KR101113729B1 - 항생제 내성균에 대한 항균 효과를 갖는 중분자량의 키토산의 제조 방법 및 이러한 키토산의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인체 및 환경 친화적인 방법을 통하여 그람 양성 세균, 특히 항생제에 내성을 갖는 황색포도상 구균 등에 대하여 높은 항균 효과를 갖는 중분자량의 키토산 당을 제조하는 방법을 제안한다. 본 발명에서는 산 용액에 용해된 키토산 고분자를 맥아 추출액을 사용하여 가수분해시킨 뒤에 고분자 물질을 제거하는 공정을 통해서 인체 및 환경에 대한 친화성은 물론이고 특히 항생제 내성인 그람 양성 세균에 대한 항균 효과가 월등히 개선되어 질병 예방 및 치료 효과가 크게 기대된다.

키토산, 맥아 추출효소액, 항균 활성, 메타실린-내성 황색포도상구균(MRSA), 녹농균

Description

항생제 내성균에 대한 항균 효과를 갖는 중분자량의 키토산의 제조 방법 및 이러한 키토산의 용도{Process for Preparation of Middle Molecular Chitosan Having Antibacterial Activity against Antibiotic Resistance Bacteria and Uses thereof}

본 발명은 키토산을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체 및 환경 친화적이면서도 제조 공정에서의 코스트를 절감하여 경제성을 향상시킴과 동시에 그람-양성 세균은 물론이고 그람-음성 세균을 포함하며, 특히 항생제 내성인 세균에 대한 항균 효과가 현저하게 개선된 중분자량의 키토산당을 제조하는 방법 및 이와 같은 방법으로 얻어진 키토산당의 용도에 관한 것이다.

키토산의 제조 원료가 되는 키틴은 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetly-D-glucosamine)이 β-1,4 결합한 다당류인 폴리-β-1,4-N-아세틸-D-글루코사민(poly-β-1,4-N-acetyl-D-glucosamine)로서, 새우 등의 갑각류의 껍질이나 곤충류의 표피, 버섯, 균류의 세포벽 등에 널리 분포되어 있는 천연 고분자 물질이며, 생명체 의 지지와 방호 역할을 담당하는 다당류이다. 이러한 키틴은 자연계에 널리 분포되어 있는 다당류인데, 용매에 녹지 않는 불용성이라는 한계로 인하여 그 이용이 저조하였다. 키틴은 셀룰로즈와 유사한 구조를 가지는 곁사슬이 없는 매우 긴 사슬구조의 고분자 물질로 2번 탄소에 수산화기(-OH) 대신에 아세틸아미노기(-NHCOCH₃)가 치환되어 있다. 이와 같이 키틴이 최근 천연자원으로 각광을 받고 있는 셀룰로오스와 유사한 구조를 갖는다는 점에서 기능성 고분자 소재, 생분해성 소재 등에서 관심이 고조되고 있다.

한편, 키토산(chitosan)은 전술한 키틴의 2번 탄소의 아미노기에 연결된 아세틸기를 탈아세틸화하여 얻어진다. 즉, 통상적으로 키틴을 고온의 알칼리 용액(예를 들어 진한 수산화나트륨 용액)에 반응시켜 탈아세틸화 처리에 의하여 키토산이 제조되는데, 1,4-글루코시드 결합으로 연결된 2-아미노-2-데옥시-β-D- 글루코피라노스 (2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose)와 2-아세트아미드-2- 데옥시-β-D-글루코피라노스(2-acetamido-2-deoxy-β-Dglucopyranose)를 함유하는 다당류이다. 이때, 키틴에 대한 탈아세틸화 처리시의 반응온도, 반응시간, 수산화나트륨 농도에 따라 각각 다른 탈아세틸화도의 키토산이 얻을 수 있다.

이 과정에서 많은 유리 양이온을 지닐 수 있기 때문에 다양한 생리 활성을 가지고 있다. 한편, 키토산을 물이나 알코올에는 용해되지 않고 묽은 포름산, 초산, 젖산, 아스코르부산과 같은 유기산 또는 묽은 염산과 같은 무기산에 용해되므로 산성식품에 첨가가 가능하다.

이와 관련하여 탈아세틸화가 75~85%인 키토산은 모발에 흡착되어 보습 효과를 가지고 있어 화장품 분야라든가 폐수용 응집제/중금속 이온 흡착/염료 폐수 정화제 등으로 응용되고 있고, 탈아세틸화가 85~90%인 키토산은 토양 개량제/식물 병충해 방지제/서방성 농약 등에 응용되고 있으며, 탈아세틸화가 90~95%인 키토산은 항균/방취/정전기 방지/수축 방지/염색성 향상 등의 기능이 있어서 섬유 분야에 응용되는 것은 물론이고 콜레스테롤 저하/연화제/서방성 조제/항암제/혈압 조정제/면역 기능 활성화/약물 전달체 등의 기능 및 효과가 있어서 식품 및 의약품 등에 널리 활용되고 있다.

특히, 천연 유래의 항균제 중에서 대표적인 것이 키토산이며, 이것으로 처리된 섬유나 필름은 항균, 방취 및 보습효과 등 복합적인 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 키토산은 자체의 독성이 비교적 낮고 생분해성이기 때문에 의약학 분야에서의 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 최근의 연구에 따르면 키토산은 위의 제산작용은 물론(조지연 등, 키토산의 제산력 평가, 한국키틴키토산학회지, 8(4), 2003, pp. 202~206), 혈청 또는 간에서의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 저하 효과(Furda, I. (1990). Interaction of dietary fiber with lipids - mechanic theories and their limitations. In New Developments in Dietary Fiber, pp. 67-82. New York: Plenum Press; Ikeda, I., Sugano, M., Yoshida, K., Sasaki, E., Iwamoto, Y. & Hatano, K. (1993) Effects of chitosan hydrolysates on lipid absorption and on serum and liver lipid concentrations in rats, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 41, pp. 431-435; Razdan, A. & Pettersson, D. (1994). Effect of chitin and chitosan on nutrient digestibility and plasma lipid concentrations in broiler chickens, British Journal of Nutrition, 72, pp. 277-288), 항암 효과(류병호, 새우 껍질에서 추출한 키토산의 항암 및 면역 활성, 한국식품영양과학회지, 21(2), 1992, pp. 154~162) 등 다양한 생리적 활성을 가지고 있다.

