CN102812050A

CN102812050A - 透明质酸及/或其盐的提纯方法

Info

Publication number: CN102812050A
Application number: CN2010800655179A
Authority: CN
Inventors: 香坂昌信; 石毛克己; 星加博光; 酒井晴子
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 2010-03-17
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2030-03-17
Also published as: JP5713995B2; KR101638662B1; CN102812050B; WO2011114475A1; KR20130056222A; TW201139463A; JPWO2011114475A1; TWI504611B

Abstract

本发明公开了一种透明质酸及/或其盐的提纯法，包括将含有高分子透明质酸及其盐和杂质的透明质酸溶液，经超滤膜进行透析处理的工序。通过本发明的方法，能够简便、高收率且工业规模地制造出去除了蛋白质、核酸、乳酸、金属等的高品质的透明质酸及/或其盐。

Description

透明质酸及/或其盐的提纯方法

技术领域

本发明涉及透明质酸及/或其盐的提纯方法。

背景技术

透明质酸，除了作为化妆品的保湿剂以外，还可用作眼科、骨科、皮肤科等的药剂制品。透明质酸可以从动物组织，例如，可以从鸡的鸡冠、牛眼玻璃体等的提取物制造而得，但因为作为杂质的硫酸软骨素等的混入，或因组织内含有透明质酸酶等使其容易被低分子量化，也进行具有透明质酸生产能力的微生物的培养，从培养液中制造透明质酸(发酵法)(非专利文献1以及专利文献1)。

使用提取法或发酵法制造得到的透明质酸中，存在蛋白质或致热源等杂质，因而对将这些杂质分离去除后得到高纯度制品的方法进行了研究。特别是在制造的初期阶段的杂质的去除，能够减轻之后的提纯工序的负荷，有望开发出得到能够作为药剂制品使用的高纯度制品的方法。作为高纯度提纯透明质酸的方法，为了去除例如蛋白质、核酸等副产品以及来源于培养基的无机盐类，已知将含有透明质酸及其盐和杂质的透明质酸溶液，通过带正电的过滤器后，加入水溶性有机溶剂，使透明质酸钠析出·沉淀，提取上清液实现提纯的方法(非专利文献2)。

非专利文献1：Journal of General Microbiology,85,372-375,1976

专利文献1：日本国专利公报“特公平4-12960号公报”

专利文献2：日本国专利公报“特开平9-324001号公报”

发明内容

然而，要得到工业规模下能够作为药剂制品使用的高纯度的透明质酸类，上述方法也还存在透明质酸的回收率低等问题。

鉴于上述情况，本发明旨在提供一种简便且高收率的，用于工业规模下的高纯度的透明质酸类的提纯方法。

本发明人等为了达到上述目的，对从含有透明质酸及其盐和杂质的透明质酸溶液中高效地分离去除杂质，简便且高效地提纯得到高纯度的透明质酸类的方法，进行了各种研究，结果发现将透明质酸类溶液调节至酸性端pH后，经超滤膜进行透析处理，能够有效地去除核酸、致热源、蛋白质、乳酸、无机盐类等，完成了本发明。

换句话说，本发明提供一种透明质酸及/或其盐的提纯方法，包括将含有透明质酸及其盐和杂质的透明质酸溶液调节至酸性端pH后、经超滤膜进行透析处理的工序。该制造方法能够有效地去除杂质。

具体实施方式

〔用语说明〕

本说明书中的“透明质酸及/或其盐”和“透明质酸类”为同义，可以交换使用，表示游离的透明质酸、以及、在不损害本发明目的的范围内可以使用的任意的透明质酸盐(并非限定于此，例如，钠盐、钾盐、钙盐、锂盐等的金属盐，盐酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐等酸加成物等)或水合物，或以上这些的混合物。在此，透明质酸是指，N-乙酰-D-葡糖胺与D-葡萄糖醛酸相结合的双糖单元重复相连成链的高分子量的多糖类，各种盐主要是指葡萄糖醛酸部分呈盐的形式。透明质酸通过可以折叠的链部分与D-葡萄糖醛酸部分的羧基的负电荷的相互作用，使其容易向空間扩展，因而能够与大量的水结合形成凝胶。此外，即使是低浓度，由于分子间作用力强，所以具有较高的粘性。从这样的作用出发，例如，具有湿润关节的作用、软化皮肤的作用等，生理上也担当这样的角色。

