CN112255345A - 一种测定高分子量透明质酸分子量的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种测定高分子量透明质酸分子量的方法，其特征在于，包括如下步骤：取待测样品高分子量透明质酸，将其溶解，得到初始溶液；向所述初始溶液中加入盐类化合物，得到待测样品溶液；联用体积排阻色谱和多角度激光光散射法测定所述待测样品溶液中高分子量透明质酸的分子量。本申请的方法特别适合于检测分子量为2000～3000kDa的透明质酸的分子量。
Description
技术领域
本发明涉及透明质酸的检测领域，具体涉及一种多角度激光光散射法测定透明质酸分子量、特别是高分子透明质酸分子量的方法。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，HA)是由乙酰葡糖胺和葡糖醛酸的双糖单位重复交替连接形成的高分子粘多糖，由于其特殊的生物学特性和生理功能，已被广泛应用于化妆品及医学领域。HA的相对分子质量大小是表征其特性的基本参数之一，HA的生物学性质与其相对分子量大小有密切的关系。不同相对分子量透明质酸，其生理活性也不相同，甚至具有完全相反的作用。例如，分子量大于2000kDa的HA具有较好的保湿性、黏弹性、润滑、抑制炎性反应等功能，可用于眼科手术、骨关节注射制剂；分子量1000kDa～2000kDa的HA具有良好的保湿性、润滑性及药物缓释作用，广泛用于化妆品、滴眼液和皮肤烧伤愈合；分子量10kDa～80kDa的属低分子HA，口服能被肠道吸收，补充机体HA的不足，发挥保健和美容养颜的功效；HA寡聚糖(分子量小于10kDa)具有抗肿瘤、促进骨和血管生成作用，具有潜在的医学应用前景。
透明质酸分子量的测定方法主要有粘度法、分子体积排阻色谱法(SEC)和多角度激光光散射法(MALS)。粘度法获得的只是样品的相对分子质量，且受环境影响较大；SEC法需要分子量标准品，而市场上没有不同分子量HA的标准品，只能用与透明质酸结构相同的多糖来代替，准确性差。多角度激光光散射联用体积排阻色谱法(MALS-SEC)无需用标准品做参照，就能得到分子量结果，操作简单，节约时间。目前较多的是对2000kDa以下的透明质酸的分子量和分布的测定，采用MALS-SEC测定高分子量透明质酸分子量的研究较少，且实际操作发现采用常规的MALS-SEC测定高分子量透明质酸分子量时存在色谱柱残留以及所测分子量偏差大、拖尾等问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本申请对现有方法进行了优化，通过将待测样品溶解，得到初始溶液，随后向待测初始溶液中添加一定量的盐类化合物，再利用MALS-SEC进行分子量测定，确定了一种测定高分子量透明质酸分子量的方法。
本申请的具体技术方案如下：
1.一种测定高分子量透明质酸分子量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
取待测样品高分子量透明质酸，将其溶解，得到初始溶液；
向所述初始溶液中加入盐类化合物，得到待测样品溶液；
联用体积排阻色谱和多角度激光光散射法测定所述待测样品溶液中高分子量透明质酸的分子量。
2.根据项1所述的方法，其特征在于，所述初始溶液中待测样品的浓度为0.01～0.02mg/mL。
3.根据项1或2所述的方法，其特征在于，所述盐类化合物为氯化钠、硝酸钠或硫酸钠，优选为氯化钠；
优选所述待测样品溶液中所述盐类化合物的浓度为所述初始溶液中待测样品的浓度的2000～4000倍，更优选为3500～4000倍。
4.根据项1～3中任一项所述的方法，其特征在于，使用所述体积排阻色谱的流动相溶解所述待测样品，得到所述初始溶液。
5.根据项1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相中包含氯化钠，所述氯化钠的浓度为0.1～0.2mol/L；
优选地，所述流动相包含氯化钠和叠氮化钠。
6.根据项1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.3～0.6mL/min，优选为0.5～0.6mL/min。
7.根据项1～6中任一项所述的方法，其特征在于，在联用所述体积排阻色谱和多角度激光光散射法进行分析时的检测波长为630～658nm。
8.根据项1～7中任一项所述的方法，其特征在于，在联用所述体积排阻色谱和多角度激光光散射法进行分析时的进样量为300～500μL，优选为400～500μL。
9.根据项1～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述体积排阻色谱的色谱柱为凝胶色谱柱，优选为TSKgel GMPWxl色谱柱。
10.根据项1～9中任一项所述的方法，其特征在于，所述高分子量透明质酸的分子量为2000～3000kDa。
发明的效果
