JP3371783B2 - 菌体分離方法 - Google Patents
菌体分離方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は菌体分離方法に係
り、特に、膜濾過により発酵液から菌体を分離すると共
に目的有価物を回収する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】発酵法によって生産した酵素などの有価
物、例えば、リパーゼ、セルラーゼ、キシラーゼ等の酵
素や生理活性ペプチド、蛋白質などを製品化する場合、
生産菌と発酵生産物とを分離して有価物を回収する必要
がある。従来、発酵液からの目的有価物の回収及び菌体
分離のための一般的な方法として、珪藻土濾過法があ
る。珪藻土濾過法では、多量の珪藻土を濾過助剤又はプ
リコート剤として使用するため、珪藻土の混入した菌体
が分離される。この珪藻土の混入した菌体は焼却処理す
ることができず、投棄処分するため、処分場の問題があ
る。 【０００３】このため、珪藻土を使用しない分離方法と
して、ＭＦ（精密濾過）膜又はＵＦ（限外濾過）膜を用
いた膜分離法が検討されている。 【０００４】膜分離法による発酵液からの菌体分離と目
的有価物の回収は、発酵液の膜濾過（有価物の透過と菌
体の濃縮）とダイアフィルトレーション（加水処理によ
る、濃縮液側に残った有価物の透過液側への回収）とに
よって行われる。即ち、まず、発酵液を膜分離処理して
有価物を透過液側に回収すると共に菌体を濃縮し、菌体
の濃縮がある程度進んだ後に、濃縮液側に水を添加（加
水処理）して濃縮液側に残留する有価物の透過液側への
回収を促進する。 【０００５】このようなダイアフィルトレーションに必
要な加水量（Ｖ１）は、初期の濃縮液量（Ｖ０）、初期
の濃縮液側の有価物濃度（Ｃ０）、目標とする濃縮液中
の有価物濃度（Ｃ１）及び膜による有価物の阻止率
（Ｒ）から、次のように算出される。 【０００６】 Ｖ１＝−ｌｎ（Ｃ１／Ｃ０）×Ｖ０／（１−Ｒ／１００） 従って、目標とする濃縮液中の有価物濃度（Ｃ１）と濃
縮液量（Ｖ０）が決められている場合、ダイアフィルト
レーションに必要な加水量（Ｖ１）は初期の有価物濃度
（Ｃ０）が低いほど、また、膜による有価物の阻止率
（Ｒ）が小さいほど少なくて足りる。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】発酵液の膜分離処理で
は、膜の孔が菌体や発酵生産物などによって閉塞し、目
的有価物が膜を透過せずに阻止されてしまうことがあ
る。目的有価物が膜で阻止されると、濃縮液側で目的有
価物が過度に濃縮されることにより、目的有価物が変性
したり、濃縮液中から目的有価物を回収するためのダイ
アフィルトレーションに必要な加水量が大幅に増加する
などの問題が生じる。この加水量の増加は設備の大型
化、処理時間の増大を招く。 【０００８】本発明は上記従来の問題点を解決し、膜濾
過により発酵液から菌体を分離すると共に目的有価物を
回収する方法において、膜による目的有価物の阻止を抑
制し、ダイアフィルトレーションに必要な加水量を低減
して目的有価物の回収効率を高めることができる菌体分
離方法を提供することを目的とする。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明の菌体分離方法
は、発酵液を膜分離処理して菌体を濃縮液側に分離する
と共に、目的有価物を透過液側に回収する方法におい
て、該発酵液にキトサンを添加して膜分離処理して該目
的有価物を透過液側に回収すると共に菌体を濃縮液側に
濃縮し、菌体の濃縮が進んだ後に、該濃縮液側に水を加
えて膜分離処理することを特徴とする。 【００１０】発酵液にキトサンを添加することにより、
発酵液中のコロイド状濁質等が除去されて、膜孔の閉塞
が防止され、その結果、膜による目的有価物の阻止も抑
制され、目的有価物の回収のためのダイアフィルトレー
ションに必要な加水量が低減され、効率的な膜分離処理
を行える。 【００１１】 【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を詳細
に説明する。 【００１２】本発明において、キトサンは、通常の場
合、所定濃度の水溶液として発酵液に添加するが、この
場合において、キトサン濃度に特に制限はないが、発酵
液量の増加を抑制するためには、なるべく高濃度の水溶
液として添加するのが望ましい。キトサン濃度は０．５