透明质酸类中，也已知分子量约为200万Da的透明质酸钠，与分子量约为80万Da的物质相比，作为药剂制品，对于变形性膝关节病、肩周炎、慢性类风湿关节炎等的治疗能发挥优良的疗效(薬理と治療，Vol.22,No.9,289(1994)；薬理と治療，Vol.22,No.9,319(1994))。此外，在其他方面，已知被用于外科手术后的粘连的预防，还已知作为皮肤科领域、眼科领域中的药剂制品的效果，一部分已经被普遍用于临床。作为药剂制品被使用时，优选使用平均分子量为100万以上的透明质酸类。进而，考虑到获取和处理的容易程度时，优选平均分子量为100万～500万Da的透明质酸类作为药剂制品，特别优选平均分子量为150万～400万Da的透明质酸类。此外，如此高分子量的透明质酸类用于化妆品用途时，从其高保湿力来说，也能发挥优良的效果。

本说明书中的“平均分子量”除特别注明外，表示透明质酸类平均分子量时，均为粘度平均分子量。本领域技术人员能够通过常用方法来求得粘度平均分子量。优选能够使用各国药典等一般使用的测定方法求得，更优选能够使用日本药典中所使用的测定方法求得。作为一个例子，例如，期望透明质酸钠具有接近本申请的发明的平均分子量(150万～390万)时，并非限定于此，其平均分子量，使用特性粘度［η］，可以根据下列公式求得。

【式1】

作为药剂制品，作为溶解透明质酸类的注射用溶解剂，可以酌情使用在注射用水、生理盐水等中，加入了含有如酸、碱、磷酸盐的缓冲剂的pH调节剂等的通常使用的注射用溶解剂(例如，各国药典认可的注射用溶解剂)。

这些透明质酸类，可以是通过从动物组织中提取的提取法制造而得的，也可以是利用生产透明质酸的微生物菌株使之发酵而得的发酵法制造的。然而，因为从动物组织中提取得到的提取物中，其他粘多糖等杂质比较多，透明质酸类的分子量也小，所以优选使用通过发酵法得到的。适用于本发明的发酵法的一个例子中，例如使用链球菌属微生物，能够通过已知方法得到透明质酸类。

通过发酵法得到的发酵液用于本发明的方法等时，优选使用经已知方法，例如，离心分离或过滤处理等进行了除菌的溶液。根据不同情况，也可以使用加入乙醇等水溶性有机溶剂析出提纯透明质酸的溶液。此外，也可以使用经氧化铝等处理过的溶液。

本说明书中的“链球菌”包括，能够生产透明质酸的链球菌属(Streptococcus)的任意细菌·其突变株。特别是，优选使用如专利文献2中记载的马链球菌FM-100(微工研菌寄第9027号)、如日本特开平2-234689号公报中所述的马链球菌FM-300(微工研菌寄第2319号)能够即高收率又稳定地生产透明质酸的突变株。作为适用于透明质酸生产的链球菌属的细菌的例子，此外，虽然并不限定于此，可以列举出，例如，马链球菌(Streptococcus equi)、兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)、似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)以及其突变株等。

本说明书中的“超滤膜”是指，孔径为0.001～0.01μm的过滤膜及/或截留分子量为1000～300000左右的过滤膜。超滤膜的材料，大致可以分为无机膜和有机膜，进一步划分为疏水性和亲水性。作为疏水性的有机膜，并非限定于此，可以列举出聚砜、聚醚砜、聚醚、聚偏二氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯等。作为亲水性的有机膜，并非限定于此，可以列举出聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰亚胺、醋酸纤维素等。其滤芯形状包括，平膜、管状膜、螺旋膜、中空纤维(中空丝)膜等、所有模块形式。

