KR20110056346A - 고순도의 의료용 히아루론산의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히아루론산 및 그의 염 정제 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 원심분리, 분리여과, 유기용매, 크로마토그래피 등의 복잡하고 고비용의 공정 사용 없이 단백질, 핵산 및 금속성 불순물, 발열성 물질을 매우 효율적으로 제거하여 경제적이고 효율적으로 의료용 히아루론산을 얻어내는 방법에 관한 것이다.

히아루론산, 고순도, 정제

Description

고순도의 의료용 히아루론산의 제조 방법 { Processing for Medical Hylaronic Acid }

히아루론산(Hyaluronic Acid)은 생체 내에 존재하는 글리코스아미노글리칸의 일종인 산성 뮤코 다당류로서, D-글루콘산과 N-아세틸글루코스아민이 (1-3)과 (1-4)로 동일 반복 분자구조를 가지는 분자량 1,000Da~10kDa의 범위의 매우 높은 점성과 탄성을 지닌다. 히아루론산은 피부, 눈의 초자체, 관절액, 탯줄 등의 신체의 모든 부위에 존재하며 신체의 각 부위에서 여러 가지 특성을 보여주는 물질이다. 몸의 움직임을 원활하게 하는 윤활작용, 생리 활성물질들의 이동을 주관하며 세포와의 특이한 작용에 의해 세포의 분화 및 성장을 유도하는 중개자 역할, 세포외 기질에서는 콜라겐, 엘라스틴, 황산콘드로이틴 등의 조직을 지탱하게 하는 단백질과 당 단백질들의 지지체 역할을 하며, 수분 함유 능력이 뛰어나고 점섬과 탄성이 좋은 생체 고분자이다. 이러한 특성들로 인해 히아루론산은 노령화에 따른 퇴행성 관절염의 치료 및 통증완화 치료제로서 사용되고, 안과 수술시 수술 보조재 및 안구 건조증 약물의 주성분으로 사용되기도 하며 또한 주름 및 함몰된 피부조직의 보완에도 사용되고 등 성형 보조재의 주원료로서 주목받고 있다. 이러한 의료용 히아루론산은 미생물을 발효(스트렙토코커스속 등의 박테리아)시키거나 동물성 조직(닭벼슬, 소의 안구 등)에서 추출하거나 그 산물을 회수하는 방법으로 얻을 수 있다.

미생물을 발효하거나 동물성 조직에서 추출하면 지질, 단백질, 핵산, 콘드로이친 설페이트, 글리칸 설페이트, 금속성 불순물, 발열성 물질 등이 포함된 히아루론산 혼합액을 얻을 수 있다. 이와 같은 혼합액에서 고순도의 의료용 히아루론산을 얻기 위해서 혼합액의 불용성 물질을 제거하는 원심분리법, 원심분리로 해결되지 않는 미세입자들을 제거하는 여과법, 특정 유효 성분의 용해도를 이용하여 정제하는 침전법, 특정 유효성분의 분자량 및 전위차를 이용하여 정제하는 전기영동법, 특정 성분의 전위차, 활성, 부위, 분자량, 친수성 유무 등의 차를 이용하여 정제하는 크로마토그래피법, 용매를 이용하여 정제하는 용매추출법 등이 이용된다.

미국 특허 제4,782,046호에는 알콜 침전 과정을 통한 정제 방법, 미국특허 제4,141,933호에는 클로로포름을 사용하여 pH 6 ~7에서 단백질 및 미확인된 염증원인 물질을 제거하여 정제하는 방법, 미국 특허 제4,517,296호에는 유기용매로 침전과정을 수회 반복하여 정제하는 방법, 미국 특허 제4,784,990호에는 염화세틸 피리디늄 침전 과정을 수회 반복하여 정제하는 방법, 유럽특허 제01238572호에는 한외 여과막을 사용하여 정제하는 방법, 국제특허 WO9200861호는 사급 암모늄염 및 유기용매, 이온교환수지, 염화세틸피리디늄, 침전법을 사용하는 정제방법이 사용되었다.

하지만 통상적인 정제 방법은 처리 과정들이 매우 복잡하고 생산 원가를 상승시키며 염증원의 원인인 발열성 물질(Endoxin)을 완전하게 제거하기 어려운 문제가 있다.

본 발명은 천연물 또는 미생물로 생산된 히아루론산을 이용하여 고순도, 즉 의료용 히아루론산을 제조하는 방법에 관한 것으로 복잡한 과정을 거쳐서 정제하는 방법을 배제하고 매우 경제적이고 단순한 과정으로 핵산, 단백질, 지질 및 가장 중요한 발열성 물질(Endoxin)을 완전하게 제거하는 것이다. 또한 본 발명은 미생물 유래 히아루론산 뿐 만 아니라 동물 유래 히아루론산을 의료용으로 정제할 수 있는 방법이다.

