % homologii może być mierzony w znaczeniu identyczności, sam proces zestawienia nie jest zazwyczaj oparty na porównaniu par typu wszystko-albo-nic. Zamiast tego stosuje się skalowaną macierz podobieństwa wyników, która przypisuje wyniki dla każdej porównywanej pary w oparciu o podobieństwo chemiczne lub odległość ewolucyjną. Przykładem powszechnie stosowanej macierzy jest macierz BLOSUM62 - macierz domyślna dla pakietu programów BLAST. Programy GCG Wisconsin ogólnie wykorzystują publiczne domyślne wartości lub tabelę porównawczą z własnymi symbolami, jeśli jest dołączona (szczegóły w podręczniku). Zalecane jest zastosowanie publicznych domyślnych wartości pakietu GCG lub w przypadku innego oprogramowania, macierzy wartości domyślnych, takiej jak BLOSUM62.

Po uzyskaniu dzięki programowi optymalnego zestawienia możliwe jest obliczenie % homologii, dogodnie % identyczności sekwencji. Programy zazwyczaj wykonują tę część porównania sekwencji i generują dane liczbowe.

Termin „wariant” lub „pochodna” w odniesieniu do sekwencji aminokwasowych tu opisanych obejmuje jakąkolwiek jej substytucję, wariację, modyfikację, zastąpienie, delecję lub addycję jednego (lub więcej) aminokwasów z lub do sekwencji, dającej w rezultacie sekwencję aminokwasową o aktywności enzymatycznej, dogodnie posiadającej przynajmniej tę samą aktywność enzymatyczną, jak sekwencja aminokwasową zawarta w SEQ ID NO: 22.

SEQ ID NO: 22 może być modyfikowana do zastosowania tu opisanego. Zazwyczaj, modyfikacje wprowadzane są w taki sposób, aby zachować aktywność enzymatyczną sekwencji. Różne substytucje aminokwasowe mogą być dokonywane, na przykład, od 1, 2 lub 3 do 10 lub 20 substytucji, pod warunkiem, że zmodyfikowana sekwencja zachowa wymaganą aktywność enzymatyczną. Substytucje aminokwasowe C mogą obejmować stosowanie analogów nie występujących w naturze.

SEQ ID NO: 22 do opisanego tu zastosowania może również zawierać delecje, insercje lub substytucje reszt aminokwasowych, wywołujące ciche zmiany i dające funkcjonalnie równoważny enzym. Celowe substytucje aminokwasów mogą być dokonane na podstawie podobieństwa polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilowości i/lub właściwości amfipatycznych reszt pod warunkiem utrzymania aktywności enzymatycznej enzymu HOX. Na przykład, ujemnie naładowane aminokwasy obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy; dodatnio naładowane aminokwasy obejmują lizynę i argininę; oraz aminokwasy o nie naładowanych, polarnych grupach głównych o podobnych wartościach hydrofilowych obejmują leucynę, izoleucynę, walinę, glicynę, alaninę, asparaginę, glutaminę, serynę, treoninę, fenyloalaninę i tyrozynę.

Konserwatywne substytucje mogą być dokonane, na przykład, według poniższej tabeli. Możliwa jest wzajemna substytucja aminokwasów w tym samym bloku drugiej kolumny i dogodnie, w tej samej linii trzeciej kolumny.

ALIFATYCZNE	Nie polarne	G A P I L V
	Nie naładowane polarne	C S T M N Q
	Polarne naładowane	D E K R
AROMATYCZNE		H F W Y

Warianty/homologi/pochodne (sekwencji nukleotydowej)

Specjalistom w dziedzinie wiadomo, że liczne różne sekwencje nukleotydowe mogą kodować ten sam enzym HOX w wyniku degeneracji kodu genetycznego. Ponadto, specjaliści w dziedzinie mogą, stosując zwyczajowe techniki, wprowadzić nukleotydowe substytucje, nie wpływające na enzym HOX kodowany przez nukleotydową sekwencję do zastosowania tu opisanego, sprawiając, że kodon może być wykorzystywany przez jakikolwiek organizm gospodarza, w którym ma zajść ekspresja enzymu HOX tu opisanego.

PL 206 561 B1

Termin „wariant”, „homolog” lub „pochodna” w odniesieniu do sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQ ID NO: 22 tu opisanej, obejmuje jakiekolwiek jej substytucję, zmianę, modyfikację, zastąpienie, delecję lub addycję do tej sekwencji jednego (lub więcej) kwasu nukleinowego z lub do sekwencji, dając w rezultacie sekwencję nukleotydową, kodującą enzym HOX o aktywności enzymatycznej, dogodnie, posiadający przynajmniej taką samą aktywność jak sekwencja nukleotydową wymieniona w SEQ ID NO: 22 z wykazu sekwencji.

Jak wspomniano wyżej, w odniesieniu do homologii sekwencji, dogodnie, istnieje przynajmniej 75%, bardziej dogodnie przynajmniej 85%, korzystnie przynajmniej 90% homologia z sekwencjami zawartymi w wykazie sekwencji. W zalecanej postaci istnieje przynajmniej 95%, w szczególności przynajmniej 98% homologia. Porównanie homologii nukleotydów może być prowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem. Zalecanym programem porównującym sekwencje jest opisany powyżej program GCG Wisconsin Bestfit. Macierz domyślnych wyników posiada dopasowującą wartość 10 dla każdego identycznego nukleotydu i -9 dla każdego braku dopasowania. Domyślna kara za utworzenie przerwy wynosi -50, a domyślna kara za wydłużenie domyślnej przerwy -3 dla każdego nukleotydu.

Opisano tu również sekwencje nukleotydowe zdolne do wybiórczej hybrydyzacji z zaprezentowanymi sekwencjami lub jakimkolwiek ich wariantem, fragmentem lub pochodną lub jakąkolwiek sekwencją z nimi komplementarną. Sekwencje nukleotydowe dogodnie mają długość przynajmniej 15 nukleotydów, w szczególności przynajmniej 20, 30, 40 lub 50 nukleotydów.

Hybrydyzacja

Stosowany w niniejszym opisie termin „hybrydyzacja” obejmuje „proces, w wyniku którego nić kwasu nukleinowego wiąże się z komplementarną nicią poprzez utworzenie par zasad”, jak również proces amplifikacji zachodzący w technologii łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR).

Sekwencje nukleotydowe zdolne ulegać wybiórczej hybrydyzacji z przedstawionymi sekwencjami nukleotydowymi lub z sekwencjami komplementarnymi, są ogólnie, przynajmniej w 75%, dogodnie, przynajmniej w 85 lub 90% i w szczególności, przynajmniej w 95% lub 98% homologiczne z odpowiadającymi im, przedstawionymi tu sekwencjami w obszarze przynajmniej 20, zwłaszcza, przynajmniej 25 lub 30, na przykład, przynajmniej 40, 60 lub 100 lub więcej sąsiadujących ze sobą reszt nukleotydowych. Zalecane sekwencje nukleotydowe obejmują regiony homologiczne z sekwencją nukleotydową wymienioną w SEQ ID NO: 22, zwłaszcza, w przynajmniej 80 lub 90% i w szczególności w przynajmniej 95% homologiczne z sekwencją nukleotydową wymienioną w SEQ ID NO: 22.

Termin „zdolny do wybiórczej hybrydyzacji” oznacza, że sekwencja nukleotydową wykorzystywana jako sonda stosowana jest w warunkach, w których docelowa sekwencja nukleotydową hybrydyzuje z sondą na poziomie istotnie wyższym niż tło. Tło hybrydyzacji może wystąpić, ze względu na obecność innych sekwencji nukleotydowych, na przykład, w bibliotece cDNA lub genomowego DNA podlegającej skriningowi. W tym przypadku, tło daje poziom sygnału powstały w wyniku oddziaływania pomiędzy sondą a niespecyficznym DNA biblioteki, który jest mniej niż 10-krotnie, zwłaszcza mniej niż 100-krotnie tak intensywne, jak swoiste oddziaływania obserwowane dla docelowego DNA. Intensywność oddziaływania może być mierzona, na przykład, poprzez zastosowanie znakowanej izotopowo sondy, np. znakowanej ³²P.

Warunki hybrydyzacji opierają się na temperaturze topnienia (Tm) kompleksu wiążącego kwas nukleinowy, według Berger i Kimmel (1987, podręcznik: Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, t. 152, Academic Press, San Diego CA) i określają „ostrość warunków”, jak wyjaśniono poniżej.

Maksymalna ostrość warunków występuje zazwyczaj w temperaturze około Tm -5°C (5°C poniżej Tm sondy); znaczna ostrość w temp. około 5°C do 10°C poniżej Tm; umiarkowanie ostre warunki w temp. około 10°C do 20°C poniżej Tm i łagodne w około 20°C do 25°C poniżej Tm. Jak wiadomo specjalistom w dziedzinie, hybrydyzacja w najbardziej surowych warunkach może być zastosowana do identyfikowania lub wykrywania identycznych sekwencji nukleotydowych, natomiast umiarkowane (lub łagodne) warunki hybrydyzacji do identyfikowania lub wykrywania podobnych lub pokrewnych sekwencji polinukleotydowych.

W zalecanej realizacji, ujawniono sekwencje nukleotydowe, które mogą ulegać hybrydyzacji z sekwencją nukleotydową tu opisaną w ostrych warunkach {np. 65°C i 0,1 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3 cytrynian pH 7,0)}. Gdy sekwencja nukleotydową tu opisana jest dwuniciowa, obie nici dupleksu, pojedynczo lub łącznie, są tu włączone. Gdy sekwencja nukleotydową jest jednoniciowa, przyjmuje się, że komplementarna do niej sekwencja nukleotydową jest tu również włączona.

PL 206 561 B1

Sekwencje nukleotydowe, które nie są w 100% homologiczne z sekwencjami tu opisanymi, lecz mieszczą się w ich zakresie, mogą być uzyskane różnymi sposobami. Inne warianty opisanych sekwencji mogą zostać otrzymane, na przykład, w wyniku sondowania bibliotek DNA pochodzących z różnych źródeł. Ponadto, możliwe jest uzyskanie innych wirusowych/bakteryjnych lub komórkowych homologów, szczególnie komórkowych homologów występujących w komórkach ssaczych (np. komórkach szczurzych, mysich, krowich i naczelnych). Takie homologi i ich fragmenty, ogólnie, będą zdolne do wybiórczej hybrydyzacji z sekwencjami zawartymi w załączonej liście sekwencji. Sekwencje te mogą być uzyskane poprzez sondowanie bibliotek cDNA otrzymanych z bibliotek genomowego DNA innych gatunków zwierząt oraz sondowanie tych bibliotek sondami zawierającymi wszystkie lub część sekwencji nukleotydowej wymienionej w SEQ ID NO: 22 w średnio ostrych warunkach. Podobne rozwiązanie dotyczy otrzymania gatunków homologicznych i wariantów alleli sekwencji aminokwasowych i/lub nukleotydowych tu opisanych.

Warianty i szczepy/gatunki homologiczne mogą być również otrzymane przy zastosowaniu degenerującej PCR, ze starterami zaprojektowanymi dla docelowej sekwencji w wariantach i homologach kodujących zakonserwowane sekwencje aminokwasowe z sekwencji tu opisanych. Możliwe jest wcześniejsze określenie sekwencji zakonserwowanych, na przykład, poprzez zestawienie sekwencji aminokwasowych z kilku wariantów/homologów. Zestawienie sekwencji może być dokonane z użyciem znanych w dziedzinie programów komputerowych. Na przykład, szeroko stosowany jest program GCG Wisconsin PileUp. Wykorzystywane w degenerującej PCR startery zawierają jedną lub więcej zdegenerowanych pozycji i będą stosowane w mniej ostrych warunkach, niż stosowane przy klonowaniu sekwencji ze starterami pojedynczej sekwencji zaprojektowanymi na podstawie znanych sekwencji.

Alternatywnie, takie sekwencje nukleotydowe mogą być uzyskane w wyniku miejscowo ukierunkowanej mutagenezy scharakteryzowanych sekwencji, takich jak sekwencja nukleotydową wymieniona w SEQ ID NO: 22. Może być to użyteczne, na przykład, w wypadku zmian związanych z powstaniem cichego kodonu, w celu optymalizacji kodonu, dogodnej dla danej komórki gospodarza, w której ma zajść ekspresja sekwencji nukleotydowej. Inne zmiany sekwencji mogą być pożądane w celu wprowadzenia miejsc rozpoznawanych przez enzym restrykcyjny lub do zmiany aktywności enzymu HOX, kodowanego przez takie sekwencje nukleotydowe.

Sekwencje nukleotydowe tu opisane mogą być wykorzystane do wytworzenia startera, np. startera PCR, startera do alternatywnej reakcji amplifikacji, sondy, np. odpowiednio znakowanej znanymi sposobami, radioaktywnymi lub nieradioaktywnymi znacznikami, lub też sekwencje nukleotydowe mogą być klonowane do wektorów. Takie startery, sondy i inne fragmenty mają przynajmniej 20, na przykład przynajmniej 25, 30 lub 40 nukleotydów długości i objęte są również stosowanym tu terminem sekwencji nukleotydowej tu opisanej.

Sekwencje nukleotydowe, takie jak polinukleotydy i sondy DNA, mogą być uzyskane technikami rekombinacji, syntezy lub z użyciem jakiegokolwiek znanego w dziedzinie sposobu. Mogą być również klonowane przy zastosowaniu standardowych technik. Ogólnie, startery produkowane są syntetycznie, włączając etapową produkcję pożądanej sekwencji kwasu nukleotydowego jeden nukleotyd na raz. Techniki te wykorzystują automatyczną syntezę i są szeroko dostępne w dziedzinie.

Dłuższe sekwencje nukleotydowe otrzymywane są ogólnie z użyciem sposobów rekombinacji, na przykład, technik klonowania PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy). Obejmują one otrzymanie pary starterów (np. około 15 do 30 nukleotydowych), flankujących region docelowej klonowanej sekwencji, kontakt starterów z mRNA lub cDNA, zajście łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w warunkach pozwalających na amplifikację pożądanego regionu, izolację amplifikowanego regionu (np. poprzez oczyszczenie mieszaniny reakcyjnej w żelu agarozowym) i odzysk amplifikowanego DNA. Startery mogą być zaprojektowane tak, by zawierały miejsca rozpoznawane przez odpowiednie enzymy restrykcyjne, pozwalające na wstawienie powielonego DNA do odpowiedniego wektora do klonowania.

W wyniku naturalnej degeneracji kodu genetycznego, inne sekwencje DNA, kodują ce istotnie takie same lub funkcjonalnie równoważne sekwencje aminokwasowe mogą być wykorzystane w klonowaniu i ekspresji enzymu HOX. Jak wiadomo specjalistom w dziedzinie, zalecane jest otrzymanie sekwencji nukleotydowych kodujących enzym HOX o nie występujących naturalnie kodonach. Możliwe jest wybranie kodonów dogodnych dla poszczególnych gospodarzy prokariotycznych lub eukariotycznych (Murray E. i wsp. (1989) Nuc. Acids Res. 17: 477-508), na przykład w celu zwiększenia szybkości ekspresji enzymu HOX lub w celu otrzymania rekombinowanych transkryptów RNA o pożą18

PL 206 561 B1 danych właściwościach, takich jak dłuższy czas połowicznego rozkładu, niż transkrypty uzyskane z naturalnie występujących sekwencji.

Skrining

Sposób tu opisany może być wykorzystany do skriningu podwyższonych poziomów wewnątrzkomórkowego POI w zmutowanej komórce organizmu gospodarza. Komórki poddane takiemu skriningowi mogą być osadzone na stałym nośniku lub na stałym substracie, takim jak plastykowe szpilki lub inne powierzchnie. Komórki mogą być poddane kontaktowi z kompozycją do ekstrakcji błon tu opisaną, a poziom uwolnionego POI może być mierzony z wykorzystaniem znanych w dziedzinie sposobów.

System skriningu High Through put Screens (HTS)

Sposób tu opisany może być wykorzystany w systemach High Through put Screens (HTS), obejmujących wzrost docelowych komórek i skrininig na płytkach do mikromiareczkowania (10000 mutantów na dzień) przez system operacyjny. Na przykład, podczas otrzymywania nowego rekombinowanego szczepu produkcyjnego, zazwyczaj, konieczne jest przeprowadzenie jednej lub kilku tradycyjnych mutagenez w celu osiągnięcia wzrostu produktywności. Osiąga się to skuteczniej stosując HTS zmutowanych komórek.

Sposób tu opisany jest bardzo zalecany, ponieważ umożliwia skrining typu HTS dla podwyższonych poziomów wewnątrzkomórkowego POI. Dotychczas, systemy te pozwalały jedynie na skrining wysokiego poziomu wydzielanych POI.

Wstęp do części dotyczącej przykładów i figur

Niniejszy wynalazek przedstawiono jedynie przykładowo w odniesieniu do następujących figur.

