CN104662158B - 生产具有可控分子量的高纯度透明质酸钠(hana)的方法 - Google Patents

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Abstract

公开的是用于生产具有60‑2400kDa的分子量和低多分散性(1.4Mw/Mn)的透明质酸钠的方法，其包括：a)马链球菌兽疫亚种CNCM I‑4645在合适的培养基中的发酵步骤；b)1.0‑5.0barg的差压条件(ΔP)和0.5‑4barg的跨膜压力(TMP)下，通过浓缩和渗滤溶液超滤无细胞过滤溶液的步骤。

Description

生产具有可控分子量的高纯度透明质酸钠(HANA)的方法
说明书摘要
公开的是用于生产透明质酸钠(HANa)的方法，其包括在合适的条件下，在含有糖作为碳源的营养培养基中培养马链球菌属(Streptococcus equi)兽疫(zooepidemicus)亚种的微生物。
本发明涉及通过链球菌属(Streptococcus)的微生物的大规模发酵来生产高度纯化的透明质酸钠盐的方法。
发明领域
本发明涉及用于生产高度纯化的透明质酸钠的方法，并特别涉及包括发酵步骤的方法。
通过本发明的方法，按照当前的纯度、安全性和一致性标准生产HANa。为了获得高的纯度，在方法中使用不含有动物来源成分的培养基。
由于其颗粒的多孔性和小的尺寸，通过本文要求保护的方法获得的HANa比动物和发酵来源的其他HANa溶解地更快，导致制造时间和成本的极大降低。此外，材料的高纯度使得其能够随后被灭菌，而分子量没有任何明显丢失。这种新的制造方法的优势因而是绝对的安全性、高纯度谱和低热不稳定性；快速的容散性和简单的过滤性以制备溶液；和分子量的重复性，其与低多分散性(polydispersity)相关。
现有技术
透明质酸是自然界中存在的糖胺聚糖，其由具有50,000-13,000,000道尔顿分子量的线性聚合物组成。其是通过交替的β1-3和β1-4键键合的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的重复单元形成的多糖。透明质酸存在于动物的多种结缔组织中，如皮肤和软骨。一些器官，如脐带、滑膜液、玻璃体液和公鸡冠中特别富含透明质酸。透明质酸还由多种微生物，如类型A和C的链球菌产生。透明质酸存在于所有的身体组织中，并执行许多重要的功能。其促进营养物的释放并从没有血液供应的细胞，如定位在软骨中的那些细胞中转运毒素；没有足量的HA的话，关节会恶化并且变脆。透明质酸不仅保持关节润滑，还刺激其他身体组织中的液体潴留。在皮肤和软骨中，透明质酸的作用是结合水并保持组织的张力和弹性。关节液中的粘性透明质酸溶液充当润滑剂，为细胞提供保护环境。
由于其亲水的性质及其流变学和润滑的性质，透明质酸钠是具有高增值的生物聚合物，其具有广泛的医学应用，包括皮肤水合、骨关节炎治疗、眼科手术、在腹部外科手术后防止粘连，和创伤愈合。
透明质酸钠的新用途是基于其修改细胞行为能力的药物释放、包被/移植和治疗处理。因为在许多所述应用中配制的产物的性能依赖于生物聚合物的分子量，所以MW代表透明质酸钠生产中头等重要性的特征。
具有两种获得透明质酸钠的主要方法：(i)从动物组织中提取透明质酸(例如从公鸡冠中提取)；(ii)培养微生物并回收作为发酵产物的透明质酸。
(i)从公鸡冠中提取昂贵且耗时，并且导致严重的问题，即由于降解透明质酸的酶(HAase)的污染而导致质量下降，和注射时的炎症反应。提取方法的特征还在于许多问题和低产量、初始材料的受限可用性、不能控制终产物的特征(如分子量)，和来自病毒的污染风险。
(ii)通过发酵合适的微生物生产透明质酸钠在成本方面代表有效的方法。在文献中描述了许多方法使用发酵技术生产和纯化透明质酸钠。然而，它们中的许多方法通常使用季铵盐来去除杂质，导致漫长的沉淀再溶解时间并且在终产物中存在季铵盐。此外，所述纯化技术主要基于不同的沉淀步骤，其需要广泛使用有机溶剂，因此增加了纯化产物和处理废物相关的成本。
US2010/0137579A1公开了用于纯化生物来源(兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus))的透明质酸的方法，其适合用于医学使用，包括渗滤和超滤步骤。
出版物Biopolymers,2010,387-412描述了这样的方法，其用于通过发酵Streptococcus zooepidermicus，通过碳滤池过滤、超滤/渗滤和通过微量过滤灭菌来生物技术生产透明质酸。
Separation and Purification Technology,2006,52,29-38描述了两步切向流过滤方法，其用于从发酵液中分离透明质酸。然而，该方法不适合于大规模生产透明质酸，并且后者不能达到适合于医学使用的纯度。