本申请通过在初始溶液中添加一定量的氯化钠，可以降低样品的粘度，从而有效解决了MALS-SEC法测定高分子透明质酸的分子量的过程中产生的色谱柱中透明质酸残留以及所测分子量偏差大、拖尾等问题。本申请进一步限定体积排阻色谱仪中的流动相、流动相流速、检测波长、进样量等参数，最终测得的高分子量透明质酸分子量相对于粘度法测得的分子量的相对平均偏差小于等于7％，可低至2.5％，拖尾不明显，洗脱后色谱柱透明质酸残留小，在提高检测的准确度和灵敏度的同时，延长了色谱柱的使用寿命。
附图说明
图1为本申请一个具体实施方式的体积排阻色谱图。
图2为现有技术一个具体实施方式的体积排阻色谱图。
具体实施方式
本申请中的“色谱法”又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。
本申请中的“体积排阻色谱”(SEC)是一种液相色谱方法，液相色谱方法就是用液体作为流动相的色谱法。体积排阻色谱的分离机理是分子的体积排阻，根据分子的大小而不是其它分离参数如分子量或极性来分离分子样品，组分和固定相之间原则上不存在相互作用，色谱柱的固定相是具有不同孔径的多孔凝胶，只让临界直径小于凝胶孔开度的分子进入(保留)，其孔径大于溶剂分子，所以溶剂分子可以自由地出入。高聚物分子在溶液中呈无规则线团，线团的体积和分子量有一定的线性关系，对不同大小的溶质分子可以渗透到不同大小的凝胶孔内不同的深度，小的溶质分子，大孔小孔都可以进去，甚至可以渗透到很深的孔中。因此小的溶质分子保留时间长，洗脱体积大，而大的溶质分子保留时间短，洗脱体积小。
本申请的“体积排阻色谱”的液相检测器使用的是示差折光检测器和多角度激光光散射仪。“示差折光检测”，是任意一束光由一种介质射入另一种介质时由于两种介质的折射率不同而发生折射现象。折光率是一个无量纲的常数，光在真空中的速度和光在某种介质中的速度之比定义为该介质的折射率，其大小表明了介质光密度的高低。“示差折光检测器”是通过连续测定色谱柱流出液折射率的变化而对样品浓度进行检测的。“多角度激光光散射仪(MALS)”，是指对分子从多个角度进行光强度测量，而并非局限在单一角度。这些测量结果可用于建立散射光随入射角度变化的函数模型，从而推断出0°入射光时的散射光强度，当分子被激光照射时，散射光强度与其分子量直接相关，这种关系可以用瑞利方程来进行描述。得到0°入射光时的散射光强度从而即可推断出分子量。
以下将对本申请做以详细说明。
本申请提供一种测定高分子量透明质酸重均分子量的方法，其特征在于，包括如下步骤：取待测样品高分子量透明质酸，将其溶解，得到初始溶液；向所述初始溶液中加入盐类化合物，得到待测样品溶液；联用体积排阻色谱和多角度激光光散射法测定所述待测样品溶液中高分子量透明质酸的分子量。
本申请中的“透明质酸”可来自本领域已知的任何来源，例如来自公鸡鸡冠或来自微生物。在优选的实施方案中，透明质酸通过微生物发酵产生，例如通过链球菌属(Streptococcus)的菌株，如兽疫链球菌(S.zooepidemicus)发酵产生；又例如通过巴斯德氏菌属(Pasteurella)的菌株，如多杀巴斯德氏菌(P.multocida)发酵产生。
本申请中的“透明质酸”涵盖了透明质酸和透明质酸盐。上述透明质酸盐可为透明质酸的碱金属盐、碱土金属盐等，具体可为透明质酸钠或透明质酸钙等。
本申请的测定方法，通过将待测样品高分子量透明质酸溶解形成溶液，在溶液中加入一定量的盐类化合物，使得测得的高分子透明质酸分子量偏差小，拖尾不明显，洗脱后色谱柱透明质酸残留小。
在一个具体实施方式中，本申请的高分子量的透明质酸的分子量为2000～3000kDa，例如可为：2000kDa、2100kDa、2200kDa、2300kDa、2400kDa、2500kDa、2600kDa、2700kDa、2800kDa、2900kDa、3000kDa等。
在一个具体实施方式中，将待测样品高分子量透明质酸溶解的溶剂包含氯化钠，所述溶剂中氯化钠的浓度为0.1～0.2mol/L，例如可为：0.1mol/L、0.12mol/L、0.14mol/L、0.16mol/L、0.18mol/L、0.2mol/L等。优选地，所述溶剂包含浓度为0.1～0.2mol/L的氯化钠和浓度为0.01％～0.05％的叠氮化钠。
在一个具体实施方式中，所述盐类化合物可为氯化钠、硝酸钠和硫酸钠，优选为氯化钠，盐类化合物的加入，可以降低样品粘度，从而有效解决了MALS-SEC法测定高分子透明质酸的分子量的过程中产生的色谱柱中透明质酸残留以及所测分子量偏差大、拖尾等问题。
在一个具体实施方式中，所述包括如下步骤：取待测样品高分子量透明质酸，将其溶解，得到初始溶液；取部分初始溶液，向其中加入盐类化合物，得到待测样品溶液；联用体积排阻色谱和多角度激光光散射法测定所述待测样品溶液中高分子量透明质酸的分子量。本申请中，取部分初始溶液后，向其中加入盐类化合物，加入所述盐类化合物导致的溶液体积的变化可忽略不计。
在一个具体实施方式中，所述初始溶液中待测样品的浓度为0.01～0.02mg/mL，例如可为0.01mg/mL、0.012mg/mL、0.014mg/mL、0.016mg/mL、0.018mg/mL、0.02mg/mL等；所述盐类化合物为氯化钠；所述待测样品溶液中所述盐类化合物的浓度为所述初始溶液中待测样品浓度的2000～4000倍，例如可为2000倍、2200倍、2400倍、2600倍、2800倍、3000倍、3200倍、3400倍、3600倍、3800倍、4000倍等，优选为3000～4000倍，更优选为4000倍。
