JP2848620B2 - エンドチア・パラシチカからプロテアーゼの製法 - Google Patents

エンドチア・パラシチカからプロテアーゼの製法

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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、エンドチア・パラシチカ（Endothia paras
itica）により分泌され、乳汁を凝固させるプロテアー
ゼの製造方法に関する。
［従来の技術および発明が解決しようとする課題］ このプロテアーゼはすでにフランス特許第1401474号
に記載されている。
発酵培地の粘度はプロテアーゼ産生段階に相当増大
し、これは精製および分離、さらに具体的に言うと、限
外濾過において操作を困難にすることおよび、粘度は特
にプロテアーゼとともに微生物により共産生された多糖
類の存在によることが判明した。
［課題を解決するための手段］ 本発明の方法は、微生物により副生された多糖類に作
用する酵素を発酵培地中に導入するものである。
酵素は、発酵の初期または発酵中に、または発酵バイ
オマスの濾過前の培地の最終処理中のみに、または限外
濾過またはミクロフィルトレーション（microfiltratio
n）により得られた濾液の濃縮中に添加できる。
培地中に異なる種類の酵素を同時に、または工程中の
別々の段階に分離して添加することも可能である。
培地中にプロテアーゼが存在するにもかかわらず、酵
素は多糖類に作用し、上記発酵中であろうと上記発酵が
停止した後であろうと、上記培地の粘度を減少させる。
エンドチア・パラシチカ（Endothia parasitica）の
発酵による凝固プロテアーゼの製造方法には、アメリカ
特許第3423288合記載の担子菌類（Basidiomycetes）の
ベータ−1,3−グルカナーゼ、商標グルカネックスのも
とにノボ社から市販の、または商標ラピダーゼGL150の
もとにギスト−ブロケイド社から市販のベータ−1,3−
ベータ−1,6−グルカナーゼなどのグルカナーゼ、ある
いはノボ社製フンガミル、またはギスト・ブロケイド社
製アミラーゼP200のような真菌製アルファ・アミラーゼ
などを用いることができる。
一般的に、酵素は発酵培地中に酵素なしの発酵の場合
に予定される総時間の50％以上、好ましくは75％以上の
時間後にのみ添加する。これらの条件下では、培地の粘
度は少ないままであり、プロテアーゼの産生は減少せ
ず、向上さえすることがある。事実、工程の終末でブロ
スの粘度は酵素なしの発酵の場合よりも明らかにより小
さく、およそ２−４倍小さく、バイオマスを何ら減少さ
せない。
この場合、細胞の除去後得られる濾液は粘度がより小
さく、従来の装置による限外濾過により、プロテアーゼ
30g/l以上、40g/lまでも濃縮することができる。ところ
が、従来の発酵後では、最大濃度はおよそ10g/lしかな
い。終末での多孔度の低い膜上の最終濾過がより容易で
ある。
別の観点によれば、本発明の方法は、発酵ブロスを濾
過前に、１−５時間、多糖類作用性酵素組成物50mg/l−
1g/lで処理することからなり、ブロスの粘度を２−５倍
減少させ、バイオマスと目的生成物を含む培地を分離す
るのに要する濾過時間を減少するものである。
最後の観点によれば、本発明の方法は、細胞を分離後
得られた濾液を、副生した多糖類を加水分解する酵素
で、限外濾過による濃縮中に処理し、目的生成物を変性
することなく、沈澱、または溶媒の溜去によって直接分
離できない場合に上記生成物の溶液を高濃度で得るもの
である。このような場合、好ましくはアルファ−アミラ
ーゼを用いる。
次の記載は、エンドチア・パラシチカ（Endothia par
asitica）の発酵に適用した本発明の具体的実施例に関
するものである。
接種物はエンドチア・パラシチカ（Endothia parasit
ica）、ATCC第14729号株の凍結胞子から、グルコース、
大豆粉末、無機塩および自己消化酵母抽出物を含む滅菌
水性培地中で28℃にて培養することにより調製する。
製造は前記のものと同じ型の滅菌水性培地中で行う。
粘度をブルックフィールド粘度計にて測定し、凝固活
性は国際乳業連合（Federation Internationale de Lai
terie）が推薦し、1981年３月20日付オフィシャル・ジ
ャーナル・オブ・ザ・フレンチ・リパブリック（Offici
al Journal of the French Republic）に掲載された方
法により測定した。
実施例1:発酵中における酵素処理 総時間約90時間の発酵中の種々の時間に添加されたグ