키토산이 가지고 있는 다양한 활성 효과를 근거로 이에 대한 부가가치를 높이기 위하여 공중합결합체, 계면활성제, 페놀계 등의 유기계 화합물과 은이나 동 등을 함유하는 무기계 화합물이 첨가되어 사용되어 왔다. 그렇지만, 최근에는 환경문제가 없고 인체에 무해한 천연 유래의 항균제가 개발되면서 이들에 대한 수요가 증가하고 있는데, 이와 관련해서 키틴 및/또는 키토산에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

하지만, 고분자량의 키틴이나 키토산은 용매, 특히 물에 대한 용해도가 낮기 때문에 특히 물에 용해되는 수용성 키토산을 얻기 위한 방안이 모색되고 있는데, 이러한 방안으로는 크게 ⅰ) 수용성 작용기를 갖는 키토산 유도체를 합성하는 방법과 ⅱ) 고분자량의 키토산을 분해하여 예를 들어 키토산 올리고당(chitosan oligosaccharide)과 같은 수용성 키토산당으로 분해하는 방법을 들 수 있다.

우선, 첫 번째 방법과 관련해서는 단위체 키토산의 C-2 위치에 존재하는 아민을 다른 화합물로 치환하거나 아민염의 형태로 제조하여 수용성의 상태가 되도록 하는 것인데, 키토산이 가지는 특유의 아민기의 특성이 저하되는 문제점이 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위해서 예를 들어 키토산 단위체의 C-6 위치에 디에틸아미노에틸 치환기를 도입한 키토산 유도체를 합성하거나(Chun-Ho Kim et al., synthesis an Antibacterial Activity of Water-Soluble Chitin Derivatives, Polymers for Advanced Technologies, vol. 8, pp. 319-325, 1996), 키토산 올리고당의 유기산/무기산 염의 용액에 트리알킬 아민으로 처리하여 수용성 유리 아민의 키토산을 제조하거나(대한민국등록특허 제441270호), 특정 화학식을 갖는 아졸 유도체를 사용하여 키토산 유도체를 제조하였다(대한민국등록특허 제702221호).

그런데 수용성 개선을 위하여 별개의 치환기를 반응시켜 키토산 유도체를 얻기 위한 공정은 번거로울 뿐만 아니라, 분자량이 저하되지 않음으로 인하여 키토산 특유의 항균 효과를 최대한 얻기에는 한계가 있고, 경우에 따라서는 물에 용해되었을 경우의 pH 수준이 생리학적 조건과 차이가 있어서 생체의료용과 같은 의학적 용도로 사용되기에 한계가 존재한다.

특히 고분자 형태의 키토산은 입체 장애가 커서 사용 용도가 한정될 뿐만 아니라 피부 투과성에 있어서 문제가 있어서 생물학적 활성을 크게 기대할 수 없다는 점을 고려해 볼 때 이러한 방법은 키토산의 생물학적 용도로서의 활용을 크게 제한하게 된다.

특히, 현재까지 보고되고 있는 연구결과에 의하면, 일반적으로 키틴이나 키토산의 항균 능력은 고분자량의 것보다는 올리고머에 해당하는 저분자량 (특히, 수평균중합도 6～10에 해당하는 것)의 것이 우수하다고 알려져 있다. 이에, 이들 저분자 올리고당 수득을 위하여 염산, 불화수소, 과산화수소, 과산화붕산 및 아질산과 같은 산을 이용한 산-분해법이나 알칼리로 키틴 및/또는 키토산을 처리하여 저-분자량의 키토산을 얻는 화학적 처리 방법이 제안되었으나, 이러한 화학적 처리 방법은 취급이 어렵고 제조된 수용성 키토산의 수율이 저하될 뿐만 아니라 특히 생리 활성이 기대되는 적절한 크기의 키토산당의 함량이 극히 낮아서 적절한 분자량을 갖는 키토산당을 얻기에는 많은 문제가 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위해서 산-분해 과정에서 초음파 조사(ultrasound irradiation)를 병행하는 등의 방법이 제안되었으나 이러한 방법은 제조 코스트를 증가시키는 문제점이 있고, 여전히 원하는 크기의 키토산당을 얻기 위해서는 별도의 여과 공정을 수행하여야 하는 등의 문제를 피할 수 없다.

이러한 화학적 처리 방법을 대신하여 키토산 분해 특이적 효소(키토산 분해효소, chitosanase, Aspergillus sp. Bacillus sp. 등이 분비하는 β-1,4-gluoside 결합을 분해하는 chitosanase)나 비-특이적 효소(셀룰로오스 분해효소인 셀룰라아제(cellulase)나 라이소자임(lysozyme) 등)를 이용하여 저분자당 형태의 키토산을 효율적으로 생산하는 방법을 추구하고 있다.

하지만, 대부분의 키틴분해효소에 의하여 처리되어 얻어진 키토산당은 항균 효과가 거의 없을 뿐만 아니라, 이러한 효소적 처리 방법에서는 불순물 형태로 존재하는 염을 적극적으로 제거할 필요가 없으며, 특히 최종적으로 생성된 키토산이 초저분자량으로 변환되어 오히려 항균성이 저해되고 저-농도로만 생성된다는 문제점이 있다. 더욱이 수용성 키토산을 얻기 위하여 고가의 효소를 사용하여야 하는 것은 제조 코스트와 관련해서 명백하게 문제가 있으며 이에 따라 종래의 효소적 처리 방법으로 특히 항균성이 뛰어난 수용성 키토산을 산업적인 수준으로 얻기에는 많은 한계가 있다.

따라서 제조 공정에 있어서 비용 절감 효과를 누리면서 별도의 추가적인 공정을 필요로 하지 않으면서도 특정 크기의 분자량 획득을 위한 종래의 고가의 여러 효소들을 사용하는 것은 제한적이다. 특히, 중분자당 또는 저분자당의 키토산을 제조하기 위하여 사용된 여러 단백질 효소들의 부적절한 정제 과정 등으로 인해 포함될 경우 제거 과정이 필요하며, 여러 공정상의 어려움이 있으며 인체에 대한 안정성 검토 역시 필요하다. 아울러, 일부 논문에 따르면 저분자 키토산 올리고당은 고분자 키토산에 비해 항균 활성이 떨어져 고분자상태의 키토산을 이용한 항균 활력에 대한 논고를 하였으나, 고분자 키토산이 비수용성인 관계로 다소 이용에 많은 문제점들이 지적되고 있다(Joao C. Fernandes et al., Antimicrobial effects of chitosans and chitooligosaccharides, upon Staphylococcus aureus and Escherichia coli, in food model system, Food Microbiology, 25(2008), pp. 922-928).