重量％以上、とりわけ５重量％以上とするのが望まし
い。水溶液の取り扱い性とくに粘性等を考慮した場合、
キトサン濃度は特に５〜１０重量％であることが望まし
い。 【００１３】なお、キトサンの分子量には特に制限はな
いが、キトサン水溶液の濃度を高くするためには、分子
量が小さいほうが取り扱い上有利であり、通常は分子量
３０万以下のもの、好ましくは１万〜２０万のものが用
いられる。 【００１４】発酵液に対するキトサンの好適添加量は、
処理対象の発酵液により異なるため、発酵液毎に予備実
験等により適宜決定される。即ち、少量のキトサンを発
酵液に添加した場合、キトサンは菌体と反応して液中に
は残留しないが、添加量がある量以上になると菌体と反
応しきれないキトサンが液中に残留するようになる。キ
トサンの適正添加量は、通常は液中にキトサンが残留し
はじめる添加量付近であるが、発酵液の性状によって
は、キトサンが残留しないほうが良いものや、若干残留
する程度が良いものもある。 【００１５】本発明において、キトサンを添加した後の
発酵液の膜分離方法には特に制限はない。膜としてはＭ
Ｆ又はＵＦ膜が用いられる。膜素材にも制限はなく、ポ
リオレフィン膜、ポリスルホン膜、テフロン膜、セラミ
ック膜などが用いられる。ＭＦ又はＵＦ膜の選択、及び
膜素材の選択は、目的有価物の分子量や発酵液の性状な
どを加味して行われる。膜型式にも特に制限はないが、
一般的には中空糸、チューブラー、スパイラル、プレー
ト＆フレーム型膜モジュールなどが用いられる。 【００１６】キトサンを添加した発酵液の膜分離処理
は、例えば次のような操作で行われる。 【００１７】まず、キトサンを添加した発酵液をクロス
フローで膜モジュールに供給し、目的有価物を含む透過
液を回収する。これに伴い、濃縮液側に菌体が濃縮され
ていく。所定の倍率まで濃縮が進んだ後、濃縮液側に残
存する有価物を更に回収するために水を加えてダイアフ
ィルトレーションを行う。この場合、ダイアフィルトレ
ーションに必要な加水量や加水方法は、濃縮液中の目的
有価物の濃度、膜による目的有価物の阻止率、及び目標
とする目的有価物回収率等によって、適宜選択される。
なお、加水方法は、連続加水であっても間欠加水であっ
ても良く、また、バッチ毎の加水であっても良い。本発
明方法によれば、低加水量で回収率９０％以上を達成す
ることが可能である。 【００１８】透過液側に回収された目的有価物は、その
種類に応じて、ＵＦ膜又はＲＯ（逆浸透）膜、或いはイ
オン交換樹脂、晶析等により濃縮精製され、製品とされ
る。 【００１９】このような本発明の菌体分離方法は、発酵
液からの菌体の分離及び、蛋白質やリパーゼ、セルラー
ゼ、キシラーゼなどの酵素、生理活性ペプチド等の目的
有価物の回収に工業的に極めて有用である。 【００２０】 【実施例】以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をよ
り具体的に説明する。 【００２１】実施例１ 乾燥菌体濃度２重量％、ｐＨ６．２、電気伝導度４．３
ｍＳ／ｃｍの目的蛋白質含有発酵液１０Ｌに、５重量％
キトサン（分子量１０万）水溶液０．１Ｌを加えて１分
間撹拌した。キトサン水溶液添加後の発酵液中の目的蛋
白質濃度は９．５７ｇ／Ｌであった。 【００２２】膜面積０．０５ｍ２のポリオレフィン平膜
を装着したセルを用いて、キトサン水溶液を添加した発
酵液のクロスフロー濾過を行った。発酵液は膜面流束２
ｍ／秒で循環し、濾過圧力は１．０ｋｇ／ｃｍ２とし
た。また、発酵液の温度は２５℃で一定になるようにし
た。 【００２３】透過液を１．０Ｌずつ分取し、９．０Ｌの
透過液を回収したところで、濃縮液側に１．０Ｌのイオ
ン交換水を加えた。更に透過液１．０Ｌを回収したとこ
ろで、濃縮液側に１．０Ｌのイオン交換水を加えた。そ
の後、初期の発酵液中に含まれている目的蛋白質の９９
％が透過液側に回収されるまで、この加水を繰り返し
た。 【００２４】透過液分取毎の各透過液中の目的蛋白質濃
度及び濃縮液中の蛋白質濃度と、これらの値から算出し
た膜による目的蛋白質の阻止率及び目的蛋白質の回収
量，回収率を表１に示した。なお、蛋白質回収率は透過
液をプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で分析して
求めた。 【００２５】 【表１】 【００２６】比較例１ 発酵液にキトサン水溶液を添加しなかったこと以外は、
実施例１と同様にして膜分離処理を行い、処理結果を表
