CN102323355A

CN102323355A - 一种酶解-hplc法检测依诺肝素的方法

Info

Publication number: CN102323355A
Application number: CN201110241617A
Authority: CN
Inventors: 李建科
Original assignee: SHENZHEN CITY TECHDOW PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHENZHEN CITY TECHDOW PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2011-08-22
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2031-08-22
Also published as: CN102323355B

Abstract

本发明公开了一种酶解-HPLC法检测依诺肝素的方法，所述方法包括下述步骤：a、依诺肝素的完全酶解：向浓度为10-200mg/ml的依诺肝素溶液中，加入酶I∶酶II∶酶III＝8∶1∶2的混合酶溶液，室温下酶解48小时；b、HPLC法分析：取降解产物做SAX-HPLC分析；c、二、四糖单元种类和含量的计算：根据现有的标准双糖和四糖的洗脱时间，确定供试品二、四糖单元的种类和含量，计算其中8个双糖和1个四糖各自所占百分含量。

Description

一种酶解-HPLC法检测依诺肝素的方法

技术领域

本发明涉及一种通过HPLC法检测完全酶解的依诺肝素的二、四糖单元指纹图谱，并由此判断产品是否合格的方法。

背景技术

依诺肝素(enoxaparin)是低分子肝素的一种，由肝素苯丙化碱降解而来。是一种由许多链长不一的肝素小分子组成的混合物，结构非常复杂。临床上用于预防深静脉血栓形成及肺栓塞；治疗已形成的静脉血栓；预防血液透析时体外循环中血栓的形成；治疗不稳定性心绞痛和非Q波心梗。

依诺肝素由法国赛诺菲安万特公司(Sanofi Aventis)原创，其在美国市售品商品名为“Lovenox”，在中国大陆市售品商品名为“克赛”。近几年国内外涌现出一批该药的仿制药，比如杭州九源基因工程公司的商标名为“亿喏佳”的针剂药品、深圳天道医药公司商品名为“普洛宁”的针剂产品等。

美国药典、欧洲药典、中国药典等对于依诺肝素的质量控制有许多项，包括效价、1，6-酐环含量、分子量分布、重金属含量、试剂残留含量等理化检测项目，这些检测项目基本反映了依诺肝素的特性，可判断产品是否合格。然而，基于对病人健康负责的态度，为避免2008年肝素事件类似悲剧的发生，提高依诺肝素检测水平是有必要的。

鉴于依诺肝素结构的高度复杂性，而目前的常规尚难以涉及其分子细节结构，本发明提出一种通过将依诺肝素分子用肝素酶特异性降解然后用HPLC分析其主要组成双糖含量，并由此判断药物是否合格的方法。本方法严谨、科学，具有极高的实际使用价值和长远深刻的社会意义。

发明内容

本发明公开了一种通过HPLC法检测完全酶解的依诺肝素API和注射剂的二、四糖单元指纹图谱，并由此判断产品是否合格。为此，本发明提供一种用HPLC法检测依诺肝素酶解后的二糖和四糖含量的方法，所述方法包括下述步骤：

a、依诺肝素的完全酶解：向浓度为10-200mg/ml的依诺肝素溶液中，加入酶I∶酶II∶酶III＝8∶1∶2的混合酶溶液，室温下酶解48小时；

b、HPLC法分析：取降解产物做SAX-HPLC分析；

c、二、四糖单元种类和含量的计算：根据双糖和四糖的洗脱时间，确定依诺肝素二、四糖单元的种类和含量，计算其中8个双糖和1个四糖各自所占百分含量；

d、质量是否合格的判断：计算其中8个双糖和1个四糖各自所占百分含量，观察其含量是否符合正常范围，并由此判断试品依诺肝素质量是否合格。

其中，步骤a中所述对应于1mg降解底物的混合酶溶液用量为酶I∶酶II∶酶III＝0.3mIU∶0.75mIU∶1.5mIU。酶I，酶II，酶III分别代表：肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III，为现有技术产品，可以从市场上购买得到。

步骤a中所述的酶解，是将依诺肝素溶液，缓冲液B，肝素酶I溶液、肝素酶II溶液、肝素酶III溶液混合，放置48小时进行酶解，所述的依诺肝素为依诺肝素或依诺肝素钠盐。