따라서, 제조 공정에서 코스트를 절감하는 한편 적절한 크기로 분해됨으로써 의약품 원료로서는 물론이고 화장품, 식품, 의료 소재로서도 산업적으로도 널리 활용될 수 있는 수용성의 중분자당 형태의 키토산을 제조하는 공정 내지는 방법을 개발할 필요성은 여전히 남아 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있도록 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 항균성이 크게 개선되어, 예를 들어 항생제 내성인 세균을 포함하는 그람-양성 세균 및 경우에 따라서는 그람-음성 세균에 대해서도 탁월한 항균 효과를 발휘하는 중분자당의 키토산을 제조하는 방법 및 이러한 방법에 따라 얻어진 키토산의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 제조 과정에서 고가의 효소를 사용할 필요가 없어서 제조 공정의 경제성이 크게 개선된 중분자당 키토산을 제조하는 방법 및 그 용도에 관한 것이다.

결국, 본 발명의 기본적인 목적은 합성화합물이 아닌 천연물로부터 항균력이 높은 신소재를 개발하여 식품, 의약품, 화장품 등에서의 다기능성 방부제로서 품질의 안전성과 안정성을 높이고 사람을 포함한 가금류 및 동물에서의 다기능성 항균제로서 안전하고 내성이 유발되지 않는 질병의 치료 및 예방을 위한 소재를 제조하고자 하는 것이다.

본 발명의 궁극적인 목적은 항균력을 갖는 것으로 알려진 천연고분자 키토산으로부터 우리나라 고유 전통음식소재 유래 맥아(엿기름) 추출효소액을 이용하여 키토산과 효소반응 시켜 수득하는 고 항균성 키토산으로서 중분자당의 당의 제조에 관한 것이다. 또한 본 발명의 또 다른 목적은 종래의 항균제를 대체하여 새로운 기능성의 고-항균제를 제조하는 것이다.

본 발명의 다른 이점 및 목적은 후술하는 발명의 상세한 설명 및 첨부하는 도면을 통해서 더욱 분명해질 것이다.

상기와 같은 목적을 갖는 본 발명의 일 관점에 따르면, 탈아세틸화도가 70 ~ 99%인 키토산의 산성 수용액에 맥아 효소 추출액을 1:1 ~ 1:3의 부피비로 첨가함으로써 상기 키토산을 가수분해하여 분자량 60,000 ~ 450,000의 중분자량 키토산 수용액을 얻는 단계; 상기 얻어진 키토산 수용액을 투석 처리하여 불용성 물질을 제거하는 단계를 포함하는 항균 효과를 갖는 중분자량 키토산당을 제조하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 투석 처리 이후에 상기 중분자량 키토산당을 멸균수에 현탁시킨 뒤에 유기산을 가하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 중분자량 키토산당은 항생제 내성인 황색포도상구균(MRSA)과 같은 그람-양성 세균은 물론이고 그람-음성 세균에 대해서도 항균 효과를 갖는다.

투석 단계에서 상기 중분자량의 키토산은 상기 멸균수에 0.1 ~ 2.0 중량%(w/v)가 되도록 현탁되며, 상기 유기산은 젖산으로서 5.0 ~ 100 mM의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 키토산 산성 수용액을 얻기 위하여 초산, 젖산, 프로피온산, 포름산, 아스코르부산, 주석산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 유기산에 상기 키토산이 0.2 ~ 2.0 중량%의 비율로 용해되며, 상기 가수분해 단계는 25 ~ 65℃의 온도에서 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 전술한 방법이나 공정에 따라 제조된 중분자당의 키토산을 세균의 성장 억제를 위하여 사용하는 방법을 제안한다.

이때, 상기 중분자량 키토산당은 20 ~ 300 ㎍/㎖의 농도, 바람직하게는 30 ~ 60 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있으며, 특히 항생제 내성인 세균에 대해서도 탁월한 항균 효과를 발휘한다.

본 발명에서는 환경 친화적인 식물성 성분인 맥아로부터 얻어진 효소추출액을 사용하여 간단한 방법으로 산-처리된 키토산 용액에 가하여 가수분해한 뒤, 불용성 성분을 제거하는 방법으로 중분자량의 키토산당을 제조하였다.

본 발명에 따르면 고가의 가수분해효소를 사용하지 않고, 식물 추출물인 맥아 효소추출물을 사용함으로써 제조 공정의 코스트를 크게 줄일 수 있으면서도 특히 항생제 내성인 세균에 대해서도 강력한 항균 효과를 갖는다.

본 발명의 키토산 중분자당 제조방법은 전통발효음식 유래 효소추출액과 천 연고분자 키토산을 이용하는 방법으로 동물 또는 사람에게도 매우 안정성이 높고, 특히 농양이나 창상감염 등의 피부감염, 아토피, 골관절염, 폐렴, 패혈증, 독소 쇼크증후군 등의 원인균인 MRSA에 대한 고 항균력으로 질병 예방 및 치료에 이용가치가 매우 높다.

또한 그람 음성 세균인 Psedomonas aeruginosa 에 대해서는 80% 이상의 높은 항균활성을 갖기 위해서는 MRSA에 비해 약 10배 정도의 높은 농도를 필요로 하지만, 본 발명에서 제조한 중분자당 키토산(MMC-P1, MMC-P2)은 천연고분자 키토산을 고유전통음식소재로 이용되는 맥아(엿기름) 추출효소액을 이용하는 친환경적, 그리고 부작용이 적을 것으로 예상되는 생체 친화적 바이오 소재로서 천연물 유래 항균제로서의 특징을 갖는다.

본 발명은 기본적으로 탈아세틸화가 진행된 고분자의 키토산의 산 용액에 소정 비율의 맥아(엿기름) 효소 추출액을 사용하여 종래 시판중이거나 합성된 키토산고 비교할 때 항균력이 크게 개선된 중분자당의 키토산을 제조하는 방법 및 그 용도에 관한 것이다.

본 발명자들은 적절한 탈아세틸화도를 가지는 고분자량의 키토산의 산성 용액에 맥아(엿기름)에서 유래된 효소추출액을 소정의 비율로 혼합하여 가수분해한 뒤에 투석 처리와 같은 간단한 분리 공정을 통하여 현재 상업적으로 시판중이거나 종래 보고되었던 키토산당과 비교할 때 항균 효과가 크게 개선된 중분자량의 키토 산당을 얻을 수 있다는 점을 발견하고 본 발명을 완성하였는바, 이하에서는 본 발명에 따른 제조 공정에 대해서 상세하게 설명한다.