本申请的方法，采用多角度激光散射仪测定体积排阻色谱分离出的样品在不同角度的光散射量，示差折光检测器测定体积排阻色谱分离出的样品的折光率，即可对样品浓度进行检测，多角度激光散射仪和示差折光检测器联用即可计算出各个切片的分子量。该方法不需标准品校准，克服了样品与标准品的化学组成、分子结构及大小不同带来的相对分子量测定的误差。不必依赖泵的流速、校正曲线及其他错误的假设，即可直接求得分子量及分子量分布等数据。
在一个具体实施方式中，使用所述体积排阻色谱的流动相溶解所述待测样品，得到所述初始溶液。所述流动相为包含盐类化合物的溶液，优选为包含氯化钠的溶液，所述流动相中氯化钠的浓度为0.1～0.2mol/L。
在一个具体实施方式中，所述流动相包含0.1～0.2mol/L氯化钠和0.01％～0.05％(w/v)的叠氮化钠，所述叠氮化钠起到抑制细菌生长的作用。
在一个具体实施方式中，使用的色谱柱为TSKgel GMPWxl色谱柱，尺寸为7.8×30cm，膜厚13μm，TOSOH，所述色谱柱为凝胶色谱柱，可以根据分子量的大小分离样品，色谱柱的固定相为凝胶，流动相为氯化钠和叠氮化钠。
本申请的检测波长为多角度激光散射仪的检测波长。
在一个具体实施方式中，体积排阻色谱的色谱条件为：所述流动相的流速为0.3～0.6mL/min，优选为0.5～0.6mL/min，例如可为：0.3mL/min、0.35mL/min、0.4mL/min、0.45mL/min、0.5mL/min、0.55mL/min、0.6mL/min，特别优选为0.6mL/min；进样量为300～500μL，优选为400～500μL，例如可为：300μL、320μL、340μL、360μL、380μL、400μL、420μL、440μL、460μL、480μL、500μL等，特别优选为500μL；柱温为30～40℃，优选35℃。检测波长为630～658nm，优选为645～658nm，例如可为：630nm、632nm、634nm、636nm、638nm、640nm、642nm、644nm、646nm、648nm、650nm、652nm、654nm、656nm、658nm等，特别优选为658nm。在该色谱条件下进行高分子量透明质酸分子量的测定，测定结果能够更加准确，测得的透明质酸分子量相对于粘度法测得的分子量的偏差小于等于7％，可低至2.5％。
本申请测定高分子量透明质酸分子量的方法，使用含有0.1～0.2mol/L氯化钠的流动相将待测样品溶解，得到初始溶液，然后向初始溶液中加入盐类化合物，得到待测样品溶液，再利用MALS-SEC法测定分子量，由于高分子量的透明质酸粘度大，在初始溶液中添加一定量的氯化钠，可以降低样品的粘度，从而有效解决了MALS-SEC法测定高分子透明质酸的分子量的过程中产生的色谱柱中透明质酸残留以及所测分子量偏差大、拖尾等问题，本申请的方法尤其适用于高分子量透明质酸分子量的测定。实施例中通过控制体积排阻色谱的色谱条件中的流动相组分、流动相的流速、柱温、进样量、检测波长等参数来测定透明质酸的分子量，结果表明采用体积排阻色谱的色谱条件为：流动相为氯化钠和叠氮化钠的水溶液，其中氯化钠的浓度为0.2mol/L，叠氮化钠的浓度为0.02％，流动相的流速为0.6mL/min，进样量为500μL，柱温为35℃，检测波长为658nm，向初始溶液中加入待测样品浓度4000倍的氯化钠时，测得的高分子量透明质酸分子量相对于粘度法测得的分子量的偏差最小，达到2.5％。
使用本申请的方法测得的高分子量透明质酸分子量，相对于粘度法测得的高分子量透明质酸分子量的相对平均偏差可在7％以下，甚至可达到2.5％，相比于对比例中最低为9％的相对平均偏差，本申请的方法的准确度和灵敏度明显提高，同时也有效的延长了色谱柱的使用寿命。
本申请的以下实施例仅用来说明实现本申请的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本申请的限制。其他的任何在未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。
实施例
以下利用实施例对本申请做以详细说明。然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
1.试剂及材料
氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)、叠氮化钠(大连亿德瑞生物科技有限公司)
高分子量透明质酸钠(华熙生物科技股份有限公司)
2.色谱条件
色谱柱：TSKgel GMPWxl色谱柱(7.8×30cm，13μm)
流动相：0.2mol/L NaCl，0.02％NaN3
流速：0.6mL/min
进样量：500μL
柱温：35℃
检测波长：658nm。
3.仪器
多角度激光光散射仪(型号：DAWN HELEOS-11厂家：美国怀雅特技术公司)
示差折光检测器(型号：Optilab T-rEx，厂家：美国怀雅特技术公司)
高效液相色谱仪(型号：Agilent 1100，厂家：安捷伦)
体积排阻色谱柱(型号：TSKgel GMPWxl，厂家：TOSOH)