在所述方法相关的问题上，简单、容易应用并且能够去除杂质如蛋白质、核酸、内毒素、金属离子等的透明质酸钠制造方法的重要性是清晰的。
发明描述
本发明涉及高产量生产透明质酸钠的方法，该方法通过在好氧条件下，在富含气流的生长培养基中发酵链球菌细菌，随后从所得培养液中分离细菌，并从该培养液中分离透明质酸钠。
发明详述
本发明通过在适当条件下，在合适的营养培养基中，使用马链球菌种兽疫亚种(来自野生株DSM 20727的突变株)进行发酵来生产高度纯化的透明质酸钠的方法克服了上文提及的问题。该突变株在2012年06月21日保藏在法国巴黎巴斯德研究所的法国国立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Paris))，保藏号为CNCM I-4645下。
在发酵过程中，微生物产生透明质酸，并将其释放到培养基中。
然后通过如下方法从发酵培养基中回收透明质酸：利用酸降低溶液的粘度，例如通过超滤将其浓缩并纯化，利用低pH值的热处理检查并确定分子量，利用合适的吸附技术通过吸附进一步纯化，例如利用有机溶剂通过沉淀来沉淀透明质酸钠，过滤并干燥沉淀物。
图示的方案阐明了本发明的方法。
根据本发明，“高分子量透明质酸钠”表示具有≥1.8m3/Kg的特性粘度的透明质酸钠。
在高速搅拌和通气条件下，在生物反应器中的合适的培养基中培养微生物。
培养基含有初始浓度在20-80克/升范围内的糖作为碳源，和20-30克/升酵母提取物和/或大豆蛋白胨。
通过pH控制器操作连续加入碱性溶液将培养基的pH保持稳定在6.0-8.0间隔内；优选通过连续加入浓缩的NaOH将培养基的pH维持在约7.0。
在加压的好氧条件下，优选利用高速搅拌进行细菌的培养。将气压保持恒定在约0.6-1.0bar gauge，并且将通气维持在约0.8-1.2空气体积/培养基体积/分钟。
发酵产量在5.0-10g·L-1的透明质酸钠范围内，所述透明质酸钠的平均分子量在约1.8至约3.0x106道尔顿范围内。
发酵的持续时间是约7-12小时，其中1-5％v/v接种物生长至在600nm处测定的4.0-12.0OD单位。发酵结束时，生物量的密度等于8-16OD单位的浊度。
最合适的培养基具有以下组分：
可以通过处理培养基去除微生物和培养基中不可溶的其他物质来回收透明质酸钠。添加酸以降低溶液的粘度后，优选的去除方法是利用惰性助滤剂过滤。
然后通过具有0.6/0.2微米(μm)额定值(nominal rating)的过滤筒微量过滤透明质酸钠，以去除任何残留的助滤剂和微生物。
然后通过加入浓缩的NaOH将培养基的pH调整至约7.0。
利用惰性助滤剂处理的滤液经历切向流过滤(TFF)，以去除来自发酵步骤的具有低分子量的残留成分。利用具有10-100KDa截留值的超滤膜，用高度纯化的水(HPW)作为渗滤缓冲液进行超滤处理。
然后加入盐酸(2M)使渗滤的溶液进行热处理，以降低其分子量和特性粘度。在热处理结束时，通过加入浓缩的NaOH将溶液的pH调整至7.0±1.0。
由此获得的产物在加入氯化钠(通常是0.7M)后，然后利用合适的助滤剂过滤以纯化。
然后利用具有0.2微米(μm)额定值的过滤筒微量过滤滤液。
加入盐酸(HCl)后，可以利用有机溶剂，如96％v/v乙醇沉淀透明质酸钠。去除上清液后，向沉淀物中加入96％v/v乙醇。去除上清液后，向该第二次的沉淀物中加入96％v/v乙醇。然后在真空下干燥因此回收的沉淀物，以获得精细的透明质酸钠粉末。若需要，可以根据下文所述的表，通过在低pH值下进行热处理来产生具有确定分子量和特性粘度的透明质酸钠：
分子量(KDa) 特性粘度(m3·kg-1) pH(UpH)
60-100 0.14-0.29 1.00-3.00
100-250 0.29-0.68 1.00-3.00
250-350 0.68-0.88 2.00-4.00
350-500 0.88-1.12 2.00-4.00
500-800 1.2-1.52 2.00-4.00
800-1000 1.52-1.75 3.00-5.00
1000-1400 1.75-2.14 3.00-5.00
1400-1800 2.14-2.47 3.00-5.00
1800-2400 2.47-2.92 3.00-5.00
将通过以下实施例更详细地描述本发明。
实施例
选择细菌用于高产量生产
马链球菌兽疫亚种CNCM I-4645(来自野生株DSM 20727的突变株，保藏在DSMZMicrobial Collection中)用作HANa生产菌株：微生物储存在小瓶中的20％(v/v)甘油中并冰冻(T≤-70℃)。