作为过滤方式，包括全量过滤方式和错流方式。全量过滤方式是指，对供应到膜的水的全部进行过滤的方式。与此相对的，错流方式是指，通过使水流相对于膜面平行流动，抑制供应至膜的水中含有的悬浮物质或胶体在膜面上堆积的现象的同时进行过滤的方式。错流方式，并非限定于此，包括一次通过方式、反冲洗方式以及回流方式。一次通过方式是指，如图1的A所示，经过超滤膜的透过液不进行再利用的过滤方式。反冲洗方式是指，如图1的B所示，包括经过超滤膜的透过液存储到透过液罐中，从透过液罐输送至超滤膜，冲洗过滤膜表面附着的透明质酸类的工序的过滤方式。回流方式是指，如图1的C所示，包括通过关闭透过液阀门使经过超滤膜的透过液回流，冲洗过滤膜表面附着的透明质酸类的工序的过滤方式。

本说明书中的“杂质”是指，除了透明质酸类、水以及其它溶剂成分、无机盐以外的物质，特别是，使用作为最终产品的透明质酸类时可能带来不良影响的物质(致热源等)。作为主要的杂质源，可以列举出在透明质酸类生产阶段中来自组织、微生物或培养液(培养基)的物质、或者、在此后的提纯阶段等中混入的物质。本说明书中，作为杂质的例子，虽然并不限定于此，可以列举出，组织或菌体、蛋白质、核酸、多糖类、低分子化合物、或者内毒素等。在作为杂质的组织或菌体中，虽然并不限定于此，分别包括，来自提取法所用的作为提取原料的组织的组织片等，或发酵法所用微生物的菌体或菌体片等。作为杂质的蛋白质中，虽然并不限定于此，包括来自上述组织、菌的蛋白质，或在生产后的工序中混入的蛋白质等。作为杂质的内毒素，虽然并不限定于此，包括来自上述菌的脂多糖类等。

本说明书中的“低分子化合物”是指，与透明质酸类相比，分子量较小的化合物，虽然并不限定于此，例如，分子量2000Da以下、或者分子量1000Da、或分子量500Da以下的化合物。像这样的低分子化合物包括，各种氨基酸、有机酸(例如、乳酸)、糖(例如、葡萄糖)等。

本说明书中的“去除”，不仅包括完全去除目标物质的情况，还包括部分去除(减少该物质的量)的情况。本说明书中的“提纯”，包括去除任意的或特定的杂质。

关于本说明书中各数值范围，分别包括用“～”表示的上限值以及下限值。

〔实施方式〕

本发明，虽然并不限于此，例如，涉及以下的实施状态。

实施状态1.

透明质酸及/或其盐的提纯方法，包括将含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸溶液调节至酸性端pH后，经超滤膜进行透析处理从而去除杂质的工序。

实施状态2.

在满足下列式子的超滤膜的截留分子量与经超滤膜进行透析处理时的pH关系的条件下，pH≤-5×10^-5×(截留分子量)＋4.4978经超滤膜进行透析处理的，如实施状态1所述的方法。

实施状态3.

超滤膜的截留分子量为25000～35000的，透析处理时的pH为3.3以下的，实施状态1或2所述的方法。

上述超滤膜的截留分子量为12000～14000的，透析处理时的pH为3.9以下的、实施状态1或2所述的方法。

实施状态4.

上述超滤膜的截留分子量为9000～11000的，透析处理时的pH为4.1以下的，实施状态1或2所述的方法。

实施状态5.

上述超滤膜的截留分子量为6000～8000的，透析处理时的pH为4.2以下的，实施状态1或2所述的方法。

实施状态6.

上述超滤膜的截留分子量为4000～5000的，透析处理时的pH为4.3以下的，实施状态1或2所述的方法。

实施状态7.

上述超滤膜为疏水性有机膜的，实施状态1至6任何一项所述的方法。

实施状态8.

上述处理的过滤方式为回流方式的，实施状态1至7任何一项所述的方法。

实施状态9.

上述处理时的过滤流速为20～50L/m²·hr的，实施状态1至8任何一项所述的方法。

实施状态10.