1878년 독일의 Koch가 처음으로 화농염증 검체에서 발견한 포도상구균 (Staphylococcus spp.) 은 그람-양성 구균으로 사람의 피부와 구강인후 점막에 상재 분포하는 균으로, 여기에는 S. epidermidis, S. homins, S. haemolyticus 등의 아종이 있다. 그 중 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 catalase test 양성, 그리고 coagulase 양성인 종으로, 농양(abscesses), 종기(furuncle), 봉와직염(cellulitis folliculitis), 창상감염(carbuncles) 등의 피부감염은 물론이고 골관절염(osteoarthritis), 폐렴, 뇌막염(meningitis), 골수염(osteomyelitis), 심장 내막염(endocarditis), 패혈증(septicemia), 독소쇼크증후군(toxic shock syndrome) 등과 같은 위협적인 질병의 원인균이다.

황색포도상구균은 건강한 사람의 피부에서도 일상적으로 검출되며 40~50%가 건강인의 비강에서 검출되는 가장 흔한 병원성 세균으로 전파력이 강하다. 만일 음식물에서 증식한다면, '엔테로톡신(enterotoxin)'이란 독소를 만들어 식중독을 일으킨다. 과학자들은 가열을 하면 황색포도상구균은 죽지만 독소는 죽지 않아 구토나 설사 등을 일으킨다고 보고되고 있다. 지금까지 황색포도상구균으로 인한 질병은 '메티실린(methicillin)'이나 '반코마이신(vancomycin)' 등의 항생제로 치료되었으나, 최근 들어 이들 항생제에 대해서 내성을 보이는 변종들이 등장하면서 더욱 치료를 어렵게 만들고 있다.

한편, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 그람-음성의 호기성, 구상(rod-shaped) 세균으로서, 특히 인간을 포함한 동물의 면역 기능을 약화시켜 염증이나 패혈증을 야기하며 특히 폐나 신장과 같은 기관에 감염되었을 경우에는 심각한 결과가 초래될 수 있다. 녹농균에 대한 치료를 위해서 아미노글리코사이드류(aminoglycosides), 퀴놀론계(quinolones), 카르복실계페닐리신(carboypenicillins) 등의 항생제가 사용되고 있으나, 녹농균은 항생제에 대한 민감도(antibiotic susceptibility)가 극히 낮아 녹농균에 의한 처리에 많은 어려움을 겪고 있는 실정이다.

특히, 1990년대 초 페니실린 대체 항생제로 개발된 '현존하는 최고의 항생제'라 찬사를 받던 반코마이신에 내성을 보이는 황색포도상구균(Vancomycin resistant Staphylococcus aureus, VRSA)이 첫 출현한 뒤 미국과 일본 프랑스 등지에서 잇달아 VRSA가 관찰된 사례가 보고되었으며, 1999년 6월에는 국내에도 등장했다. 항생제 남용 및 오용에 따른 다양한 내성균주가 나타나서 감염증 치료를 위해 병원에서는 고단위의 항생제를 사용, 결국 악순환의 고리를 형성하고 있어 원인균의 내성 및 항생제 잔류문제는 공중보간 뿐 만 아니라 사회적으로 중요한 문제로 대두되고 있다. 전 세계적으로 메티실린에 내성을 갖는 황색포도상구균(Methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)나 VRSA 등에 의한 감염을 예방하거나 치료를 위하여 여러 항생제를 복합적으로 이용하거나 반코마이신을 사용하고 있으나, 항생제 내성 세균의 출현으로 천연물 유래 항생치료제 개발이 시급 한 실정이다.

최근 항생제에 대한 감수성을 높이기 위해 대체물질과의 혼합사용 또는 항균 펩타이드 이용 등의 많은 연구가 시도되고 있으나, 항균 펩타이드는 항균성만을 나타내는 제한성 및 경제적 대량생산 방법 등의 문제가 대두되고 있다.

이러한 대체 혼합물질들의 이용에 있어서 안정성 검토는 신중히 수행되어야 하며, 식품, 의약품, 화장품 등의 산패에 의한 경제 손실이 막대하고, 또한 사람에게까지 큰 영향을 줄 수 있어 전통고유 음식이나 천연소재 유래 항균효과를 검토할 필요가 있다.

한편, 키토산은 천연 염기성 고분자 다당류로서 산업적 이용 가치 뿐 만 아니라, 여러 미생물에 대한 항균 효과, 면역증강, 혈압강하, 간 기능 개선 및 해독작용 등이 알려져 그 응용이 크게 확대되어가고 있으며, 각종 식품첨가물, 천염물 농약, 화장품원료 등으로 이용되고 있다. 그러나 키토산의 이러한 다양한 생리활성을 갖고 있음에도 불구하고 항균제로서의 실질적 이용이나 개발은 매우 미진하다. 그 이유로는, 생물종 다양성에 따른 키토산의 항균 스펙트럼, 그리고 분자량 크기 등의 제한성 때문일 것으로 추측되는데, 현재까지 항균 효과가 보고된 키토산은 고가의 효소를 사용하고 있어서 공정 코스트와 관련해서 문제가 있어서 산업적인 규모로 발전시키기에는 많은 문제가 있었다.

이에, 본 발명자들은 전술한 종래 기술의 문제점을 해소하기 위하여 고-기능성 항균제로서 이용가능한 중분자량 키토산 당을 효율적으로 생산하는 방법을 제안 한다. 이와 관련해서, 본 명세서에서 '중분자량의 키토산당', '중분자량의 키토산', '중분자당의 키토산'이라는 용어는 중합도가 350 ~ 4,250 정도로서, 그 분자량은 바람직하게는 60,000 ~ 450,000 정도를 갖는 키토산당을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 따라 우수한 항균 효과를 갖는 중분자당의 키토산을 제조하는 공정은 다음과 같다. 우선 탈아세틸화도가 70~99%인 키토산을 산성 수용액에 용해시킨다. 이때, 만약 탈아세틸화도가 70% 미만인 고분자의 키토산을 사용하는 경우에는 최종적으로 얻어지는 중분자당의 키토산 수율이 저하될 수 있으므로 탈아세틸화도가 70% 이상인 키토산을 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 최종적으로 항균 효과가 크게 개선된 중분자당의 키토산을 얻기 위하여 사용된 고분자의 키토산을 용해시키기 위하여 사용되는 산으로는 아세트산(초산), 젖산, 프로피온산, 포름산, 아스코르부산, 주석산과 같은 유기산을 사용하는 것이 바람직하며, 최초 출발물질로 사용되는 탈아세틸화도가 70~99%인 고분자당 형태로서 키토산은 바람직하게는 유기산이며, 특히 바람직하게는 0.1 ~ 0.5 몰농도의 젖산 또는 아세트산인 산 용액에 0.2 ~ 2.0 중량%의 비율로 고분자량의 키토산을 배합하여 용해시키는 것이 후술하는 맥아 효소추출물을 이용하여 높은 점성을 갖는 키토산의 가수분해에 있어서 유리하다.