２に示した。 【００２７】 【表２】【００２８】表１，２の結果から明らかなようにキトサ
ン水溶液を添加した実施例１では、膜の目的蛋白質阻止
率は低く、９９％以上の目的蛋白質を回収するのに必要
な加水量は３．０Ｌで足りた。これに対し、キトサン水
溶液を添加していない比較例１では膜の目的蛋白質阻止
率が高く、９９％以上の目的蛋白質を回収するために必
要な加水量は８．０Ｌと実施例１に比べて多かった。 【００２９】 【発明の効果】以上詳述した通り、本発明の菌体分離方
法によれば、膜濾過及びダイアフィルトレーションによ
り発酵液から菌体を分離すると共に、目的有価物を回収
する方法において、膜による目的有価物の阻止を抑制
し、ダイアフィルトレーションに必要な加水量を大幅に
低減することができる。このため、膜分離処理に必要な
膜面積や循環ポンプ等の装置設備を縮小すると共に、処
理時間の短縮を図ることができ、目的有価物の回収効率
は格段に向上する。
り、特に、膜濾過により発酵液から菌体を分離すると共
に目的有価物を回収する方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】発酵法によって生産した酵素などの有価
物、例えば、リパーゼ、セルラーゼ、キシラーゼ等の酵
素や生理活性ペプチド、蛋白質などを製品化する場合、
生産菌と発酵生産物とを分離して有価物を回収する必要
がある。従来、発酵液からの目的有価物の回収及び菌体
分離のための一般的な方法として、珪藻土濾過法があ
る。珪藻土濾過法では、多量の珪藻土を濾過助剤又はプ
リコート剤として使用するため、珪藻土の混入した菌体
が分離される。この珪藻土の混入した菌体は焼却処理す
ることができず、投棄処分するため、処分場の問題があ
る。 【０００３】このため、珪藻土を使用しない分離方法と
して、ＭＦ（精密濾過）膜又はＵＦ（限外濾過）膜を用
いた膜分離法が検討されている。 【０００４】膜分離法による発酵液からの菌体分離と目
的有価物の回収は、発酵液の膜濾過（有価物の透過と菌
体の濃縮）とダイアフィルトレーション（加水処理によ
る、濃縮液側に残った有価物の透過液側への回収）とに
よって行われる。即ち、まず、発酵液を膜分離処理して
有価物を透過液側に回収すると共に菌体を濃縮し、菌体
の濃縮がある程度進んだ後に、濃縮液側に水を添加（加
水処理）して濃縮液側に残留する有価物の透過液側への
回収を促進する。 【０００５】このようなダイアフィルトレーションに必
要な加水量（Ｖ１）は、初期の濃縮液量（Ｖ０）、初期
の濃縮液側の有価物濃度（Ｃ０）、目標とする濃縮液中
の有価物濃度（Ｃ１）及び膜による有価物の阻止率
（Ｒ）から、次のように算出される。 【０００６】 Ｖ１＝−ｌｎ（Ｃ１／Ｃ０）×Ｖ０／（１−Ｒ／１００） 従って、目標とする濃縮液中の有価物濃度（Ｃ１）と濃
縮液量（Ｖ０）が決められている場合、ダイアフィルト
レーションに必要な加水量（Ｖ１）は初期の有価物濃度
（Ｃ０）が低いほど、また、膜による有価物の阻止率
（Ｒ）が小さいほど少なくて足りる。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】発酵液の膜分離処理で
は、膜の孔が菌体や発酵生産物などによって閉塞し、目
的有価物が膜を透過せずに阻止されてしまうことがあ
る。目的有価物が膜で阻止されると、濃縮液側で目的有
価物が過度に濃縮されることにより、目的有価物が変性
したり、濃縮液中から目的有価物を回収するためのダイ
アフィルトレーションに必要な加水量が大幅に増加する
などの問題が生じる。この加水量の増加は設備の大型
化、処理時間の増大を招く。 【０００８】本発明は上記従来の問題点を解決し、膜濾
過により発酵液から菌体を分離すると共に目的有価物を
回収する方法において、膜による目的有価物の阻止を抑
制し、ダイアフィルトレーションに必要な加水量を低減
して目的有価物の回収効率を高めることができる菌体分
離方法を提供することを目的とする。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明の菌体分離方法
は、発酵液を膜分離処理して菌体を濃縮液側に分離する
と共に、目的有価物を透過液側に回収する方法におい
て、該発酵液にキトサンを添加して膜分離処理して該目
的有価物を透過液側に回収すると共に菌体を濃縮液側に
濃縮し、菌体の濃縮が進んだ後に、該濃縮液側に水を加
えて膜分離処理することを特徴とする。 【００１０】発酵液にキトサンを添加することにより、