Na figurze 1 przedstawiono konstrukt genetyczny;

Na figurze 2A przedstawiono konstrukty genetyczne;

Na figurze 2B zamieszczono fotografię;

Na figurach 3A-3B zamieszczono fotografię;

Na figurze 4 przedstawiono wykres;

Na figurze 5 zawarto wykaz sekwencji;

Na figurze 6 zawarto wykaz sekwencji;

Na figurach 7A-7D zamieszczono fotografię;

Na figurze 8 przedstawiono wykres;

Na figurze 9 przedstawiono wykres;

Na figurach 10A-10B zamieszczono fotografię;

Na figurach 11A-11B przedstawiono wykres;

Na figurach 12A-12B zamieszczono fotografię;

Na figurach 13A-13B zamieszczono fotografię;

Na figurach 14A-14B zamieszczono fotografię.

Bardziej szczegółowo

Na figurze 1 przedstawiono mapę wektora ekspresyjnego do produkcji HOX w Hansenula polymorpha. Tępo zakończone fragmenty EcoRI/NotI z regionem kodującym syntetyczny gen HOX połączono z ewentualną sekwencją sygnałową i klonowano w miejscu wielokrotnego klonowania standardowego wektora ekspresyjnego Hansenula. Wektor ekspresyjny zawierał promotor genu dehydrogenazy mrówczanowej (FMD) i terminator (MOX-T) genu oksydazy metanolowej rozdzielone miejscem wielokrotnego klonowania dla fragmentów insercyjnych, ori i bla (ampR), służących powielaniu i selekcji w E. coli, sekwencje ARS (HARS) do replikacji w H. polymorpha, gen URA3 do selekcji.

Na figurze 2A przedstawiono diagram 1,4 kz oryginalnego genu FMD (schemat górny) i promotor FMD z wklonowanym heterologicznym DNA (schemat dolny). Miejscami restrykcyjnymi były: Asp718, Ncol.

Na figurze 2B przedstawiono kopie genu HOX zintegrowanego w genomie. Na torach 1-12 zamieszczono różne rekombinowane izolaty i odpowiadające im rozcieńczenia DNA. Na torze 13 przedstawiono nie transformowany szczep gospodarza, a na torze 14 marker masowy (M).

Na figurach 3A i 3B przedstawiono analizę SDS-PAGE ekspresji HOX. Na figurze 3A zademonstrowano analizę SDS-PAGE filtratu hodowlanego z fermentacji glicerolowej mutagenizowanego szczepu DK8-27KanII3-mut25. Na torze pierwszym nałożono białko markerowe, na torze 2 standard

HOX (0,03 U/ml; 18 μΐ), na torze 3 nadsącz z sondy 3 (18 μ|, na torze 7 nadsącz z sondy 7 (18 μΐ), na torze 8 nadsącz z sondy 8 (18 μθ, na torze 9 nadsącz z sondy 9 (18 μθ i na torze 10 nadsącz z sondy 10 (18 μ^. Na figurze 3B przedstawiono analizę western biot rekombinowanych szczepów

PL 206 561 B1 wykazujących ekspresję HOX. Próby nakładano w taki sam sposób jak na figurze 3A. Membranę sondowano poliklonalnym przeciwciałem HOX.

Na figurze 4 przedstawiono wzrost i produktywność 10 l hodowli fermentacyjnej wydzielającego białko szczepu DK8-27KanII3-mut25. Fermentację przeprowadzono w 25°C i pH 5,0 z kontrolą glicerolu i pO2.

Na figurze 5 przedstawiono poszczególne oligonukleotydy stosowane do syntezy genu HOX z optymalizacją kodonu.

Na figurze 6 przedstawiono sekwencję nukleotydową syntetycznego genu HOX z optymalizacją kodonu i odpowiadającą sekwencję aminokwasową.

Na figurach 7A-7D przedstawiono lokalizację enzymu HOX w H. polymorpha określoną na podstawie immunofluorescencji. Zaznaczono superimpozycje położenia enzymu HOX (zielony sygnał) wraz z położeniem jądrowym (niebieski sygnał). Patrz A) szczep RB11 bez genu HOX. B) DK8-27. C) DK8-27mut25. D) DK2II-I.

Na figurze 8 przedstawiono wykres aktywności HOX jako funkcję liczby cykli homogenizatora komórek.

Na figurze 9 przedstawiono wykres dla komórek Hansenula polymorpha ekstrahowanych różnymi stężeniami CTAB i Triton X-100.

Na figurze 10A przedstawiono analizę SDS-PAGE poziomu enzymu HOX w nadsączu komórkowym (tor 7-10) i osadzie (tor 2-5) po potraktowaniu CTAB. Enzym HOX uwalniany był z osadu poprzez ekstrakcję mechaniczną. Próby analizowano w 4-12% żelu NuPAGE z MES, Novex. Na każdy tor nakładano 10 μΐ następującej próby w kolejności: tor 2-5: pozostałość HOX w osadzie komórkowym; tor 7-10: uwolniony HOX w nadsączu; tor 1 i 6: standard Novex See Blue, tor 2: kontrola, tor 3: 0,1% CTAB; tor 4: 0,2% CTAB; tor 5: 0,4% CTAB; tor 7: kontrola, tor 8: 0,1% CTAB; tor 9: 0,2% CTAB i tor 10: 0,4% CTAB.

Na figurze 10B przedstawiono analizę Western blot poziomu enzymu HOX w nadsączu komórkowym (tory 7-10) i osadzie (tory 2-5) po potraktowaniu CTAB. Enzym HOX uwalniany był z osadu poprzez ekstrakcję mechaniczną. Próby analizowano w 4-12% żelu NuPAGE z MES, Novex. Na każdy tor nakładano 5 μl próby w następującej kolejności: tor 2-5: pozostałość HOX w osadzie komórkowym; tor 7-10: uwolniony HOX w nadsączu; tor 1 i 6: standard Novex See Blue, tor 2: kontrola, tor 3: 0,1% CTAB; tor 4: 0,2% CTAB; tor 5: 0,4% CTAB; tor 7: kontrola, tor 8: 0,1% CTAB; tor 9: 0,2% CTAB i tor 10: 0,4% CTAB.

Na figurze 11A przedstawiono profil elucji dla HOX ekstrahowanego z udziałem CTAB.

Na figurze 11B przedstawiono profil elucji ekstrahowanego mechanicznie HOX.

Przykłady

Materiały i metody

Odczynniki chemiczne

Wszystkie zastosowane odczynniki chemiczne przeznaczone były do analiz analitycznych. Lecytyna (3-sn-fosfatydylocholina) jest handlowo dostępna jako Sternpur PM z Stern (Niemcy). Pronaza E (nazwa zastrzeżona mieszaniny różnych egzo- i endopeptydaz, uzyskanych z Streptomyces griseus, zdolna do niemal całkowitej hydrolizy właściwie każdego białka do wolnych aminokwasów). Lizolecytyna (lizofatydylocholina), D-glukoza, o-dianizydyna, peroksydaza (P-8125), kwas kaprynowy (kwas dekanoinowy), saponina (jakikolwiek z licznej grupy glikozydów, powszechnie występujących w roślinach, będących dobrymi surfaktantami) i CTAB (bromek cetylotrimetyloamoniowy, zwany również bromkiem heksadecylotrimetyloamoniowym) (H-5882) pochodziły z Sigma Chemical Co., USA. Metanol (HPLC) nabyty został z Lab-Scan Ltd. Nadtlenek wodoru i Triton X-100 (nazwa zastrzeżona polietoksylowanego oktylofenolu) pochodziły z Merck, Niemcy. Emulgator YN, zwany również handlowo jako Palsgaard 4445 pochodził z Palsgaard, Dania. Czwartorzędowe związki amoniowe, takie jak LTAB (bromek lauroilotrimetyloamoniowy), Cetrymid-40 (znany również jako cetrymidum, dezynfekujący detergent, zawierający mieszaninę bromków alkiloamoniowych, głównie CTAB), CTAB (bromek cetylotrimetyloamoniowy), STAB (bromek stearoilotrimetyloamoniowy), MTAC (chlorek mirystylotrimetyloamoniowy), CTAC (chlorek cetylotrimetyloamoniowy), STAC (chlorek stearoilotrimetyloamoniowy), wszystkie pochodziły z FeF, Dania. Rodalon, zawierający około 9,5% (95 g/l) chlorku alkilodimetylobenzyloamoniowego (C12H25N(CH3)2C7H7Cl) uzyskano z Superfos Biosector, 2950 Vedbaek, Dania. Chlorek alkilodimetylobenzyloamoniowy znany jest również jako chlorek benzalkonium. Emulgator, sodowy mleczan laurylu (SLL) pochodził z Danisco Cultor, Grindsted, Dania.

PL 206 561 B1

Fermentacja drożdży

Hodowle drożdży prowadzono w 6 1 lub 100 l fermentorze według podręcznika do fermentacji Rhein Biotech dla skali 10 l.

P r z y k ł a d 1

Składanie syntetycznego genu HOXz optymalizacją kodonu

Projektowanie genu

Zmieniano sekwencję nukleotydową natywnego genu HOX, uzyskując syntetyczny gen. Syntetyczny gen HOX (figura 6) zaprojektowano tak, by zastosowany kodon był dokładnie dopasowany do znanych preferencji kodonów biotechnologicznie istotnych drożdży, takich jak Pichia sp., Hansenula sp., Kluyveromyces, Yarrowinia, S. pombe, w celu ułatwienia osiągnięcia wysokiego poziomu produkcji w tych organizmach. Gen podzielono na trzy oddzielnie składane i/lub klonowane fragmenty.

Podzestawy, oznaczone jako 5'-proksymalna połowa, składały się z oligonukleotydów wymienionych na figurze 5 jako komplementarne pary: HOX1a/HOX2b, HOX3a/HOX4b, HOX5a/HOX6b, HOX7a/HOX8b, HOX9a/HOX10b); 3'dystalna połowa A wykorzystująca startery 1-6 i 3'dystalna połowa B wykorzystująca startery 6-10.

5' proksymalny syntetyczny gen HOX

5' proksymalna połowę syntetycznego genu HOX syntetyzowano stosując dziesięć oligonukleotydów HOX1A do HOX10B. Jako startery (każdy o stężeniu = 0,1 μΜ) w 100 μΐ reakcji PCR gorącego startu (z termostabilną polimerazą DNA Pwo (Boehringer)) zastosowano oligonukleotydy o długości od 100-120 par zasad. Gorący start prowadzono poprzez ogrzewanie mieszaniny oligonukleotydów, buforu, MgSO₄ do 90°C przed dodaniem dNTP (250 μM) i polimerazy Pwo (2,5 jednostki). Reakcja PCR obejmowała 40 cykli: 94°C przez 30 sekund, 57°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Reakcja dodatkowo obejmowała 10 minutowy, końcowy etap wydłużania w 72°C. Analiza elektroforetyczna produktów PCR w żelu agarozowym wykazała rozmyte prążki DNA wielkości od 100 do 850 par zasad. Pierwsze produkty PCR ponownie powielono stosując 2 μl z powyższej reakcji jako matrycę i jako startery flankujące (każdy 1 μM HOX1A i HOX 10B. Mieszanina reakcyjna zawierała 200 nM dNTP, 2,5 mM MgCl2 i 2 jednostki AmpliTaq^® (Perkin-Elmer Cetus). Warunki PCR były następujące: 94°C przez 2 minuty, następnie 30 cykli PCR: 94°C przez 30 sekund, 60°C przez 1 minutę i 72°C przez 45 sekund. Reakcja obejmowała końcowy, 10 minutowy etap wydłużania w 72°C. Analiza elektroforetyczna w żelu agarozowym drugich produktów PCR wykazała obecność prążka DNA o 850 pz, który następnie oczyszczono z żelu i klonowano do wektora pCR^® (Invitrogen).

3' dystalny syntetyczny gen HOX

Do syntezy dystalnej części genu HOX zaprojektowano dziesięć starterów długości 90-126 par zasad. Startery zawierały zachodzące (komplementarne) regiony o 16-21 parach zasad i temperaturze topnienia obliczonej w przybliżeniu na 60°C. Dystalną część genu HOX syntetyzowano w dwóch fragmentach (A i B), każdy długości 530 par zasad. Reakcje PCR przeprowadzono stosując jednocześnie 6 starterów. W 1 reakcji PCR wykorzystano startery 1-6, a w drugiej reakcji PCR startery 5-10. Reakcje PCR prowadzono stosując 0,1 μM każdego ze starterów, 250 μM każdego z dNTP, 2 mM MgSO4 i 2,5 jednostki polimerazy DNA Pfu z Pyrococcus furiosus (Strategene) w objętości reakcji 100 pl. Parametry 2 reakcji PCR z użyciem polimerazy DNA Pfu obejmowały: 1 min. denaturacji w 95°C, po której następowało 30 cykli PCR: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Na zakończenie reakcji następował etap wydłużania w 72°C przez 3 minuty. Analiza elektroforetyczna w żelu agarozowym produktów PCR z dwóch reakcji PCR wykazała w obu przypadkach syntezę jednego specyficznego prążka DNA o prawidłowej długości, w przybliżeniu 530 pz. Produkty PCR klonowano w wektorze pCR^®-Blunt (Invitrogen). Klonowane, częściowe syntetyczne geny HOX sekwencjonowano stosując startery flankujące miejsca wielokrotnego klonowania (starter odwrotny M13 i starter promotora T7). Wyniki sekwencjonowania potwierdziły, że zsyntetyzowane częściowe geny zawierały prawidłową sekwencję.

Składanie ostatecznego genu HOX z optymalizacją kodonu

Trzy części syntetycznego genu HOX połączono poprzez ligację oczyszczonych z żelu fragmentów DNA zawierających Ncol/PVuII 5' proksymalny HOX, 3' dystalny PVuII/SpeI fragment A HOX i fragment B cięty Spel/Notl. Całkowity syntetyczny gen HOX ze zoptymalizowanym kodonem (figura 6) wstawiono do wektora ekspresyjnego Hansenula, otrzymanego w celu osiągnięcia ekspresji i wydzielania obcych białek z Hansenula. Wektor ekspresyjny opierał się na promotorze dehydrogenazy mrówczanowy (FMD), terminatorze MOX, z i bez drożdżowej sekwencji wydzielniczej.

PL 206 561 B1

Wyniki 1

Ekspresja rekombinowanego HOX w H. polymorpha

W tabeli 1 przedstawiono różne konstrukty fuzyjne HOX/wydzielanie, wstawione jako tępe fragmenty EcoRI/Notl w miejscu wielokrotnego klonowania wektora ekspresyjnego/integracyjnego H. polymorpha.

Różne sekwencje sygnałowe pochodziły z genu glukoamylazy z Schwanniomyces occidentalis, genu czynnika a typu dopasowującego z Saccharomyces cerevisiae i TAKA-amylazy z Aspergillus oryzae. Konstrukt Ncol/Notl HOX bez sekwencji sygnałowej był również klonowany w wektorze.

T a b e l a 1

Nazwa klonu	Sekwencja sygnałowa	HOX	Połączenie fuzyjne
1. DK 1	glukoamylaza	syntetyczny dziki typ	SAIQA MATLP
2. DK 2	glukoamylaza	syntetyczny dziki typ	SAIQA ATLP
3. DK 3	czynnik α	syntetyczny dziki typ	KREAEA MATLP
4. DK 4	czynnik α	syntetyczny dziki typ	KREAEA ATLP
5. DK 5	czynnik α	syntetyczny mutant	KREAEA MATLP
6. DK 6	czynnik α	syntetyczny mutant	KR MATLP
7. DK 7	TAKA-amylaza	syntetyczny mutant	APALA MATLP
8. DK 8	bez sekwencji sygnałowej	syntetyczny dziki typ	brak - MATLP

Termin syntetyczny mutant odnosi się do przypuszczalnego miejsca cięcia proteazy KEX2 R331^-K332 ^{do R}331^-P332^.

P r z y k ł a d 2

Transformacja i pasaże

W celu transformacji uracyloauksotroficznego szczepu H. polymorpha RB11 do prototrofa urydynowego, zastosowano różne plazmidy ekspresyjne HOX.

Transformowane komórki HOX posiadające różne plazmidy ekspresyjne hodowano w warunkach selekcyjnych przez 30 pokoleń w celu amplifikacji plazmidowego DNA i zajścia jego integracji z genomem.

Transformanty hodowano na nieselekcyjnym kompletnym podłożu przez 20 pokoleń.

Oprócz selekcji, do badań transformantów zastosowano PCR i analizę Southern blotting.

Określenie ilości kopii zintegrowanego, heterologicznego DNA

Genomowy DNA nie transformowanego szczepu gospodarza i różne rekombinowane izolaty poszczególnych konstruktów HOX trawiono enzymami restrykcyjnymi, Asp718/NcoI.

Przecięty DNA rozdzielano w 0,8% żelu agarozowym, przenoszono na membranę (nitrocelulozę) i hybrydyzowano ze znakowanym ³²P fragmentem klonowanego promotora FMD.

Wzór hybrydyzacji ujawnił dwa sygnały, jeden dla prawidłowej, pojedynczej kopii 1,4 kz genu FMD i jeden pochodzący z nieco mniejszego heterologicznego genu fuzyjnego.

Serie rozcieńczeń umożliwiły oszacowanie intensywności sygnału zintegrowanego DNA w porównaniu z wewnętrzną pojedynczą kopią kontrolną.

Wyniki 2

Skrining pod względem ekspresji HOX

Transformanty hodowano w 3 ml probówkach hodowlanych i w warunkach powstałych w wyniku uzupełnienia podłoża 1% glicerolem.