전술한 방법을 통하여 고분자량의 키토산이 용해되어 있는 산 용액으로 맥 아(엿기름) 효소추출액을 소정의 비율로 배합하여 키토산을 가수분해시켜 항균 효과가 양호한 중분자량의 키토산당을 얻을 수 있다. 맥아는 엿기름이라고도 불리는 것으로 한국에서는 고추장, 된장, 식혜와 같은 고유의 전통음식의 제조를 위한 추출효소액으로 사용되고 있다.

맥아 효소추출액을 얻기 위해서는 건조, 파쇄된 맥아를 정량하고 정량된 맥아 중량에 이온정제수나 완충액을 이용하여 20 ~ 60℃의 온도에서 잘 저어가며 처리한 뒤에 원심분리하여 수용성 당 성분 및 효소가 혼합된 상층액을 수득하고, 효소원만을 얻기 위해서 일정 분자량 크기의 물질이 빠져나가는 투석막 또는 별도의 필터링 수단을 이용하여 일정 크기 이상의 효소원만을 함유하는 맥아 유래의 효소추출액을 얻을 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면 1-kDa 이상의 효소원만을 취득하기 위한 투석 처리를 수행하였다. 구체적으로 본 발명의 실시예에서는 10-kDa 이하의 저분자량의 물질을 통과시키는 셀룰로오스 투석용의 멤브레인을 사용하고, 효소추출을 위하여 사용한 완충 용액에 완충액에 대해 4℃로 설정된 인큐베이터 안에서 맥아 유래의 효소추출액: 투석액 = 1 : 100 ~ 1 : 500 (본 발명의 실시예에서는 1 : 200)의 비율로 하여 투석하고, 얻어진 효소액을 키토산 가수분해에 이용하였으나, 본 발명이 꼭 이에 한정되는 것은 결코 아니다.

일반적으로 맥아 효소추출액에는 키틴아제(kitinase), 아밀라아제(amylase), 셀룰로오스 분해효소(cellulase), 헤이셀룰라아제(hemicellulase) 등이 함유되어 있다고 알려져 있으나, 키토산 분해 효과는 전혀 보고되지 않았다. 놀랍게도, 본 발명자들의 연구에 따르면, 전술한 방법에 따라 유기산에 용해되어 있는 키토산의 산 용액에 맥아 효소추출물을 소정의 비율로 배합하여 가수분해한 중분자당의 키토산의 항균 효과가 시판 중인 키토산과 비교해서 탁월한 항균 효과를 얻을 수 있다.

이때 추출 조효소인 맥아 유래의 효소추출액을 얻기 위하여 첨가된 이온정제수 또는 PBS나 Tris-HCl과 같은 완충 용액 등의 '효소 추출 용액'에 대하여 맥아는 1 ~ 20%, 바람직하게는 5 ~ 10%의 비율로 배합되는 것이 바람직하다. 만약 맥아의 함량이 전술한 비율 미만이거나 전술한 비율을 초과하는 경우에는 맥아를 팽윤시켜 수용성의 효소추출액을 얻는데 어려움이 있을 수 있다. 본 발명의 실시예에 따라 효소 추출액 부피 대비 약 5% 중량비의 맥아를 배합하여 얻어진 맥아 효소추출액의 단백질 정량값은 0.08 ~ 0.1 ㎍/㎕로서 유기산에 용해되어 있는 바람직하게는 0.2 ~ 2.0 중량% 키토산의 산성 수용액과의 반응에서 항균 효과가 양호한 중분자당의 키토산을 얻는데 적합하다.

한편, 키토산의 산성 수용액에 대하여 맥아 유래의 효소추출액을 첨가하여 중분자당의 키토산으로 가수분해하는 단계에서 전술한 방법에 따라 얻어진 맥아 유래의 효소추출액의 혼합 비율이나 가수분해 시간 및 온도를 고려하여 항균 효과가 우수한 중분자당의 키토산을 얻을 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 키토산 산성 수용액에 대하여 맥아 유래의 효소추출액은 바람직하게는 1:1 ~ 1:3의 비율로 혼합되는 경우에 수용성이 향상됨과 동시에 항균력이 양호한 중분자당의 키토산을 얻을 수 있다.

만약, 키토산의 산 용액에 대한 맥아 유래의 효소추출액의 배합 비율이 전술한 비율인 1:1 미만인 경우에는 수용성이 떨어져서 산업적으로 응용하는데 문제가 있을 뿐만 아니라 희석 배율이 높아짐에 따라 가수분해 반응 종료 후의 후속 처리 공정에서 상당한 에너지 손실로 이어질 수 있고, 전술한 비율인 1:3을 초과하는 경우에는 항균성이 저하될 수 있을 뿐만 아니라, 불필요한 사전 작업 및 에너지 사용은 물론이고 고농도의 효소추출액 사용으로 인한 부작용의 우려가 있을 수 있기 때문이다.

아울러, 본 발명에 따라 0.2 ~ 2.0%의 키토산 산성 수용액에 대하여 전술한 배합 비율의 맥아 유래의 효소추출액을 이용한 가수분해 단계에서 가수분해 활성을 위해서 25 ~ 65℃의 온도에서 6 ~ 12 시간 동안 수행하면 가수분해 산물인 중분자당의 키토산이 갖는 항균 효과가 극대화 될 수 있는 것으로 확인되었다.

한편, 전술한 고분자량의 키토산을 산성 수용액에 용해시키고 맥아 유래의 효소추출액에 배합하는 가수분해 반응을 통해서도 항균 효과가 탁월한 중분자당의 키토산을 얻을 수 있으나, 원하는 분자량을 갖는 키토산을 고농도로 획득하기 위해서는 반응액에 대한 투석 처리를 수행하여 변성된 단백질이라든가 극단적으로 작은 분자량의 키토산을 제거하는 것이 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 1-kDa 미만의 물질 제거를 위하여 투석 처리를 위해서 상온에서 12시간 수행한 뒤 121℃에서 15분 동안 수행하였으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니라 할 것이다.

한편, 전술한 방법을 통하여 제조된 중분자당의 키토산에 대한 항균 효과를 측정하기 위해서 중분자당 키토산을 예를 들어 0.1 ~ 2.0%의 비율로 멸균수에 현탁, 고정하고, 분자량 크기에 따른 수용화 정도를 고려하여 균일한 중분자당 키토산의 수용액을 얻기 위하여 젖산/초산과 같이 고분자량 키토산을 용해시키기 위하여 사용되었던, 바람직하게는 유기산에 5 ~ 100 mM, 바람직하게는 5 ~ 50 mM의 농도로 첨가하여 사용한다. 계속해서 키토산의 완전한 용해를 위하여 상온에서 교반한 뒤에 불용성의 물질을 원심분리하여 제거한 뒤에 사용될 수 있다.

