JP5713995B2 - ヒアルロン酸及び/又はその塩の精製方法 - Google Patents
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Description
本明細書における「ヒアルロン酸及び/又はその塩」と「ヒアルロン酸類」は同義であって、交換可能に使用され、遊離のヒアルロン酸、及び、本発明の目的を損なわない範囲で使用可能な任意のヒアルロン酸塩(これに限定されるものではないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩などの金属塩や、塩酸塩、リン酸塩、クエン酸塩などの酸付加物など)や水和物、それらの混合物を意味する。ここで、ヒアルロン酸とは、N−アセチル−D−グルコサミンとD−グルクロン酸とが結合した2糖単位がくりかえし連鎖してなる高分子量の多糖類をいい、各種塩は主にグルクロン酸部分が塩の形となったものをいう。ヒアルロン酸は、折り畳み可能な鎖部分と、D−グルクロン酸部分のカルボキシル基の負電荷の相互作用によって、空間に展開しやすく、これにより大量の水と結合してゲルを形成することができる。また、低濃度であっても、分子間力が強いため、比較的高い粘性を有する。このような作用から、例えば、関節の湿潤作用、皮膚の柔軟作用などを有し、生理的にもそれらの役割を担っている。
本明細書における「平均分子量」について、特記しない限り、ヒアルロン酸類の平均分子量を示す際は、粘度平均分子量のことをいう。粘度平均分子量は、当業者が通常行う方法により求めることができる。好ましくは、各国の薬局方等で一般的に用いられている測定方法により求めることができ、より好ましくは、日本薬局方で用いられている測定方法により求めることができる。一例としては、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムが本願発明に近い平均分子量(150万〜390万)を有すると期待される場合、これに限定されるものではないが、その平均分子量は、極限粘度[η]を用いて、次式により求めることができる。
発酵法により得られた発酵液を本発明の方法等に用いる場合には、既知の方法、例えば、遠心分離やろ過処理等で除菌した液を使用することが望ましい。場合によっては、アルコール等の水溶性有機溶媒を添加してヒアルロン酸を析出精製したものを使用してもよい。また、アルミナ等で処理したものを用いてもよい。
本発明は、これに限られるものではないが、例えば、以下の実施態様に関する。
ヒアルロン酸及び/又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸溶液を酸性側のpHに調製した後、限外ろ過膜にて透析処理することにより不純物を除去する工程を含む、ヒアルロン酸及び/又はその塩の精製方法。
限外ろ過膜の分画分子量と限外ろ過膜による透析処理時のpHとが以下の式
pH≦−5×10−5×(分画分子量)+4.4978
を満たす条件下で限外ろ過膜による透析処理が行われる、実施態様1に記載の方法。
限外ろ過膜の分画分子量が25000〜35000であり、透析処理時のpHが3.3以下である、実施態様1又は2に記載の方法。
前記限外ろ過膜の分画分子量が12000〜14000であり、透析処理時のpHが3.9以下である、実施態様1又は2に記載の方法。
前記限外ろ過膜の分画分子量が9000〜11000であり、透析処理時のpHが4.1以下である、実施態様1又は2に記載の方法。
前記限外ろ過膜の分画分子量が6000〜8000であり、透析処理時のpHが4.2以下である、実施態様1又は2に記載の方法。
前記限外ろ過膜の分画分子量が4000〜5000であり、透析処理時のpHが4.3以下である、実施態様1又は2に記載の方法。
前記限外ろ過膜が疎水性有機膜である、実施態様1ないし7の何れか一項に記載の方法。
前記処理のろ過方式がリバース方式である、実施態様1ないし8の何れか一項に記載の方法。
前記処理時の透過流速が、20〜50L/m2・hrである、実施態様1ないし9の何れか一項に記載の方法。
前記不純物が、菌体、タンパク質、核酸、低分子化合物、又はエンドトキシンを含む、実施態様1ないし10の何れか一項に記載の方法。
精製後の上記ヒアルロン酸及び/又はその塩の平均分子量が350万〜700万Daである、実施態様1ないし11の何れか一項に記載の方法。
前記ヒアルロン酸類溶液中のヒアルロン酸及び/又はその塩の濃度が1〜5g/Lである、実施態様1ないし12の何れか一項に記載の方法。
pH≦−5×10−5×(分画分子量)+4.4978
を満たす条件下で限外ろ過膜による透析処理が行うことにより、実質的にヒアルロン酸類を損失することなく精製することができる。上記の式を満たす限外ろ過膜の分画分子量と限外ろ過膜による透析処理時のpHとして、例えば分画分子量35000の限外ろ過膜ではpH2.7、分画分子量30000の限外ろ過膜ではpH3.0、分画分子量25000の限外ろ過膜ではpH3.3、分画分子量20000の限外ろ過膜ではpH3.5、分画分子量14000の限外ろ過膜ではpH3.8、分画分子量13000の限外ろ過膜ではpH3.9、分画分子量12000の限外ろ過膜ではpH3.9、分画分子量11000の限外ろ過膜ではpH4.0、分画分子量10000の限外ろ過膜ではpH4.0、分画分子量9000の限外ろ過膜ではpH4.1、分画分子量8000の限外ろ過膜ではpH4.1、分画分子量7000の限外ろ過膜ではpH4.2、分画分子量6000の限外ろ過膜ではpH4.2、分画分子量5000の限外ろ過膜ではpH4.3、分画分子量4000の限外ろ過膜ではpH4.3が挙げられる。
ここで、「実質的にヒアルロン酸類を損失することなく」とは、ヒアルロン酸類の損失率が3%以下(回収率が97%以上)となることをいう。