上述杂质包括，菌体、蛋白质、核酸、低分子化合物、或内毒素的，实施状态1至9任何一项所述的方法。

实施状态11.

提纯后的上述透明质酸及/或其盐的平均分子量为350万～700万Da的，实施状态1至10任何一项所述的方法。

实施状态12.

上述透明质酸类溶液中，透明质酸及/或其盐的浓度为1～5g/L的，实施状态1至11任何一项所述的方法。

接下来，对本发明的状态进行说明。

本发明的状态(例如、实施状态1)为透明质酸及/或其盐的提纯方法，包括将含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸溶液调节至酸性端pH后，经超滤膜进行透析处理从而去除杂质的工序。该提纯方法，通过将其pH调节至酸性端，减少经超滤膜过滤时透明质酸类的损失，可以高效地去除杂质。

满足下列式子的超滤膜的截留分子量与经超滤膜进行透析处理时的pH关系的条件下，pH≤-5×10^-5×(截留分子量)＋4.4978经超滤膜进行透析处理，能够实质上不损失透明质酸类而进行提纯。作为满足上式的超滤膜的截留分子量和经超滤膜进行透析处理时的pH，例如，可以列举出，对于截留分子量为35000的超滤膜pH为2.7，对于截留分子量为30000的超滤膜pH为3.0，对于截留分子量为25000的超滤膜pH为3.3，对于截留分子量为20000的超滤膜pH为3.5，对于截留分子量为14000的超滤膜pH为3.8，对于截留分子量为13000的超滤膜pH为3.9，对于截留分子量为12000的超滤膜pH为3.9，对于截留分子量为11000的超滤膜pH为4.0，对于截留分子量为10000的超滤膜pH为4.0，对于截留分子量为9000的超滤膜pH为4.1，对于截留分子量为8000的超滤膜pH为4.1，对于截留分子量为7000的超滤膜pH为4.2，对于截留分子量为6000的超滤膜pH为4.2，对于截留分子量为5000的超滤膜pH为4.3，对于截留分子量为4000的超滤膜pH为4.3。

在此，“实质上不损失透明质酸类”是指，透明质酸类的损失率为3%以下(回收率为97%以上)。

使用截留分子量高的膜，引起透明质酸类通过超滤膜的损失风险变大，另一方面，使用截留分子量低的膜，降低了蛋白质等相对高分子杂质的去除效率。通过上述实施方式的方法，无论使用截留分子量高的膜，或截留分子量低的膜，通过调节pH至适合于膜的截留分子量的pH，都能够在不损失透明质酸类的情况下去除杂质，因此上述状态的方法中对所使用的超滤膜的截留分子量，不作特别限定。例如使用具有25000～35000的截留分子量的超滤膜时，通过调节pH至3.3以下能够在不损失透明质酸类的情况下进行提纯。使用具有12000～14000的截留分子量的超滤膜时，通过调节pH至3.9以下能够在不损失透明质酸类的情况下进行提纯。使用具有9000～11000的截留分子量的超滤膜时，通过调节pH至4.1以下能够在不损失透明质酸类的情况下进行提纯。使用具有6000～8000的截留分子量的超滤膜时，通过调节pH至4.2以下能够在不损失透明质酸类的情况下进行提纯。使用具有4000～5000的截留分子量的超滤膜时，通过调节pH至4.3以下能够在不损失透明质酸类的情况下进行提纯。

在此，超滤膜的截留分子量，可以通过使用如表1所示的标志性物质进行过滤，通过分别调查截留率为90%时对应的分子量来决定。

【表1】

用于测定截留分子量的标志性物质

种类	分子量	推测分子直径（nm）
			蔗糖	340	1.1
棉子糖	590	1.3
			维生素B12	1360	1.7
杆菌肽	1410	1.7
			胰岛素	5700	2.7
细胞色素Ｃ	13000	3.8
			肌红蛋白	17000	4.0
α-胰凝乳蛋白酶原	25000	4.6
			胃蛋白酶	35000	5.0
卵白蛋白	43000	5.6
			牛血清白蛋白	66000	6.4
醛缩酶	142000	8.2
			γ-球蛋白	150000	8.4