이하, 본 발명에 대한 바람직한 실시예에 대해서 기술한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 결코 아니다.

실시예 1 : 중분자량 키토산당의 제조

5g의 키토산 (탈아세틸화도 90.5%, 평균 분자량 250만 Da)을 중량비로 1.0 % 되도록 2% 초산에 넣어 5 시간 동안 교반하여 키토산수용액을 제조하였다. 상기와 동일한 방법으로 불용성 또는 불필요 혼합물 제거를 위해 원심분리하여 제거하여 수용액을 얻었다.

이어서, 키토산 가수분해에 이용되는 맥아 추출효소액은 일반적으로 시판되는 엿기름(사임당 식품 (주), 한국)을 이용하였다. 효소추출액을 만들기 위해 중량 단위로 약 1~20% 정도로 하였으며, 효소추출액 제조를 위해 사용되는 물은 멸균한 2~3차 증류수를 이용하며, 필요에 따라 효소의 안정을 위해 통상 사용되는 10 ~ 50 mM Tris-HCl( pH 7.0 ~ 8.0) 또는 10 ~ 50 mM 인산완충액을 이용하여 추출 가능하다. 구체적으로 효소추출액 제조를 위해 3 g의 엿기름을 정량하고, 30 ㎖의 20 mM Tris-HCl( pH 7.2) 완충 용액을 이용하여 4 ℃ 배양기에서 10 ~ 12 시간 동안 천천히 진탕하면서 효소 혼합액을 추출하였다. 추출한 조효소액을 취하기 위해 30 분간 원심분리 (3,000 x g)를 하고 상층액을 취하였다. 이어서, 전술한 완충 용액에 대하여 4 ℃로 설정된 인큐베이터 안에서 효소추출액 : 투석액 = 1 : 200의 비율로 하여 투석하여 얻어진 효소액을 키토산 가수분해에 이용하였다.

효소반응을 위해 사전에 섭씨 45℃로 온도를 조절하여 두고, 여기에 실시예 1에서 얻은 엿기름 효소추출액을 첨가하여 키토산 수용액의 부피비로 1:3의 비율로 점가하고, 45℃에서 12 시간동안 가수분해 반응시켜 부분 가수분해된 키토산 중분자당을 얻었다. 반응 종료 후 반응액을 다시 상기 기술한 바와 같이 실시예 1, 2 와 동일한 방법으로 분자량 1-kDa이하의 물질 제거를 위해 투석을 48 시간 수행하여 얻어진 물질을 섭씨 121 ℃ 에서 15분간 감압 멸균하여 변성된 단백질들을 제거하였다.

이때 얻어진 키토산 중분자당의 평균 분자량은 약 63,000 Da으로 측정되었다. 분자량 측정은 여러 분자량 크기의 dextran을 표준물질(Dextrans [(43,000, 71,327, 188,000, 464,336, 2,000,000 Da (Sigma, USA)])로 하여 size-fractionation HPLC를 이용하여 측정하였다. 수득한 키토산 가수분해 산물을 섭씨 -80℃ 냉동고에서 동결 혹은 액체 질소를 이용하여 급속 동결 시킨 후, 동결건조기를 이용하여 건조시켜 약 4.5 g의 키토산 중분자당(이하, 본 실시예에 따라 제조된 중분자당 키토산을 'MMC-P1'으로 약칭)을 수득하였다.

실시예 2 : 중분자량 키토산당의 제조

5g의 키토산(탈아세틸화도 90.5%, 평균 분자량 280만 Da)을 중량비로 1.0 % 되도록 2% 초산에 넣어 2 시간 동안 교반하여 키토산수용액을 제조하였다. 불용성 또는 불필요 혼합물을 제거하기 위하여 원심분리하고 이들 성분을 제거한 뒤 키토산 산성 수용액을 얻었다.

효소반응을 위해 사전에 섭씨 37도로 온도를 조절하여 두고, 여기에 실시예 1에서 제조한 엿기름 추출효소액을 첨가하여 키토산 수용액의 부피비로 1:1 점가하고, 37℃에서 12 시간동안 가수분해 반응시켜 부분 가수분해된 키토산 중분자당을 얻었다. 반응 종료 후 반응액을 다시 상기 기술한 바와 같이 실시예 1과 동일한 방법으로 분자량 1-kDa이하의 물질 제거를 위해 투석을 20 시간 수행하여 얻어진 물질을 섭씨 121 ℃에서 15분간 감압 멸균하여 변성된 단백질들을 제거하였다. 이때 얻어진 키토산 중분자당의 평균 분자량은 약 450,000Da 으로 측정되었다. 분자량 측정은 여러 분자량 크기의 dextran 을 표준물질로 하여 size-fractionation HPLC를 이용하여 측정하였다. 수득한 키토산 가수분해 산물을 섭씨 -80℃ 냉동고에서 동결 혹은 액체 질소를 이용하여 급속 동결 시킨 후, 동결건조기를 이용하여 건조 시켜 약 4.3 g의 키토산 중분자당((이하, 본 실시예에 따라 제조된 중분자당 키토산을 'MMC-P2'로 약칭)을 수득하였다.

비교실시예 : 고분자량 키토산당 제조

5 g의 고분자량 키토산(분자량 10,000 ~ 250,000 kDa, 탈아세틸화도 97.5%, 태훈 바이오, 한국)을 중량비로 0.5%가 되도록 1% 초산에 넣어 2시간 동안 교반하여 키토산 수용액을 제조하였다. 불용성 성분 또는 불필요한 혼합물을 제거하기 위하여 얻어진 수용액을 원심분리하여 이들을 제거하여 키토산 산성 수용액을 제조하였다.

효소반응을 위해 사전에 섭씨 37℃로 온도를 조절하여 두고, 실시예 1에서 제조한 투석한 엿기름 추출효소액을 부피비로 키토산: 추출효소액=2:1 비율로 첨가하여 37℃에서 6 시간동안 가수분해 반응시켜 부분 가수분해된 키토산 중분자당을 얻었다.