4.溶液配制
流动相：称取11.7g氯化钠，0.2g叠氮化钠，溶解到1L纯化水中，配制成流动相(氯化钠的浓度为0.2mol/L)，0.22μm滤膜过滤，超声脱气使用。
待测样品溶液：称取高分子量透明质酸钠待测样品5mg，用10mL上述流动相溶解待测样品，并稀释至0.01mg/mL，得到初始溶液，取10mL初始溶液，向其中加入400mg氯化钠，0.22μm滤膜过滤，即得待测样品溶液。平行制备两份待测样品溶液，最终测得的分子量为由两份平行待测样品溶液测得的分子量的平均值。
5.测定
采用体积排阻色谱对待测样品溶液进行分离，具体的，取高分子量透明质酸待测样品溶液500μL进样，按照上述色谱条件进行分离检测，采集谱图结束后，分别经多角度激光散射仪测定分离出的样品在不同角度的光散射量，经示差折光检测器测定体积排阻色谱分离出的样品的折光率，通过ASTRA软件对检测得到的光散射量和折光率进行数据处理，即可得到样品的重均分子量Mw。
6.结果
表1为本实施例待测样品分子量检测结果数据；图1为本实施例待测样品的分子量谱图，其中，浅色虚线表示多角度激光光散射信号，深色虚线表示示差折光信号。
表1
注：RD＝d/x*100％，RD-相对平均偏差，d-两个分子量之差，x-两个分子量之和。
实施例2
实施例2的待测样品用流动相溶解后加入200mg氯化钠，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表2所示。
表2
实施例3
实施例3的待测样品用流动相溶解后加入300mg氯化钠，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表3所示。
表3
实施例4
实施例4的待测样品用流动相溶解后加入100mg氯化钠，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表4所示。
表4
实施例5
实施例5的待测样品用流动相溶解后加入500mg氯化钠，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表5所示。
表5
实施例6
实施例6的进样量为300μL，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表6所示。
表6
实施例7
实施例7的进样量为400μL，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表7所示。
表7
实施例8
实施例8的进样量为250μL，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表8所示。
表8
实施例9
实施例9的进样量为550μL，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表9所示。
表9
实施例10
实施例10的流动相流速为0.3mL/min，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表10所示。
表10
实施例11
实施例11的流动相流速为0.4mL/min，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表11所示。
表11
实施例12
实施例12的流动相流速为0.5mL/min，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表12所示。
表12
实施例13
实施例13的流动相流速为0.2mL/min，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表13所示。
表13
实施例14
实施例14的流动相流速为0.7mL/min，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表14所示。
表14
实施例15
实施例15的检测波长为635nm，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表15所示。
表15
实施例16
实施例16得到初始溶液后加入400mg硝酸钠，得到待测样品溶液，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表16所示。
表16
实施例17
实施例17得到初始溶液后加入400mg硫酸钠，得到待测样品溶液，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表17所示。
表17
实施例18
实施例18的流动相中氯化钠的浓度为0.1mol/L，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表18所示。
表18
实施例19
实施例19的流动相中氯化钠的浓度为0.25mol/L，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表19所示。
表19
对比例1
