JPH11124401A - オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法 - Google Patents
オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法Info
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- JPH11124401A JPH11124401A JP30803497A JP30803497A JPH11124401A JP H11124401 A JPH11124401 A JP H11124401A JP 30803497 A JP30803497 A JP 30803497A JP 30803497 A JP30803497 A JP 30803497A JP H11124401 A JPH11124401 A JP H11124401A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】従来の方法に比べて遥かに単純な工程でかつ安
価に純度の高い分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸
（塩）を容易に製造する方法を提供する。 【解決手段】ヒアルロン酸（塩）の水溶液に、ヒアルロ
ン酸（塩）分解酵素を添加して温度５℃〜５０℃で該ヒ
アルロン酸（塩）を分解した後、分画分子量１万以下の
限外ろ過膜を用いて分解酵素と該分子量１万以下のオリ
ゴヒアルロン酸（塩）を分離し、該オリゴヒアルロン酸
（塩）の水溶液に、０．３モル／リットル以上になるよ
うに塩化ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムを添加し、
その後オリゴヒアルロン酸（塩）の水溶液の５〜１０倍
容量のエタノール等の貧溶媒に、該オリゴヒアルロン酸
（塩）の水溶液を添加して晶析することにより、高純度
オリゴヒアルロン酸（塩）を製造する。
価に純度の高い分子量１万以下のオリゴヒアルロン酸
（塩）を容易に製造する方法を提供する。 【解決手段】ヒアルロン酸（塩）の水溶液に、ヒアルロ
ン酸（塩）分解酵素を添加して温度５℃〜５０℃で該ヒ
アルロン酸（塩）を分解した後、分画分子量１万以下の
限外ろ過膜を用いて分解酵素と該分子量１万以下のオリ
ゴヒアルロン酸（塩）を分離し、該オリゴヒアルロン酸
（塩）の水溶液に、０．３モル／リットル以上になるよ
うに塩化ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムを添加し、
その後オリゴヒアルロン酸（塩）の水溶液の５〜１０倍
容量のエタノール等の貧溶媒に、該オリゴヒアルロン酸
（塩）の水溶液を添加して晶析することにより、高純度
オリゴヒアルロン酸（塩）を製造する。
Description
【発明の属する技術分野】本発明は、医薬、化粧品、食
品等に広範囲に利用されるオリゴヒアルロン酸もしくは
その塩（以下、これらを略称してオリゴヒアルロン酸
（塩）という）をヒアルロン酸分解能を有する酵素を用
いることでより簡便に、かつ迅速に製造する方法に関す
る。
品等に広範囲に利用されるオリゴヒアルロン酸もしくは
その塩（以下、これらを略称してオリゴヒアルロン酸
（塩）という）をヒアルロン酸分解能を有する酵素を用
いることでより簡便に、かつ迅速に製造する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】従来より、ヒアルロン酸もしくはその塩
（以下、これらを略称してヒアルロン酸（塩）という）
の製造は工業的には、主ににわとりのとさかから抽出す
る方法（抽出法）もしくはヒアルロン酸生産能を有する
微生物を培地に培養して該培養液より採取する方法（発
酵法）により行われている。得られるヒアルロン酸
（塩）の分子量は数百万から１万以下に至るまで種々の
ヒアルロン酸（塩）が製造されている。近年、低分子量
ヒアルロン酸（塩）については従来の分子量の物に比べ
高濃度で使用でき、ベトツキ感がないなどの特性を有す
ることが明らかとなり、また、糖の重合度で１０〜１４
糖の低分子量ヒアルロン酸（塩）に血管形成促進作用が
あることが報告されている。このため低分子量ヒアルロ
ン酸（塩）特にここでいう平均分子量１万以下のオリゴ
ヒアルロン酸（塩）の需要の増大が期待されている。
（以下、これらを略称してヒアルロン酸（塩）という）
の製造は工業的には、主ににわとりのとさかから抽出す
る方法（抽出法）もしくはヒアルロン酸生産能を有する
微生物を培地に培養して該培養液より採取する方法（発
酵法）により行われている。得られるヒアルロン酸
（塩）の分子量は数百万から１万以下に至るまで種々の
ヒアルロン酸（塩）が製造されている。近年、低分子量
ヒアルロン酸（塩）については従来の分子量の物に比べ
高濃度で使用でき、ベトツキ感がないなどの特性を有す
ることが明らかとなり、また、糖の重合度で１０〜１４
糖の低分子量ヒアルロン酸（塩）に血管形成促進作用が
あることが報告されている。このため低分子量ヒアルロ
ン酸（塩）特にここでいう平均分子量１万以下のオリゴ
ヒアルロン酸（塩）の需要の増大が期待されている。
【０００３】該低分子量ヒアルロン酸（塩）の製造法と
しては、ヒアルロン酸分解酵素を用いる方法（特開昭６
２−７９７９０公報）、酸、アルカリを用いる方法（特
開昭６３−５７６０２公報、特開平１−２６６１０２公
報）や次亜塩素酸などの酸化剤を用いる方法（特開平２
−２４５１９３公報）が提案されている。
しては、ヒアルロン酸分解酵素を用いる方法（特開昭６
２−７９７９０公報）、酸、アルカリを用いる方法（特
開昭６３−５７６０２公報、特開平１−２６６１０２公
報）や次亜塩素酸などの酸化剤を用いる方法（特開平２