上述状态的方法中所使用的超滤膜的材料，并无特别限定，但从去除杂质的角度出发，优选疏水性有机膜，更优选聚砜、聚醚砜、聚醚、聚偏二氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯。

作为上述状态的方法中所使用的超滤膜，可以使用例如、PM-10、PM-50、PM-100(Koch公司制造)、NTU-3050(日东电工株式会社制造)、IRIS3065(罗纳·普朗克公司制造)、FS-10(旭化成株式会社制造)、MU-6303(Kuraray株式会社制造)、DUSO400(Daicel化学工业株式会社制造)、SLP-3053(旭化成化学株式会社制造)等，但并不只限制于此。

上述状态的方法中的过滤方式，并非特别限定，从水的膜过滤流速易于稳定、延长过滤膜寿命等角度出发，优选错流方式，其中特别优选回流方式。

上述状态的方法中，用超滤膜处理时透明质酸类溶液的过滤流速，虽然因透明质酸类溶液的性状或超滤膜的种类而有所不同，不能统一规定，但例如，工业规模中透明质酸类的提纯，优选20L/m²·hr以上，更优选25L/m²·hr以上，特别优选30L/m²·hr以上。从透明质酸类被切断而引起分子量下降的角度出发，透明质酸类溶液的过滤中的过滤流速，优选100L/m²·hr以下，更优选50L/m²·hr以下。

上述状态的方法中，并不限定用于输送溶液的压力，优选经过普通加压使之通过过滤膜。特别优选用泵等加压输送的方法。对于输送溶液时用泵施加压力，只要是不发生过滤膜破损或堵塞孔等使其性能恶化的现象就不作特别限定。作为对过滤膜施加的压力，优选0.01MPa以上0.30MPa，更优选0.03MPa以上0.20MPa，特别优选0.05MPa以上0.10MPa。

进而，上述状态的方法中，提纯时能够降低透明质酸类分子量的下降，特别是，在高分子量(例如，提纯后的平均分子量为350万～700万Da)的透明质酸类的提纯中，能够发挥优良效果。此外，对于历来难于处理的较高浓度(例如，0.1～20g/L、0.5～15g/L、1～10g/L)的透明质酸类溶液，也能够有效地进行处理。

此外，上述状态的方法，能够抑制透明质酸类的损失为低损失的同时，还能够有效地分离·去除杂质，作为杂质，不仅包括通常超滤膜能够去除的低分子化合物（例如、氨基酸、糖、有机酸），还包括高分子化合物（例如、核酸、内毒素、蛋白质）。此外，上述状态的方法，还能够对核酸、内毒素及/或蛋白质的去除发挥优良效果。

使用上述状态的方法时的透明质酸类溶液的透明质酸类浓度，从因溶液粘度高所带来的处理困难，以及透明质酸类的溶解度的角度出发，并非限定于此，优选0.1～20g/L，最优选1～10g/L。

此外，上述状态的方法中，为了降低透明质酸类溶液的粘度，可以使透明质酸类溶液与氯化钠等盐类共存。这种情况下，为了无损于提纯效果，优选避免与高浓度的盐共存。作为这样的盐的共存的具体例子，可以列举出在透明质酸类溶液中加入0.1～5重量%的氯化钠。

使用上述状态的方法时透明质酸类溶液的温度，并非限定于此，优选0～80℃。温度在80℃以下时，能够强烈抑制处理中的透明质酸类的分解以及分子量的下降。

此外，进行超滤透析处理时，作为膜的预处理，优选使用2%以下的碱(例如、氢氧化钠水溶液)、过氧化物(例如、次氯酸钠水溶液)、表面活性剂、柠檬酸、柠檬酸铵·加酶洗涤剂等的药剂对膜实施洗净处理的化学方法，或，刷、海绵球、空气喷射法等的物理方法进行。

