CN102803299A

CN102803299A - 透明质酸的提纯方法以及制造方法

Info

Publication number: CN102803299A
Application number: CN2010800655268A
Authority: CN
Inventors: 香坂昌信; 石毛克己; 日置和利; 星加博光; 酒井晴子
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 2010-03-17
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2012-11-28
Also published as: JP5603926B2; TWI522369B; JPWO2011114470A1; WO2011114470A1; TW201139462A; KR101639105B1; KR20130010077A

Abstract

本发明的目的在于提供一种简便且高收率的用于工业规模下的高纯度透明质酸类的提纯方法。本发明提供一种透明质酸及/或其盐的提纯方法以及制造方法，包括：使从（1）活性炭、（2）无机吸附剂、（3）无机吸附剂和有机吸附剂、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、（6）有机吸附剂、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群中选择的吸附剂，与含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸类溶液相接触的工序。

Description

透明质酸的提纯方法以及制造方法

技术领域

本发明涉及透明质酸类的提纯方法以及制造方法。

背景技术

透明质酸，除了作为化妆品的保湿剂以外，还用作眼科、骨科、皮肤科等的药剂制品。透明质酸可以从动物组织，例如，可以从鸡的鸡冠、牛眼玻璃体等的提取物制造而得，但因为作为杂质的硫酸软骨素等的混入，或因组织内含有透明质酸酶等使其容易被低分子量化，也进行具有透明质酸生产能力的微生物的培养，从培养液中制造透明质酸（发酵法）（非专利文献1以及专利文献1）。

使用提取法或发酵法制造得到的透明质酸中，存在蛋白质或致热源等杂质，因而对将这些杂质分离去除后得到高纯度的制品的方法进行了研究。特别是制造的初期阶段中的杂质的去除，能够减轻之后的提纯工序的负荷，有望开发出能够作为药剂制品使用的高纯度制品的方法。作为这样的例子，公开了例如有在发酵液中加入乙醇等有机溶剂使得透明质酸析出与杂质分离的提纯法，或使用阴离子交换树脂从发酵液中去除致热源或蛋白质等的透明质酸提纯法（专利文献2）。

非专利文献1：Journal of General Microbiology,85,372-375,1976

专利文献1：日本国专利公报“特公平4-12960号公报”

专利文献2：日本国专利公报“特开昭63-12293号公报”

发明内容

然而，要得到能够工业规模生产的作为注射液等的药剂制品来使用的高纯度透明质酸类，还存在：（1）因为在初期阶段杂质的去除没有充分进行，使得后续工序的负荷大（2）操作复杂且透明质酸类的回收率低等，还需要得到进一步的改善的需求点。

鉴于上述情况，本发明旨在提供一种简便且高收率的，用于工业规模下的高纯度透明质酸类的提纯方法。此外，本发明也旨在提供用于该提纯方法的吸附剂。

本发明人等，为了达到上述目的，对从含有透明质酸类的溶液中高效地分离去除杂质，简便且高效地得到高纯度的透明质酸类的提纯方法，进行了各种研究，结果发现通过使透明质酸类溶液与活性炭相接触，可以高效地吸附去除杂质，完成了本发明。

也就是说，本发明提供一种透明质酸及/或其盐的提纯方法，包括：使从（1）活性炭、（2）无机吸附剂、（3）无机吸附剂和有机吸附剂、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、（6）有机吸附剂、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群中选择的吸附剂，与含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸类溶液相接触的工序。该提纯方法，能够高效地吸附去除杂质。

此外，本发明提供一种透明质酸及/或其盐的提纯方法，包括：使从（1）活性炭、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群中选择的吸附剂，与含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸类溶液相接触的工序。该提纯方法，能够高效地吸附去除杂质。

此外，本发明提供一种旨在制造透明质酸及/或其盐的方法，包括：使从（1）活性炭、（2）无机吸附剂、（3）无机吸附剂和有机吸附剂、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、（6）有机吸附剂、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群中选择的吸附剂，与含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸类溶液相接触，从而将透明质酸及/或其盐提纯的工序。该制造方法，通过高效地吸附去除杂质，能够有效地制造出高纯度的透明质酸。