반응 종료 후 반응액을 다시 상기 기술한 바와 같이 분자량 1-kDa이하의 물질 제거를 위해 투석을 실온에서 12시간 수행, 얻어진 물질을 섭씨 121 도에서 15분간 감압 멸균하여 변성된 단백질들을 제거하였다. 이때 얻어진 키토산 중분자당의 평균 분자량은 약 804,000 Da으로 측정되었으며, 분자량 측정은 여러 분자량 크기의 dextran을 표준물질 Dextrans [(43,000, 71,327, 188,000, 464,336, 2,000,000 Da (Sigma) ]로 하여 size-fractionation HPLC (Dionex, USA) 를 이용하여 측정하였다. 수득한 키토산 가수분해 산물을 섭씨 -80℃ 냉동고에서 동결 혹은 액체 질소를 이용하여 급속 동결 시킨 후, 동결건조기를 이용하여 완전 건조시켜 약 4.4 g의 키토산 중분자당을 수득하였다.

실험예 1 : 항균력 시험

본 발명에 따라 제조된 키토산 용액의 항균력을 확인하기 위하여, 가수분해 이전의 고분자 키토산과 상기 실시예 1, 2에서 얻어진 중분자량 키토산당, 비교실시예에서 제조한 고분자당 키토산을 각각 1 중량%(w/v)가 되도록 멸균수에 현탁시켰다. 이때 분자량 크기에 따라 수용화 정도에 차이가 있어, 보다 균일한 수용액을 만들기 위해 최소량의 젖산을 첨가하여 농도가 5~100 mM 되도록 하였으며, 희석산의 농도로는 50 mM 정도가 가장 적합하였다. 비교실시예를 통하여 제조된 고분자량(800,000 Da)의 키토산당은 저 농도의 산에 용해되지 않아서 항균 효과에 사용될 수 없었다. 이후 실온에서 1 시간 동안 더 교반시켜가면서 녹여 고분자 키토산 및 중분자당 수용액을 제조하였으며, 이때 불용성의 물질은 원심분리하여 제거하였다. 이것을 이용하여 항균력 시험을 실시하였다.

여기에 이용된 균주는 그람 양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, 균주 번호 CCARM 3230)과 그람 음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, 균주 번호 CCARM 2171이었으며, 이하 각각의 균체 수는 1 x 10⁵ (CPU/ ㎖)로 하여 실험을 수행하였다.

항균력 시험은 단일 콜로니를 Oxacilline 또는 ampcillin/kanamycine (Sigma, USA)을 50 ㎍/㎖ 포함하는 3 ㎖ MH 액체배지에 하룻밤 진탕배양하고(37℃), 새로운 액체 배지에 각각의 전배양액 0.5 ㎖를 4.5 ㎖ 배지에 넣고, 여기에 실시예 1에서 제조된 키토산 중분자당 (63-kDa, MMC-P1 및 450-Kda, MMC-P2)과 의 농도를 0~200 ㎍/㎖로 되도록 하여 첨가하고, 12시간 동안 섭씨 37도에서 진탕배양하여 대조구(희석산만을 사용)에 대하여 흡광도 600 nm에서 50.0% 생육저지효과를 보이는 키토산 중분자당의 농도를 하기의 표 1에 기술하였다.

표 1. 중분자량 키토산의 50% 생육저지 농도

	50% 생육저지 키토산 중분자당 농도(㎍/㎖)
	황색포도상구균	녹농균
MMC-P1	20	100
MMC-P2	20	100

상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 본 발명의 키토산 중분자당 함유 수용액은 그람-양성 세균(황색포도상구균)은 물론, 그람- 음성 세균(녹농균)에 대해서도 우수한 항균력을 나타냄을 알 수 있다. 한편, 황색포도상구균에 대하여 본 발명에서 제조, 합성된 중분자당 키토산의 처리에 따른 생육 곡선은 도 1a에, 녹농균에 대하여 본 발명에서 제조, 합성된 키토산 중분자당의 처리에 따른 생육 고선은 도 1b에 도시되어 있다.

도 1a 도시된 것처럼, 그람-양성 세균인 황색포도상구구균에 대하여 99.99%의 생육 저지 효과를 얻기 위해서는 MMC-P1이 30 ~ 60 ㎍/㎖ 정도면 충분하고, 도 1b에 도시된 것처럼 그람-음성 세균인 녹농균에 대해서 200 ~ 300 ㎍/㎖의 농도의 MMC-P1에 의하여 약 84%의 생육저지 효과를 얻었다. 따라서, 본 발명에 따라 합성된 MMC-P1의 항균 활성은 그람 양성균 (Gram-positive)에 더 큰 항균효과를 보이는 것으로 밝혀졌으며, 다소 낮은 항균활성을 보였으나 같은 농도에서의 MMC-P1은 그람 음성균 (Gram-negative) 에 대해서도 탁월한 항균 효과를 보이고 있음을 확인하였다.

실험예 2. 종이디스크 상의 항균활성 실험

본 실험예에서는 고체상의 0.5% agar 배지에서 종이디스크 상의 항균물질 활성을 실험하였다. 실험예 1에서 사용된 상기의 두 균주를 각각 배양하여 2중층의 agar 배지 쓰일 0.5% agar 배지 (45℃로 조절)에 배양 부피비로 1: 10으로 하여 배양 균주를 넣고 잘 섞어 agar 2중층으로 한 뒤, 굳을 때까지 기다려 배양균액이 골고루 섞인 2중층 agar 위에 지름 0.6cm 종이디스크를 올려두었다. 여기에 미리 준비한 키토산 중분자당 수용액과 고분자 키토산(>19,000 kDa)을 여러 농도로 스며들게 한 뒤, 37℃ 배양기에서 1-3일간 배양하였다. 이때 나타나는 MRSA에 대한 항균 효과는 종이디스크 주변으로 clear zone이 형성되어 항균효과를 확인할 수 있다.

본 실시예에 따라 분석한 항균 효과 결과가 도 2에 표시되어 있다. 도시된 것처럼, MRSA에 대하여 본 발명에 따라 제조된 중분자당 키토산(MMC-P1)은 저-농도 20 ㎍/㎖에서도 탁월한 항균 효과를 보이고 있으나, 고분자 키토산은 액체 배양시에만 약간의 항균효과를 보일 뿐 Paper disc assay에서는 항균효과를 보이지 않다는 점을 확인, 입증하였다.