−２４５１９３公報）が提案されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヒアル
ロン酸分解酵素を用いる場合、その酵素が高価格のため
製造コストが高くなり、また、生成物より該分解酵素を
除去する操作が煩雑であり、さらに反応制御が大変難し
い。酸、アルカリを使用する方法では、工業的には安価
に処理できるものの平均分子量１万以下のオリゴヒアル
ロン酸（塩）を製造する場合、過激な条件で尚かつ長時
間の処理が必要であり、変色も発生する。また、次亜塩
素酸などの酸化剤を用いる方法ではヒアルロン酸（塩）
を酸化的に分解するためにヒアルロン酸（塩）の還元末
端及び非還元末端に加水分解反応では発生しない新たな
化学構造の末端が生成し、医薬、化粧品、食品に使用す
る場合、問題となる。
ロン酸分解酵素を用いる場合、その酵素が高価格のため
製造コストが高くなり、また、生成物より該分解酵素を
除去する操作が煩雑であり、さらに反応制御が大変難し
い。酸、アルカリを使用する方法では、工業的には安価
に処理できるものの平均分子量１万以下のオリゴヒアル
ロン酸（塩）を製造する場合、過激な条件で尚かつ長時
間の処理が必要であり、変色も発生する。また、次亜塩
素酸などの酸化剤を用いる方法ではヒアルロン酸（塩）
を酸化的に分解するためにヒアルロン酸（塩）の還元末
端及び非還元末端に加水分解反応では発生しない新たな
化学構造の末端が生成し、医薬、化粧品、食品に使用す
る場合、問題となる。
【０００５】本発明者らはかかる従来法の問題点を解決
すべく鋭意研究した。その結果、ヒアルロン酸（塩）の
水溶液に、ヒアルロン酸（塩）分解能を有する分解酵素
を添加し、５〜５０℃で該ヒアルロン酸（塩）を分解し
たのち、分画分子量１万以下の限外ろ過膜に供すること
により、該分解酵素と該分子量１万以下のオリゴヒアル
ロン酸（塩）水溶液とを分離したのち、該オリゴヒアル
ロン酸水溶液を、エタノール、メタノール、イソプロピ
ルアルコール及びアセトンのなかから選ばれる少なくと
も一種以上の貧溶媒を用いて晶析することにより高純度
のオリゴヒアルロン酸（塩）が得られることを見い出
し、この知見に基づき、本発明を完成した。 以上の記
述から、明かなように、本発明の目的は、簡単かつ安価
に分子量１万以下の高純度オリゴヒアルロン酸（塩）を
製造する方法を提供することである。
すべく鋭意研究した。その結果、ヒアルロン酸（塩）の
水溶液に、ヒアルロン酸（塩）分解能を有する分解酵素
を添加し、５〜５０℃で該ヒアルロン酸（塩）を分解し
たのち、分画分子量１万以下の限外ろ過膜に供すること
により、該分解酵素と該分子量１万以下のオリゴヒアル
ロン酸（塩）水溶液とを分離したのち、該オリゴヒアル
ロン酸水溶液を、エタノール、メタノール、イソプロピ
ルアルコール及びアセトンのなかから選ばれる少なくと
も一種以上の貧溶媒を用いて晶析することにより高純度
のオリゴヒアルロン酸（塩）が得られることを見い出
し、この知見に基づき、本発明を完成した。 以上の記
述から、明かなように、本発明の目的は、簡単かつ安価
に分子量１万以下の高純度オリゴヒアルロン酸（塩）を
製造する方法を提供することである。
【０００６】
（１）ヒアルロン酸もしくはその塩（以下、これらを略
してヒアルロン酸（塩）という）の水溶液に、該ヒアル
ロン酸（塩）分解能を有する酵素を添加して温度５℃〜
５０℃で該ヒアルロン酸（塩）を分解した後、分画分子
量１万以下の限外ろ過膜を用いて分解酵素と分子量１万
以下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩を分離し、該
オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液に、０．３
モル／リットル以上になるように塩化ナトリウムもしく
は酢酸ナトリウムを添加し、その後オリゴヒアルロン酸
もしくはその塩の水溶液の５〜１０倍容量の、エタノー
ル、メタノール、イソプロピルアルコール及びアセトン
のなかから選ばれる少なくとも一種以上に、該オリゴヒ
アルロン酸もしくはその塩の水溶液を添加して晶析する
ことを特徴とする高純度オリゴヒアルロン酸もしくはそ
の塩の製造法。 （２）ヒアルロン酸（塩）が微生物が産出したヒアルロ
ン酸（塩）もしくは動物の生体より抽出したヒアルロン
酸（塩）である前記第１項記載の高純度オリゴヒアルロ
ン酸もしくはその塩の製造法。 （３）ヒアルロン酸（塩）を産出する微生物がストレプ
トコッカス属のストレプトコッカス・ピオゲネス(Strep
tococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エクイシミ
リス(Strescoccus equisimilis)、ストレプトコッカス
・エクイ (Streptococcus equi)、ストレプトコッカス
・デイスガラクテイエ(Streptococcus dysgalactiae）
もしくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Strep
tococcus zooepidemicus)である前記第２項記載の高純
度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。 （４）分画分子量１万以下の限外ろ過膜で分子量１万以
下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩より分離したヒ
アルロン酸（塩）の分解能を有する酵素を繰り返し使用
することを特徴とする前記第１項記載の高純度オリゴヒ
アルロン酸もしくはその塩の製造法。
してヒアルロン酸（塩）という）の水溶液に、該ヒアル
ロン酸（塩）分解能を有する酵素を添加して温度５℃〜