此外，本发明提供一种旨在制造透明质酸及/或其盐的方法，包括：使从（1）活性炭、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群中选择的吸附剂，与含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸类溶液相接触，从而将透明质酸及/或其盐提纯的工序。该制造方法，通过高效地吸附去除杂质，能够有效地制造出高纯度的透明质酸。

具体实施方式

〔用语说明〕

本说明书中的“透明质酸类”包括：游离的透明质酸、以及在不损害本发明目的的范围内能够使用的任意透明质酸盐（并非限定于此，例如、钠盐、钾盐、钙盐、锂盐等金属盐，盐酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐等酸加成物等）或水合物、或以上这些的混合物。在此，透明质酸是指，N-乙酰-D-葡糖胺与D-葡萄糖醛酸相结合的双糖单元重复相连成链的高分子量的多糖类，各种盐主要是指葡萄糖醛酸部分呈盐的形式。透明质酸，通过可以折叠的链部分与D-葡萄糖醛酸部分的羧基的负电荷的相互作用，使其容易向空間扩展，因而能够与大量的水结合形成凝胶。此外，即使是低浓度，由于分子间作用力强，所以具有较高的粘性。从这样的作用出发，例如，具有湿润关节的作用、软化皮肤的作用等，生理上也担当这样的角色。

透明质酸类中，也已知分子量约为200万Da的透明质酸钠，与分子量约为80万Da的物质相比，作为药剂制品，对于变形性膝关节病、肩周炎、慢性类风湿关节炎等的治疗能发挥优良的疗效（薬理と治療，Vol.22,No.9,289（1994）；薬理と治療，Vol.22,No.9,319（1994））。此外，在其他方面，已知被用于外科手术后的粘连的预防，还已知用作皮肤科领域、眼科领域中的药剂制品的效果，一部分已经被普遍用于临床。作为药剂制品被使用时，优选使用平均分子量为100万以上的透明质酸类。进而，考虑到获取和处理的容易程度时，优选平均分子量为100万～500万Da的透明质酸类作为药剂制品，特别优选平均分子量为150万～400万Da的透明质酸类。此外，如此高分子量的透明质酸类使用于化妆品用途时，从其高保湿力来说，也能发挥优良的效果。

作为药剂制品，作为溶解透明质酸类的注射用溶解剂，可以酌情使用在注射用水、生理盐水等中，加入了含有如酸、碱、磷酸盐的缓冲剂的pH调节剂等通常使用的注射用溶解剂（例如，各国药典认可的注射用溶解剂）。

这些透明质酸类，可以是通过从动物组织中提取的提取方法制造而得的，也可以是通过利用生产透明质酸的微生物菌株使之发酵而得的发酵法制造而得的。然而，因为从动物组织中提取得到的透明质酸中，其他粘多糖等杂质比较多，分子量也小，所以优选使用通过发酵法得到的。适用于本发明的发酵法的一个例子中，例如使用链球菌属微生物通过已知方法能够得到透明质酸类。

通过发酵法得到的发酵液用于本发明的方法等时，优选使用经已知的方法，例如、离心分离或过滤处理等，进行了除菌的溶液。根据不同情况，也可以进行经透析处理、超过滤等去除低分子化合物，经精密过滤处理去除不溶于水的微粒等操作，也可以使用加入乙醇等水溶性有机溶剂析出提纯透明质酸的物质。此外，也可以使用经氧化铝等处理过的物质。

本说明书中的“链球菌”包括，能够生成透明质酸的链球菌属（Streptococcus）的任意细菌·其突变株。特别是，优选使用如专利文献2中记载的马链球菌FM-100（微工研菌寄第9027号）、如日本特开平2-234689号公报中所记载的马链球菌FM-300（微工研菌寄第2319号）能够即高收率又稳定地生产透明质酸的突变株。作为适用于透明质酸生产的链球菌属的细菌的其他例子，并不限定于此，可以列举出，例如，马链球菌（Streptococcus equi）、兽疫链球菌（Streptococcuszooepidemicus）、似马链球菌（Streptococcus equisimilis）、停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）、化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）以及其突变株等。