発酵液中のコロイド状濁質等が除去されて、膜孔の閉塞
が防止され、その結果、膜による目的有価物の阻止も抑
制され、目的有価物の回収のためのダイアフィルトレー
ションに必要な加水量が低減され、効率的な膜分離処理
を行える。 【００１１】 【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を詳細
に説明する。 【００１２】本発明において、キトサンは、通常の場
合、所定濃度の水溶液として発酵液に添加するが、この
場合において、キトサン濃度に特に制限はないが、発酵
液量の増加を抑制するためには、なるべく高濃度の水溶
液として添加するのが望ましい。キトサン濃度は０．５
重量％以上、とりわけ５重量％以上とするのが望まし
い。水溶液の取り扱い性とくに粘性等を考慮した場合、
キトサン濃度は特に５〜１０重量％であることが望まし
い。 【００１３】なお、キトサンの分子量には特に制限はな
いが、キトサン水溶液の濃度を高くするためには、分子
量が小さいほうが取り扱い上有利であり、通常は分子量
３０万以下のもの、好ましくは１万〜２０万のものが用
いられる。 【００１４】発酵液に対するキトサンの好適添加量は、
処理対象の発酵液により異なるため、発酵液毎に予備実
験等により適宜決定される。即ち、少量のキトサンを発
酵液に添加した場合、キトサンは菌体と反応して液中に
は残留しないが、添加量がある量以上になると菌体と反
応しきれないキトサンが液中に残留するようになる。キ
トサンの適正添加量は、通常は液中にキトサンが残留し
はじめる添加量付近であるが、発酵液の性状によって
は、キトサンが残留しないほうが良いものや、若干残留
する程度が良いものもある。 【００１５】本発明において、キトサンを添加した後の
発酵液の膜分離方法には特に制限はない。膜としてはＭ
Ｆ又はＵＦ膜が用いられる。膜素材にも制限はなく、ポ
リオレフィン膜、ポリスルホン膜、テフロン膜、セラミ
ック膜などが用いられる。ＭＦ又はＵＦ膜の選択、及び
膜素材の選択は、目的有価物の分子量や発酵液の性状な
どを加味して行われる。膜型式にも特に制限はないが、
一般的には中空糸、チューブラー、スパイラル、プレー
ト＆フレーム型膜モジュールなどが用いられる。 【００１６】キトサンを添加した発酵液の膜分離処理
は、例えば次のような操作で行われる。 【００１７】まず、キトサンを添加した発酵液をクロス
フローで膜モジュールに供給し、目的有価物を含む透過
液を回収する。これに伴い、濃縮液側に菌体が濃縮され
ていく。所定の倍率まで濃縮が進んだ後、濃縮液側に残
存する有価物を更に回収するために水を加えてダイアフ
ィルトレーションを行う。この場合、ダイアフィルトレ
ーションに必要な加水量や加水方法は、濃縮液中の目的
有価物の濃度、膜による目的有価物の阻止率、及び目標
とする目的有価物回収率等によって、適宜選択される。
なお、加水方法は、連続加水であっても間欠加水であっ
ても良く、また、バッチ毎の加水であっても良い。本発
明方法によれば、低加水量で回収率９０％以上を達成す
ることが可能である。 【００１８】透過液側に回収された目的有価物は、その
種類に応じて、ＵＦ膜又はＲＯ（逆浸透）膜、或いはイ
オン交換樹脂、晶析等により濃縮精製され、製品とされ
る。 【００１９】このような本発明の菌体分離方法は、発酵
液からの菌体の分離及び、蛋白質やリパーゼ、セルラー
ゼ、キシラーゼなどの酵素、生理活性ペプチド等の目的
有価物の回収に工業的に極めて有用である。 【００２０】 【実施例】以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をよ
り具体的に説明する。 【００２１】実施例１ 乾燥菌体濃度２重量％、ｐＨ６．２、電気伝導度４．３
ｍＳ／ｃｍの目的蛋白質含有発酵液１０Ｌに、５重量％
キトサン（分子量１０万）水溶液０．１Ｌを加えて１分
間撹拌した。キトサン水溶液添加後の発酵液中の目的蛋
白質濃度は９．５７ｇ／Ｌであった。 【００２２】膜面積０．０５ｍ２のポリオレフィン平膜
を装着したセルを用いて、キトサン水溶液を添加した発
酵液のクロスフロー濾過を行った。発酵液は膜面流束２
ｍ／秒で循環し、濾過圧力は１．０ｋｇ／ｃｍ２とし
た。また、発酵液の温度は２５℃で一定になるようにし
た。 【００２３】透過液を１．０Ｌずつ分取し、９．０Ｌの
透過液を回収したところで、濃縮液側に１．０Ｌのイオ
ン交換水を加えた。更に透過液１．０Ｌを回収したとこ