５０℃で該ヒアルロン酸（塩）を分解した後、分画分子
量１万以下の限外ろ過膜を用いて分解酵素と分子量１万
以下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩を分離し、該
オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液に、０．３
モル／リットル以上になるように塩化ナトリウムもしく
は酢酸ナトリウムを添加し、その後オリゴヒアルロン酸
もしくはその塩の水溶液の５〜１０倍容量の、エタノー
ル、メタノール、イソプロピルアルコール及びアセトン
のなかから選ばれる少なくとも一種以上に、該オリゴヒ
アルロン酸もしくはその塩の水溶液を添加して晶析する
ことを特徴とする高純度オリゴヒアルロン酸もしくはそ
の塩の製造法。 （２）ヒアルロン酸（塩）が微生物が産出したヒアルロ
ン酸（塩）もしくは動物の生体より抽出したヒアルロン
酸（塩）である前記第１項記載の高純度オリゴヒアルロ
ン酸もしくはその塩の製造法。 （３）ヒアルロン酸（塩）を産出する微生物がストレプ
トコッカス属のストレプトコッカス・ピオゲネス(Strep
tococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エクイシミ
リス(Strescoccus equisimilis)、ストレプトコッカス
・エクイ (Streptococcus equi)、ストレプトコッカス
・デイスガラクテイエ(Streptococcus dysgalactiae）
もしくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Strep
tococcus zooepidemicus)である前記第２項記載の高純
度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。 （４）分画分子量１万以下の限外ろ過膜で分子量１万以
下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩より分離したヒ
アルロン酸（塩）の分解能を有する酵素を繰り返し使用
することを特徴とする前記第１項記載の高純度オリゴヒ
アルロン酸もしくはその塩の製造法。
【０００７】本発明でオリゴヒアルロン酸（塩）とはＨ
ＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析による平均
分子量が１万以下のヒアルロン酸（塩）をいう。該ＨＰ
ＬＣによる平均分子量の測定はカラム（Shodx Ionpak K
S806およびIonpakKS-G）を用いた。溶出液として０．２
モル／リットルの塩化ナトリウム水溶液を用い、流速
１．０ミリリットル／分で流した。検出は２０６ｎｍで
行った。平均分子量は分子量既知のヒアルロン酸ナトリ
ウムで作製した検量線より計算した。
ＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析による平均
分子量が１万以下のヒアルロン酸（塩）をいう。該ＨＰ
ＬＣによる平均分子量の測定はカラム（Shodx Ionpak K
S806およびIonpakKS-G）を用いた。溶出液として０．２
モル／リットルの塩化ナトリウム水溶液を用い、流速
１．０ミリリットル／分で流した。検出は２０６ｎｍで
行った。平均分子量は分子量既知のヒアルロン酸ナトリ
ウムで作製した検量線より計算した。
【０００８】本発明に使用するヒアルロン酸（塩）は、
ヒアルロン酸生産菌により発酵生産され、精製されたヒ
アルロン酸（塩）もしくはニワトリの鶏冠などの動物組
織より抽出、精製されたヒアルロン酸（塩）の水溶液を
用いる。もちろん一度粉末としたヒアルロン酸（塩）を
用いても差し支えない。水溶液としたヒアルロン酸
（塩）にヒアルロン酸分解能を有する酵素、たとえばヒ
アルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３
５）、ヒアルロノグルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．
１．３６）およびヒアルロネートリアーゼ（ＥＣ ４．
２．２．１）の少なくとも１種以上を、ヒアルロン酸ナ
トリウム量に対して１／５００〜１倍量添加後、温度５
〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃で３０分以上、好ま
しくは６時間以上分解した後、分画分子量１万以下の限
外ろ過膜を用いて平均分子量１万以下のオリゴヒアルロ
ン酸（塩）とヒアルロン酸分解能を有する酵素を分離す
る。分離されたオリゴヒアルロン酸（塩）へ塩濃度が
０．１モル／リットル以上に好ましくは０．２〜０．４
モル／リットルになるように塩化ナトリウムもしくは酢
酸ナトリウムを添加後、１０℃以下まで冷却し、その５
〜１０倍容量、好ましくは７倍容量の１０℃以下に冷却
したエタノール、メタノール、イソプロピルアルコール
もしくはアセトンの少なくとも一種以上の貧溶媒に添加
して晶析することにより、高純度のオリゴヒアルロン酸
がを得られる。 一方、分離されたヒアルロン酸分解能
を有する酵素は溶液の状態で低温で冷蔵保存し、繰り返
し使用することができる。
ヒアルロン酸生産菌により発酵生産され、精製されたヒ
アルロン酸（塩）もしくはニワトリの鶏冠などの動物組
織より抽出、精製されたヒアルロン酸（塩）の水溶液を
用いる。もちろん一度粉末としたヒアルロン酸（塩）を
用いても差し支えない。水溶液としたヒアルロン酸
（塩）にヒアルロン酸分解能を有する酵素、たとえばヒ
アルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３
５）、ヒアルロノグルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．