실험예 3. 저분자, 중분자 항균력 비교실험

항균력 비교실험은 MRSA의 단일 콜로니를 항생제인 Oxacilline 50 ㎍/㎖ 포함하는 3 ㎖ MH 액체배지에 하룻밤 진탕배양하고(37℃), 새로운 액체배지에 각각의 전배양액 0.5 ㎖를 4.5 ㎖ 배지에 넣고 (균체수 1.2 x 10⁵ /㎖), 여기에 본 발명의 실시예 1에서 제조한 키토산 중분자당 (63-kDa, MMC-P1), 실시예 2에서 제조한 키토산 중분자당 (450-Kda, MMC-P2), 고분자량의 천연 키토산(>19,000 kDa, 이하 'CTN'으로 약칭), 미국 시그마(Sigma)사로부터 구입한 저분자당 키토산)(Low-molecular-weight chitosan, 이하, 'LMWC'로 약칭, 20,000 cps), 그리고 중분자당 키토산(Medium-molecular-weight chitosan, 이하, 'MMWC'로 약칭, 200,000 cps)의 농도를 각각 30 ㎍/㎖로 되도록 하여 첨가하고, 0-24 시간 동안 37℃에서 진탕배양하여 대조구(저농도 젖산만 투여)에 대비한 생육저지효과를 비교 분석하였다.

본 실험예에 따른 결과가 도 3에 표시되어 있다. 무첨가 대조구, 50 mM 젖산, 그리고 고분자 키토산(>19,000 -kDa)의 경우는 전형적인 생물생장곡선을 보여 24 시간 배양기간 동안에도 MRSA의 생육저지를 유도하지 못하는 반면, Sigma 사로부터 구입한 저분자 (LMWC), 그리고 중분자 (MMWC)의 경우는 본 발명에서 제조한 MMC-P1과 유사한 생육저해 효과를 보였다.

하지만, 저분자당 키토산(LMWC)과 중분자당 키토산(MMWC)의 경우, 배양을 시작하여 6 시간 전후 어느 정도 MRSA의 생육이 확인된 반면, MMC-P1의 경우 MRSA의 배양 초기부터 배양시간 24 시간 경과까지 완전한 생육 저해 효과를 보여 Sigma 사 로부터 구입한 저분자당 키토산(LMWC), 그리고 중분자당 키토산(MMWC)에 비해 훨씬 안정적으로 높은 항균효과를 갖고 있음을 확인하였다.

한편, 도 4에서는 본 발명에 따라 제조된 중분자당 키토산(MMC-P1, MMC-P2)과 고분자량의 천연 키토산을 사용한 경우에, 그람-양성 세균인 메티실린-내성 황색포도상구균(MRSA)과 그람-음성 세균인 녹농균에 대한 상대적인 생육 억제율을 비교한 것으로, 본 발명에 따라 제조된 중분자당 키토산의 탁월한 항균 효과를 보여주고 있다.

도 3 및 도 4에서 표시한 분석 결과에서 알 수 있는 것처럼, 본 발명에서 제조된 중분자당 키토산인 MMC-P1 및 MMC-P2는 고분자 키토산에 비해 탁월하게 높은 항균효과를 보임으로서 키토산 분자량 크기와 항균효과간의 상관관계가 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명에서 제조한 MMC-P1 및 MMC-P2의 탁월한 항균효과는 질병 예방 및 치료에 이용가치가 매우 높을 것으로 사료된다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 기술하였으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야의 평균적 기술자라면 상술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다 할 것이다. 그러나 그러한 변형과 변경은 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부하는 청구의 범위를 통하여 더욱 분명해질 것이다.

도 1은 본 발명에 따라 제조된 중분자당 키토산(MMC-P1)의 농도에 따른 세균의 생육 곡선(growth curve)를 도시한 것으로, 도 1a는 그람-양성 세균인 황색포도상구균을 대상으로 한 것이고, 도 1b는 녹농균을 대상으로 한 것이다.

도 2는 본 발명에 따라 제조된 중분자당 키토산과 비교를 위하여 고분자 키토산을 사용하여 항생제-내성 황색포도상구균(MRSA)에 대하여 종이 디스크 상에서의 항균 활성을 분석한 사진이다.

도 3은 본 발명에 따라 제조된 중분자당 키토산(MMC-P1)과 비교예로서 천연 고분자량의 키토산, 현재 상업적으로 시판 중인 중분자당 키토산 및 저분자당 키토산을 사용하여 MRSA에 대한 생육저지 정도를 측정한 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따라 제조된 중분자당 키토산(MMC-P1, MMC-P2)과 비교예로서 천연 고분자량의 키토산을 사용한 경우에 항생제-내성 황색포도상구균과 녹농균에 대한 상대적인 생육 억제율을 비교한 그래프이다.

Claims (10)

1. 탈아세틸화도가 70 ~ 99%인 키토산이 용해된 산성 수용액에 맥아 효소 추출액을 1:1 ~ 1:3의 부피비로 첨가함으로써 상기 키토산을 가수분해하여 분자량 60,000 ~ 450,000의 중분자량 키토산 수용액을 얻는 단계;

   상기 얻어진 키토산 수용액을 투석 처리하여 불용성 물질을 제거하는 단계를 포함하는 항균 효과를 갖는 중분자량 키토산당을 제조하는 방법.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 투석 처리 이후에 상기 중분자량 키토산당을 멸균수에 현탁시킨 뒤에 유기산을 가하는 단계를 더욱 포함하는 중분자량 키토산당을 제조하는 방법.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 중분자량 키토산당은 그람-양성 세균에 대하여 항균 효과를 갖는 키토산당을 제조하는 방법.
4. 제 2항에 있어서,

   상기 중분자량 키토산당은 상기 멸균수에 0.1 ~ 2.0 중량%(w/v)가 되도록 현탁되며, 상기 유기산은 젖산으로서 5.0 ~ 100 mM의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 중분자량 키토산당을 제조하는 방법.
5. 제 3항에 있어서,

   상기 중분자량 키토산당은 항생제 내성 황색포도상구균(MRSA)에 대하여 항균 효과를 갖는 중분자량 키토산당을 제조하는 방법.
6. 제 1항에 있어서,

   상기 키토산이 용해된 산성 수용액을 얻기 위하여 초산, 젖산, 프로피온산, 포름산, 아스코르부산 및 주석산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 유기산에 상기 키토산이 0.2 ~ 2.0 중량%의 비율로 용해되며, 상기 가수분해 단계는 25 ~ 65℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 중분자량 키토산당을 제조하는 방법.
7. 제 3항에 있어서,

   상기 중분자량 키토산당은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대하여 항균 효과를 갖는 중분자량 키토산당을 제조하는 방법.
8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,

   상기 중분자량 키토산당은 그람-음성 세균에 대하여 항균 효과를 갖는 중분자량 키토산당을 제조하는 방법.
9. 제 8항에 있어서,

   상기 중분자량 키토산당은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 대하여 항균 효과를 갖는 중분자량 키토산당을 제조하는 방법.
10. 삭제

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