本说明书中的“平均分子量”除特别注明外，表示透明质酸类平均分子量时，均为粘度平均分子量。粘度平均分子量能够通过本领域技术人员常用的方法来求得。优选能够使用各国药典等一般使用的测定方法，更优选能够使用日本药典中所使用的测定方法求得。作为一个例子，例如，但并不限定于此，其平均分子量，使用特性粘度［η］，可以根据下列公式求得。

【式1】

本说明书中的“活性炭”是指，市售的、常见使用的、用于分离·去除·提纯的多孔的碳，并不限定源自煤炭或木材等原料的来源，或药晶激活或水蒸气活化等制备方法，进而，也不限定于粉末活性炭、颗粒状活性炭等形状，或干式、湿式等性状。本发明的方法等中，虽然并不限于此，优选使用源于木材的活性炭。此外，同样的，优选使用经水蒸气活化制造而成的活性炭（湿式活性炭）。而且，优选经煮沸等预处理的活性炭（湿润化处理活性炭）。此外，同样的，优选使用粉末活性炭。

作为活性炭的具体实例，并不限定于此，可以列举出，例如tsurumikoru GL-30S、tsurumikoru HC-30S［以上为颗粒状·tsurumikoru株式会社制造］、白鹭WH5C8/32、白鹭LH2C20/48、白鹭WH2C8/32SS［以上为颗粒状·武田药品工业株式会社制造］、白鹭A、白鹭P、精制白鹭、特性白鹭、karuborafin［以上为粉末状·武田药品工业株式会社制造］、北越SD、北越GSA［以上为粉末状·北越炭素工业株式会社制造］、银A、花F、雪A［以上为粉末状·大三工业株式会社制造］等。

本说明书中的“无机吸附剂”是指，例如，由Al₂O₃、SiO₂、MgO、CaO、Al(OH)₃等无机化合物组成的吸附剂，并不限定其配比、制法、或有无水合物等。但是，本说明书中的“无机吸附剂”中，不包括活性炭。

作为无机吸附剂的具体例子，并不限定于此，可以列举出，由蒙脱土的酸处理产物组成的活性白土、例如、nikkanaito GHC-36、nikkanaitoG-36、nikkageru M-30；由SiO₂·Al₂O₃组成的吸附剂、例如、nikkageruS-6、nikkageru S-65［以上为日本活性白土株式会社制造］；由Al₂O₃·10SiO₂·xH₂O组成的吸附剂、例如、tomix AD-700NS；由Al₂O₃·xH₂O组成的吸附剂、例如、tomix AD-200NS；由Al(OH)₃·NaHCO₃组成的吸附剂、例如、tomix AD-400NS；由6MgO·Al₂O₃·CO₂·H₂O组成的吸附剂、例如、tomix AD-500NS；MgO·3SiO₂·xH₂O组成的吸附剂、例如、tomix AD-600NS；由MgO组成的吸附剂、例如、tomixAD-100G、tomix AD-100GG；由MgO·Al₂O₃·2SiO₂组成的吸附剂、例如、tomix AD-300NSS、tomix AD-800颗粒、Q-Fiae2000、Q-Fiae3000［以上为富田制药株式会社制造］；合成沸石A-4、合成沸石F-9［以上为东洋曹达工业株式会社制造］；天然沸石［日本活性白土株式会社制造］；膨润土［和光纯药工业株式会社制造］等。

本说明书中的“有机吸附剂”是指，由有机化合物组成的吸附剂，并不限定其构造。

作为有机吸附剂的具体例子，并不限定于此，可以列举出，由纤维素衍生物系树脂组成的吸附剂、例如、DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、ECTEOLA-纤维素［以上为Serva Finebiochemica Gmb H&Co制造］；聚氨基酸衍生物系树脂组成的吸附剂、例如、PMLG、PMLG-ED、PMLG-PD、PMLG-BD；交联葡聚糖衍生物系树脂组成的吸附剂、例如、DEAE-交联葡聚糖、QAE-交联葡聚糖）［以上为Pharmacia株式会社制造］；壳聚糖衍生物系树脂组成的吸附剂、例如、kurimuba［以上为粟田工业株式会社制造］；作为反相色谱用填料，辛基与硅胶化学键合而成的反相色谱用填料、例如、YMC·GEL Co-300-S5；十八烷基与硅胶化学键合而成的反相色谱用填料、例如、YMC·GELODS-AQ60-S50、DS-AM-120-S50、YMC·GEL ODS-A120-S30/50、YMC·GEL ODS-AQ60-S50、YMC·GEL ODS-AD 120-S50［以上为YMC制造］；十八烷基与合成树脂化学键合而成的反相色谱用填料、例如、ODP-400［以上为旭化成株式会社制造］、OP-4PW［以上为Tosoh株式会社制造］等。