本发明的其他状态为，上述第一状态中所述工序以外，还可以包括使透明质酸类溶液与无机吸附剂、有机吸附剂及/或活性炭相接触的工序。

此外，考虑到在之后必要的分离·提纯工序等，优选避免有必要追加提纯工序的成分的混入。即，为了避免新杂质的混入的本发明的其它状态为，上述第一状态中，不包括使透明质酸类溶液在超滤后与无机吸附剂或有机吸附剂相接触的工序的提纯方法。本发明的其他状态为，上述第一状态中，不包括使透明质酸类溶液与无机吸附剂或有机吸附剂相接触的工序。本发明中，因为超滤也能够起到充分的提纯效果，所以在重视避免新杂质混入时，优选超滤单独处理。当然，这种情况下，除超滤以外，也可以进行其他的提纯处理等的工序。

此外，本发明的其他状态为，上述状态中的透明质酸类为经马链球菌FM-100（微工研条寄第9027号）或马链球菌FM-300（微工研条寄第2319号）生产而得的。使用经这些微生物生产而得的透明质酸类作为提纯对象，能够得到杂质较少、分子量高的透明质酸类提纯物，特别是作为医药品使用时，能够发挥优良效果。

通过使用上述状态的提纯方法，能够减轻透明质酸类的分离·提纯工序的负担，因此涉及上述状态的提纯方法，在制造的工业过程的较初期阶段的应用是特别有效的。

而且，上述实施状态、方式中进行说明的提纯方法等，并不限定本发明，只是意图举例说明而披露的。本发明的技术范围，是通过专利权利要求的所述范围确定的，本领域技术人员可以在专利权利要求的范围内所记载的发明的技术范围内，进行各种设计上的变更。

例如，上述提纯方法，也可以是包括其他工序，或者在上述提纯方法之后继续实施其他工序·方法的制造透明质酸类等的方法。作为这样的工序·方法，可以列举出，例如，培养产生透明质酸的微生物菌株的工序，从产生透明质酸的微生物菌株的培养液中制造培养滤液的工序，离心分离提纯对象溶液的工序、中和对象溶液的工序、将提纯对象溶液精密过滤的工序、将对象溶液进行透析处理的工序、向提纯对象溶液中加入芳香族系吸附树脂并搅拌以及过滤的工序、用色谱法对对象溶液进行提纯的工序、将活性炭从对象溶液中分离的工序、从对象溶液中去除活性炭的工序、加入有机溶剂使透明质酸类沉淀的工序、使透明质酸类结晶的工序、将透明质酸类干燥的工序等。

〔实施例〕

接下来，通过实施例对本发明进行更加具体的说明，但本发明并不限于此。

实施例1

取使用马链球菌FM-100(微工研菌寄第9027号)培养的培养液45L，用纯水稀释至80L(透明质酸钠浓度2.0g/1)，经离心分离去除菌体。将得到的粗制透明质酸的pH调节至2.9后，使用截留分子量为30000、材料为聚砜的超滤膜(Koch公司制造·PM-100)2m²，过滤流速为30L/m²·hr、反复进行体积比2倍的浓缩、等倍稀释操作，透析次数为10次，用回流方式进行处理。得到的溶液80L中溶解食盐2.4kg，调节pH至7后用乙醇240L析出、用乙醇8L清洗，在40℃下进行真空干燥得到透明质酸钠。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

实施例2

实施例1中使用的粗制透明质酸，将其pH调节至2.9后，使用截留分子量为30000、材料为聚醚砜的超滤膜(旭化成株式会社制造·FS-10)5m²，过滤流速为30L/m²·hr，反复进行体积比2倍的浓缩、等倍纯水稀释操作，透析次数为11次、用回流方式进行处理。对得到的溶液进行与实施例1相同的处理，得到透明质酸钠。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

实施例3

实施例1中使用的粗制透明质酸，将其pH调节至3.3后，使用截留分子量为20000、材料为聚砜的超滤膜(日东电工株式会社制造·NTU-3050)3m²，过滤流速为30L/m²·hr，反复进行体积比2倍的浓缩、等倍纯水稀释操作，透析次数为8次、用回流方式进行处理。对得到的溶液进行与实施例1相同的处理，得到透明质酸钠。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