１．３６）およびヒアルロネートリアーゼ（ＥＣ ４．
２．２．１）の少なくとも１種以上を、ヒアルロン酸ナ
トリウム量に対して１／５００〜１倍量添加後、温度５
〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃で３０分以上、好ま
しくは６時間以上分解した後、分画分子量１万以下の限
外ろ過膜を用いて平均分子量１万以下のオリゴヒアルロ
ン酸（塩）とヒアルロン酸分解能を有する酵素を分離す
る。分離されたオリゴヒアルロン酸（塩）へ塩濃度が
０．１モル／リットル以上に好ましくは０．２〜０．４
モル／リットルになるように塩化ナトリウムもしくは酢
酸ナトリウムを添加後、１０℃以下まで冷却し、その５
〜１０倍容量、好ましくは７倍容量の１０℃以下に冷却
したエタノール、メタノール、イソプロピルアルコール
もしくはアセトンの少なくとも一種以上の貧溶媒に添加
して晶析することにより、高純度のオリゴヒアルロン酸
がを得られる。 一方、分離されたヒアルロン酸分解能
を有する酵素は溶液の状態で低温で冷蔵保存し、繰り返
し使用することができる。
【０００９】本発明に使用するヒアルロン酸生産菌とし
てはストレプトコッカス属、例えばストレプトコッカス
・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコ
ッカス・エクイシミリス(Strescoccus equisimilis)、
ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ス
トレプトコッカス・デイスガラクテイエ(Strepto- co
ccus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ズーエピデ
ミカス(Streptococcuszooepidemicus)等を挙げることが
できる。
てはストレプトコッカス属、例えばストレプトコッカス
・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコ
ッカス・エクイシミリス(Strescoccus equisimilis)、
ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)、ス
トレプトコッカス・デイスガラクテイエ(Strepto- co
ccus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ズーエピデ
ミカス(Streptococcuszooepidemicus)等を挙げることが
できる。
【００１０】 以下の説明で％は重量
（ｇ）／容量（ｄｌ）％をいう。本発明に用いる培地は
ヒアルロン酸生産菌を培養するのに通常、用いられる培
地を用いればよく、例えばグルコース３．０％、酵母エ
キス１．０％、リン酸１カリウム０．３％、リン酸２カ
リウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸
マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．
００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン
０．００１％を含む成分でｐＨ６．０〜８．５に調整さ
れたものを用いることができる。
（ｇ）／容量（ｄｌ）％をいう。本発明に用いる培地は
ヒアルロン酸生産菌を培養するのに通常、用いられる培
地を用いればよく、例えばグルコース３．０％、酵母エ
キス１．０％、リン酸１カリウム０．３％、リン酸２カ
リウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸
マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．
００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン
０．００１％を含む成分でｐＨ６．０〜８．５に調整さ
れたものを用いることができる。
【００１１】本発明の培養では通気撹拌培養でも振トウ
培養のいずれを用いてもよく培養温度は２０℃〜４０
℃、好ましくは３０℃〜３８℃にて培養する。培養は２
０〜７０時間を要し、培養液の粘度上昇がみられなくな
った時点で停止する。
培養のいずれを用いてもよく培養温度は２０℃〜４０
℃、好ましくは３０℃〜３８℃にて培養する。培養は２
０〜７０時間を要し、培養液の粘度上昇がみられなくな
った時点で停止する。
【００１２】本発明の精製では培養液から遠心分離もし
くは加圧ろ過にて菌体をろ過し、限外ろ過膜にてろ過液
より不純物を透析除去したものも用いることができる。
くは加圧ろ過にて菌体をろ過し、限外ろ過膜にてろ過液
より不純物を透析除去したものも用いることができる。
【００１３】
【実施例】以下にその実施例を示す。なお、ヒアルロン
酸（塩）の純度測定は化粧品種別配合規格（ヒアルロン
酸ナトリウム（２））記載のグルクロン酸定量法に従っ
た。また、ここでいう高純度とはグルクロン酸含有量で
４０．０〜５０．０重量％のものをいう。なお、実施例
および比較例で用いた％とは、断らない限り重量（ｇ）
／容量（ｄｌ）％を意味する。
酸（塩）の純度測定は化粧品種別配合規格（ヒアルロン
酸ナトリウム（２））記載のグルクロン酸定量法に従っ
た。また、ここでいう高純度とはグルクロン酸含有量で
４０．０〜５０．０重量％のものをいう。なお、実施例
および比較例で用いた％とは、断らない限り重量（ｇ）
／容量（ｄｌ）％を意味する。
【００１４】実施例１ 炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキ
ス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム
０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、
亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００
１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した
培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコ
ッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を
１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水
で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去
液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高い
ヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。この粉末１００ｇを
０．０５モル／リットル酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０
リットルに溶解し、３７℃でヒアルロノグルコサミニダ
ーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）１０ｇを添加、溶解
し、攪拌を続ける。６時間後、分画分子量６０００の限
外ろ過膜（旭化成製、SIP1013）に通し、ヒアルロン酸
分解酵素よりオリゴヒアルロン酸を分離する。分離され
たオリゴヒアルロン酸水溶液に、塩化ナトリウムを０．
３モル／リットルになるように添加、溶解後、１０℃ま
で冷却し、その溶液をその７倍容量の１０℃のエタノー
ルに攪拌しながら添加して晶析を行った。沈殿は回収後
真空乾燥を行い、９２ｇのオリゴヒアルロン酸ナトリウ
ムを得た。この操作で得られたオリゴヒアルロン酸ナト
リウムの平均分子量はＨＰＬＣ法で５３００であった。
また、純度はグルクロン酸含有量で４５％以上であっ
た。使用した酵素を２ヶ月冷蔵保存した後同様な操作で
処理し得られたオリゴヒアルロン酸（塩）の平均分子量
は６３００であった。純度はグルクロン酸含有量で４５
重量％以上であった。
ス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム
０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、
亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００
１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した
培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコ
ッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を
１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水
で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去
液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高い
ヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。この粉末１００ｇを
０．０５モル／リットル酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０
リットルに溶解し、３７℃でヒアルロノグルコサミニダ
ーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）１０ｇを添加、溶解
し、攪拌を続ける。６時間後、分画分子量６０００の限
外ろ過膜（旭化成製、SIP1013）に通し、ヒアルロン酸
分解酵素よりオリゴヒアルロン酸を分離する。分離され
たオリゴヒアルロン酸水溶液に、塩化ナトリウムを０．
３モル／リットルになるように添加、溶解後、１０℃ま
で冷却し、その溶液をその７倍容量の１０℃のエタノー
ルに攪拌しながら添加して晶析を行った。沈殿は回収後
真空乾燥を行い、９２ｇのオリゴヒアルロン酸ナトリウ
ムを得た。この操作で得られたオリゴヒアルロン酸ナト
リウムの平均分子量はＨＰＬＣ法で５３００であった。
また、純度はグルクロン酸含有量で４５％以上であっ
た。使用した酵素を２ヶ月冷蔵保存した後同様な操作で
処理し得られたオリゴヒアルロン酸（塩）の平均分子量
は６３００であった。純度はグルクロン酸含有量で４５
重量％以上であった。
【００１５】比較例１ 炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキ
ス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム
０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、
亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００
１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した
培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコ
ッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を
１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水
で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去
液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高い
ヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。この粉末１００ｇを
０．０５モル／リットル酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０
リットルに溶解し３７℃でヒアルロノグルコサミニダー
ゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）１０ｇ添加溶解し、攪拌
を続ける。６時間後１００℃で６分間煮沸する。室温ま
で冷却後、発生したヒアルロノグルコサミニダーゼの変
成物をろ過除去し、ろ過液に塩化ナトリウムを０．３モ
ル／リットルになるように添加溶解後、活性炭白鷺A50W
(武田薬品工業製）１５０ｇを添加し１時間撹拌する。
活性炭をろ過除去し、１０℃まで冷却する。その水溶液
をその７倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添
加することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行
い、８７ｇのオリゴヒアルロン酸ナトリウムを得た。こ
の操作で得られたオリゴヒアルロン酸ナトリウムの平均
分子量はＨＰＬＣ法で７８００であった。また、純度は
グルクロン酸含有量で４５重量％以上であった。反応に
使用したあとのヒアルロン酸（塩）分解能を有する酵素
はその分解能を喪失してしまい、繰り返し使用すること
はできなかった。
ス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム
０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、
亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００
１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した
培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコ
ッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を
１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水
で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去
液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高い
ヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。この粉末１００ｇを
０．０５モル／リットル酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０
リットルに溶解し３７℃でヒアルロノグルコサミニダー
ゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）１０ｇ添加溶解し、攪拌
を続ける。６時間後１００℃で６分間煮沸する。室温ま
で冷却後、発生したヒアルロノグルコサミニダーゼの変
成物をろ過除去し、ろ過液に塩化ナトリウムを０．３モ
ル／リットルになるように添加溶解後、活性炭白鷺A50W
(武田薬品工業製）１５０ｇを添加し１時間撹拌する。
活性炭をろ過除去し、１０℃まで冷却する。その水溶液
をその７倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添
加することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行
い、８７ｇのオリゴヒアルロン酸ナトリウムを得た。こ
の操作で得られたオリゴヒアルロン酸ナトリウムの平均
分子量はＨＰＬＣ法で７８００であった。また、純度は
グルクロン酸含有量で４５重量％以上であった。反応に
使用したあとのヒアルロン酸（塩）分解能を有する酵素
はその分解能を喪失してしまい、繰り返し使用すること
はできなかった。
【００１６】比較例２ 炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキ
ス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム
０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、
亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００
１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した
培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコ
ッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を
１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水