本说明书中的“杂质”是指，除了透明质酸类、水以及其它溶剂成分、无机盐以外的物质，特别是，使用作为最终产品的透明质酸类时可能带来不良影响的物质（致热源等）。作为主要的杂质源，可以列举出透明质酸类生产阶段等中来自组织、微生物或培养液（培养基）的物质、或者、此后的提纯阶段中混入的物质。本说明书中，作为杂质的例子，并不限定于此，可以列举出，组织或菌体、蛋白质、核酸、多糖类、低分子化合物、或者内毒素等。在作为杂质的组织或菌体中，并不限定于此，分别包括，来自提取法所用的作为提取原料的组织的组织片等，或发酵法所用的微生物的菌体或菌体片等。作为杂质的蛋白质中，并不限定于此，包括来自上述组织、菌的蛋白质，或生产后的工序中混入的蛋白质等。作为杂质的内毒素，并不限定于此，包括来自上述菌的脂多糖类等。

本说明书中的“低分子化合物”是指，与透明质酸类相比，分子量较小的化合物，例如，并不限定于此，分子量2000Da以下、或者分子量1000Da、或分子量500Da以下的化合物。像这样的低分子化合物包括，各种氨基酸、有机酸（例如、乳酸）、糖（例如、葡萄糖）等。

本说明书中的“清洁环境”是指、通过空调管理，使得来自环境的菌或内毒素等杂质污染产品的可能性极低的环境，特别是指相当于医药（无菌、无内毒素）产品的制造环境。

作为清洁环境的一个例子，例如，可列举出将目标物质进行如下限制的环境。

【表1】

本说明书中的“去除”，不仅包括完全去除目标物质的情况，还包括部分去除（减少该物质的量）的情况。本说明书中的“提纯”，包括去除任意的或特定的杂质。

关于本说明书中各数值范围，分别包括用“～”表示的上限值以及下限值。例如，如“A～Ｂ”的记述，表示A以上B以下的意思。此外，“含有…”包括“实质上由…而成的”以及“由…形成的”。

〔实施方式〕

本发明，虽然并不限于此，例如，涉及以下的实施状态。

实施状态1：

一种透明质酸及/或其盐的提纯方法，包括：使从（1）活性炭、（2）无机吸附剂、（3）无机吸附剂和有机吸附剂、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、（6）有机吸附剂、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群中选择的吸附剂，与含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸类溶液相接触的工序。

实施状态2：

一种旨在制造透明质酸及/或其盐的方法，包括：使从（1）活性炭、（2）无机吸附剂、（3）无机吸附剂和有机吸附剂、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、（6）有机吸附剂、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群中选择的吸附剂，与含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸类溶液相接触，从而将透明质酸及/或其盐提纯的工序。