步骤b中所述的HPLC法，其色谱条件如下：

检测器/波长	紫外检测器/234nm
		色谱柱	Waters Spherisorb S5-SAX，4.6mm×250mm×5μm
预柱	Waters Spherisorb SAX，4.6mm×10mm×5μm
		柱温	室温
流动相	洗提液A和洗提液B进行梯度洗脱
		流速	1.40ml/min
进样量	25μl
		采集时间	70min

洗脱采用梯度洗脱。

步骤d中所述8种双糖为：IV-S、II-A、III-A、II-S、III-S、I-A、I-S、IV-A。

1个四糖为：3-o-sulf。以上9种糖均为已知技术，其结构可以从手册上查到。

步骤d中所述8种双糖符合标准的含量范围分别是IV-S(1.67％±0.09％)、II-A(2.77％±0.15％)、III-A(1.06％±0.10％)、II-S(9.92％±0.30％)、III-S(5.44％±0.14％)、I-A(1.56％±0.07％)、I-S(60.66％±0.67％)、IV-A(1.67％±0.22％)，所述四糖3-o-sulf符合标准的含量范围是(5.04％±0.32％)。以上标准的含量范围来源于表1。

表1为天道依诺肝素钠原料药三批、天道依诺肝素钠注射液一批、杭州九源基因工程有限公司的依诺肝素钠注射液一批、安万特在中国的依诺肝素钠注射液二批、安万特在美国销售注射液三批冻干品、安万特在中国销售注射液三批冻干品等分析图谱和各双糖种类、含量统计分析表。

附图说明：

图1为三批合格依诺肝素产品的HPLC图。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1：

a、依诺肝素的完全酶解步骤中溶液的配制：

缓冲液A的配制：称取136mg的磷酸二氢钾，用约40ml的超纯水溶解后，加入50ml的丙三醇，用1mol/Ld的氢氧化钠溶液中和至pH为7，加入200mg的牛白蛋白，移到100ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀。得到10mM的磷酸二氢钾溶液。

缓冲液B的配制：移取0.57ml的冰醋酸于烧杯中，加入约80ml的超纯水，加入35mg的醋酸钙，并使之溶解。用1mol/L的氢氧化钠溶液中和至pH为7，加入100mg的牛白蛋白。移到100ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀。得到100mM的醋酸钠溶液。

肝素酶溶液的配制：根据肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III的装量，用缓冲液A将肝素酶稀释到1.5IU/ml。保存在≤-20℃的冰箱中。

肝素双糖标准溶液的配制：用超纯水将每个肝素双糖的冻干粉稀释到约1mg/ml的浓度。将双糖标准溶液各取20μl于200μl的内插管中，混匀。此内插管保存在≤-20℃的冰箱中。

依诺肝素钠样品溶液的配制：精密称取50mg的依诺肝素钠样品于洁净试管中，加入2.5ml的超纯水溶解，混匀。

8.5％的磷酸溶液的配制：移取8.5ml的磷酸，加入91.5ml的水，混匀，即得。

洗提液A的配制：称取780mg的磷酸二氢钠溶于约1800ml的注射用水中，用8.5％的磷酸调节pH到2.9，加水至2000ml。用0.22μm的滤膜过滤，即得2.5mMol/L pH为2.9的磷酸二氢钠溶液。

洗提液B的配制：称取140.7g的一水合高氯酸钠溶于约800ml的注射用水中，加入390mg的磷酸二氢钠，用8.5％的磷酸调节pH到3.0，加水至1000ml。用0.22μm的滤膜过滤，即得1.0Mol/L pH为3.0的高氯酸钠溶液。

b、依诺肝素的完全酶解

于离心管中依次加入20μl的依诺肝素钠样品溶液，80μl的缓冲液B和16μl肝素酶I溶液、2μl肝素酶II溶液、4μl肝素酶III溶液，并搅拌彻底。室温下酶解48小时。酶解后移取62μl的酶解液于内插管中，

C、取降解产物做SAX-HPLC分析；采用以下高效液相色谱仪，

色谱条件：

项目	名称/指标
		检测器/波长	紫外检测器/234nm
色谱柱	Waters Spherisorb S5-SAX，4.6mm×250mm×5μm
		预柱	Waters Spherisorb SAX，4.6mm×10mm×5μm
柱温	室温
		流动相	洗提液A和洗提液B进行梯度洗脱
流速	1.40ml/min
		进样量	25μl
采集时间	70min

洗脱梯度表

时间(min)	流速(ml/min)	洗提液A％	洗提液B％	Curve
					0	1.4	97	3	——
40	1.4	40	60	6
					60	1.4	20	80	6
70	1.4	97	3	1