实施例4

实施例1中使用的粗制透明质酸，将其pH调节至2.9后，使用截留分子量为30000、材料为聚偏二氟乙烯的超滤膜(罗纳·普朗克公司制造·IRIS3065)5m²，过滤流速为30L/m²·hr，反复进行体积比2倍的浓缩、等倍纯水稀释操作，透析次数为9次、用回流方式进行处理。对得到的溶液进行与实施例1相同的处理，得到透明质酸钠。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

实施例5

实施例1中使用的粗制透明质酸，将其pH调节至2.7后，使用截留分子量为40000、材料为聚醚砜的超滤膜(Daicel化学工业株式会社制造·DUSO400)5m²，过滤流速为30L/m²·hr，反复进行体积比2倍的浓缩、等倍纯水稀释操作，透析次数11次，用回流方式进行处理。对得到的溶液进行与实施例1相同的处理，得到透明质酸钠150g。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

实施例6

实施例1中使用的粗制透明质酸，将其pH调节至3.7后，使用截留分子量为13000、材料为聚砜的超滤膜(Kuraray株式会社制造·MU-6303)5m²，过滤流速为30L/m²·hr，反复进行体积比2倍的浓缩、等倍纯水稀释操作，透析次数为11次，用回流方式进行处理。对得到的溶液进行与实施例1相同的处理，得到透明质酸钠。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

实施例7

实施例1中使用的粗制透明质酸，将其pH调节至3.7后，使用截留分子量为10000、材料为聚砜的超滤膜(旭化成化学公司制造·SLP-3053)4.5m²，过滤流速为30L/m²·hr，反复进行体积比2倍的浓缩、等倍纯水稀释操作，透析次数为11次，用回流方式进行处理。对得到的溶液进行与实施例1相同的处理，得到透明质酸钠。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

对比例1

实施例1中使用的粗制透明质酸，将其pH调节至5.5后，使用截留分子量为10000、材料为聚砜的疏水性超滤膜(Koch公司制造·PM-10)2m²，过滤流速为30L/m²·hr，反复进行体积比2倍的浓缩、等倍稀释操作，透析次数为15次，用回流方式进行处理。对得到的溶液进行与实施例1相同的处理，得到透明质酸钠。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

对比例2

实施例1中使用的粗制透明质酸，将其pH调节至3.6后，使用截留分子量为20000、材料为醋酸纤维素的亲水性超滤膜(DDS公司制造·CA600PP)4.5m²，过滤流速为30L/m²·hr，反复进行体积比2倍的浓缩、等倍纯水稀释操作，透析次数为10次，用回流方式进行处理。对得到的溶液进行与实施例1相同的处理，得到透明质酸钠。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

对比例3

实施例1中使用的粗制透明质酸，将其pH调节至3.3后，使用截留分子量20000、材料为醋酸聚酰亚胺的亲水性超滤膜(日东电工株式会社制造·NTU-4220)5m²，过滤流速为30L/m²·hr，反复进行体积比2倍的浓缩、等倍纯水稀释操作，透析次数为9次，用回流方式进行处理。对得到的溶液进行与实施例1相同的处理，得到透明质酸钠。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

对比例4

实施例1中使用的粗制透明质酸，将其pH调节至3.7后，使用截留分子量为13000、材料为醋酸聚砜的疏水性超滤膜(Kuraray株式会社制造·MU-6303)5m²，过滤流速为5L/m²·hr，反复进行体积比2倍的浓缩、等倍纯水稀释操作，透析次数为11次，用一次通过方式进行处理。对得到的溶液进行与实施例1相同的处理，得到透明质酸钠。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

对比例5

实施例1中使用的粗制透明质酸，将其pH调节至3.7后，使用截留分子量为13000、材料为醋酸聚砜的疏水性超滤膜(Kuraray株式会社制造·MU-6303)5m²，过滤流速为15L/m²·hr，反复进行体积比2倍的浓缩、等倍纯水稀释操作，透析次数为11次，用反冲洗方式进行处理。对得到的溶液进行与实施例1相同的处理，得到透明质酸钠。分析结果以及透明质酸的回收率显示于表2中。