实施状态3：

上述透明质酸类溶液的pH为2～5的，实施状态1或2中记载的方法。

实施状态4：

包括使活性炭与上述透明质酸类溶液相接触的工序的，实施状态1至3任何一项中记载的方法。

实施状态5：

上述活性炭为湿润化处理活性炭的，实施状态1至4任何一项记载的方法。

实施状态6：

包括在上述接触工序之前，向上述透明质酸类溶液中加入氯化钠的工序的，实施状态1至5任何一项记载的方法。

实施状态7：

上述杂质为含有菌体、蛋白质、核酸、低分子化合物、或者内毒素的，实施状态1至6任何一项记载的方法。

实施状态8：

上述杂质为含有蛋白质或内毒素的，实施状态1至7任何一项记载的方法。

实施状态9：

提纯后的上述透明质酸及/或其盐的平均分子量为350万～700万Da的，实施状态1至8任何一项记载的方法。

实施状态10：

上述透明质酸类溶液中的透明质酸及/或其盐的浓度为1～10g/L的，实施状态1至9任何一项记载的方法。

实施状态11：

上述工序为清洁环境下进行的，实施状态1至10任何一项记载的方法。

接下来，对本发明的状态进行说明。

本发明的第一状态（例如、实施状态1）为，一种透明质酸及/或其盐的提纯方法，包括：使从（1）活性炭、（2）无机吸附剂、（3）无机吸附剂和有机吸附剂、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、（6）有机吸附剂、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群中选择的吸附剂，与含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸类溶液相接触的工序。该提纯方法中，通过使用特定的吸附剂，能够高效地吸附·去除杂质。

上述第一状态中所使用的吸附剂，优选选自于（1）活性炭、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群，更优选（1）活性炭。

本发明的第二状态（例如、实施状态2）为，一种旨在制造透明质酸及/或其盐的方法，包括：使从（1）活性炭、（2）无机吸附剂、（3）无机吸附剂和有机吸附剂、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、（6）有机吸附剂、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群中选择的吸附剂，与含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸类溶液相接触，从而将透明质酸及/或其盐提纯的工序。该制造方法中，通过使用特定的吸附剂，来高效地吸附·去除杂质，从而能够有效地制造出高纯度的透明质酸。

上述第二状态中所使用的吸附剂，优选选自于（1）活性炭、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群，更优选（1）活性炭。

上述状态的方法中，将多种吸附剂与透明质酸类溶液相接触时，可以同时接触，也可以分别接触。此外，也可以使用将多种吸附剂混合得到的混合吸附剂。

上述状态的方法中，使吸附剂与透明质酸类溶液相接触后，也可以将吸附剂分离出来，这种情况下，例如、通过过滤或离心分离等，能够回收滤液。从分离的效率和操作的复杂程度等观点出发，作为分离手段，优选进行过滤。

作为分离手段，进行过滤时，只要能够分离吸附剂以及吸附在之上的杂质，则对过滤方法或滤芯没有限定，例如、使用滤膜、过滤器、柱、滤纸等，在常压下（自然过滤）或进行加压。滤芯的材料，并不限定于此，例如、可以列举出聚丙烯制等的各种无纺布、陶瓷、纤维（滤纸）等。此外，也可以使用硅藻土等的过滤辅助剂，但从防止混入杂质（特别是金属/重金属）的观点出发，更优选不使用过滤辅助剂。滤芯的孔径，只要是能够分离吸附剂以及吸附在之上的杂质，也没有限定，可以使用例如、孔径为0.2～50μm的滤芯。

用于上述状态的方法等的无机吸附剂的量，并不限定于此，相对于透明质酸类溶液100重量%，优选0.5～20.0重量%，更优选5.0～20.0重量%。在此范围内，有望达到更高的提纯（吸附）作用。

用于上述状态的方法等的有机吸附剂的量，并不限定于此，相对于透明质酸类溶液100重量%，优选0.5～20.0重量%，更优选5.0～20.0重量%。在此范围内，有望达到更高的提纯（吸附）作用。

用于上述状态的方法的活性炭的量，并不限定于此，相对于透明质酸类溶液100重量%，优选0.5～20.0重量%，更优选5.0～20.0重量%。在此范围内，有望达到更高的提纯（吸附）作用。

进而，活性炭优选实施了在水溶液中的加热处理等预处理的湿润化处理活性炭。通过实施湿润化处理，使活性炭的杂质吸附量增高，分散性提高，因而不仅能够高效地吸附·去除杂质，还能够在提纯时减少透明质酸类的分子量的下降，特别是高分子量（例如、提纯后（例如，紧接吸附处理的过滤后）的平均分子量为350万～700万Da）的透明质酸类的提纯中，能够发挥优良的效果。