Ekspresję genu HOX analizowano stosując SDS-PAGE kultur fermentacji glicerolowej.

Zastosowano analizę Western biot z poliklonalnym przeciwciałem HOX do wykrycia obecności białka HOX.

PL 206 561 B1

T a b e l a 2

Charakterystyka wybranych transformantów wykazujących ekspresję HOX

Transformant	Ilość kopii	N-koniec	Miejsce ekspresji	Aktywność HOX
DK1-49	« 10	nieobrabiany peptyd sygnałowy	rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje	brak
DK2II-1	« 20	nieobrabiany peptyd sygnałowy	rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje	brak
DK3II-4	« 20	nieobrabiany peptyd sygnałowy	rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje	brak
DK4-39	« 10	nieobrabiany peptyd sygnałowy	rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje	brak
DK5-13	« 30-40	nieobrabiany peptyd sygnałowy	rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje	brak
DK6-16	« 10	nieobrabiany peptyd sygnałowy	rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje	brak
DK7-1	« 10	nieobrabiany peptyd sygnałowy	rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje	brak
DK8-1	« 2-3	tak, jak dojrzały	rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje	aktywność
DK8-27	« 20	tak, jak dojrzały	rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje	aktywność
DK8-27* KanII3-mut25	« 20	tak, jak dojrzały	zewnątrzkomórkowa i wewnątrzkomórkowa	aktywność
DK8-27Kan* IV2-mut301	« 20	tak, jak dojrzały	zewnątrzkomórkowa i wewnątrzkomórkowa	aktywność

* Szczep DK8-27 poddany chemicznej mutagenezie (NTG - nitrozoguanidyna)

P r z y k ł a d 3

Położenie rekombinowanego HOX w H. polymorpha

Do immunofluorescencyjnej analizy mikroskopowej rekombinowanych H. polymorpha, komórki hodowano wstępnie w Yeast Nitrogen Base (YNB) + glukoza do osiągnięcia gęstości 10⁸ kom./ml. W celu indukcji ekspresji, 3 x 10⁸ komórek przeniesiono do 100 ml kolby do hodowli z wytrząsaniem, uzupełnionej YNB + 1% glicerol. Po 1, 2 lub 3 dniach wzrostu w warunkach utworzonych obecnością glicerolu, 5 x 10⁸ komórek utrwalano poprzez łączne działanie paraformaldehydu (4%) i glutaraldehydu (0,2%) (Hagen & Hyam, 1988). Po trzech przepłukaniach 1 ml PEM (100 mM Pipes, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 6,9), ściany komórkowe częściowo usuwano w PEMS (PEM + 1 M sorbitol) uzupełniony 0,5 ml Zymolaze-100T. Po upływie w przybliżeniu 60 minut trawienia komórki przenoszono do PEMS + 1% Triton X-100, inkubowano 30 sekund i przemywano trzykrotnie 0,5 ml PEM. W celu wygaszenia nie przereagowanego glutaraldehydu komórki zawieszano ponownie w PEM + 1 mg/ml borowodorku sodu. Natychmiast po tym komórki przemywano dwukrotnie PEM, zawieszano ponownie w PEMBAL (PEM + 1% BSA (bez globulin), 1 mM chlorowodorku lizyny, 0,1% NaN3) i inkubowano na wytrząsarce przez 30 minut. 25% zawiesiny komórkowej, równoważne 10⁸ komórek, uzupełniano 10 μg/ml oczyszczonego metodą powinowactwa poliklonalnego, przeciwciała swoistego wobec HOX i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Po trzech przemyciach 0,5 ml PEMBAL, komórki zawieszano w PEMBAL i inkubowano przez 5-20 godzin w ciemności wraz z 0,5% sprzężonymi z FITC kozimi przeciwciałami antykróliczymi (Sigma). Po przemyciu w PEMBAL, komórki przemywano raz PBS, raz PBS + 0,2 μg/ml diamidynofenyloindolu (DAPI) i ostatecznie zawieszano ponownie w PBS + 0,1% NaN3. W celu obserwacji mikroskopowych, małe próbki zawiesiny komórkowej suszono na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną, odwracano je do kropli 100% glicerolu zawierającego 1 mg/ml parafenylenodiaminy. Komórki badano stosując mikroskop Zeiss, odpowiedni do pośredniej immunofluorescencji przy 1000 X, obrazy przechwytywano kamerą CCD (MicroMAXKodak) i analizowano przy użyciu programu MetaMorph software.

PL 206 561 B1

Wyniki 3

Analiza mikroskopii immunofluorescencyjnej transformanta DK8-27 wykazała, że rekombinowane białko HOX położone jest głównie na obrzeżach komórki w postaci skupisk (figura 7b). Biorąc pod uwagę także dane biochemiczne, wyniki wskazują, że w pewnym zakresie, HOX może być białkiem towarzyszącym błonie komórki (w przeciwieństwie do białka istotnie związanego z błonami). Prawdopodobnie, HOX występuje w błonie plazmatycznej H. polymorpha. W szczepie DK8-27 mut25, pochodzącym od DK8-27, HOX również towarzyszy błonie plazmatycznej (figura 7c). Jednakże białko nie występuje w agregatach, lecz jest bardziej jednolicie rozmieszczone. W przypadku, gdy połączone jest z różnymi peptydami liderowymi, HOX występuje w postaci olbrzymich, wewnątrzkomórkowych skupisk (figura 7d).

P r z y k ł a d 4

Ekstrakcja HOX z rekombinowanych komórek Hansenula z użyciem różnych detergentów i proteaz

Eksperyment wykonano stosując 5,0 ml zawiesiny komórkowej (komórki + nadsącz) w 15 ml probówkach do wirowania (HOX9926-7, 317 g kom/l mokrej masy, 0,3 U/ml zewnątrzkomórkowej aktywności HOX). Komórki oddzielano poprzez wirowanie przy 4000 g przez 10 minut. Do badań nad przepuszczalnością, nadsącz uzupełniano CTAB, CTAB + Pronazą E, Tween 20 (nazwa zastrzeżona polioksyetylenowego monolaurynianu sorbitanu) i Tween 80 (nazwa zastrzeżona monooleinianu sorbitanu). Następnie, komórki zawieszano ponownie w 4,0 ml i inkubowano 23 godz. w temperaturze 25°C (500 obr/min), w celu zbadania wpływu czasu z CTAB komórki w jednej z probówek inkubowano tylko 7 min. w temperaturze 25°C w 4 ml 0,4% CTAB. Komórki rozdzielano poprzez wirowanie. Komórki zawieszano ponownie w wyjściowym nadsączu bez CTAB i inkubowano przez 23 godziny jak wyżej. Po inkubacji, mierzono, stosując analizę HOX, poziom zewnątrzkomórkowego HOX w ekstrakcie pozbawionym komórek.

Analiza określająca aktywność HOX (analiza HOX)

Aktywność HOX szacowano stosując analizę według Sullivan i Ikawa (1973). Zmniejszono jej skalę, przystosowując do badań na płytce do mikromiareczkowania.

Podstawa metody

Analiza HOX oparta jest na pomiarze nadtlenku wodoru tworzonego podczas utleniania glukozy. Nadtlenek wodoru utlenia o-dianizydynę w obecności peroksydazy (POD), czemu towarzyszy pojawienie się zabarwienia.

HOX β-D-glukoza + H₂O + O₂ D-glukono-delta-lakton + H₂O₂POD

H₂O₂ + o-dianizydynaz_red. 2 H₂O + o-dianizydyna..·

Odczynniki

1. 100 mM bufor fosforanowy, pH 6,3.

2. 100 mM D-glukoza w 100 mM buforze fosforanowym, pH 6,3.

3. o-Dianizydyna, 0,10 mg/ml w 100 mM buforze fosforanowym, pH 6,3.

Analiza

120 μl odczynnika 1 150 μl odczynnika 2 μl odczynnika 3 10 μl odczynnika 4 μl roztworu enzymu (w odpowiednim rozcieńczeniu)

Analizę wykonywano na płytce do mikromiareczkowania. Reakcję rozpoczynano dodając roztwór enzymu. Mieszaninę inkubowano wytrząsając w 25°C przez 10 minut. Próba ślepa zawierała wszystkie składniki z wodą zamiast roztworu enzymu. Powstawanie koloru mierzono czytnikiem do płytek do mikromiareczkowania przy 405 nm. Liniowość reakcji sprawdzano stosując program pomiaru kinetyki czytnika mikropłytki.

Krzywa standardowa dla nadtlenku wodoru

Krzywą standardową dla nadtlenku wodoru sporządzono stosując różne stężenia świeżego H2O2. Jedną jednostkę aktywności enzymatycznej zdefiniowano jako ilość enzymu, która pozwala na otrzymanie 1 μmola H₂O₂ na minutę w 25°C.

PL 206 561 B1

Wyniki 4

Dane przedstawione w tabeli 3 wskazują na dużą skuteczność CTAB w ekstrakcji HOX. CTAB jest również dużo bardziej skuteczny niż Tween 20 i Tween 80. Nie zaobserwowano znaczącej korzyści, płynącej z dodania proteazy. Bardzo interesujący jest fakt, że CTAB wywiera pozytywny wpływ, nawet, gdy stosowany jest tylko przez 7 minut wstępnej inkubacji. Wskazuje to na to, że CTAB bardzo szybko wiąże się i zwiększa przepuszczalność ścian komórkowych Hansenula. Potwierdzono to analizą CTAB nadsączu bez komórek (patrz poniżej), która wykazała, że jedynie 50-100 ppm z dodanych 4000 ppm CTAB obecnych jest w pozbawionym komórek nadsączu. Porównanie osadu powstałego w probówkach dla każdego testowanego odczynnika również wskazuje na to, że upakowana objętość komórki traktowanej CTAB jest mniejsza niż objętość komórek kontrolnych lub komórek traktowanych detergentami innymi, niż CTAB. Takie skurczenie komórek świadczy o tym, że komórki te rzeczywiście stały się przepuszczalne i utraciły część ich rozpuszczalnej zawartości.

T a b e l a 3

Wpływ detergentu, detergentu w połączeniu z protezą i wstępnej inkubacji na ekstrakcję wewnątrzkomórkowego HOX

Test	Aktywność HOX %
Kontrola	100
0,4% CTAB	4600
0,4% CTAB + Pronase E (400 PU)	5000
0,4% CTAB + Pronase E (800 PU)	4800
Pronase E (400 PU)	120
0,4% Tween 20	140
0,4% Tween 80	140
Wstępna inkubacja w 0,4% CTAB przez 7 min.	5100

P r z y k ł a d 5

Ekstrakcja HOX przy użyciu CTAB i chlorku benzalkonium (BAC)

Doświadczenie przeprowadzono stosując 5,0 ml zawiesiny komórek (komórki + nadsącz) w 15 ml probówkach do wirowania (HOX9959, Mut 45). Zawiesinę komórek uzupełniano następnie CTAB (z 10% roztworu wyjściowego CTAB) lub chlorkiem benzalkonium (Rodalon, 9,5% chlorek benzalkonium) i inkubowano przez 22 godziny w 25°C (200 obr/min.). Po inkubacji, mierzono poziom zewnątrzkomórkowego HOX (komórki usuwano poprzez 10 min wirowanie przy 4000 g) stosując analizę HOX.

Wyniki 5

Dane przedstawione w tabeli 4 wskazują, ze chlorek benzalkonium (BAC) jest bardzo skuteczny w uwalnianiu enzymu HOX z komórek.

T a b e l a 4

Wpływ CTAB i chlorku benzalkonium (BAC) na uwalnianie HOX z komórek

Test	Aktywność HOX %
Kontrola	100
0,4% CTAB	1300
0,08% BAC	2500
0,17% BAC	2300
0,50% BAC	2300
0,70% BAC	2100
0,83% BAC	1700
1,00% BAC	1600

PL 206 561 B1

P r z y k ł a d 6

Ekstrakcja HOX z użyciem CTAB w połączeniu z solami i w różnych temperaturach

W celu zbadania mechanizmu działania CTAB, CTAB połączono z chaotropowymi i niechaotropowymi solami. Pięć ml zawiesiny komórek (komórki + nadsącz) dodawano do 15 ml probówek do wirowania (HOX9926-7, 317 g kom./litr mokrej masy, 0,3 U/ml zewnątrzkomórkowej aktywności HOX). Komórki rozdzielano poprzez wirowanie przy 4000 g przez 10 min.

Nadsącz następnie uzupełniano CTAB, CTAB + NaCl, CTAB + mocznikiem, CTAB + siarczanem amonu lub niejonowym detergentem, oktyloglukozydem. Komórki zawieszano ponownie w 4,0 ml nadsączu i inkubowano przez 26 godzin w 25°C (500 obr/min.).

W tym doświadczeniu, badano również wpływ wytrząsania i temperatury. Po inkubacji, pozbawiony komórek ekstrakt stosowano do oszacowania aktywności HOX przy użyciu analizy HOX, jak wyżej, w przykładzie 4.

Wyniki 6

Wyniki przedstawiono w tabeli 5. Wynika z nich jasno, że wytrząsanie nie jest niezbędne w ekstrakcji HOX w obecności CTAB.

Wyraźnie widoczny jest wpływ temperatury, przejawiający się w tym, że ekstrakcja w 4°C pozwoliła na osiągnięcie jedynie połowy aktywności obserwowanej w 25°C.

Zarówno dodatek chlorku sodu, jak i siarczanu amonu obniżył wpływ działania CTAB, co może świadczyć, że jonowy charakter CTAB jest nie bez znaczenia.

Dodanie mocznika wywoływało mniej drastyczny skutek, jednak wciąż zmniejszało ilość ekstrahowanego HOX do około połowy ilości ekstrahowanej 0,4% CTAB. Mimo że mocznik jest niejonowy, może zakłócać oddziaływania hydrofobowe.

Wcześniejsze badania ujawniły, że mocznik zwiększa przepuszczalność komórek Pichia w ekstrakcji białek lipofilnych (Craig 1987). Niejonowy detergent, glukozyd oktylu, nie przejawiał żadnego znaczącego wpływu na ekstrakcję.

T a b e l a 5

Wpływ detergentu, detergentu w połączeniu z solą, wytrząsania i temperatury na ekstrakcję wewnątrzkomórkowego HOX

Test	Aktywność HOX %
Kontrola	100
0,4% CTAB	6700
0,4% CTAB, bez wytrząsania	7700
0,4% CTAB, bez wytrząsania, w 4°C	2800
0,4% CTAB + 1,0 M NaCl	1900
0,4% CTAB + 1,0 M mocznik	3600
0,4% CTAB + 1,0 M siarczan amonu	2300
0,2% oktylo-glukozyd	130
0,4% oktylo-glukozyd	190

P r z y k ł a d 7

Określenie CTAB i LTAB przy użyciu LC-ESI-MS w ekstraktach komórkowych zawierających HOX Próby ekstrahowanego HOX, uzyskane w przykładzie 5 analizowano pod kątem zawartości

CTAB przy użyciu LC-ESI-MS w układzie Hewlett-Packard 1100 HPLC-MS, składającym się z następujących elementów:

a) pompy podwójnego gradientu, HP 1100,

b) automatycznej obsługi próbek, HP 1100,

c) termostatowanej kolumny przedziałowej, HP 1100,

d) selektywnego detektora masowego, HP 1100,

e) systemu danych chromatograficznych, HP ChemStation, wersja 6.01.

Układ wyposażony był w kolumnę Zorbax Eclipse® XDB-C8, 5 μΜ, 150 x 4,6 mM id. (Hewlett-Packard).

PL 206 561 B1

Temperatura kolumny wynosiła 25°C.

Warunki chromatografii obejmowały ruchomą fazę zawierającą dwa rozpuszczalniki. Rozpuszczalnik A: 1 mM NH4OAc/woda, rozpuszczalnik B: 1 mM NH4OAc/metanol.

Kolumna pracowała w warunkach izokratycznych (tzn. w zastosowanych warunkach skład eluenta pozostawał stały podczas chromatografii): 5% A + 95% B, przy prędkości przepływu rozpuszczalnika 0,80 ml/min i wstrzykiwanej objętości 10 pl.

Próby wstrzykiwano bezpośrednio.

Warunki spektrometrii masowej były następujące według ustawienia komory sprayu: sposób jonizacji: elektrospray dodatni temperatura suszącego gazu (N2): 350°C prędkość przepływu gazu suszącego: 6,0 l/min ciśnienie nebulizera: 60 psi (0,4 Mpa) napięcie kapilarne: -4000 Volt napięcie fragmentora: 100 Volt

Ustawienia detektora były następujące: parametry SIM: m/z 284,1 (kation heksadecylotrimetyloamoniowy).

Roztwór wyjściowy, zawierający 500 μg CTAB/ml wody (indeks stężenia 1000) rozcieńczano wodą w celu uzyskania standardowych roztworów o następujących indeksach stężenia: 300-100-30-10. Do prób dodawano 0,4% CTAB, która to ilość dawała stężenie 4000 μg/ml, jeżeli cały CTAB był obecny w ekstrakcie.

Metodę analizy czwartorzędowych związków amoniowych optymalizowano stosując różne kolumny i różne fazy ruchome. Do dwóch 90 l fermentorów (Vest0002b o stężeniu biomasy 314 g/l mokrych komórek i Vest0003b o stężeniu biomasy 332 g/l mokrych komórek) dodano LTAB do stężenia na poziomie 0,20% (wag./obj.) i ekstrahowano HOX przez 24 godz.