본 발명은 퇴행성 관절염의 치료 및 통증완화 치료제, 안과 수술 보조재 및 안구 건조증 약물의 주성분, 주름 및 함몰된 피부조직 보완용 성형 보조재의 주원료로 사용되는 의료용 히아루론산의 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 천연물 또는 미생물로 얻어진 저순도의 히아루론산을 이용하여 (1) 히아루론산 수용액과 무기염류를 포함하는 수용액과 반응시켜 정제하는 단계, (2) 침전물을 여과하는 단계, (3) 무기염류 및 발열성 물질을 제거하는 단계, (4) 상기 단계를 여과한 후 침전시켜 정제하는 단계를 제공한다.

히아루론산 수용액과 무기염류를 포함하는 수용액과 반응시켜 정제하는 단계에서는 히아루론산의 농도를 0.1g ~ 10g/Liter로 하는 것이 좋으며 3 ~ 5g/Liter의 농도가 가장 바람직하다. 히아루론산의 농도가 너무 낮으면 처리 효율이 떨어지고 농도가 높으면 점도가 높아져 혼합이 어려워진다. 무기염류를 포함하는 수용액은 질산칼슘 수화물, 제이인산암모늄, 수산화칼륨의 농도의 합이 10mM ~ 0.1M이 되도록 첨가하여 제조한다. 무기염류의 농도의 합은 30mM ~ 100mM이 가장 바람직하다. 제조된 히아루론산 수용액과 무기염류를 포함하는 수용액을 혼합하여 1 ~ 24시간동안 반응시킨다. 히아루론산 수용액과 무기염류를 포함하는 수용액의 혼합비는 0.5 ~ 10으로 하며 혼합비 0.5 ~ 2가 가장 바람직하다. 또한 반응 시간 동안 혼합 수용액의 pH가 6.0 ~ 8.0이 되도록 한다. 가장 바람직하게는 6 ~ 10시간동안 pH 7.0 ~ 7.5가 되도록 하는 것이다. 본 단계에서는 혼합 후 교반하면서 무기염류가 서로 반응하여 아파타이트라는 침전물을 생성시키며 히아루론산 수용액에 포함되어 있는 단백질, 핵산, 발열성 물질(Endoxin)을 물리.화학적으로 흡착하여 제거시키는 효과가 있다. 또한 본 단계에서는 활성탄을 단독으로 처리할 경우 제거되지 않는 잔류(residual) 단백질을 효과적으로 제거할 수 있다. 또한 혼합 용액의 pH를 유지시키기 위해 수산화칼륨 수용액을 첨가하거나, 혼합 수용액의 온도를 40~50도가 되도록 하여 수행하는 것도 무방하다.

침전물을 여과하는 단계에서는 상기 단계에서 매우 미립자의 침전물이 생성되었기 때문에 침전물이 생성된 혼합 수용액을 5㎛, 1㎛, 0.2㎛의 기공을 갖는 여과지 순으로 여과하여 투명한 수용액을 얻는다.

무기염류 및 발열성 물질을 제거하는 단계에서는 입상의 활성탄을 150 ~ 1000도에서 열처리하며 가장 바람직한 열처리온도는 200 ~ 300도이다. 활성탄을 열처리하는 이유로 활성탄의 경우 미세한 기공을 포함하고 있는 물질로 기공내에 쉽게 불순물이 발생할 수 있기 때문이며, 또한 생산과정에서 활성탄의 기공 내에 발생할 수 있 는 발열성 물질을 완전하게 제거하기 위해서이다. 활성탄의 첨가량이 많을 경우 불순물의 제거에는 효과적이나 비용이 많이 들고 수율이 낮아지는 문제가 있고, 첨가량이 적을 경우 불순물을 효과적으로 제거하지 못하는 문제점이 있다. 따라서 활성탄의 양은 0.01 ~ 3%가 좋으며 0.1 ~ 1%가 가장 바람직하다. 또한 활성탄과의 반응 전에 염화나트륨을 2 ~ 3M 첨가한다. 염화나트륨을 첨가하면 활성탄이 불순물을 잘 제거하고 에탄올 침전 시 균일한 히아루론산을 얻을 수 있다. 금속 이온이 함유된 의료용 주사제를 사용 시 염증 반응이 발생할 수 있으며 활성탄을 이용하면 이와 같은 금속 이온을 제거할 수 있다.

그리고 상기 단계를 거친 수용액을 여과한 후 침전시켜 정제하는 단계에서는 3㎛ 여과지로 여과를 한 후에 0.2㎛로 여과하여 얻은 투명한 수용액에서 95%의 에탄올을 사용하여 히아루론산을 침전시킨다. 침전시킨 히아루론산을 수거하여 동결건조하거나 감압 건조하여 정제된 고순도의 의료용 히아루론산을 얻을 수 있다.