系统平衡好后，先分析标准双糖溶液，判断各双糖峰之间的分离度是否≥1.5。若分离度≥1.5，才可进样分析。进样顺序为：

序号	样品名
		1	标准双糖溶液
2	样品的酶解液

数据处理：

双糖和四糖的洗脱顺序如下表：

双糖～四糖	保留时间(分钟)	分子量
			IV-A(red)	4.5	401
峰1(连接区域)(red)	11.0	734
			IV-Sgal(red)	11.9	461
IV-S(red)	12.2	461
			II-A(red)	13.7	503
双糖1+2(1，6-anhydro结构)	15.2	443
			III-A(red)	16.0	503
II-Sgal(red)	16.4	563
			II-S(red)	18.0	563
III-S(red)	21.5	563
			I-A(red)	25.0	605
双糖3(1，6-anhydro结构)	26.4	545
			峰2	29.5	1066
I-S(red)	29.9	665
			峰3(四糖3-O-Sulf)	35.0	965
四糖1(1，6-anhydro结构)	43.3	1210

含量计算：

双糖或四糖组分的摩尔百分含量＝峰面积/∑面积

d、计算得到的8个双糖和1个四糖各自所占百分含量，观察其含量是否符合正常范围，并由此判断试品依诺肝素质量是否合格。符合为合格，不符合为不合格。

表1：酶解后各成份的百分含量和批间差异分析表：

- 40110230、40110240、40110250、Clasina4011CC101202分别为天道依诺肝素钠四个批次产品；亿喏佳20100901为杭州九源基因工程有限公司的依诺肝素钠一个批次产品；克赛24311、24209和DTC7237、DTC7140、DTC7244为安万特在中国销售的依诺肝素钠五个批次产品；DTU1741、DTU1742、DTU1748为安万特在美国销售依诺肝素钠三个批次产品。

Claims

1.一种用HPLC法检测依诺肝素酶解后的二糖和四糖含量的方法，所述方法包括下述步骤：

b、HPLC法分析：取降解产物做SAX-HPLC分析；

c、二、四糖单元种类和含量的计算：根据现有的标准双糖和四糖的洗脱时间，确定供试品二、四糖单元的种类和含量，计算其中8个双糖和1个四糖各自所占百分含量；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中所述对应于1mg降解底物的混合酶溶液用量为酶I∶酶II∶酶III＝0.3mIU∶0.75mIU∶1.5mIU。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中所述酶I，酶II，酶III分别代表：肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中所述的酶解，是将依诺肝素溶液，缓冲液B，肝素酶I溶液、肝素酶II溶液、肝素酶III溶液混合，放置48小时进行酶解。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中所述的HPLC法，其色谱条件如下：

检测器/波长紫外检测器/234nm 色谱柱 Waters Spherisorb S5-SAX，4.6mm×250mm×5μm 预柱 Waters Spherisorb SAX，4.6mm×10mm×5μm 柱温室温流动相洗提液A和洗提液B进行梯度洗脱流速 1.40ml/min 进样量 25μl 采集时间 70min

洗脱采用梯度洗脱。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤d中所述8种双糖为：IV-S、 II-A、III-A、II-S、III-S、I-A、I-S、IV-A；1个四糖为：3-o-sulf。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤d中所述8种双糖含量范围分别是IV-S(1.67％±0.09％)、II-A(2.77％±0.15％)、III-A(1.06％±0.10％)、II-S(9.92％±0.30％)、III-S(5.44％±0.14％)、I-A(1.56％±0.07％)、I-S(60.66％±0.67％)、IV-A(1.67％±0.22％)，四糖3-o-sulf含量范围是(5.04％±0.32％)。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：双糖和四糖的洗脱顺序如下表：

双糖～四糖保留时间(分钟) 分子量 IV-A(red) 4.5 401 峰1(连接区域)(red) 11.0 734 IV-Sgal(red) 11.9 461 IV-S(red) 12.2 461 II-A(red) 13.7 503 双糖1+2(1，6-anhydro结构) 15.2 443 III-A(red) 16.0 503 II-Sgal(red) 16.4 563 II-S(red) 18.0 563 III-S(red) 21.5 563 I-A(red) 25.0 605 双糖3(1，6-anhydro结构) 26.4 545 峰2 29.5 1066 I-S(red) 29.9 665 峰3(四糖3-O-Sulf) 35.0 965 四糖1(1，6-anhydro结构) 43.3 1210