Próba z każdego fermentora była wirowana przy 10000 g przez 10 minut, a uzyskany w ten sposób nadsącz pobierano do analizy LTAB. Do określenia zawartości LTAB w nadsączach zastosowano LC-ESI-MS w układzie Hewlett-Packard 1100 HPLC-MS, system składający się z następujących elementów:

a) pompy podwójnego gradientu, HP 1100,

b) automatycznej obsługi próbek, HP 1100,

c) termostatowanej kolumny przedziałowej, HP 1100,

d) selektywnego detektora masowego, HP 1100,

e) systemu danych chromatograficznych, HP ChemStation, wersja 6.01.

Układ wyposażony był w kolumnę PLRP-S, 100A, 5 μm, 250 x 4,6 mM id. (Polimer Laboratories). Temperatura kolumny wynosiła 25°C.

Warunki chromatografii obejmowały ruchomą fazę zawierającą 0,1% kwas heptafluoromasłowy w metanolu. Kolumna pracowała przy prędkości przepływu rozpuszczalnika 1,00 ml/min i wstrzykiwanej objętości 5 \xl. Próby rozcieńczano 25-krotnie metanolem i filtrowano przed wstrzyknięciem przez Gelman GHP Acrodisc 13 mM Minispike 0,45 pM.

Warunki spektrometrii masowej były następujące według ustawienia komory sprayu: sposób jonizacji: elektrospray dodatni temperatura suszącego gazu (N2): 350°C prędkość przepływu gazu suszącego: 13,0 l/min ciśnienie nebulizera: 60 psi (0,4 Mpa) napięcie kapilarne: -4000 Volt napięcie fragmentora: 150 Volt

Ustawienia detektora były następujące: parametry SIM: m/z 228,1 (kation lauroilotrimetyloamoniowy). Roztwór wyjściowy, zawierający 250 μg LTAB/ml metanolu (indeks stężenia 1000) rozcieńczano metanolem w celu uzyskania standardowych roztworów o następujących indeksach stężenia: 400-200-120-80-36-10,8- 5,4-2,16-0,864.

Wyniki 7

Na podstawie danych zamieszczonych w tabeli 6, jasne jest, że poziom CTAB w ekstraktach komórkowych zawierających enzym HOX jest dużo niższy, niż ilość dodana do komórek.

Wyjaśnia to wiązanie i wywołane przez to unieruchomienie CTAB przez ściany komórkowe drożdży. Oznacza to, że uzyskany enzym HOX zawiera jedynie bardzo niski poziom CTAB.

PL 206 561 B1

T a b e l a 6

Zawartość CTAB w ekstrahowanych nadsączach HOX, uzyskanych w przykładzie 6

Test	Stężenie ¹CTAB, μg/ml
Kontrola	21
0,4% CTAB	115
0,4% CTAB, bez wytrząsania	52
0,4% CTAB, bez wytrząsania, w 4°C	35
0,4% CTAB + 1,0 M NaCl	212
0,4% CTAB + 1,0 M mocznik	235
0,4% CTAB + 1,0 M siarczan amonu	246

¹ analizowane pierwszą metodą

Wyniki uzyskane dla LTAB w nadsączu (patrz tabela 6a) wskazują, że jedynie około 27% dodanego LTAB odnalezione zostało w frakcji pozbawionej komórek. Wyniki te wykazują te same tendencje jak rezultaty uzyskane dla CTAB, zamieszczone w tabeli 6.

T a b e l a 6a

Zawartość LTAB w nadsączach ekstrahowanych z fermentacji Vest0002b i Vest0003b z przykładu 6

Fermentacja	Dodany LTAB [pg/ml]	¹LTAB w ekstrakcie bezkomórkowym ^g/ml]
Vest0002b	2000	538
Vest0003b	2000	550

¹ analizowane metodą optymalizowaną

P r z y k ł a d 8

Wpływ temperatury na czas i skuteczność ekstrakcji HOX z użyciem CTAB

Wpływ temperatury na czas i skuteczność ekstrakcji HOX z użyciem CTAB badano na próbie z Hansenula: Mut45, HOX9949, 282 g/l, 2,6 U/ml.

Do 5 ml kultury fermentacyjnej (komórki + nadsącz) w probówkach do wirowania dodano 0,2% lub 0,4% CTAB (z 10% roztworu CTAB). Probówki inkubowano odpowiednio w 25, 30, 35 i 40°C (200 obr/min.). W określonych punktach czasowych próby pobierano, wirowano przez 5 minut przy 10000 g i analizowano nadsącz pod kątem aktywności HOX. Wyniki przedstawiono w tabeli 7.

T a b e l a 7

Czasowy przebieg ekstrakcji HOX z H. polymorpha w różnych temperaturach

Warunki ekstrakcji	Ekstrahowany HOX [U/ml]
4 h	8 h	24 h	31 h	48 h
25°C, 0,2% CTAB	5,1	7,5	31	36	44
25°C, 0,4% CTAB	5,9	9,2	25	29	37
30°C, 0,2% CTAB	6,8	15	38	45	44
30°C, 0,4% CTAB	7,4	15	36	40	42
35°C, 0,2% CTAB	6,4	16	36	44	41
35°C, 0,4% CTAB	8,2	15	33	37	23
40°C, 0,2% CTAB	16	27	44	43	32
40°C, 0,4% CTAB	17	28	56	59	40

PL 206 561 B1

Wyniki 8

Jasne jest, że ekstrakcja CTAB zależy od temperatury i że ekstrakcja przebiega szybciej w wyższej temperaturze. Jednakże jest to parametr, który powinien być zrównoważony stabilnością ekstrahowanego białka. W niniejszym doświadczeniu nie odnotowano żadnych znaczących różnic pomiędzy zastosowaniem 0,2%, czy 0,4% CTAB. Jednak uzależnione jest to od stężenia komórek w poszczególnych eksperymentach.

P r z y k ł a d 9

Ekstrakcja HOX z użyciem różnych czwartorzędowych związków amoniowych

Kilka czwartorzędowych związków amoniowych badano pod względem zastosowania w ekstrakcji wewnątrzkomórkowego enzymu HOX z Hansenula polymorpha. Pobierano próbkę bulionu fermentacyjnego z 6 l fermentora o stężeniu biomasy w przybliżeniu 340 g mokrej masy na litr. Jeden ml z 4% (wag./obj.) roztworu każdego z czwartorzędowych związków amoniowych wymienionych w tabeli 8 dodawano do 9 ml bulionu fermentacyjnego w plastykowych probówkach. Po 24 godz. inkubacji w 25°C przy 200 obr/min, probówki wirowano 10 minut przy 12000 g. Uzyskany nadsącz analizowano pod względem aktywności HOX stosując opisaną wcześniej metodę HOX.

Badano przebieg czasowy ekstrakcji HOX z użyciem CTAB, LTAB i CTAC. Z fermentora pobrano próbę fermentacyjną, zawierającą 280 g mokrej masy Hansenula polymorpha na litr. Do plastykowych probówek zawierających 9 ml bulionu fermentacyjnego dodano 4% (wag./obj.) roztwór CTAB, LTAB i CTAC do końcowego stężenia 0,2 lub 0,4% (wag./obj.). Po 0, 7, 17, 24 i 48 godz. inkubacji w 25°C przy 200 obr/min, probówki wirowano przez 10 minut przy 12000 x g. Uzyskany nadsącz analizowano pod względem aktywności HOX, stosując opisaną uprzednio metodę HOX.

Wpływ LTAB na ekstrakcję badano na szczepie Pichia pastoris # 349, produkującym wewnątrzkomórkowo HOX. Próbkę bulionu fermentacyjnego pobierano z 6 l fermentora o stężeniu biomasy w przybliżeniu 232 g mokrej masy na litr. Dziewięć ml bulionu fermentacyjnego dodawano do plastykowych probówek wraz z 0 (kontrola) lub 180 pl 10% (wag./obj.) roztworu LTAB. Po 24 godz. inkubacji w 30°C przy 20 obr/min., probówki wirowano przez 5 min przy 9000 g. Nadsącz badano pod względem aktywności HOX, stosując opisaną uprzednio analizę HOX.

Wyniki 9

HOX mógł być ekstrahowany wszystkimi badanymi czwartorzędowymi związkami amoniowymi (patrz tabela 8), gdy dodawano je w stężeniu 0,4% (wag./obj.) do próbki fermentacyjnej. Po 24 godz. inkubacji w 25°C, w ekstrakcji HOX, LTAB okazał się najlepszy z wszystkich testowanych związków. Ilość ekstrahowanego HOX ulegała obniżeniu wraz z wydłużaniem łańcucha czwartorzędowych związków amoniowych.

W tabeli 9 przedstawiono przebieg czasowy ekstrakcji HOX z użyciem CTAB, LTAB lub CTAC. Oczywiście, zarówno czas inkubacji, jak i stężenie odczynnika ekstrakcyjnego wpływały na poziom aktywności wyekstrahowanego HOX. LTAB okazał się najlepszym odczynnikiem ekstrakcyjnym we wszystkich analizowanych punktach czasowych inkubacji, co jest zgodne z wynikami zamieszczonymi w tabeli 8. Ekstrakcja HOX z udziałem LTAB przebiegała wolniej przy stężeniu 0,2% (wag./obj.) LTAB, niż przy stężeniu 0,4% (wag./obj.) LTAB. Zaobserwowano niewielkie różnice ekstrakcji HOX przy zastosowaniu 0,2 i 0,4% (wag./obj.) CTAB.

T a b e l a 8

Ekstrakcja HOX z Hansenula polymorpha różnymi czwartorzędowymi związkami amoniowymi

Nazwa rynkowa	^a Grupy metylenowe w łańcuchu	Przeciw- jon	Aktywność wyekstrahowanego HOX normalizowana z wyekstrahowaną ilością LTAB	^b Odchylenie standardowe
1	2	3	4	5
LTAB	11	Bromek	100	7
Cetrimide-40	13	Bromek	62	6
Cetrimide-40 rozpuszczony w butanolu	13	Bromek	65	1
CTAB	15	Bromek	53	10
STAB	17	Bromek	38	11

PL 206 561 B1 cd. tabeli 8

1	2	3	4	5
MTAC	13	Chlorek	71	2
CTAC	15	Chlorek	67	7
STAC	17	Chlorek	54	10
Pichia pastoris	11	Bromek	3000 ^c	nie określono
LTAB Pichia pastoris kontrola	-	Bromek	100 ^c	nie określono

Poziom zewnątrzkomórkowego HOX w bulionie fermentacyjnym przed dodaniem odczynników ekstrakcyjnych wynosił około 9% aktywności wyekstrahowanego HOX przy użyciu LTAB, po 24 godz. ^a Wszystkie związki mają wzór: CH3-(CH2)n-N (CH3)⁺3 z chlorkiem lub bromkiem jako przeciwjonem ^b Wszystkie doś wiadczenia dokonano w dwóch powtórzeniach ^c Wyniki dla Pichia pastoris normalizowano względem ekstrahowanego HOX w próbie kontrolnej bez dodanego LTAB.

Poziom zewnątrzkomórkowego HOX w hodowli przed rozpoczęciem ekstrakcji wynosił około 24% kontrolnego poziomu ekstrakcji, tj. prowadzonej w plastykowej probówce, do której nie dodano LTAB.

T a b e l a 9

Przebieg czasowy ekstrakcji enzymu HOX przy użyciu CTAB, LTAB i CTAC

czas [godz.]	0,4% (wag./obj.)	0,2% (wag./obj.)
CTAB	LTAB	CTAC	CTAB	LTAB
0	3 ± 1, n = 3	6 ± 1, n = 3	4 ± 1, n = 3	2	5
7	9	25	8	8	15
17	28	74	27	38	49
24	36 ± 5, n = 3	83 ± 8, n = 3	38 ± 6, n = 3	43	65
48	65 ± 8, n = 3	100 ± 25, n = 3,	64 ± 20, n = 3	65	78

Poziom zewnątrzkomórkowego HOX w bulionie fermentacyjnym przed dodaniem odczynników ekstrakcyjnych wynosił około 4% aktywności wyekstrahowanego HOX przy użyciu 0,4% (wag./obj.) LTAB po 48 godz. Wartości podano z odchyleniem standardowym ± 1. n: liczba eksperymentów.

Wszystkie wartości normalizowano do poziomu wyekstrahowanego HOX przy użyciu 0,4% (wag./obj.) LTAB po 48 godz.

P r z y k ł a d 10

Porównanie między CTAB a innymi emulgatorami do ekstrakcji HOX

Wiadomo, że lizolecytyna (lizofosfatydylocholina) może zwiększać przepuszczalność przynajmniej komórek ssaczych, wpływając selektywnie na uwalnianie makrocząsteczek. W celu zbadania wpływu lizolecytyny i wielu innych emulgatorów oraz krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, analizowano ich zdolność do ekstrakcji HOX i porównywano z wynikami uzyskanymi dla CTAB.

Pięć ml zawiesiny komórek (komórki + nadsącz) dodawano do 15 ml probówek do wirowania (HOX9910B, 305 g kom./litr mokrej masy, 1,6 U/ml zewnątrzkomórkowej aktywności HOX). Komórki oddzielano poprzez wirowanie przy 4000g przez 10 minut. Następnie zawieszano je ponownie w 4,0 ml 25 mM kwasie cytrynowym, pH 6,3, uzupełnionym CTAB, emulgatorami SLL, YN, kwasem kaprynowym, lizolecytyna lub lecytyną. Komórki inkubowano przez 20 godzin w 25°C (500 obr/min.).

Wyniki 10

Po zakończeniu inkubacji, mierzono poziom aktywności HOX w pozbawionym komórek ekstrakcie, stosując analizę HOX. Dane przedstawione w tabeli 10 wskazują, że testowane, inne niż CTAB, emulgatory są w stanie uwolnić jedynie niski poziom aktywnego enzymu. Wyniki te świadczą również o tym, że CTAB jest w stanie aktywować uśpiony w nadsączu enzym, prawdopodobnie poprzez uwolnienie go z fragmentów związanych z błoną komórki.

PL 206 561 B1

T a b e l a 10

Wpływ detergentów, emulgatora i fosfolipidów na ekstrakcję HOX

Test	Aktywność HOX,%
Kontrola (komórki i bufor)	100
0,4% CTAB	1100
0,5% emulgator SSL	160
1,0% emulgator SSL	140
0,5% emulgator YN	130
1,0% emulgator YN	130
0,5% kwas kaprynowy	120
1,0% kwas kaprynowy	140
0,4% lizolecytyna	260
0,4% lecytyna	140
Kontrola (komórki + nadsącz)	170
Komórki + nasącz + 0,4% CTAB	1900

P r z y k ł a d 11

Porównanie CTAB i saponiny w ekstrakcji HOX

W celu ustalenia czy saponina działa podobnie jak digitonina, badano wpływ saponiny na ekstrakcję enzymu HOX z Hansenula.

W eksperymencie wykorzystano 5,0 ml zawiesiny komórek (komórki + nadsącz) w 15 ml probówkach do wirowania (HOX190799, 340 g kom./litr mokrej masy, 0,5 U/ml zewnątrzkomórkowej aktywności HOX). Komórki oddzielano poprzez wirowanie przy 4000 g przez 10 minut. Następnie zawieszano je ponownie w 4,0 ml nadsączu uzupełnionego CTAB lub saponiną, lub też zawieszano ponownie w 25 mM kwasie cytrynowym, pH 6,3, uzupełnionym CTAB lub saponiną.

W celu potwierdzenia, że mierzona w ekstrakcie bezkomórkowym (po dodaniu CTAB) aktywność HOX jest rzeczywiście wynikiem ekstrakcji, a nie jedynie aktywacji HOX w nadsączu (białko HOX, które mogło wcześniej istnieć w nadsączu lecz być nieaktywne), pozbawiony komórek nadsącz (po uzupełnieniu CTAB lub saponiną) również inkubowano i analizowano pod kątem aktywności HOX. Probówki inkubowano przez 19 godzin w 25°C (500 obr/min.). Po inkubacji, zewnątrzkomórkowe HOX w ekstrakcie bezkomórkowym mierzono analizą HOX.

Wyniki 11

Wyniki zawarte w tabeli 11 wskazują, że saponina posiada pomijalną zdolność do ekstrakcji HOX z komórek. Ponadto, nie stwierdzono aktywacji HOX ani przez saponinę, ani przez CTAB.