ろで、濃縮液側に１．０Ｌのイオン交換水を加えた。そ
の後、初期の発酵液中に含まれている目的蛋白質の９９
％が透過液側に回収されるまで、この加水を繰り返し
た。 【００２４】透過液分取毎の各透過液中の目的蛋白質濃
度及び濃縮液中の蛋白質濃度と、これらの値から算出し
た膜による目的蛋白質の阻止率及び目的蛋白質の回収
量，回収率を表１に示した。なお、蛋白質回収率は透過
液をプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で分析して
求めた。 【００２５】 【表１】 【００２６】比較例１ 発酵液にキトサン水溶液を添加しなかったこと以外は、
実施例１と同様にして膜分離処理を行い、処理結果を表
２に示した。 【００２７】 【表２】【００２８】表１，２の結果から明らかなようにキトサ
ン水溶液を添加した実施例１では、膜の目的蛋白質阻止
率は低く、９９％以上の目的蛋白質を回収するのに必要
な加水量は３．０Ｌで足りた。これに対し、キトサン水
溶液を添加していない比較例１では膜の目的蛋白質阻止
率が高く、９９％以上の目的蛋白質を回収するために必
要な加水量は８．０Ｌと実施例１に比べて多かった。 【００２９】 【発明の効果】以上詳述した通り、本発明の菌体分離方
法によれば、膜濾過及びダイアフィルトレーションによ
り発酵液から菌体を分離すると共に、目的有価物を回収
する方法において、膜による目的有価物の阻止を抑制
し、ダイアフィルトレーションに必要な加水量を大幅に
低減することができる。このため、膜分離処理に必要な
膜面積や循環ポンプ等の装置設備を縮小すると共に、処
理時間の短縮を図ることができ、目的有価物の回収効率
は格段に向上する。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 発酵液を膜分離処理して菌体を濃縮液側
に分離すると共に、目的有価物を透過液側に回収する方
法において、 該発酵液にキトサンを添加して膜分離処理して該目的有
価物を透過液側に回収すると共に菌体を濃縮液側に濃縮
し、菌体の濃縮が進んだ後に、該濃縮液側に水を加えて
膜分離処理することを特徴とする菌体分離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34141597A JP3371783B2 (ja) | 1997-12-11 | 1997-12-11 | 菌体分離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34141597A JP3371783B2 (ja) | 1997-12-11 | 1997-12-11 | 菌体分離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11169671A JPH11169671A (ja) | 1999-06-29 |
| JP3371783B2 true JP3371783B2 (ja) | 2003-01-27 |
Family
ID=18345902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34141597A Expired - Fee Related JP3371783B2 (ja) | 1997-12-11 | 1997-12-11 | 菌体分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3371783B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6289087B2 (ja) * | 2013-12-26 | 2018-03-07 | 花王株式会社 | 精製疎水性酵素溶液の製造方法 |
| US10183108B2 (en) | 2016-02-04 | 2019-01-22 | Pall Corporation | Inline diafiltration with multi-channel pump |
-
1997
- 1997-12-11 JP JP34141597A patent/JP3371783B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11169671A (ja) | 1999-06-29 |
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