【表2】

测定方法

(1)核酸含量：测定了0.1%透明质酸钠对260nm的吸光度。

(2)蛋白质含量：将透明质酸钠溶解于0.1N氢氧化钠中，用半限注法进行测定。

(3)乳酸：溶解透明质酸钠至浓度为0.1%，用L-LDH法进行测定。

(4)金属：溶解透明质酸钠于8N硝酸中，至浓度为0.05%，进行ICP发射光谱分析。

(5)特性粘度：将透明质酸钠溶解于0.2M氯化钠中，至浓度为0.02%，测定30℃的特性粘度。

【表3】

实施例8

将实施例1中使用的粗制透明质酸，使用具有各种截留分子量的聚砜的疏水性超滤膜，用以下条件进行提纯，调查超滤时的pH与透明质酸的回收率之间的关系。

HA溶液条件

HA浓度：2g/L

分子量：440万(特性粘度：55dL/g)

过滤条件

线性速度：1m/s

过滤流速：30L/(m²·hr)

浓缩：2倍浓缩

温度：25℃

显示超滤时的pH与透明质酸的回收率的关系的图如图2所示。此外，关于各截留分子量的膜，得到了显示超滤时的pH与透明质酸损失率的关系的算式1～5。使用下列算式1～5，算出对于各截留分子量的超滤膜，实质上不发生透明质酸类损失的pH，通过在此pH范围内(最佳pH)进行超滤提纯，能够进行不损失透明质酸类的提纯。

使用截留分子量为30，000的超滤膜时

(式1)透明质酸类的损失率(%)＝44.86×(超滤时的pH)-131.79(最佳pH≤2.9)

使用截留分子量为13，000的超滤膜时

(式2)透明质酸类的损失率(%)＝40.84×(超滤时的pH)-86.92(最佳pH≤3.7)

使用截留分子量为10，000的超滤膜时

(式3)透明质酸类的损失率(%)＝24.36×(超滤时的pH)-97.19(最佳pH≤4.0)

使用截留分子量为7，000的超滤膜时

(式4)透明质酸类的损失率(%)＝7.09×(超滤时的pH)-29.02(最佳pH≤4.1)

使用截留分子量为5，000的超滤膜时

(式5)透明质酸类的损失率(%)＝0.79×(超滤时的pH)-2.01(最佳pH≤4.2)

图3显示透明质酸类的损失率为3%以下的pH与超滤膜的截留分子量之间的关系。此外，显然，透明质酸类的损失率为3%以下的pH与超滤膜的截留分子量之间的关系满足以下算式6。

(式6)透明质酸类的损失率为3%以下的pH＝-5×10^-5×(截留分子量)＋4.4978

使用式6，能够求出对于超滤膜的截留分子量的最佳pH的上限，通过在最佳pH条件下进行经超滤膜的透析，能够在损失率3%以下提纯透明质酸类。

从以上试验可知，使用本发明中的提纯方法，能够从透明质酸类溶液中有效地去除杂质，提纯高分子量的透明质酸类。

以上以实施例为基础对本发明进行了说明。本领域技术人员应理解，此实施例仅仅是示例，还可能有各种变形例，此外，这些变形例也属于本发明的范围内。

附图说明

图1为表示错流方式所包括的一次通过方式(Ａ)、反冲洗方式(B)以及回流方式(C)的过滤方式的图。

图2为表示超滤时的pH与透明质酸损失率之间的关系的图。

图3为表示透明质酸类的损失率为3%以下的pH与超滤膜的截留分子量之间的关系的图。

Claims

1.一种透明质酸及/或其盐的提纯方法，包括将含有高分子量的透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸溶液，经超滤膜进行透析处理从而去除杂质的工序。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述杂质包括，菌体、蛋白质、核酸、低分子化合物、或内毒素。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述透明质酸及/或其盐的分子量为150万～400万Da。

4.如权利要求1～3中任意一项所述的方法，其中，所述透明质酸类溶液中的透明质酸及/或其盐的浓度为1～10g/L。

5.如权利要求1～4中任意一项所述的方法，其中，处理时的透明质酸溶液的温度为0～80℃。