T a b e l a 11

Porównanie ekstrakcji/aktywacji HOX uzyskanej poprzez zastosowanie różnych czynników zwiększających przepuszczalność

Test	Aktywność HOX,%
1	2
Kontrola 0 (komórki + nadsącz)	100
0,2% CTAB (komórki + nadsącz)	1200
0,4% CTAB (komórki + nadsącz)	3100
0,2% Saponina (komórki + nadsącz)	150
0,4% Saponina (komórki + nadsącz)	140
0,8% Saponina (komórki + nadsącz)	140
Kontrola 1 (komórki + bufor)	100

PL 206 561 B1 cd. tabeli 11

1	2
0,2% CTAB (komórki + bufor)	3100
0,4% CTAB (komórki + bufor)	7700
0,2% Saponina (komórki + bufor)	230
0,4% Saponina (komórki + bufor)	230
0,8% Saponina (komórki + bufor)	230
Nadsącz + 0,2% CTAB	80
Nadsącz + 0,4% CTAB	80
Nadsącz + 0,2% Saponina	80
Nadsącz + 0,4% Saponina	80
Nadsącz + 0,8% Saponina	80

P r z y k ł a d 12

Ekstrakcja HOX przy pomocy CTAB w 100 l fermentorze

Po 120 godzinach fermentacji (FermID Vest9910b) dodano roztwór CTAB (360 g CTAB rozpuszczone w 3,6 1 wody w 40°C) bezpośrednio do bulionu, przez otwór wejściowy w 100 l fermentorze. Końcowe stężenie CTAB w bulionie fermentacyjnym wynosiło w przybliżeniu 4 g/l, ponieważ aktywna objętość fermentora obejmowała w przybliżeniu 90 l. Jednocześnie zatrzymano wytrząsanie, natlenianie, kontrolę pH i pobór podłoża. Temperaturę utrzymywano na poziomie 25°C. Po 22 godz. od dodania CTAB, zawartość HOX w bulionie wzrosła od 1,6 U/ml do 30 U/ml.

P r z y k ł a d 13

Homogenizacja Hansenula polymorpha produkujących HOX w skali laboratoryjnej

W celu określenia skuteczności ekstrakcji HOX w wyniku działania CTAB, komórki pochodzące z dwóch różnych prób fermentacyjnych rozbijano stosując aparat do rozbijania komórek „Z Plus” 2,2 kW (Constant Systems Ltd, UK). Komórki (5 ml) rozbijano z użyciem jednego krótkiego uderzenia różnych ciśnień pompy. Po zakończeniu, oddzielono pozostałości komórek od nadsączu drogą wirowania (5 min przy 10000 g) i mierzono poziom wewnątrzkomórkowego HOX w pozbawionym komórek nadsączu, stosując opisaną uprzednio analizę HOX. Te same komórki poddawano także działaniu 0,2% CTAB (25°C, 500 obr/min., 20 godz.), a ekstrakt pozbawiony komórek stosowano jako próbę odnośnikową.

Wyniki 13

Dane przedstawione w tabeli 12 świadczą o tym, że całkowita ilość wewnątrzkomórkowego HOX została wyekstrahowana pod wpływem 0,2% CTAB.

T a b e l a 12

Skuteczność działania CTAB

Test	Ciśnienie [bar]	Aktywność HOX [U/ml]
HOX9931-8	1500	14,1
HOX9931-8	2000	16,3
HOX9931-8	2200	16,4
HOX9931-8	2500	16,2
HOX9931-8	2600	16,7
HOX9931-8	2700	15,7
HOX9931-8 + 0,2%CTAB*	-	18,6
HOX9934-8	2700	8,9
HOX9934-8+0,2%CTAB*	-	7,3

* Komórki inkubowano przez 48 godz. w 25°C

PL 206 561 B1

P r z y k ł a d 14

Homogenizacja Hansenula polymorpha produkujących HOX na dużą skalę l bulionu fermentacyjnego (FermID Vest9907b) homogenizowano w wysokociśnieniowym homogenizatorze, modelu 30 CD APV Gaulin. Stosowano najwyższą prędkość przepływu homogenizatora (100 l/min) i ciśnienie 1000 bar. Podczas procedury homogenizacyjnej bulion chłodzono w łaźni lodowej, tak że temperatura produktu nie przekraczała nigdy 20°C. Podczas pierwszych trzech cykli odnotowano szybki wzrost aktywności HOX, który pozostawał niemal niezmienny po 5-7 cyklach.

Wyniki 14

Wyniki przedstawiono w tabeli 13 i na figurze 8.

T a b e l a 13

Ekstrakcja mechaniczna HOX z Hansenula polymorpha

Nr cyklu	Aktywność HOX [U/ml]
0	0,86
1	5,6
2	6,4
3	6,6
4	6,6
5	6,7
6	6,9
7	6,7

P r z y k ł a d 15

Wpływ Triton X-100 na ekstrakcję HOX z Hansenula polymorpha

Do probówek do wirowania z 5 ml próby fermentacyjnej (próba HOX9954, Mut 45, 18.10.99, HVP) dodawano CTAB lub Triton X-100. Do próby kontrolnej dodano wodę. Próby inkubowano w 25°C przez 22 godz. przy 200 obr/min. Po inkubacji, próby wirowano i nadsącz analizowano, zgodnie z wcześniejszym opisem, pod względem aktywności HOX.

Wyniki 15

Wyniki zamieszczono w tabeli 14 i na figurze 9. Do zwiększenia przepuszczalności komórek drożdży użyto niejonowego detergentu, Triton X-100 (patrz, Naglak i wsp. 1990 oraz US Patent Nr 5 124 256). Z eksperymentu wynika jednak jasno, że Triton X-100 nie wywiera wpływu na ekstrakcję, przeciwnie niż CTAB, którego zdolność do ekstrakcji wewnątrzkomórkowego enzymu, takiego jak enzym HOX, nie została wcześniej opisana w dziedzinie, mimo że znane było jego zastosowanie do zwiększania przepuszczalności komórek.

T a b e l a 14

Ekstrakcja HOX z użyciem CTAB w porównaniu do zastosowania Triton X-100

Test	Aktywność ΗΟΧ [U/ml]
0,2% CTAB	14,5
0,4% CTAB	20,5
0,1% Triton Χ-100	1,5
0,2% Triton Χ-100	1,6
0,4% Triton Χ-100	1,8
0,6% Triton Χ-100	1,9
1,0%; Triton Χ-100	1,9
Kontrola, próba fermentacyjna	1,2

PL 206 561 B1

P r z y k ł a d 16

Western blotting

Do zbadania skuteczności wydzielania HOX poprzez analizę ilości enzymu HOX w resztach komórek (osadzie) i uwolnionego białka (w nadsączu) zastosowano technikę Western blotting.

Komórki traktowano przez 20 godzin odpowiednio 0, 0,1, 0,2 i 0,4% CTAB. Po zakończeniu inkubacji komórki rozdzielano wirując przy 4000 g przez 10 minut. Wynik dla otrzymanego nadsączu przedstawiono na torze 7-10 żelu SDS-PAGE (4-12% Mes Nu-Page) na figurze 10A.

Osad przemywano dwa razy buforem, a następnie ponownie zawieszano w buforze i rozbijano komórki stosując aparat FastPrep. Ekstrakt osadu również nakładano na gotowy żel Novex, zgodnie z zaleceniami producenta (Novex, San Diego, US) (patrz, tory 2-5 na figurze 10A). Żel SDS-PAGE nakładano na membranę nitrocelulozową według instrukcji producenta (Novex, San Diego, US). Blot inkubowano z przeciwciałami (króliczą surowicą odpornościową # 4364 BI/OCH 190797) swoistymi wobec enzymu HOX, przygotowanie których zostało opisane poniżej.

Produkcja przeciwciał swoistymi wobec enzymu HOX

Rekombinowany enzym HOX produkowany był w Escherichia coli z plazmidu ekspresyjnego PUP0181 zgodnie z opisem WO 96/40935. Surowy ekstrakt komórek E. coli wykazujących ekspresję rekombinowanego białka HOX analizowano poprzez SDS-PAGE. Główny prążek białka o względnej masie cząsteczkowej (Mr) 62 kD, odpowiadający HOX przeniesiono na membranę difluorku poliwinylydenu (PVDF) i analizowano sekwencję metodą N-końcowych aminokwasów zgodnie z opisem WO 96/40935.

Zidentyfikowana sekwencja to: Ala-Thr-Leu-Pro-Gln-Lys-Asp-Pro-Gly-Tyr- (SEQ ID NO: 1). Sekwencja ta odpowiada aminokwasom nr 2-11 w opublikowanej sekwencji HOX (Hansen i Stougaard, 1997). Podsumowując, wyprodukowane białko o masie 62 kD było rekombinowanym HOX pozbawionym aminokwasu N-końcowego, metioniny, Met1.

Obserwowany w żelu SDS-PAGE prążek HOX o masie 62 kD oczyszczano stosując preparatywną SDS-PAGE i elektroelucję z żelu według opisu Hunkapiller i wsp. (1983). Czystość elektroeluowanego prążka HOX o masie 62 kD analizowano za pomocą SDS-PAGE i analizy sekwencji aminokwasowej, zgodnie z powyższym opisem. Oczyszczony HOX wykorzystano w produkcji przeciwciał u królików. W przybliżeniu, 50 μg porcje mieszano z równą objętością niekompletnego adiuwanta Freuda i stosowano do immunizacji.

Poliklonalne przeciwciała swoiste wobec HOX, produkowane w królikach wykorzystano w analizie Western blot. Analizowane tą metodą białka rozdzielano elektroforetycznie, jak wyżej, i przenoszono na nitrocelulozowy filtr zgodnie ze standardowymi procedurami. Membranę nitrocelulozową blokowano 1 godz. w roztworze TBS-T (50 mM Tris, pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,1% Tween-20) zawierającym 3% odtłuszczonego mleka w proszku.

Dodawano swoiste wobec HOX przeciwciała rozcieńczano 1:10000 w TBS-T zawierającym 1,5% odtłuszczonego mleka w proszku i odcisk inkubowano przez noc. Odcisk przemywano trzy razy TBS-T przed inkubacją (1 do 2 godzin) z dodatkiem wtórnego przeciwciała (sprzężone z alkaliczną fosfatazą kozią, antykróliczego immunoglobuliny, DAKO, nr kat. D0487), rozcieńczonego 1:1000 w TBS-T, zawierającym 1,5% odtłuszczonego mleka w proszku.

Odcisk przemywano kolejno TBS-T (2x20 min) i TBS (50 mM Tris, pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 x 5 min) przed barwieniem w buforze tetrazolium Nitroblue/5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforan (NBT/BCIP), zgodnie ze standardowymi procedurami.

Swoistość przeciwciał testowano w serii doświadczeń Western blot z ekstraktami zawierającymi HOX, odpowiednio z Condrus crispus, E. coli i Pichia pastoris. Analiza Western blot ekstraktów zawierających HOX z P. pastoris wykazała obecność silnie swoistego prążka HOX o masie 62 kD oprócz dwóch lub trzech słabszych pasm o niższej masie cząsteczkowej.

Wyniki 16

Wyniki analizy Western blot przedstawiono na figurze 10B. Potwierdzają one obserwację, że praktycznie, po działaniu 0,4% CTAB, w komórkach nie pozostaje HOX.

P r z y k ł a d 17

Opis skriningu metodą HST (High Throughput Screening) pod względem podwyższonych poziomów enzymów wewnątrzkomórkowych

Szczep Hansenula polymorpha wykazujący ekspresję wewnątrzkomórkowego enzymu HOX poddano mutagenezie światłem UV o długości fali 254 nm. Zmutowany szczep nakładano na płytki

PL 206 561 B1 agarowe (1,4 g/l Yeast Nitrogen Base (YNB) z Gibco, 5 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l glicerolu i 2% (wag./obj.) agaru) i inkubowano w 30°C aż do utworzenia kolonii. Kolonie zaszczepiano za pomocą automatu (colony picker, Q-Pix, Genetix, Christchurch Dorsett, UK) na 96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania. Każda studzienka zawierała 200 pl podłoża YNB (100 mM MES pH 6,1, 1,4 g/l YNB z Gibco, 5 g/l (NH4)2SO4 i 10 g/l glicerolu).

Płytki inkubowano w 25°C z wytrząsaniem przez 7 dni w inkubatorze z wytrząsaniem IOC400.XX2.C (SANYO Gallenkamp BV, Breda, Holandia). Aktywność HOX mierzono w 10 pl bulionu fermentacyjnego, stosując analizę HOX, zmodyfikowaną tak aby zawierała jedynie 105 pl odczynnika 1 i 15 pl 0,4% (wag./obj.) CTAB dodanych do analizy. Czas reakcji wynosił 60 minut w 30°C. Analizę HOX wykonano stosując automat Plato 7 (Rosys, Hombrechtikon, Szwajcaria), absorbancję mierzono czytnikiem Spectramax plus (Molecular Devices, UK).

Wzrost w każdej studzience na płytce mierzono przenosząc 10 pl bulionu fermentacyjnego na nową mikropłytkę, dodając 100 pl 100 mM buforu fosforanowego, pH 6,3 i mierząc absorbancję przy 600 nm. Pomiary HOX normalizowano wobec absorbancji przy 600 nm, co pozwalało wziąć pod uwagę słaby wzrost.

Wyniki 17

Wyniki wskazują, że możliwy jest skrining pod względem mutantów Hansenula polymorpha produkujących podwyższone poziomy wewnątrzkomórkowego enzymu HOX.

P r z y k ł a d 18

Porównanie swoistej aktywności HOX, ekstrahowanego CTAB (patrz, na przykład, tabela 12) z „mechanicznie ekstrahowanymi” enzymami HOX (patrz, na przykład, tabela 13 i figura 8)

Wyniki 18

Wyniki wskazują, że aktywność swoista HOX, ekstrahowanego CTAB jest wyższa, niż aktywność swoista „mechanicznie ekstrahowanego” HOX. Uzyskane rezultaty świadczą o tym, że CTAB nie wywołał całkowitej ekstrakcji wszystkich wewnątrzkomórkowych białek położonych w organellach, lecz głównie białek cytozolowych.

P r z y k ł a d 19

Charakterystyka HOX ekstrahowanego CTAB i metodą mechaniczną z użyciem chromatografii anionowymiennej

W celu analizy czystości HOX ekstrahowanego CTAB, porównano to białko z HOX ekstrahowanym poprzez rozbicie komórek. Określono i porównano aktywność swoistą oraz zawartość kwasu nukleinowego w ekstraktach. Ponadto, badano czystość stosując chromatografię anionowymienną.

Siedem ml zawiesiny komórek (komórki + nadsącz) dodano do 15 ml probówki do wirowania (HOX9957, Mut 45). Po dodaniu 0,4% CTAB, zawiesinę inkubowano przez 23 godz. w 30°C (200 obr./min). Komórki usuwano drogą wirowania (10000 g i 10 min.), a bezkomórkowy nadsącz stosowano jako źródło HOX wyekstrahowanego CTAB.

Inne 7 ml tej samej zawiesiny komórkowej (bez dodania CTAB) rozbijano przy użyciu jednego, krótkiego uderzenia ciśnienia pompy na poziomie 2 x 2400 bar (Z Plus, 2,2 kW, Constant Systems Ltd, UK). Pozostałości komórkowe oddzielano wirując (10000 g i 10 min.), a nadsącz stosowano jako źródło HOX wyekstrahowanego mechanicznie.

Obie próbki odsalano na kolumnie PD10 (Pharmacia Biotech.) w 20 mM buforze TEA (trietanoloaminie, Merck), pH 7,3.

Próby analizowano pod względem aktywności HOX i stężenia białka (analiza białka oparta na analizie metodą opisaną przez Schleif i Wensink, 1981. Zawartość kwasu nukleinowego określano poprzez pomiar absorbancji przy 260 i 280 nm (Bollag i Edelstein, 1991).

Chromatografię jonowymienną przeprowadzono stosując system Biologie Duo Flow (Bio-Rad, CA, USA). 500 pl odsolonej próbki nakładano na kolumnę Source Q 15 (HR5/5, Pharmacia Biotech.) zrównoważoną buforem TEA (bufor A, 20 mM, pH 7,3). HOX wymywano 20 ml liniowego gradientu, od 0-0,5 M NaCl w buforze A, przy prędkości przepływu 1,5 ml/min. podczas, którego zbierano 1,5 ml frakcje i analizowano je pod kątem aktywności HOX.

Wynik 19

Określenie swoistej aktywności wykazało, że HOX ekstrahowany CTAB jest dużo bardziej czysty niż HOX ekstrahowany mechanicznie (tabela 15). Zawartość kwasu nukleinowego również była na dużo niższym poziomie w przypadku HOX ekstrahowanego CTAB niż HOX ekstrahowanego mechanicznie (tabela 15).

PL 206 561 B1

T a b e l a 15

Stężenie HOX i białka we frakcji HOX ekstrahowanego CTAB i mechanicznie

Test	Aktywność HOX [U/ml]	Stężenie białka [mg/ml]	Aktywność swoista [U/mg białka]	Stężenie kwasu nukleinowego ^g/ml]
Ekstrakcja CTAB	30,6	2,33	13,1	102
Ekstrakcja mechaniczna	32,0	12,70	2,5	384

Wynik ten potwierdziła analiza chromatografii anionowymiennej, której wyniki przedstawiono na figurze 11A i 11B, obrazującej chromatogramy analizy Source Q dla CTAB oraz poddanych mechanicznej ekstrakcji HOX.

Eksperymenty z CTAB

P r z y k ł a d 20

1. Eksperymenty obejmujące wytrząsanie kolb Do eksperymentów z wykorzystaniem CTAB wybrano dwa różne podłoża:

- YP/1% glicerol

- YNB/1% glicerol + 0,1 M NaPi pH 6,0

a) hodowla w YP/1% glicerol ml podłoża inokulowano 2,5 ml wstępnej hodowli YPD i hodowano w 37°C, 160 obr/min. Po 28 godz. hodowli, dodawano 1% (obj./obj.) metanolu i dalej inkubowano przez 18 godzin w 37°C, 160 obr/min.