ストレプトコッカス・エキFM−100(微工研寄第9027号)を用いて培養した培養液45Lを純水で80Lに希釈し(ヒアルロン酸ナトリウム濃度2.0g/1)、遠心分離で菌体を除いた。得られた粗製ヒアルロン酸をpH2.9に調整した後、分画分子量30000材質ポリスルフォンの限外ろ過膜(Koch社製・PM−100)2m2にて透過流速30L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍希釈操作を繰り返し透析回数10回、リバース方式で処理した。得られた液80Lに食塩2.4kgを溶解し、pH7に調整後エタノール240Lで析出、エタノール8Lで洗浄し、40℃で真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表2に示す。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸をpH2.9に調整した後、分画分子量30000材質ポリエーテルスルフォンの限外ろ過膜(旭化成社製・FS−10)5m2にて透過流速30L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透祈回数11回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例1と同様に処理してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分折結果、及びヒアルロン酸回収率を表2に示す。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸をpH3.3に調整した後、分画分子量20000材質ポリスルフォンの限外ろ過膜(日東電工社製・NTU−3050)3m2にて透過流速30L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数8回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例1と同様に処理してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸ナトリウムの回収率を表2に示す。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸をpH2.9に調整した後、分画分子量30000材質ポリフッ化ビニリデンの限外ろ過膜(ローヌ・プラン社製・IRIS3065)5m2にて透過流速30L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数9回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例1と同様に処理してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸ナトリウムの回収率を表2に示す。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸をpH2.7に調整した後、分画分子量40000材質ポリエーテルスルフォンの限外ろ過膜(ダイセル化学工業社製・DUSO400)5m2にて透過流速30L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数11回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例1と同様に処理し、150gのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果、及びヒアルロン酸ナトリウムの回収率を表2に示す。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸をpH3.7に調整した後、分画分子量13000材質ポリスルフォンの限外ろ過膜(クラレ社製・MU−6303)5m2にて透過流速30L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数11回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例1と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸ナトリウムの回収率を表2に示す。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸をpH3.7に調整した後、分画分子量10000材質ポリスルフォンの限外ろ過膜(旭化成ケミカルズ社製・SLP−3053)4.5m2にて透過流速30L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数11回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例1と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸ナトリウムの回収率を表2に示す。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸をpH5.5に調整した後、分画分子量10000材質ポリスルフォンの疎水性限外ろ過膜(Koch社製・PM−10)2m2にて透過流速30L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍希釈操作を繰り返し透析回数15回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例1と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表2に示す。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸をpH3.6に調整した後、分画分子量20000材質酢酸セルロースの親水性限外ろ過膜(DDS社製・CA600PP)4.5m2にて透過流速30L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数10回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例1と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表2に示す。