의료용 히아루론산의 기준은 다음과 같다. 발열성 물질(Endoxin)의 경우 1mg/ml 농도로 녹이고 LAL Test 측정값이 0.05 IU/mg 이하, 단백질은 10mg/ml 농도로 녹이고 로리법 정량 시 0.1% 이하, 핵산은 100mg/30ml 농도로 녹이고 260nm에서 흡광도 측정시 0.5 이하이다. 금속류 불순물은 0.25g을 질산 1ml에 녹인 후 정제수로 10ml이 되도록 하고 유럽약전 원자흡광광도법Ⅱ(유럽약전 Sodium Hyaluronate 시험법 및 Bacterial Endotoxins)에 의해 측정한다.

본 발명은 통상의 분리 방법인 원심 분리, 유기산 침전, 여과, 유기 용매 처리 등 으로 다양한 공정으로 발생할 수 있는 폐수 발생이나 처리 비용의 증감과 같은 문제점을 해결할 수 있다. 본 발명에서는 간단하게 수용액의 상태에서 경제적인 비용으로 핵산, 단백질, 발열성 물질(Endoxin), 금속류 불순물 등을 정제하여 고순도의 히아루론산을 얻을 수 있다.

본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확하게 표현하기 위한 목적으로 기재될 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 >

저순도의 히아루론산을 1g을 정제수 1리터에 녹여 히아루론산 수용액을 제조한다. 5mM 질산칼슘수화물, 3mM 제이인산암모늄, 10mM 수산화칼륨이 되도록 정량하여 정제수 1리터에 용해시켜 무기염류로 이루어진 수용액을 제조한다. 두가지의 수용액을 혼합하여 6시간 동안 반응시킨다. 반응시키는 동안 수산화칼륨을 첨가하면서 혼합 용액의 pH를 7.5로 유지시킨다. 6시간 동안 반응시킨 후 5㎛, 1㎛, 0.2㎛의 여과지 순으로 필터하여 투명한 수용액 2리터를 얻는다. 2리터의 투명한 수용액에 3M이 되도록 염화나트륨을 첨가하고 교반하면서 250도에서 1시간동안 열처리한 활성탄을 100g 첨가하여 1시간동안 교반시킨다. 교반시킨 수용액을 3㎛, 0.2㎛ 필터 순으로 여과하여 투명한 수용액을 얻은 후 에탄올 6리터에 혼합하여 히아루론산을 침전시킨다. 침전된 히아루론산을 동결하여 건조시켜 고순도의 히아루론산을 얻는다.

< 실시예 2 >

저순도의 히아루론산을 10g을 정제수 1.5리터에 녹여 히아루론산 수용액을 제조한 다. 30mM 질산칼슘수화물, 15mM 제이인산암모늄, 5mM 수산화칼륨이 되도록 정량하여 정제수 1리터에 용해시켜 무기염류로 이루어진 수용액을 제조한다. 두가지의 수용액을 혼합하여 3시간 동안 반응시킨다. 또한 10mM의 수산화칼륨 수용액을 제조한다. 반응시키는 동안 10mM의 수산화칼륨 수용액을 첨가하면서 혼합 용액의 pH를 7.0로 유지시킨다. 3시간 동안 반응시킨 후 5㎛, 1㎛, 0.2㎛의 여과지 순으로 필터하여 투명한 수용액 2.5리터를 얻는다. 2.5리터의 투명한 수용액에 3M이 되도록 염화나트륨을 첨가하고 교반하면서 300도에서 30분 동안 열처리한 활성탄을 200g 첨가하여 3시간동안 교반시킨다. 교반시킨 수용액을 3㎛, 0.2㎛ 필터 순으로 여과하여 투명한 수용액을 얻은 후 에탄올 7.5리터에 혼합하여 히아루론산을 침전시킨다. 침전된 히아루론산을 동결하여 건조시켜 고순도의 히아루론산을 얻는다.

도 1은, 본 발명의 공정도를 나타내었다.

Claims (6)

1. 천연물 또는 미생물로부터 얻어진 저순도의 히아루론산을 이용하여

   (1) 히아루론산 수용액과 무기염류를 포함하는 수용액과 반응시켜 정제하는 단계,

   (2) 침전물을 여과하는 단계,

   (3) 무기염류 및 발열성 물질을 제거하는 단계,

   (4) 상기 단계를 여과한 후 침전, 건조시켜 정제하는 단계를 포함하여 이루어지는 히아루론산의 정제 방법
2. 제 1항에 있어서, 상기 (1)단계의 무기염류로 질산칼슘수화물, 제이인산암모늄, 수산화칼륨을 포함하는 히아루론산의 정제 방법
3. 제 2항에 있어서, 무기염류의 농도의 합이 10mM ~ 0.1M인 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제 방법
4. 제 1항에 있어서, 상기 (1)단계의 과정을 1 ~ 24시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제 방법
5. 제 4항에 있어서, 반응 시간 동안 수용액의 pH가 6.0 ~ 8.0이 되도록 유지시키는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제 방법
6. 제 1항에 있어서, 상기 (2)단계에서 150~1000도로 열처리한 활성탄을 이용하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 정제 방법

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