W celu obliczenia koniecznej ilości CTAB mierzono OD600.

Pobierano 1,5 ml porcje nadsączu hodowlanego (SN) i osadu komórkowego. Po mechanicznym rozbiciu komórek izolowano frakcję rozpuszczalną (CX).

SN w tych warunkach oznaczono jako A CX w tych warunkach oznaczono jako D

Porcje pewnej objętości tej hodowli (20 ml) pobierano do dwóch kolb do wytrząsania. 20 ml hodowli uzupełniano 0,005 g CTAB. (CTAB - roztwór wyjściowy: 0,02 g/ml; DANISCO: 0,4% w hodowli fermentorowej (OD600 nm ~ 300)

OD_6Oo nm ~ 20 0,027 g CTAB/100 ml hodowli) w eksperymentach z wytrząsaniem kolb, czas inkubacji kultury: 24 godz., 4°C bez wytrząsania

SN w tych warunkach oznaczono jako C CX w tych warunkach oznaczono jako F

Druga kolba do wytrząsania, bez CTAB, inkubowana była w tych samych warunkach jak kolba zawierająca CTAB i służyła jako kultura odnośnikowa.

SN w tych warunkach oznaczono jako B CX w tych warunkach oznaczono jako E

Prowadzono hodowle szczepów posiadających pięć różnych konstruktów IL-1ra. Szczepy 4-17, AL 9/2 i II 3-1 zawierały trzy różne konstrukty bez sekwencji sygnałowej, natomiast szczepy MFa2 i MFa AL7/1 reprezentowały dwa różne konstrukty z sekwencją pre-pro MFa.

Szczep FPMT 8 hodowano w takich samych warunkach jak szczepy rekombinowane.

Szczep ten był zintegrowanym RB11 z około 30 kopiami pustego wektora Hansenula pFPMT121 i służył jako kontrola negatywna.

Po poddaniu działaniu CTAB, w nadsączu hodowli szczepów posiadających konstrukty bez sekwencji sygnałowych, wykryto 40-krotny (20-krotny) do 110-krotny wzrost stężenia IL-1ra.

W przypadku szczepów MFa poddanych działaniu CTAB, odnotowano mniejszy wzrost stężenia IL-1ra (2 do 5-krotny).

Wyniki 20

Wyniki zebrano w tabeli 16.

PL 206 561 B1

T a b e l a 16

Doświadczenia z wykorzystaniem CTAB w YP/glicerol/metanol

Szczep	Sekwencja	OD600	Próba SN	ELISA IL-1ra [pg/ml]	Czynnik
4-17	2	20,5	A	0,345	C/A = 113
			B	0,346	C/B = 113
			C	39,0
AL 9/2	3	22,6	A	0,166*	C/A = 20
			B	0,179	C/B = 19
			C	3,39
II 3/1	4	18,7	A	1,67	C/A = 49
			B	1,94	C/B = 42
			C	81,2
MFa2	6	20,4	A	4,85	C/A = 6
			B	5,69	C/B = 5
			C	27,7
MFaAL 7/1	8	22,6	A	2,28	C/A = 2,3
			B	2,02	C/B = 2,6
			C	5,23

* uwagi: stężenie IL-1ra w nadsączu hodowli szczepu AL 9/2 było niezwykle niskie. W dalszych eksperymentach wykryto stężenia między 0,6 a 0,7 pg/ml. Przyczyny niskiej wydajności nie są znane

A: nadsącz po 46 godz. hodowli w YP/glicerol/metanol.

B: nadsącz po 46 godz. hodowli w YP/glicerol/metanol, następnie inkubowanej przez 24 godziny bez CTAB.

C: sterylnie przefiltrowany nadsącz po 46 godz. hodowli w YP/glicerol/metanol, następnie inkubowanej przez 24 godziny z CTAB.

P r z y k ł a d 21

b) hodowla w YNB/1% glicerol + 0,1 M NaPi pH 6,0

Do kolejnych doświadczeń z CTAB wybrano trzy szczepy posiadające trzy różne konstrukty bez sekwencji sygnałowych (szczep 4-17; AL 9/2; II 3-1).

ml podłoża inokulowano 5 ml wstępnej hodowli YPD i hodowano w 37°C, 160 obr/min.

Po 28 godz. hodowli dodawano 1% (obj./obj.) metanolu i kontynuowano inkubację przez 18 godz. w 37°C, 160 obr/min.

W celu obliczenia koniecznej ilości CTAB mierzono OD600. Pobierano 3 ml porcje nadsączu hodowlanego (SN) i osadu komórkowego. Po mechanicznym rozbiciu komórek izolowano frakcję rozpuszczalną (CX).

SN w tych warunkach oznaczono jako A,

CX w tych warunkach oznaczono jako D.

Porcje pewnej objętości tej hodowli (20 ml) pobierano do dwóch kolb do wytrząsania. 20 ml hodowli uzupełniano 0,003 g CTAB.

inkubacja kultury: 24 godz., 4°C bez wytrząsania.

SN w tych warunkach oznaczono jako C.

CX w tych warunkach oznaczono jako F.

SN w tych warunkach oznaczono jako B.

CX w tych warunkach oznaczono jako E.

We wszystkich przypadkach inkubacja wraz z CTAB prowadziła do znacznego wzrostu stężenia

IL-1ra w nadsączu (100 do 130 krotnego).

PL 206 561 B1

Wyniki 21

Wyniki testu ELISA doświadczeń z zastosowaniem CTAB po hodowli w dwóch różnych podłożach porównano w poniższej tabeli 17.

T a b e l a 17

Porównanie doświadczeń z CTAB w YP/glicerol/metanol i YNB/glicerol/metanol

Szczep	Próba SN	YP/glicerol/metanol	YNB/glicerol/metanol (pH 6,0)
OD600	ELISA IL-1ra [pg/ml]	Czynnik	OD600	ELISA IL-1ra [pg/ml]	Czynnik
4-17	A	20,5	0, 345	C/A = 113	10,2	0,205	C/A = 108
	B		0,346	C/B = 113	10,8	0,069?	(C/B = 322)
	C		39, 0		9,8	22,2
AL 9/2	A	22,6	0, 166	C/A = 20	10,1	0, 045	C/A = 137
	B		0, 179	C/B = 19	11,6	0,025?	(C/B = 246)
	C		3,39		11,0	6,16
II 3/1	A	18,7	1, 67	C/A = 49	10,0	0,276	C/A = 105
	B		1, 94	C/B = 42	11,4	0,279	C/B = 104
	C		81,2		10,6	29,1

A: nadsącz po 46 godz. hodowli w YP/glicerol/metanol (lub YNB/glicerol/metanol).

B: nadsącz po 46 godz. hodowli w YP/glicerol/metanol (lub YNB/glicerol/metanol), następnie inkubowanej przez 24 godziny bez CTAB.

C: sterylnie przefiltrowany nadsącz po 46 godz. hodowli w YP/glicerol/metanol (lub YNB/glicerol/metanol), następnie inkubowanej przez 24 godziny z CTAB.

P r z y k ł a d 22

Badanie różnych warunków inkubacji

Przebadano różne warunki inkubacji po dodaniu CTAB dla szczepu II 3/1 hodowanego w -P/glicerol/metanol (patrz 1a).

Warunki:

godz. CTAB, 4°C, bez wytrząsania (warunki „standardowe”).

godz. CTAB; 4°C, łagodne wytrząsanie <=> 24 godz. CTAB; 37°C, bez wytrząsania.

godz. CTAB; 37°C, łagodne wytrząsanie.

Wyniki 22

Stężenie IL-1ra w nadsączu mierzono testem ELISA. Wyniki zebrano w tabeli 18.

T a b e l a 18

Różne warunki inkubacji CTAB (wyniki ELISA)

Szczep II 3/1	ELISA IL-1ra [pg/ml]	Czynnik
Nadsącz A	1,67
4°C, bez wytrząsania B	1,94	C/B = 42
C	81,2	C/A =49
4°C, łagodne wytrząsanie B	1,62	C/B = 28
C	44,7	C/A = 27
37°C, bez wytrząsania B	8,04	C/B = 16
C	127,4	C/A = 76
37°C, łagodne wytrząsanie B	11,1	C/B = 4
C	46,2	C/A = 28

A: nadsącz po 46 godz. hodowli w YP/glicerol/metanol.

C: sterylnie przefiltrowany nadsącz po 46 godz. hodowli w YP/glicerol/metanol następnie inkubowanej przez 24 godziny z CTAB.

PL 206 561 B1

Najwyższy wzrost IL-1ra odnotowano w nadsączu po inkubacji CTAB w 37°C, bez wytrząsania (76-krotny) i po inkubacji CTAB w 4°C, bez wytrząsania (49-krotny).

Najwyższe stężenie IL-1ra wykryto w 37°C, jednak stężenie próbki odnośnikowej inkubowanej bez CTAB również wzrosło (16-krotnie). Wysokie stężenie w próbce odnośnikowej mogło być spowodowane lizą komórki.

najlepsze warunki: 4°C (w celu uniknięcia lizy komórki), bez wytrząsania.

P r z y k ł a d 23

SDS-PAGE, Western blot i barwienie Coomassie

Pobrane w doświadczeniu z wytrząsaniem kolb próbki nadsączu i surowego ekstraktu analizowano stosując SDS-PAGE w warunkach redukujących.

Żel: 16% żel Novex TG 1 mm; warunki redukujące, barwienie koloidalnym coomassie (BIOSAFE Coomassie, Biorad).

Próby:

A: nadsącz po 46 godz. hodowli w YP/glicerol/metanol.

B: nadsącz odnośnikowy bez CTAB.

D: frakcja rozpuszczalna (CX) surowego ekstraktu rozcieńczona 1:3.

E: frakcja rozpuszczalna (CX) surowego ekstraktu hodowli odniesienia rozcieńczona 1:3.

F: frakcja rozpuszczalna (CX) surowego ekstraktu po działaniu CTAB rozcieńczona 1:3.

Wyniki 23 ❖ WB 33 i Coo2

Szczepy:

4-17 pFPMT icIL 1 raI.

Al 9/2 pFPMT icIL 1 rai + Al1

CTAB: inkubacja przez 24 godz.; 4°C, bez wytrząsania

Wyniki analizy Western blot przedstawiono na figurze 12A.

Próby testowe i dodawane ilości przedstawiono w poniższej legendzie figury 12A.

1. marker masowy MW See Blue (całość)	10 μl
2. 4-17 A SN	11,3 μl
3. 4-17 D CX rozc. 1:3	11,3 μl
4. 4-17 C SN CTAB	11,3 μl
5. 4-17 F CX CTAB rozc. 1:3	11,3 μl
6. standard rhll-1ra (bez BSA)	30 ng
7. AL 9/2 A SN	11,3 μl
8. AL 9/2 D CX rozc. 1:3	11,3 μl
9. AL 9/2 C SN CTAB	11,3 μl
10. AL 9/2 F CX CTAB rozc. 1:3	11,3 μl

Wyniki wykazały w przypadku obu szczepów, że po działaniu CTAB odnotowano wzrost IL-1ra w SN (tor 4, tor 9) i obniżenie CX (tor 5, tor 10).

Barwienie koloidalnym Comassie (Coo 2) blue przedstawiono na figurze 12B.

Próby testowe i ilości dodanych składników zaprezentowano w poniższej legendzie do figury 12B.

1. marker masowy MW See Blue (całość) 10 μl

2. 4-17 A SN 11,3 μί

3. 4-17 D CX rozc. 1:3 11,3 μl

4. 4-17 C SN CTAB 11,3 μl

5. 4-17 F CX CTAB rozc. 1:3 11,3 μl

6. 4-17 B CX bez CTAB 11,3 μl

7. 4-17 E CX bez CTAB rozc. 1:3 11,3 μl

8. standard rhll-1ra (bez BSA) 100 ng

9. AL 9/2 A SN 11,3 μl

10. AL 9/2 D CX rozc. 1:3 11,3 μl

11. AL 9/2 C SN CTAB 11,3 μl

12. AL 9/2 F CX CTAB rozc. 1:3 11,3 μl

13. AL 9/2 B SN bez CTAB 11,3 μl

14. AL 9/2 E CX bez CTAB rozc. 1,3 11,3 μl

15. FPMT 8 A SN 11,3 μl

PL 206 561 B1 ❖ WB 34 i Coo 3 szczepy: MF α2 pFPMT MF α IL-1ral

MF αAL 7/1pFPMT MF α IL-lral + A1

CTAB: inkubacja przez 24 godz.; 4°C, bez wytrząsania

Wyniki analizy Western blot (WB 34) przedstawiono na figurze 13A.

Próby testowe i dodawane ilości przedstawiono w poniższej legendzie Figury 13A.

1. marker masowy MW See Blue (całość) 10 μl

2. MF α 2 A SN 11,3 pi

3. MF α 2 D CX rozc. 1:3 11,3 pl

4. MF α 2 C SN CTAB 11,3 pl

5. MF α 2 F CX CTAB rozc. 1:3 11,3 pl

6. standard rhll-1ra (bez BSA) 30 ng

7. MF α AL 7/1 A SN 11,3 pl

8. MF α AL 7/1 D CX rozc. 1:3 11,3 pl

9. MF α AL 7/1 C SN CTAB 11,3 pl

10. MF α AL 7/1 F CX CTAB rozc. 1:3 11,3 pl

Wyniki wykazały, że po potraktowaniu CTAB w przypadku nadsączu C, tor 4 i 9, wykryto obecność mieszaniny wewnątrzkomórkowego i wydzielanego na zewnątrz komórki IL-1ra.

MF α 2: dodatkowy prążek o ~20 kDa i 34 kDa pochodził z wewnątrzkomórkowego IL-1ra.

MF α 7/1: dodatkowy prążek < 17 kDa pochodził z wewnątrzkomórkowego IL-1ra.

Intensywność sygnału cząsteczki o 18 kDa wzrastała.

Barwienie koloidalnym Comassie (Coo 3) blue przedstawiono na figurze 13B.

Próby testowe i ilości dodanych składników zaprezentowano w poniższej legendzie do figury 13B.

1. marker masowy MW See Blue (całość)	10 pl
2. MF α 2 A SN	11,3 pl
3. MF α 2 D CX rozc. 1:3	11,3 pl
4. MF α 2 C SN CTAB	11,3 pl
5. MF α 2 F CX CTAB rozc. 1:3	11,3 pl
6. MF α 2 B SN w/o CTAB	11,3 pl
7. MF α 2 E CX w/o CTAB rozc. 1:3	11,3 pl
8. standard rhll-1ra (bez BSA)	100 ng
9. MF α AL 7/1 A SN	11,3 pl
10. MF α AL 7/1 D CX rozc. 1:3	11,3 pl
11. MF α AL 7/1 C SN CTAB	11,3 pl
12. MF α AL 7/1 F CX CTAB rozc. 1:3	11,3 pl
13. MF α AL 7/1 B SN bez CTAB	11,3 pl
14. MF α AL 7/1 E CX bez CTAB rozc. 1:3	11,3 pl
15. FPMT 8 C SN CTAB	11,3 pl

❖ WB 35 i Coo 4 szczep: II 3/1 pFPMT icIL-1ra typ II różne warunki inkubacji po dodaniu CTAB:

godz. CTAB, 4°C, bez wytrząsania (warunki „standardowe”).

godz. CTAB; 37°C, bez wytrząsania.

Wyniki analizy Western blot (WB 35) przedstawiono na figurze 14A

Próby testowe i dodawane ilości przedstawiono w poniższej legendzie figury 14A.

1. marker masowy MW See Blue (całość)	10 pl
2. II 3/1 A SN	11,3 pl
3. II 3/1 CX rozc. 1:3	11,3 pl
4. II 3/1 SN CTAB 4°C	11,3 pl
5. II 3/1 CX CTAB 4°C rozc. 1:3	11,3 pl
6. standard rhll-1ra (bez BSA)	30 ng
7. II 3/1 SN CTAB 37°C	11,3 pl
8. II 3/1 CX CTAB 37°C rozc. 1:3	11,3 pl
9. II 3/1 SN bez CTAB 37°C	11,3 pl
10. II 3/1 CX bez CTAB 37°C rozc. 1:3	11,3 pl

PL 206 561 B1

Wyniki barwienia koloidalnym Coomassie (Coo 4) blue przedstawiono na figurze 14B.

Próby testowe i ilości dodanych składników zaprezentowano w poniższej legendzie do figury 14B.

1. marker masowy MW See Blue (całość)	10 pl
2. II 3/1 SN	11,3 pl
3. II 3/1 CX rozc. 1:3	11,3 pl
4. II 3/1 SN CTAB 4°C	11,3 pl
5. II 3/1 CX CTAB 4°C rozc. 1:3	11,3 pl
6. II 3/1 SN bez CTAB 4°C	11,3 pl
7. II 3/1 CX bez CTAB 4°C rozc. 1:3	11,3 pl
8. II 3/1 SN CTAB 37°C	11,3 pl
9. II 3/1 CX CTAB 37°C rozc. 1:3	11,3 pl
10. II 3/1 SN bez CTAB 37°C	11,3 pl
11. II 3/1 CX CTAB 37°C rozc. 1:3	11,3 pl
12. standard rhll-lra (bez BSA)	100 ng
13. FPMT 8 CX CTAB 4°C rozc. 1:3	11,3 pl
14. FPMT 8 SN CTAB 4°C	11,3 pl
15. FPMT 8 SN	11,3 pl

Wyniki wykazały, że po inkubacji CTAB w 4°C, jak również w 37°C obserwowano wzrost IL-1ra w SN (WB 35: tor 4, tor 8) i spadek w CX (WB 35: tor 5, tor 9).