以融化小瓶开始制造过程，随后将细菌悬浮液划线到平板中的固体培养基上，并在37℃下培养20-36小时(Revitalisation Step)。然后将从平板挑取的菌落重悬浮在试管中的新鲜培养基中并在37℃搅拌(100-300rpm,Cell Expansion Step I)下温育8-16小时。然后将试管中的培养物作为2个含有2升无菌培养基的5-升Erlenmeyer烧瓶的接种物。将烧瓶在37℃搅拌(100-300rpm,Cell Expansion StepII)下温育8-16小时。所获得的细胞悬浮液然后用于接种。
生产发酵
接种到无菌培养基中后，在30-40℃和pH 7.0±1.0，1500L分钟1通气,0.6-1.0bargauge超压和在200-300rpm搅拌下进行生产发酵。通过加入浓缩的NaOH将pH值保持恒定在特定范围内。在发酵过程中，透明质酸形成细胞荚膜的一部分，并且以可溶形式逐渐释放到发酵培养基中。
过滤和微量过滤
将发酵培养液转移到罐中，其中加入酸以使得其较不粘稠，并且加入惰性助滤剂，以获得更高的流速，其对所需的澄清程度是必需的。当填装(packing)步骤已经完成时，通过泵将细胞悬浮液运输到加压的过滤器中并过滤；通过滤板截住所形成的团块(panel)，同时回收滤液用于后续步骤。
通过具有0.6/0.2微米(μm)额定值的过滤筒，利用常规过滤(NFF)，通过过滤来微量过滤因此获得的产物，以去除任何助剂或细胞残留。
中和与超滤
过滤和微量过滤(MF)步骤后，获得过滤的无细胞透明质酸钠溶液，其可以被纯化。第一步是在贮存罐中收集产物，向所述贮存罐中加入浓缩的NaOH，以将pH值恢复至约7。
膜切向流超滤(TFF)系统用于浓缩和纯化产物。所使用的膜(盒或中空纤维模块)由与方法相容的材料，优选聚醚砜或聚丙烯构成，并且具有10-100kDa，优选30kDa的截断值。超滤方法的操作间隔参数是：跨膜压力(TMP)0.5-4.5barg和差压(ΔP)1.0-5.0barg。将上清液浓缩高达初始体积的3-5倍，以清除大多数低分子量污染物。利用高度纯化的水将含有透明质酸钠的滞留物渗滤高达5-7体积，以去除剩余的低分子量污染物。当达到小于300μS·cm-1的电导率值时，停止渗滤。
在低pH值时的热处理和中和
在50-65℃温度范围内恒温的处理罐中搅拌加热浓缩的渗滤的产物，并且通过加入盐酸将pH调整至1-5UpH的值。然后在所述条件下温育溶液，直至获得所需分子量。在这些条件下，透明质酸钠分子在不形成副产物的情况随机降解。通过利用浓缩的NaOH将pH调整至7.0±1.0UpH的值并冷却至约25.0℃的温度来终止热处理。
利用活性炭吸附、过滤和抛光
向超滤溶液中加入盐，以降低其粘度，并且助滤剂用于去除内毒素。为了有效去除内毒素，将溶液搅拌至少2-4小时，然后过滤以去除助滤剂。通过常规过滤来微量过滤滤液，以清除助滤剂的任何残留。
沉淀
加入盐酸(例如2M)以中和溶液后，向透明质酸钠溶液中加入有机溶剂(如96％v/v乙醇)。优选加入1.2-2.8体积的透明质酸钠溶液的水溶性有机溶剂。为了通过向透明质酸钠溶液中加入有机溶剂有效沉淀和沉积透明质酸钠，优选在加入有机溶剂后让其沉积至少3-7小时。
通过加入新鲜的有机溶剂洗涤在该步骤中从去除上清液获得的沉淀的透明质酸钠。将去除上清液后在此第二个步骤中获得的透明质酸钠沉淀物重悬浮在新鲜的有机溶剂中。
回收和干燥
回收并过滤沉积的透明质酸钠。在真空下进行最后的干燥步骤，以获得非常精细的粉末。
因此获得的透明质酸钠适合于生产特征在于缺少热原性和炎症活性的制剂。
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仅供国际局使用
0-5 该表格由国际局接受于：
0-5-1 授权官员

Claims (6)

1.用于制造具有范围在60-2400kDa内的确定分子量和1.4Mw/Mn低多分散性的透明质酸钠的方法，其包括：
a)马链球菌兽疫亚种CNCM I-4645在合适的培养基中的发酵步骤；
b)1.0-5.0barg的差压条件(ΔP)和0.5-4.5barg的跨膜压力(TMP)下，浓缩和渗滤溶液的无细胞过滤溶液的超滤步骤。
2.权利要求1的方法，其中在分批方法中进行所述发酵步骤，以在7-12小时后给出透明质酸的5-10g·L-1的最大浓缩。
3.权利要求1或2的方法，其中在好氧条件，0.6-1.0bar gauge的压力和0.8-1.2体积的空气/体积培养基/分钟的通气条件下进行所述发酵步骤。
4.权利要求1或2的方法，其中所述培养基具有以下组分：
5.权利要求1或2的方法，其中根据下表通过在低pH值下进行热处理来产生具有预先确定分子量和特性粘度的透明质酸钠：
6.马链球菌兽疫亚种CNCM I-4645。
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