で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去
液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高い
ヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。この粉末１００ｇを
０．１規定塩酸水溶液２０リットルに溶解し４５℃で２
４時間撹拌する。その後、６規定の苛性ソーダ水にて中
和した。塩化ナトリウム濃度が０．３モル／リットルに
なるように添加溶解後、１０℃まで冷却し、その水溶液
をその３倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添
加することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行
い、６５ｇヒアルロン酸ナトリウムを得た。この操作で
得られたヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰＬ
Ｃ法で６３０００であった。また、純度はグルクロン酸
含有量で４５重量％以上であった。
ス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム
０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、
亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００
１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した
培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコ
ッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を
１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水
で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去
液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高い
ヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。この粉末１００ｇを
０．１規定塩酸水溶液２０リットルに溶解し４５℃で２
４時間撹拌する。その後、６規定の苛性ソーダ水にて中
和した。塩化ナトリウム濃度が０．３モル／リットルに
なるように添加溶解後、１０℃まで冷却し、その水溶液
をその３倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添
加することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行
い、６５ｇヒアルロン酸ナトリウムを得た。この操作で
得られたヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰＬ
Ｃ法で６３０００であった。また、純度はグルクロン酸
含有量で４５重量％以上であった。
【００１７】比較例３ 炭素源としてブドウ糖６．１％、窒素源として酵母エキ
ス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム
０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、
亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００
１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した
培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコ
ッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を
１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水
で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去
液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高い
ヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。この粉末１００ｇを
０．１規定苛性ソーダ水溶液２０リットルに溶解し４５
℃で２４時間撹拌する。その後、６規定の塩酸にて中和
した。塩化ナトリウム濃度が０．３モル／リットルにな
るように添加溶解後、１０℃まで冷却し、その水溶液を
その３倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添加
することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行
い、６０ｇのヒアルロン酸ナトリウムを得た。この操作
で得られたヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰ
ＬＣ法で５５０００であった。また、純度はグルクロン
酸含有量で４５重量％以上であった。
ス１．６％で、その他の塩類としてリン酸１カリウム
０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリ
ウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、
亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００
１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分で調製した
培地に予め３７℃で１２時間、前培養したストレプトコ
ッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ ＢＰ８７８）を
１／１８容量接種し、３７℃で培養する。培養液を純水
で２倍に希釈した後、菌体を遠心分離にて除去後、除去
液の２倍容量のエタノールにて晶析、乾燥し純度の高い
ヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。この粉末１００ｇを
０．１規定苛性ソーダ水溶液２０リットルに溶解し４５
℃で２４時間撹拌する。その後、６規定の塩酸にて中和
した。塩化ナトリウム濃度が０．３モル／リットルにな
るように添加溶解後、１０℃まで冷却し、その水溶液を
その３倍容量の１０℃のエタノールに攪拌しながら添加
することで晶析を行った。沈殿は回収後真空乾燥を行
い、６０ｇのヒアルロン酸ナトリウムを得た。この操作
で得られたヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量はＨＰ
ＬＣ法で５５０００であった。また、純度はグルクロン
酸含有量で４５重量％以上であった。
【００１８】
【発明の効果】本発明の製造法によれば、ヒアルロン酸
（塩）水溶液をヒアルロン酸分解能を有する酵素で分解
し、限外ろ過膜でその酵素とオリゴヒアルロン酸（塩）
を分離することにより、従来に比べ遥かに単純な工程で
かつ安価に純度の高いオリゴヒアルロン酸（塩）を容易
に製造することができる。
（塩）水溶液をヒアルロン酸分解能を有する酵素で分解
し、限外ろ過膜でその酵素とオリゴヒアルロン酸（塩）
を分離することにより、従来に比べ遥かに単純な工程で
かつ安価に純度の高いオリゴヒアルロン酸（塩）を容易
に製造することができる。
Claims (4)
- 【請求項１】ヒアルロン酸もしくはその塩（以下、これ
らを略してヒアルロン酸（塩）という）の水溶液に、ヒ
アルロン酸（塩）分解能を有する酵素を添加して温度５
℃〜５０℃で該ヒアルロン酸（塩）を分解した後、分画
分子量１万以下の限外ろ過膜を用いて分解酵素と分子量
１万以下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩を分離
し、該オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液に、
０．３モル／リットル以上になるように塩化ナトリウム
もしくは酢酸ナトリウムを添加し、その後オリゴヒアル
ロン酸もしくはその塩の水溶液の５〜１０倍容量の、エ
タノール、メタノール、イソプロピルアルコール及びア
セトンのなかから選ばれる少なくとも一種以上に、該オ
リゴヒアルロン酸もしくはその塩の水溶液を添加して晶
析することを特徴とする高純度オリゴヒアルロン酸もし
くはその塩の製造法。 - 【請求項２】ヒアルロン酸（塩）が微生物が産出したヒ
アルロン酸（塩）もしくは動物の生体より抽出したヒア
ルロン酸（塩）である請求項１記載の高純度オリゴヒア
ルロン酸もしくはその塩の製造法。 - 【請求項３】ヒアルロン酸（塩）を産出する微生物がス
トレプトコッカス属のストレプトコッカス・ピオゲネス
(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・エク
イシミリス(Strescoccus equisimilis)、ストレプトコ
ッカス・エクイ (Streptococcus equi)、ストレプトコ
ッカス・デイスガラクテイエ(Streptococcus dysgalact
iae）もしくはストレプトコッカス・ズーエピデミカス
(Streptococcus zooepidemicus)である請求項２記載の
高純度オリゴヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。 - 【請求項４】分画分子量１万以下の限外ろ過膜で分子量
１万以下のオリゴヒアルロン酸もしくはその塩より分離
したヒアルロン酸（塩）分解能を有する酵素を繰り返し
使用することを特徴とする請求項１記載の高純度オリゴ
ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。 【０００１】
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|---|---|---|---|---|
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| JP2001081103A (ja) * | 1999-09-13 | 2001-03-27 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒアルロン酸結合薬剤 |
| WO2002069984A3 (de) * | 2001-03-02 | 2003-01-30 | Knoell Hans Forschung Ev | Verwendung von hyaluronsäure-uroniden zur behandlung von entzündlichen vorgängen |
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-
1997
- 1997-10-22 JP JP30803497A patent/JP4151092B2/ja not_active Expired - Fee Related
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