W przypadku SN CTAB 37°C (tor 8) uzyskano najwyższy poziom IL-1rall. Wynik ten jest zgodny z rezultatami uzyskanymi na podstawie testu ELISA (patrz tabela 3).

We wspomnianym nadsączu odnotowano nie tylko więcej IL-1rall, ale również i innych białek (> 35 kDa) (Coo 4: tor 8). Obserwacja ta potwierdza tezę, że w 37°C ma miejsce bardziej intensywna liza komórki, niż w 4°C.

Dyskusja

Kodon występujący w genie HOX Chondrus crispus (Stougaard i Hansen 1996, Hansen i Stougaard, 1997) modyfikowano poprzez zastąpienie rzadko stosowanych kodonów częściej wykorzystywanymi przez organizm gospodarza Hansenula. Otrzymano transformowane metylotroficzne drożdże, Hansenula polymorpha, system ekspresji (opracowany w Rhein Biotech, Dusseldorf/Niemcy) zawierający fragment DNA HOX z optymalizowanym kodonem do ekspresji HOX.

W wyniku optymalizacji kodonu genu kodującego enzym HOX uzyskano wysoki poziom ekspresji (w znaczeniu wysokiego poziomu aktywności enzymu) enzymu HOX gospodarza, drożdży Hansenula polymorpha. W przypadku braku sekwencji sygnałowej, enzym HOX miał charakter wewnątrzkomórkowy. Jednakże nawet po przyłączeniu wielu różnych sekwencji sygnałowych w różnych konstruktach, w zewnątrzkomórkowym podłożu mierzalna była niska lub niewykrywalna aktywność HOX. Wyniki te wskazują, że enzym HOX nie może być wydzielany, nawet przez szczepy gospodarza wykazujące ekspresję enzymu HOX posiadającego sekwencję sygnałową. Analiza Western blot również potwierdziła, że enzym HOX może występować we frakcji towarzyszącej błonie, nawet w obecności sekwencji sygnałowej, wskazując na to, że mimo zachodzącej transkrypcji i translacji genu HOX, enzym HOX nie jest wydzielany i ulega zatrzymywaniu w ścieżce wydzielniczej.

Ekstrakcję zewnątrzkomórkowego aktywnego enzymu HOX dokonaną dzięki zastosowaniu sposobu tu opisanego porównano z tradycyjną metodą obejmującą rozbijanie komórek i procedury ekstrakcyjne z wykorzystaniem innych jonowych/niejonowych detergentów i emulgatorów. Badano również łączne stosowanie detergentów wraz z proteazami i solami.

Podsumowanie

W jednym z szerokich aspektów opisano tu sposób uwalniania będącego przedmiotem zainteresowania, rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego białka (POI), obejmujący etapy: dostarczenia komórki zawierającej rozpuszczalne lub towarzyszące błonie wewnątrzkomórkowe POI, kontaktu komórki z kompozycją do ekstrakcji błon; i wywołania uwolnienia POI z komórki w warunkach wystarczających do wydzielenia POI i jego rozpuszczalnej postaci.

W innym szerokim aspekcie opisano tu sposób specyficznego uwalniania będącego przedmiotem zainteresowania rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego białka (POI), obejmującego etapy: dostarczenia komórki zawierającej rozpuszczalne lub towarzyszące błonie wewnątrzkomórkowe POI, kontaktu komórki z kompozycją do ekstrakcji błon; i wywołanie uwolnienia POI

PL 206 561 B1 z komórki w warunkach wystarczających do wydzielenia POI, lecz niewystarczających do wydzielenia innych, zanieczyszczających białek.

Literatura

Bollag, D. M. i Edelstein, S. J. (1991) Protein Methods. New York, Wiley-Liss.

Crahay, J., Delcour, J. M. A. G. i Hanotier, J. D. V. (1992) Process for recovering polypeptides localized in the periplasmic space of yeast without breaking the cell wali by using an non-ionic detergent and a neutral salt. US nr 5 124 256.

Craig, W. S. (1987) Purification of pichia produced lipophilic proteins. US nr 4 683 293.

Gowda, L. R., Bachhawat, N. & Bhat, S. G. (1991) Permeabilization of baker's yeast by cetyltrimethylammonium bromide for intracellular enzyme catalysis. Enzyme Microb.Technol. 13, 154-157.

Hansen, O. C. i Stougaard, P. (1997) Hexose oxidase from the red alga Chondrus crispus: purification, molecular cloning, and expression in Pichia pastoris. J. Biol. Chem. 272, 11581-11587.

Joshi, M. S., Gowda, L. R. i Bhat, S. G. (1987) Permeabilization of yeast cells (Kluyveromyces fragilis) to lactose by cetyltrimethylammonium bromide. Biotechnol. Lett. 9, 549-554.

Joshi, M. S., Gowda, L. R., Katwa, L. C. i Bhat, S. G. (1989) Permeabilization of yeast cells (Kluyveromyces fragilis) to lactose by digitonin. Enzyme Microb. Technol. ll, 439-443.

Hagen, I. M. i Hyam, J. S. (1988) J. Cell. Sci. 89, 343-357.

Hunkapiller, M. W., Lujan, U., Ostrander, F., i Hood, L. E. (1983). Isolation of proteins from polyacrylamide gels for amino acid sequence analysis. Methods in Enzymology, 91: 227-236.

King, A. T., Davey, M. R., Mellor, I. R, Mulligan, B. J. i Lowe, K. C. (1991) Surfactant effects on yeast cells. Enzyme Microb. Technol. 13, 148-153.

Miyake, T. i Shiosaka, M. (1974) Process for the extraction of enzymes from microorganisms. US nr 3 801 461.

Naglak, T. J., Hettwer, D. J. i Wang, H. Y. (1990) Chemical permeabilization of cells for intracellular product release. In Separation processes in biotechnology (Asenjo, J. A. wyd.) t. 9, rozdz. 7. M. Dekker, New York.

Poulsen, C. H. i H0strup, P. B. (1998) Purification and characterization of a hexose oxidase with excellent strengthening effects in bread. Cereal Chem. 75, 51-57.

Schleif, R. F. i Wensink, P. C. (1981) Practical Methods in Molecular Biology. New York, Springer-Verlag.

Sekhar, S., Bhat, N. i Bhat, S. G. (1999) Preparation of detergent permeabilized Bakers' yeast whole celi catalase. Process Biochem. 34, 349-354.

Stougaard, P. i Hansen, O. C. (1996) Recombinant hexose oxidase, a method of producing same and use of such enzyme. WO 96/40935.

Sullivan, J. D., i Ikawa, M. (1973) Purification and characterization of hexose oxidase from the red alga chondrus crispus. Biochem. Biophys. Acta 309, 11-22.

PL 206 561 B1

Lista sekwencji

<110>	Danisco A/S
<120>	Sposób ekstrakcji białka z komórki bakterii, drożdży lub grzyba, sposób skriningu zmutowanych transformowanych komórek i zastosowanie kompozycji do ekstrakcji błon
<130>	P006775PLJ
<140> <141>	P356129 2000-11-24
<150> <151>	GB 9927801.2 1999-11-24
<160>	28
<170>	Patentln wersja 3.5
<210> <211> <212> <213>	1 10 PRT Sekwencja sztuczna

<220> <223>	Sekwencja N-końcowa
<400>	1

Ala Thr Leu Pro Gin Lys Asp Pro Gly Tyr

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	2 61 DNA Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Oligonukleotyd syntetyczny
<400>	2

actccatggc tactttgcca caaaaggacc caggttacat tgttattgac gtcaacgctg 60 q 61

<210> <211> <212> <213>

3 107 DNA Sekwencja sztuczna

<220> <223>	Oligonukleotyd syntetyczny
<400>	3

cgaaatcgat gttggtacca atccatcttc tgttgaaacc ttgcttcatg gatggcaatc 60 ttgggtcagg cttgtctgga gtaccagcgt tgacgtcaat aacaatg 107

PL 206 561 B1 <210>

<211>

<212>

106

DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 4 gattggtacc aacatcgatt tcgtttacgt cgtttacact ccacaaggtg cttgtactgc tttggacaga gctatggaaa agtgttctcc aggtaccgtc agaatc

106 <210>

<211>

<212>

106

DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 5 ttcaaccaaa ccagtaacgt tgataatagc cttgacacat tcgtcgaaaa cgaagtcttc gtaacagtga ccaccagaaa cgattctgac ggtacctgga gaacac

106 <210> 6 <211> 120 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 6 atcaacgtta ctggtttggt tgaatctggt tacgacgacg atagaggtta cttcgtctct tccggtgaca ccaactgggg ttccttcaag accttgttca gagaccacgg tagagttttg

120 <210>

<211>

<212>

109

DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 7 caaaccgtgc aatctggcca aaataccgtc acctccaccg acaatgtgac cacccaaacc gacggagtaa caggaaccac ctggcaaaac tctaccgtgg tctctgaac

109 <210>

<211>

<212>

109

DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 206 561 B1 <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 8 tttggccaga ttgcacggtt tgccagtcga ttggttatcc ggtgttgaag ttgtcgttaa 60 gccagtcttg accgaagact ctgttcttaa gtacgttcac aaggattcc 109 <210> 9 <211> 116 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223>

Oligonukleotyd syntetyczny <400> 9 ggcaaatcct tgaagtagta tttggtgata ataccgaagt tacctccacc tccaccagtg 60 tgagcccaaa acaactcacc gtcgttacct tcggaatcct tgtgaacgta cttaag 116 <210>

<211>

<212>

118

DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 10 caaatactac ttcaaggatt tgccaatgtc tccaagaggt gtcatcgctt ctaacttaca 60 cttctcttgg gacggtttca ctagagatgc cttgcaagat ttgttgacta agtacttc 118 <210> 11 <211> 118 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 11 ggaggtatac aagtacataa caaactcttc agctgcttgg tggaagattt ggaacttacc 60 aacagtattc ttccaatcac atctagccaa cttgaagtac ttagtcaaca aatcttgc 118 <210>

<211>

<212>

DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 12 atcttccatc aggcagctga agagtttgtt atgtacttgt atacatccta ctctaacgac

PL 206 561 B1 gccgagagag aagttgccca agacagacac tatcat <210> 13 <211> 102 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223>

Oligonukleotyd syntetyczny <400> 13 gaaaggagcc caaccagcat gaccaccaag agctttggta ggctcgcatg ttttgtagat 60 ctgttcaatg tcagcctcca aatgatagtg tctgtcttgg gc 102 <210> 14 <211>

<212>

DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 14 gctggttggg ctcctttccc tgttagacct agacctagac acacatccaa gacttcttat atgcatgacg agactatgga ctaccctttc <210> 15 <211> 120 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223>

Oligonukleotyd syntetyczny <400> 15 aatctggaag tctggaaagt ccttgatcat gtaagcagac ttgtacttac ctctctgatt 60 aggaccggaa ccgttgatag tctcagtcaa agcgtagaaa gggtagtcca tagtctcgtc 120 <210>

<211>

<212>

108

DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 16 gactttccag acttccagat tgatgttatc tggaaatacc ttactgaggt tcctgacggt ttgactagtg ccgaaatgaa ggatgctctt cttcaggttg atatgttc

108 <210> 17 <211> 126

PL 206 561 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 17 cttgtcttct tcctgccagt atgtctggta ctgcagtttg atgatgtact ctctctgagc	60 120 126
aactgcagta gcatcccaaa caaccttgtg aatctcacca ccgaacatat caacctgaag
aagagc
<210> 18 <211> 108 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Oligonukleotyd syntetyczny
<400> 18
acatactggc aggaagaaga caaggatgca gttaacttga agtggattag agacttttac	60
gaggagatgt atgagcctta tggtggtgtt ccagacccta acactcag <210> 19 <211> 111 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Oligonukleotyd syntetyczny	108
<400> 19
ggcaccatac ttaccgttct tccagttgtt caagtcaaca tcagggtagt tgaagtagca	60
tccctcaaaa acacctttac cactctcaac ctgagtgtta gggtctggaa c <210> 20 <211> 117 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Oligonukleotyd syntetyczny	111
<400> 20
aagaacggta agtatggtgc cttggaactt tactttttgg gtaacctgaa cagattgatc	60
aaggccaaat ggttgtggga tcctaacgag atcttcacaa acaaacagtc tatccct	117

<210> 21 <211> 78 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 206 561 B1 <220>

<223> Oligonukleotyd syntetyczny <400> 21 gaattccgcg gccgcctact atttagtctg cttaggctcc ttaagaggtt tagtagggat 60 agactgtttg tttgtgaa 78 <210> 22 <211> 1644 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Syntetyczny gen Η0Χ <220>

<221> CDS <222> (1) . . (1644) <223> Sekwencja kodująca syntetycznego genu Η0Χ <400> 22