进一步而言，作为活性炭的原料，特别是从适用于生物体时可能成为问题的杂质等角度出发，优选来源于木材，其形状，从分散性或吸附效率的角度出发，优选粉末状。

此外，将活性炭，与无机吸附剂和有机吸附剂的其中之一或者与两者混合，作为混合吸附剂使用时，并不限定于此，活性炭的量优选适用上述状态的范围内，混合吸附剂的总量，相对于透明质酸类溶液100重量%，优选不超过20.0重量%，更优选0.5～20.0重量%，最优选5.0～20.0重量%。在此范围内，有望达到更高的提纯（吸附）作用。

此外，考虑到在之后必要的分离·提纯工序等，优选避免有必要追加提纯工序的成分的混入。即，为了避免新杂质的混入的本发明的其它状态为，上述第一状态中，使用活性炭作为吸附剂，包括使活性炭与上述透明质酸类溶液相接触的工序的提纯方法或者相应的制造方法，进而，不包括使上述透明质酸类溶液与活性炭相接触的同时，与无机吸附剂或有机吸附剂相接触的工序的提纯方法或者相应的制造方法。因为单独使用活性炭也能够起到充分的吸附·分离效果，当重视避免新杂质的混入时，优选单独使用活性炭作为吸附剂进行处理。当然，这种情况下，除了用活性炭进行吸附处理外，也可以进行其他的提纯处理等的工序。

使上述活性炭、无机吸附剂、有机吸附剂、或者混合吸附剂，与作为提纯对象的透明质酸溶液相接触时，也可将这些吸附剂进行一次悬浮操作，之后保持原状，但优选持续进行悬浮·搅拌操作。进行搅拌时，并不限定于此，优选10分钟～2小时的搅拌，更优选20分钟～1小时的搅拌。

上述状态的方法，对历来难于处理的较高浓度（例如、1g/L～10g/L）的透明质酸类溶液，也能够有效地进行处理。透明质酸类的浓度，从因溶液粘度高所带来的处理困难，以及透明质酸类的溶解度的角度出发，并不限定于此，优选0.1～20g/L，更优选0.5～15g/L，最优选1～10g/L。

此外，上述状态的方法中，为了降低透明质酸类溶液的粘度，可以让透明质酸类溶液与氯化钠等盐类共存。这种情况下，为了无损于提纯效果，优选避免与高浓度的盐共存。作为这样的盐的共存的具体例子，可以列举出透明质酸类溶液中加入0.1～5重量%的氯化钠。

使用上述状态的方法时的透明质酸类溶液的温度，并不限定于此，优选0～80℃。温度在80℃以下时，能够强烈抑制处理中的透明质酸类的分解以及分子量的下降。

本发明的其他状态为，透明质酸类溶液的pH为2～5的上述状态的方法。该提纯方法或者制造方法中，通过使用特定的pH条件下的吸附剂，特别是活性炭，既能够抑制透明质酸类的低分子量化，还能够高效地吸附·去除杂质。关于pH的调整，可以使用处于适当pH范围的透明质酸类溶液，也可使用酸·碱将其pH调整至应调整的pH范围，或者，在吸附·过滤的操作工序中，也可以调整操作对象溶液至特定的pH。

进一步而言，通过上述状态的方法，使用特定pH条件下的吸附剂，特别是活性炭，既能够抑制透明质酸类的损失为低损失，还能够有效地分离·去除杂质，作为杂质，不仅包括通常情况下活性炭能够去除的高分子化合物（例如、菌体、蛋白质、核酸、内毒素），还包括低分子化合物（例如、氨基酸、糖、有机酸）。此外，上述状态的方法，通过使用特定pH条件下的吸附剂，特别是活性炭，对于去除活菌、蛋白质、氨基酸、及/或内毒素能够发挥优良效果，特别是，对蛋白质及/或内毒素的去除能起到更加优良的效果。

进一步而言，上述状态的方法，在特定pH范围内进行吸附处理，能够减少提纯时透明质酸类的分子量的下降，特别是，在高分子量（例如、提纯后（例如，紧接吸附处理的过滤后）的平均分子量为350万～700万Da）的透明质酸类的提纯中，能够发挥优良的效果。

本发明的其他状态为，透明质酸类溶液的pH为4～5的上述状态的方法。该提纯方法或者制造方法中，因为使吸附剂或活性炭与菌体的吸附更加优良，提高提纯精度的同时，即使使用较大孔径（例如、比菌的大小（约1μm）大的孔径等）的滤芯进行过滤时，也能够完全过滤菌体（防止菌泄漏），也易于液体渗透。