ルカネックス、またはアミラーゼP200について試験を行
った。アミラーゼP200はアスペルギルス・オリゼ（Aspe
rgillus oryzae）の真菌性アルフア・アミラーゼを含
み、粉末状であり、FAU滴定:4540/gである。1FAUは、37
℃、pH4.7にて１時間に可溶性デンプン5.26gを加水分解
する酵素量に相当する。
グルカネックスは、トリコデルマ（Trichoderma）株
から分泌される酵素を含む粉末であり、１グラム当たり
ベータ−グルカナーゼを300単位含む。
酵素の添加量、添加時間、発酵培地の粘度および濃縮
物の凝固活性を下記第１表に示す。
試験13および14は発酵90時間後に処理したもので、カ
ンバスにより菌糸体を濾取し、ついで約10000より小さ
い分子量の化合物を通過させる膜を用いて限外濾過によ
り濾液を濃縮する。
得られた結果を下記第２表に示す。
試験13は酵素を添加せず従来法により行い、試験14で
は発酵72時間後ブロス１リットル当たりグルカネックス
40mgを添加する。
実施例2:発酵末期における酵素処理 ブロスを培養88時間後処理する。このブロスは多糖類
約7.5g/kgを含有し、粘度1000mPa.s.である。この段階
で、粉末状の種々の酵素組成物200mg/l、または液状酵
素組成物10ml/lを添加する。
室温にて接触時間後の結果を下記第３表に示す。
実施例3:菌糸体分離後発酵濾液における酵素処理 酵素を限外濾過の開始前に添加する。フンガミルは滴
定値800FAU/gの真菌アルファ・アミラーゼの液状組成物
であり、マキサミルおよびBAIFは、ギスト・ブロケイド
社製細菌性アミラーゼである。
第４表は、各濃度で添加された酵素の種類につき濃縮
前濾液の時間による粘度の低下を示す。
限外濾過により予め濃縮され、pH4.3の濾液は粘度70m
Pa.s.を有する。酵素組成物の量は濃縮前濾液中のプロ
テアーゼ100gに対するｇ数で示したものである。
実施例4:濾液濃縮中における酵素処理 発酵、濾過によるバイオマスの分離および限外濾過に
よる濾液の濃縮の全工程を従来法で行う。
この最後の工程は流動性がほぼゼロになった時に中止
する。このとき濃縮物はpH3.9およびプロテアーゼ9g/l
を含んでいる。
アミラーゼP200の40mgおよびフンガミル40mgを濃縮物
10kgに対し添加し、混合物を室温にて２時間15分放置
後、限外濾過を再開する。
濃縮45分後、得られた濃縮物はアミラーゼP200で処理
した場合は45g/lのプロテアーゼ濃度を有し、フンガミ
ルで処理する場合は42g/lである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マリー―フランス・プラナール フランス国50500 カランタン、リュ・ デゼチクナル ４番 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】エンドチア・パラシチカ（Endothia paras
    itica）からのプロテアーゼの製造方法において、β−
    1,3−グルカナーゼ、β−1,3−β−1,6−グルカナー
    ゼ、α−アミラーゼから選ばれる、真菌により副生され
    る増粘性ポリマーに作用する酵素またはそれらの混合物
    を、発酵中または発酵後に培地中に添加することを特徴
    とする方法。
  2. 【請求項２】酵素が発酵中に培地中に添加される、請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】酵素が細胞の分離前の発酵末期にブロス中
    に添加される、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】酵素が細胞の分離後、限外濾過またはミク
    ロフィルトレーション（microfiltration）による濃縮
    前に培地中に添加される、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】酵素が限外濾過による濃縮中に培地中に添
    加される、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】酵素がβ−1,3−β−1,6−グルカナーゼで
    あり、発酵中または末期に培地中に添加される、請求項
    １記載の方法。
  7. 【請求項７】濃縮中に培地に添加される酵素がα−アミ
    ラーゼである、請求項１記載の方法。
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