atg Met

gct Ala

act Thr

ttg Leu

cca Pro

caa Gin

aag Lys

gac Asp

cca ggt Pro Gly

tac Tyr

att Ile

gtt Val

att Ile

gac Asp

gtc Val

48

1

5

10

15

aac

gct

ggt

act

cca

gac

aag

cct

gac

cca

aga

ttg

cca

tcc

atg

aag

96

Asn

Ala

Gly

Thr

Pro

Asp

Lys

Pro

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Ser

Met

Lys

20

25

30

caa

ggt

ttc

aac

aga

tgg

att

ggt

acc

aac

atc

gat

ttc

gtt

tac

144

Gin

Gly

Phe

Asn

Arg

Trp

Ile

Gly

Thr

Asn

Ile

Asp

Phe

Val

Tyr

35

40

45

gtc

gtt

tac

act

cca

caa

ggt

gct

tgt

act

gct

ttg

gac

aga

gct

atg

192

Val

Tyr

Thr

Pro

Gin

Gly

Ala

Cys

Thr

Ala

Leu

Asp

Arg

Ala

Met

50

55

60

gaa

aag

tgt

tct

cca

ggt

acc

gtc

aga

atc

gtt

tct

ggt

cac

tgt

240

Glu

Lys

Cys

Ser

Pro

Gly

Thr

Val

Arg

Ile

Val

Ser

Gly

His

Cys

65

70

75

80

tac

gaa

gac

ttc

gtt

ttc

gac

gaa

tgt

gtc

aag

gct

att

atc

aac

gtt

288

Tyr

Glu

Asp

Phe

Val

Phe

Asp

Glu

Cys

Val

Lys

Ala

Ile

Asn

Val

85

90

95

act

ggt

ttg

gtt

gaa

tct

ggt

tac

gac

gat

aga

ggt

tac

ttc

gtc

336

Thr

Gly

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Tyr

Asp

Arg

Gly

Tyr

Phe

Val

100

105

110

tct

tcc

ggt

gac

acc

aac

tgg

ggt

tcc

ttc

aag

acc

ttg

ttc

aga

gac

384

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Trp

Gly

Ser

Phe

Lys

Thr

Leu

Phe

Arg

Asp

115

120

125

cac

ggt

aga

gtt

ttg

cca

ggt

tcc

tgt

tac

tcc

gtc

ggt

ttg

ggt

432

His

Gly

Arg

Val

Leu

Pro

Gly

Ser

Cys

Tyr

Ser

val

Gly

Leu

Gly

130

135

140

PL 206 561 B1

ggt

cac

att

gtc

ggt

gga

ggt

gac

ggt

att

ttg

gcc

aga

ttg

cac

ggt

480

Glv 145

His

Ile

Val

Gly

Gly Gly 150

Asp

Gly

Ile

Leu 155

Ala

Arg

Leu

His

Gly 160

ttg

gtc

gat

tgg

tta

tcc

ggt

gtt

gaa

gtt

gtc

gtt

aag

cca

gtc

528

Leu

Pro

Val

Asp

Trp 165

Leu

Ser

Gly

Val

Glu 170

val

Val

Lys

Pro 175

Val

ttg

acc

gaa

gac

tct

gtt

ctt

aag

tac

gtt

cac

aag

gat

tcc

gaa

ggt

576

Leu

Thr

Glu

Asp 180

Ser

Val

Leu

Lys

Tyr 185

Val

His

Lys

Asp

Ser 190

Glu

Gly

aac

gac

ggt

gag

ttg

ttt

tgg

gct

cac

act

ggt

gga

ggt

gga

ggt

aac

624

Asn

Asp

Gly 195

Glu

Leu

Phe

Trp

Ala 200

His

Thr

Gly

Gly 205

Gly

Asn

ttc

ggt

att

atc

acc

aaa

tac

ttc

aag

gat

ttg

cca

atg

tct

cca

672

Phe

dy 210

Ile

ile

Thr

Lys

Tyr 215

Tyr

Phe

Lys

Asp

Leu 220

Pro

Met

Ser

Pro

aga

ggt

gtc

atc

gct

tct

aac

tta

cac

ttc

tct

tgg

gac

ggt

t hln

act

720

Arg 225

Gly

Val

Ile

Ala

Ser 230

Asn

Leu

His

Phe

Ser 235

Trp

Asp

Gly

Phe

Thr 240

aga

gat

gcc

ttg

caa

gat

ttg

act

aag

tac

ttc

aag

ttg

gct

aga

768

Arg

Asp

Ala

Leu

Gin 245

Asp

Leu

Thr

Lys 250

Tyr

Phe

Lys

Leu

Ala e j λ 5 Sl

Arg

tgfc

gat

tgg

aag

aat

act

gtt

ggt

aag

ttc

caa

atc

ttc

cac

caa

gca

816

Cys

Asp

Trp

Lys 260

Asn

Thr

Val

Giy

Lys 265

Phe

Gin

Ile

Phe

His 270

Gin

Ala

gct

gaa

gag

ttt

gtt

atg

tac

ttg

tat

aca

tcc

tac

tct

aac

gac

gcc

864

Ala

Glu

Glu 275

Phe

Val

Met

Tyr

Leu 280

Tyr

Thr

Ser

Tyr

Ser 285

Asn

Asp

Ala

gag

aga

gaa

gtt

gcc

caa

gac

aga

cac

tat

cat

ttg

gag

gct

gac

att

912

Glu

Arg 290

Glu

Val

Ala

Gin

Asp 295

Arg

His

Tyr

His

Leu 300

Glu

Ala

Asp

Ile

gaa

cag

atc

tac

aaa

aca

tgc

gag

cct

acc

aaa

gct

ctt

ggt

cat

960

Glu 305

Gin

Ile

Tyr

Lys

Thr 310

Cys

Glu

Pro

Thr

Lys 315

Ala

Leu

Gly

His 320

gct

ggt

tgg

gct

cet

ttc

cct

gtt

aga

cct

aga

aag

aga

cac

aca

tcc

1008

Ala

oiy

Trp

Ala

Pro 325

Phe

Pro

val

Arg

Pro 330

Arg

Lys

Arg

His

Thr 335

Ser

aag

act

tct

tat

afcg

cat

gac

gag

act

atg

gac

tac

cct

ttc

tac

gct

1056

Lys

Thr

Ser

Tyr 340

Met

His

Asp

Glu

Thr 345

Met

Asp

Tyr

Pro

Phe 350

Tyr

Ala

ttg

act

gag

act

atc

aac

ggt

tcc

ggt

cct

aat

cag

aga

ggt

aag

tac

1104

Leu

Thr

Glu 355

Thr

Ile

Asn

Gly

Ser 360

Gly

Pro

Asn

Gin

Arg 365

Gly

Lys

Tyr

aag

tct

gct

tac

a tg

atc

aag

gac

ttt

cca

gac

ttc

cag

att

gat

gtt

1152

Lys

Ser 370

Ala

Tyr

Met

Ile

Lys 375

Asp

Phe

Pro

Asp

Phe 380

Gin

Ile

Asp

Val

atc

tgg

aaa

tac

c fc t

act

gag

gtt

cct

gac

ggt

ttg

act

agt

gcc

gaa

1200

PL 206 561 B1

Ile 385	Trp	Lys	Tyr	Leu	Thr 390	Glu	Val	Pro
atg	aag	gat	gct	ctt	ctt	cag	gtt	gat
Met	Lys	Asp	Ala	Leu 405	Leu	Gin	Val	Asp
aag	gtt	gtt	tgg	gat	gct	act	gca	gtt
Lys	Val	Val	Trp 420	Asp	Ala	Thr	Ala	Val 425
aaa	ctg	cag	tac	cag	aca	tac	tgg	cag
Lys	Leu	Gin 435	Tyr	Gin	Thr	Tyr	Trp 440	Gin
aac	ttg	aag	tgg	att	aga	gac	ttt	tac
Asn	Leu 450	Lys	Trp	Ile	Arg	Asp 455	Phe	Tyr
ggt	ggt	gtt	cca	gac	cct	aac	act	cag
Giy 465	Gly	Val	Pro	Asp	Pro 470	Asn	Thr	Gin
ttt	gag	gga	tgc	tac	ttc	aac	tac	cct
Phe	Glu	Gly	Cys	Tyr 485	Phe	Asn	Tyr	Pro
aag	aac	ggt	aag	tat	ggt	gcc	ttg	gaa
Lys	Asn	Gly	Lys 500	Tyr	Gly	Ala	Leu	Glu 505
aac	aga	ttg	atc	aag	gcc	aaa	tgg	ttg
Asn	Arg	Leu 515	Ile	Lys	Ala	Lys	Trp 520	Leu
aca	aac	<3. cl cl	cag	tct	atc	cct	act	aaa
Thr	Asn	Lys	Gin	Ser	Ile	Pro	Thr	Lys

530 535 act aaa tag tag

Thr Lys

545

Asp	Gly 395	Leu	Thr	Ser	Ala	Glu 400
atg	ttc	ggt	ggt	gag	att	cac	1248
Met	Phe	Gly	Gly	Glu	Ile	His

410 415 gct cag aga gag tac atc atc 1296

Ala Gin Arg Glu Tyr Ile Ile

430 gaa gaa gac aag gat gca gtt 1344

Glu Glu Asp Lys Asp Ala Val

445 gag gag atg tat gag cct tat 1392

Glu Glu Met Tyr Glu Pro Tyr

460 gtt gag agt ggt aaa ggt gtt 1440

Val Glu Ser Gly Lys Gly Val

475 480 gat gtt gac ttg aac aac tgg 1488

Asp Val Asp Leu Asn Asn Trp 490 495 ctt tac ttt ttg ggt aac ctg 1536

Leu Tyr Phe Leu Gly Asn Leu

510 tgg gat cct aac gag atc ttc 1584

Trp Asp Pro Asn Glu Ile Phe

525 cct ctt aag gag cct aag cag 1632

Pro Leu Lys Glu Pro Lys Gin

540

1644

<210> <211> <212> <213>	23 546 PRT Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Konstrukt syntetyczny
<400>	23
Met Ala Thr Leu Pro Gin Lys ;

Gly Tyr Ile Val Ile Asp Val 10 15

5

Asn Ala Gly Thr Pro Asp Lys Pro Asp 20 25

Pro Arg Leu Pro Ser Met Lys 30

PL 206 561 B1

Gin Gly Phe Asn Arg Arg Trp Ile Gly Thr Asn Ile Asp Phe Val Tyr 35 40 45

Val Val Tyr Thr Pro Gin Gly Ala Cys Thr Ala Leu Asp Arg Ala Met 50 55 60

Glu Lys Cys Ser Pro Gly Thr Val Arg Ile Val Ser Gly Gly His Cys 65 70 75 80

Tyr Glu Asp Phe Val Phe Asp Glu Cys Val Lys Ala Ile Ile Asn Val 85 90 95

Thr Gly Leu Val Glu Ser Gly Tyr Asp Asp Asp Arg Gly Tyr Phe Val 100 105 110

Ser Ser Gly Asp Thr Asn Trp Gly Ser Phe Lys Thr Leu Phe Arg Asp 115 120 125

His Gly Arg Val Leu Pro Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Val Gly Leu Gly 130 135 140

Gly His Ile Val Gly Gly Gly Asp Gly Ile Leu Ala Arg Leu His Gly 145 150 155 160

Leu Pro Val Asp Trp Leu Ser Gly Val Glu Val Val Val Lys Pro Val 165 170 175

Leu Thr Glu Asp Ser Val Leu Lys Tyr Val His Lys Asp Ser Glu Gly 180 185 190

Asn Asp Gly Glu Leu Phe Trp Ala His Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asn 195 200 205

Phe Gly Ile Ile Thr Lys Tyr Tyr Phe Lys Asp Leu Pro Met Ser Pro 210 215 220

Arg Gly Val Ile Ala Ser Asn Leu His Phe Ser Trp Asp Gly Phe Thr 225 230 235 240

Arg Asp Ala Leu Gin Asp Leu Leu Thr Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Arg 245 250 255

Ala

PL 206 561 B1

Glu Arg Glu Val Ala Gin Asp Arg His Tyr His Leu Glu Ala Asp Ile 290 295 300

Glu Gin Ile Tyr Lys Thr Cys Glu Pro Thr Lys Ala Leu Gly Gly His 305 310 315 320

Ala Gly Trp Ala Pro Phe Pro Val Arg Pro Arg Lys Arg His Thr Ser 325 330 335

Lys Thr Ser Tyr Met His Asp Glu Thr Met Asp Tyr Pro Phe Tyr Ala 340 345 350

Leu Thr Glu Thr Ile Asn Gly Ser Gly Pro Asn Gin Arg Gly Lys Tyr 355 360 365

Lys Ser Ala Tyr Met Ile Lys Asp Phe Pro Asp Phe Gin Ile Asp Val 370 375 380

Ile Trp Lys Tyr Leu Thr Glu Val Pro Asp Gly Leu Thr Ser Ala Glu 385 390 395 400

Met Lys Asp Ala Leu Leu Gin Val Asp Met Phe Gly Gly Glu Ile His 405 410 415

Lys Val Val Trp Asp Ala Thr Ala Val Ala Gin Arg Glu Tyr Ile Ile 420 425 430

Lys Leu Gin Tyr Gin Thr Tyr Trp Gin Glu Glu Asp Lys Asp Ala Val 435 440 445

Asn Leu Lys Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Glu Glu Met Tyr Glu Pro Tyr 450 455 460

Gly Gly Val Pro Asp Pro Asn Thr Gin Val Glu Ser Gly Lys Gly Val 465 470 475 480

Phe Glu Gly Cys Tyr Phe Asn Tyr Pro Asp Val Asp Leu Asn Asn Trp 485 490 495

Lys Asn Gly Lys Tyr Gly Ala Leu Glu Leu Tyr Phe Leu Gly Asn Leu 500 505 510

Asn Arg Leu Ile Lys Ala Lys Trp Leu Trp Asp Pro Asn Glu Ile Phe 515 520 525

PL 206 561 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób ekstrakcji rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego rekombinowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) z komórki bakterii, drożdży lub grzyba, przy czym jako rekombinowane POI stosuje się albo enzym oksydazę heksozową (HOX) albo antagonistę receptora interleukiny 1 IL-1ra, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:

(a) dostarcza się komórkę bakterii, drożdży lub grzyba zawierającą rozpuszczalne lub związane z błoną wewnątrzkomórkowe rekombinowane POI, przy czym jako komórkę bakterii, drożdży lub grzyba stosuje się komórkę transformowaną;

(b) uwalnia się rekombinowane POI z tej komórki poprzez kontaktowanie tej komórki z kompozycją do ekstrakcji błon zawierającą czwartorzędowy związek amoniowy w stężeniu pomiędzy 0,05% a 0,6% wagowych, w warunkach wystarczających do uwolnienia rekombinowanego POI w postaci rozpuszczalnej i (c) odzyskuje się rekombinowane POI z kompozycji do ekstrakcji błon.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrahuje się wewnątrzkomórkowe rekombinowane POI wytworzone z użyciem technik rekombinacji DNA.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako komórkę stosuje się komórkę drożdży.
4. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że stosuje się czwartorzędowy związek amoniowy wybrany z grupy składającej się z bromku lauroilotrimetyloamonu (LTAB), chlorku mirystylotrimetyloamonu (MTAC), chlorku cetylotrimetyloamonu (CTAC), cetrymidu, bromku cetylotrimetyloamonu (CTAB), chlorku stearoilotrimetyloamonu (STAC), bromku stearoilotrimetyloamonu (STAB), chlorku benzalkonium (chlorku alkilodimetylobenzyloamonu), bromku N-cetylopirydyny (bromku N-heksadecylopirydyny), chlorku N-cetylopirydyny (chlorku N-heksadecylopirydyny), chlorku benzylodimetylotetradecyloamonu, chlorku benzylodimetyloheksadecyloamonu i kombinacji jakichkolwiek dwóch lub więcej z wymienionych składników.
5. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że komórkę bakterii, drożdży lub grzyba kontaktuje się z kompozycją do ekstrakcji błon w temperaturze od 4°C do 40°C.
6. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że komórkę bakterii, drożdży lub grzyba kontaktuje się z kompozycją do ekstrakcji błon w pH od 2,0 do około 11,0.
7. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że gdy jako rekombinowane POI stosuje się enzym HOX, to ten enzym HOX obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID No: 22 lub jej wariant, homolog, pochodną lub fragment, które wykazują co najmniej 90% identyczność z sekwencją aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 22.
8. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że gdy jako rekombinowane POI stosuje się enzym HOX, to ten enzym HOX kodowany jest przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariant, homolog, pochodną lub fragment, które wykazują co najmniej 90% homologię z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22.
9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że gdy jako rekombinowane POI stosuje się enzym HOX, to ten enzym HOX kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzacji z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariantem, homologiem, pochodną lub fragmentem, które wykazują co najmniej 90% homologię z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22, lub sekwencję komplementarną z sekwencją, która ulega hybrydyzacji.
10. Sposób skriningu zmutowanych komórek lub transformowanych komórek produkujących podwyższone poziomy rozpuszczalnego lub towarzyszącego błonie wewnątrzkomórkowego rekombinowanego POI, przy czym jako rekombinowane POI stosuje się albo enzym oksydazę heksozową (HOX) albo antagonistę receptora interleukiny 1 IL-1ra, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:

(a) hoduje się zmutowane lub transformowane komórki w 30°C;

(b) inkubuje się zmutowane lub transformowane komórki z kompozycją do ekstrakcji błon zawierającą czwartorzędowy związek amoniowy w stężeniu pomiędzy 0,05% a 0,6% wagowych;

(c) odzyskuje się pożywkę pozbawioną komórek;

(d) poddaje się skriningowi pożywkę pozbawioną komórek pod kątem podwyższonych poziomów wewnątrzkomórkowego rekombinowanego POI;

przy czym obecność wewnątrzkomórkowego rekombinowanego POI w pożywce pozbawionej komórek wskazuje na uwolnienie wewnątrzkomórkowego rekombinowanego POI; i przy czym jako zmutowaną lub transformowaną komórkę stosuje się komórkę bakterii, drożdży lub grzyba.

PL 206 561 B1
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako czwartorzędowy związek amoniowy w kompozycji do ekstrakcji błon stosuje się związek wybrany z grupy składającej się z bromku lauroilotrimetyloamonu (LTAB), chlorku mirystylotrimetyloamonu (MTAC), chlorku cetylotrimetyloamonu (CTAC), cetrymidu, bromku cetylotrimetyloamonu (CTAB), chlorku stearoilotrimetyloamonu (STAC), bromku stearoilotrimetyloamonu (STAB), chlorku benzalkonium (chlorku alkilodimetylobenzyloamonu), bromku N-cetylopirydyny (bromku N-heksadecylopirydyny), chlorku N-cetylopirydyny (chlorku N-heksadecylopirydyny), chlorku benzylodimetylotetradecyloamonu, chlorku benzylodimetyloheksadecyloamonu i kombinacji jakichkolwiek dwóch lub więcej z wymienionych składników.
12. Sposób według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że gdy jako rekombinowane POI stosuje się enzym HOX, to ten enzym HOX obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariant, homolog, pochodną lub fragment, które wykazują co najmniej 90% identyczność z sekwencją aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 22.
13. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 12, znamienny tym, że gdy jako rekombinowane POI stosuje się enzym HOX, to ten enzym HOX kodowany jest przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariant, homolog, pochodną lub fragment, które wykazują co najmniej 90% homologię z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22.
14. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 13, znamienny tym, że gdy jako rekombinowane POI stosuje się enzym HOX, to ten enzym HOX kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzacji z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariantem, homologiem, pochodną lub fragmentem, które wykazują co najmniej 90% homologię z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22, lub sekwencję komplementarną z sekwencją, która ulega hybrydyzacji.
15. Zastosowanie kompozycji do ekstrakcji błon, zawierającej czwartorzędowy związek amoniowy w stężeniu pomiędzy 0,05% a 0,6% wagowych, do ekstrakcji rekombinowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) z transformowanej komórki bakterii, drożdży lub grzyba, przy czym jako rekombinowane POI stosowany jest albo enzym oksydaza heksozowa (HOX), albo antagonista receptora interleukiny 1 IL-1ra.
16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że gdy jako rekombinowane POI stosowany jest enzym HOX, to ten enzym HOX obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariant, homolog, pochodną lub fragment, które wykazują co najmniej 90% identyczność z sekwencją aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 22.
17. Zastosowanie według zastrz. 15 albo 16, znamienne tym, że gdy jako rekombinowane POI stosowany jest enzym HOX, to ten enzym HOX kodowany jest przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariant, homolog, pochodną lub fragment, które wykazują co najmniej 90% homologię z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22.
18. Zastosowanie według jednego z zastrz. 15 do 17, znamienne tym, że gdy jako rekombinowane POI stosuje się enzym HOX, to ten enzym HOX kodowany jest przez sekwencję nukleotydową zdolną do hybrydyzacji z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22 lub jej wariantem, homologiem, pochodną lub fragmentem, które wykazują co najmniej 90% homologię z sekwencją nukleotydową przedstawioną na SEQ ID NO: 22, lub sekwencję komplementarną z sekwencją, która ulega hybrydyzacji.