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸をpH3.3に調整した後、分画分子量20000材質酢酸ポリイミドの親水性限外ろ過膜(日東電工社製・NTU−4220)5m2にて透過流速30L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数9回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例1と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表2に示す。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸をpH3.7に調整した後、分画分子量13000材質酢酸ポリスルフォンの疎水性限外ろ過膜(クラレ社製・MU−6303)5m2にて透過流速5L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数11回、ワンパス方式で処理した。得られた液は実施例1と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表2に示す。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸をpH3.7に調整した後、分画分子量13000材質酢酸ポリスルフォンの疎水性限外ろ過膜(クラレ社製・MU−6303)5m2にて透過流速15L/m2・hr、容積比2倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数11回、バックフラッシュ方式で処理した。得られた液は実施例1と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表2に示す。
(1)核酸含量:0.1%ヒアルロン酸ナトリウムの260nmにおける吸光度を測定した。
(2)タンパク質含量:ヒアルロン酸ナトリウムを0.1N水酸化ナトリウムに溶解し、ローリー法で行った。
(3)乳酸:ヒアルロン酸ナトリウムを、0.1%の濃度に溶解し、L−LDH法にて行った。
(4)金属:ヒアルロン酸ナトリウムを、0.05%の濃度に8N硝酸に溶解し、ICP発光分光分析を行った。
(5)極限粘度:ヒアルロン酸ナトリウムを、0.02%の濃度に0.2M塩化ナトリウムに溶解し、30℃における極限粘度を測定した。
実施例1で用いた粗製ヒアルロン酸を、様々な分画分子量を有するポリスルフォンの疎水性限外ろ過膜を用いて以下の条件で精製し、限外ろ過時のpHとヒアルロン酸の回収率との関係を調べた。
HA溶液条件
HA濃度:2g/L
分子量:440万 (極限粘度:55dL/g)
ろ過条件
線速:1m/s
透過流速:30L/(m2・hr)
濃縮:2倍濃縮
温度:25℃
分画分子量30,000の限外ろ過膜を用いた場合
(式1)ヒアルロン酸類の損失率(%)=44.86×(限外ろ過時のpH)−131.79
(至適pH≦2.9)
分画分子量13,000の限外ろ過膜を用いた場合
(式2)ヒアルロン酸類の損失率(%)=40.84×(限外ろ過時のpH)−86.92
(至適pH≦3.7)
分画分子量10,000の限外ろ過膜を用いた場合
(式3)ヒアルロン酸類の損失率(%)=24.36×(限外ろ過時のpH)−97.19
(至適pH≦4.0)
分画分子量7,000の限外ろ過膜を用いた場合
(式4)ヒアルロン酸類の損失率(%)=7.09×(限外ろ過時のpH)−29.02
(至適pH≦4.1)
分画分子量5,000の限外ろ過膜を用いた場合
(式5)ヒアルロン酸類の損失率(%)=0.79×(限外ろ過時のpH)−2.01
(至適pH≦4.2)
(式6)ヒアルロン酸類の損失率が3%以下となるpH=−5×10−5×(分画分子量)+4.4978
式6を用いることで、限外ろ過膜の分画分子量に対する至適pHの上限を求めることができ、至適pHで限外ろ過膜による透析を行うことにより、損失率3%以下でヒアルロン酸類を精製することができる。
Claims (12)
- ヒアルロン酸及び/又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸溶液を酸性側のpHに調製した後、限外ろ過膜にて透析処理することにより不純物を除去する工程を含む、ヒアルロン酸及び/又はその塩の精製方法であって、
前記限外ろ過膜の分画分子量と限外ろ過膜による透析処理時のpHとが以下の式
pH≦−5×10 −5 ×(分画分子量)+4.4978
を満たす条件下で限外ろ過膜による透析処理が行われる、ヒアルロン酸及び/又はその塩の精製方法。 - 前記限外ろ過膜の分画分子量が25000〜35000であり、透析処理時のpHが3.3以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記限外ろ過膜の分画分子量が12000〜14000であり、透析処理時のpHが3.9以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記限外ろ過膜の分画分子量が9000〜11000であり、透析処理時のpHが4.1以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記限外ろ過膜の分画分子量が6000〜8000であり、透析処理時のpHが4.2以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記限外ろ過膜の分画分子量が4000〜5000であり、透析処理時のpHが4.3以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記限外ろ過膜が疎水性有機膜である、請求項1ないし6の何れか一項に記載の方法。
- 前記処理のろ過方式がリバース方式である、請求項1ないし7の何れか一項に記載の方法。
- 前記処理時の透過流速が、20〜50L/m2・hrである、請求項1ないし8の何れか一項に記載の方法。
- 前記不純物が、菌体、タンパク質、核酸、低分子化合物、又はエンドトキシンを含む、請求項1ないし9の何れか一項に記載の方法。
- 精製後の上記ヒアルロン酸及び/又はその塩の平均分子量が350万〜700万Daである、請求項1ないし10の何れか一項に記載の方法。
- 前記ヒアルロン酸類溶液中のヒアルロン酸及び/又はその塩の濃度が1〜5g/Lである、請求項1ないし11の何れか一項に記載の方法。
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