此外，本发明的另外的状态中，上述状态中的透明质酸类为经马链球菌FM-100（微工研条寄第9027号）或马链球菌FM-300（微工研条寄第2319号）生产而得的。使用经这些微生物生产而得的透明质酸类作为提纯对象，能够得到杂质较少、分子量高的透明质酸类提纯物，特别是作为医药品使用时，能够发挥优良效果。

因为通过使用上述状态的提纯方法，能够减轻透明质酸类的分离·提纯工序的负担，因此有关于上述状态的提纯方法，在透明质酸类制造的工业过程中的较初期阶段的应用是特别有效的。

进而，通过在清洁环境中进行上述状态的提纯方法，可以使以前很难达到的、药剂制品中所要求的、高品质透明质酸类的工业规模的有效提纯成为可能。这样的提纯方法，在用于药剂制品的透明质酸类的生产中，具有极高的工业实用性。

而且，上述实施状态、上述方式中进行说明的提纯方法等，并不限定于本发明，只是意图举例说明而披露的。本发明的技术范围，是通过记述的专利权利要求的范围确定的，本领域技术人员可以对记载于专利权利要求的范围内的发明的技术范围，进行各种设计上的变更。

例如，上述提纯方法，可以是包括更多其他工序，或者在上述提纯方法之后继续实施更多其他工序·方法的制造透明质酸类等的方法。作为这样的工序·方法，可以列举出，例如，培养产生透明质酸的微生物菌株的工序，从产生透明质酸的微生物菌株的培养液中制造培养滤液的工序，离心分离提纯对象溶液的工序、中和对象溶液的工序、将提纯对象溶液精密过滤的工序、将对象溶液进行透析处理的工序、向提纯对象溶液中加入芳香族系吸附树脂并进行搅拌以及超过滤的工序、用色谱法对对象溶液进行提纯的工序、将活性炭从对象溶液中分离的工序、从对象溶液中去除活性炭的工序、加入有机溶剂使透明质酸类沉淀的工序、使透明质酸类结晶的工序、将透明质酸类干燥的工序等。

〔实施例〕

接下来，通过实施例对本发明进行更加具体的说明，但本发明并不限于此。

取使用马链球菌FM-100（微工研菌寄第9027号）培养的发酵液150ml（透明质酸钠浓度3.5g/l、pH4.0）到300ml的玻璃烧杯中，使用如表1或2中所显示的条件进行吸附剂处理，使用磁力搅拌器在400rpm条件下进行30分钟悬浮搅拌处理。将该处理液用滤纸加压过滤，在150ml滤液中加入氯化钠4.5g（3.0重量%）后，用乙醇600ml使透明质酸钠析出。将该析出透明质酸钠、用乙醇300ml清洗后、在40℃下进行真空干燥得到0.5g透明质酸钠。

对如此得到的透明质酸钠，使用表4中所示的评价项目、评价标准进行评价。提纯条件以及评价结果如表2及3中所示。

并且，当吸附处理时的溶液的pH为1时，含有作为提纯对象的透明质酸的培养液发生凝胶化，不能进行提纯工序（吸附处理等）。

【表2】

【表3】

【表4】

*ET：内毒素

从以上实验可知，使用本发明涉及的提纯方法，可以从透明质酸类溶液中有效地吸附去除杂质，达到提纯目的。

以上，以实施例为基础对本发明进行了说明。本领域技术人员应理解，此实施例仅仅是示例，还可能有各种变形例，此外，这些变形例也属于本发明的范围内。

Claims

1.一种透明质酸及/或其盐的提纯方法，包括：使从（1）活性炭、（2）无机吸附剂、（3）无机吸附剂和有机吸附剂、（4）无机吸附剂和活性炭、（5）无机吸附剂和有机吸附剂和活性炭、（6）有机吸附剂、以及（7）有机吸附剂和活性炭组成的群中选择的吸附剂，与含有透明质酸及/或其盐和杂质的透明质酸类溶液相接触的工序。