实施例1中的样品用流动相溶解后不加入氯化钠，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表20所示；图2是对比例1的HA分子量谱图，其中，浅色虚线表示多角度激光光散射信号，深色虚线表示示差折光信号。
表20
对比例2
对比例2得到初始溶液后加入1mL 1mol/L的HCl，得到待测样品溶液，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表21所示。
表21
对比例3
对比例3得到初始溶液后加入1mL 1mol/L的NaOH，得到待测样品溶液，其它条件与实施例1相同，测定待测样品溶液中透明质酸钠的分子量，HA分子量检测结果如表22所示。
表22
下表23中示出了上述实施例1～22与对比例的结果比较。
表23
尽管对本申请的实施方案和具体实施例进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。
Claims (10)
1.一种测定高分子量透明质酸分子量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
取待测样品高分子量透明质酸，将其溶解，得到初始溶液；
向所述初始溶液中加入盐类化合物，得到待测样品溶液；
联用体积排阻色谱和多角度激光光散射法测定所述待测样品溶液中高分子量透明质酸的分子量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初始溶液中待测样品的浓度为0.01～0.02mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述盐类化合物为氯化钠、硝酸钠或硫酸钠，优选为氯化钠；
优选所述待测样品溶液中所述盐类化合物的浓度为所述初始溶液中待测样品的浓度的2000～4000倍，更优选为3000～4000倍。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，使用所述体积排阻色谱的流动相溶解所述待测样品，得到所述初始溶液。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相中包含氯化钠，所述氯化钠的浓度为0.1～0.2mol/L；
优选地，所述流动相包含氯化钠和叠氮化钠。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.3～0.6mL/min，优选为0.5～0.6mL/min。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，在联用所述体积排阻色谱和多角度激光光散射法进行分析时的检测波长为630～658nm。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，在联用所述体积排阻色谱和多角度激光光散射法进行分析时的进样量为300～500μL，优选为400～500μL。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述体积排阻色谱的色谱柱为凝胶色谱柱，优选为TSKgel GMPWxl色谱柱。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其特征在于，所述高分子量透明质酸的分子量为2000～3000kDa。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110195925A1 (en) * | 2010-02-09 | 2011-08-11 | Liu X Michael | Sterile Hyaluronic Acid Solutions |
| WO2011114470A1 (ja) * | 2010-03-17 | 2011-09-22 | 電気化学工業株式会社 | ヒアルロン酸の精製方法及び製造方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BARUCH ET AL.: "CHANGES IN THE PHYSICAL CHARACTERISTICS OF THE HYALURONATE OF GROUND SUBSTANCE WITH ALTERATIONS IN SODIUM CHLORIDE CONCENTRATION", 《THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION》, 30 September 1955 (1955-09-30), pages 1456 * |
| 丁厚强 等: "多角度激光光散射仪与体积排阻色谱联用（MALLS-SEC）测定透明质酸分子量及其分布", 《中国药学会2008年全国多糖类药物研究与应用讨论会论文集》, 21 September 2009 (2009-09-21), pages 204 - 207 * |
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