JP2508808B2 - フラクト―ス脱水素酵素の製造方法 - Google Patents
フラクト―ス脱水素酵素の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、フラクトース脱水素酵素を産生し得る細菌
細胞からフラクトース脱水素酵素を大量に製造する方法
に関する。
細胞からフラクトース脱水素酵素を大量に製造する方法
に関する。
（従来の技術） 本発明のフラクトース脱水素酵素とは、通常膜酵素と
呼ばれる酵素であり、酵素番号（EC1.1.99.11）に分類
される。
呼ばれる酵素であり、酵素番号（EC1.1.99.11）に分類
される。
膜酵素とは、膜結合酵素とも呼ばれ、生体膜に種々の
強さで結び付けられている酵素の総称である。この酵素
の結合の強さは、イオン強度のわずかな変化で遊離する
ものから、膜の中にも埋もれているものまでさまざまで
ある。
強さで結び付けられている酵素の総称である。この酵素
の結合の強さは、イオン強度のわずかな変化で遊離する
ものから、膜の中にも埋もれているものまでさまざまで
ある。
この様な膜酵素は通常の酵素とは異り、その製造方法
において可溶化工程が必要となる。この可溶可工程と
は、生物細胞の細胞膜に埋った状態にある膜酵素を膜か
ら切り出して分画する工程である。
において可溶化工程が必要となる。この可溶可工程と
は、生物細胞の細胞膜に埋った状態にある膜酵素を膜か
ら切り出して分画する工程である。
通常この工程は生物細胞を物理的な手法で破砕したの
ち、種々の界面活性剤を添加することによって行なわ
れ、その後高速遠心分離より、可溶化した膜酵素と膜残
渣とに分画することにより行なわれる〔生化学実験講座
５−酵素研究法（上）（東京化学同人）217〜231頁、生
物化学実験法17−生体膜成分の構造と機能（学会出版セ
ンター）49−113頁参照〕。
ち、種々の界面活性剤を添加することによって行なわ
れ、その後高速遠心分離より、可溶化した膜酵素と膜残
渣とに分画することにより行なわれる〔生化学実験講座
５−酵素研究法（上）（東京化学同人）217〜231頁、生
物化学実験法17−生体膜成分の構造と機能（学会出版セ
ンター）49−113頁参照〕。
しかし、従来の方法は、少量の生物細胞を材料として
いる場合には有効であるが、数キログラムの生物細胞を
材料とする場合には不適当な方法であるといえる。なぜ
なら、この方法で可溶化された膜酵素は通常の濾過操
作、低速の遠心分離では膜残渣と分離できず、分離する
ためには、20万Ｇ程度の高速遠心分離操作が必要とな
り、数キログラムの生物細胞を材料とした場合、界面活
性剤処理後の試料を高速遠心分離する様な大規模な高速
遠心分離機は非常に高価であり、また運転時の危険性も
非常に高くなるからである。
いる場合には有効であるが、数キログラムの生物細胞を
材料とする場合には不適当な方法であるといえる。なぜ
なら、この方法で可溶化された膜酵素は通常の濾過操
作、低速の遠心分離では膜残渣と分離できず、分離する
ためには、20万Ｇ程度の高速遠心分離操作が必要とな
り、数キログラムの生物細胞を材料とした場合、界面活
性剤処理後の試料を高速遠心分離する様な大規模な高速
遠心分離機は非常に高価であり、また運転時の危険性も
非常に高くなるからである。
（本発明が解決しようとする課題） 本発明は、大量の細菌細胞を原料として、フラクトー
ス脱水素酵素を製造する方法において、その可溶化工程
で高速遠心分離を必要としないフラクトース脱水素酵素
の製造方法を提供することである。
ス脱水素酵素を製造する方法において、その可溶化工程
で高速遠心分離を必要としないフラクトース脱水素酵素
の製造方法を提供することである。
（問題を解決するための方法） 本発明方法は、フラクトース脱水素酵素を産生し得る
細菌細胞を破砕した後、ポリエチレンイミンを添加して
生物細胞を凝集させ膜画分のみを分離し、膜画分中の膜
酵素を可溶化しフラクトース脱水素酵素を分離すること
を特徴とするフラクトース脱水素酵素の製造方法であ
る。
細菌細胞を破砕した後、ポリエチレンイミンを添加して
生物細胞を凝集させ膜画分のみを分離し、膜画分中の膜
酵素を可溶化しフラクトース脱水素酵素を分離すること
を特徴とするフラクトース脱水素酵素の製造方法であ
る。
本発明に用いる細菌細胞とは、通常フラクトース脱水
素酵素を取得する細菌細胞であれば、いかなる細菌細胞
であっても好適に実施できるが、特に好適なものとして
は、グルコノバクター属細菌、例えばグルコノバクター
・セリヌス（Gluconobacter cerinus）IFO−3268,グル
コノバクター・インダストリウス（Gluconobacter indu
strius）IFO−3260,アセトバクター属、例えば、アセト
バクター・キシリヌス（Acetobacter xylinus）IFO−32
88等がある。
素酵素を取得する細菌細胞であれば、いかなる細菌細胞
であっても好適に実施できるが、特に好適なものとして
は、グルコノバクター属細菌、例えばグルコノバクター
・セリヌス（Gluconobacter cerinus）IFO−3268,グル
コノバクター・インダストリウス（Gluconobacter indu
strius）IFO−3260,アセトバクター属、例えば、アセト
バクター・キシリヌス（Acetobacter xylinus）IFO−32
88等がある。
細菌細胞の破砕法としては、ガラス・ビース、フレン
チプレスなど各種方法がある。
チプレスなど各種方法がある。
本発明では可溶化工程での高速遠心分離操作を除くた
め、細菌細胞を破砕した後、ポリエチレンイミンを添加
して膜画分を凝集させ、これを分画する。
め、細菌細胞を破砕した後、ポリエチレンイミンを添加
して膜画分を凝集させ、これを分画する。
ポリエチレンイミンは通常0.005％〜10重量％好まし
くは0.01〜1.0重量％の濃度で用いられるが、この濃度
に限定されるものではない。
くは0.01〜1.0重量％の濃度で用いられるが、この濃度
に限定されるものではない。
分画方法としては、（１）静置による沈澱とデカンテ
ーションの繰り返し、（２）濾紙、布などを用いた濾過
などがある。また、（３）従来から用いられているシャ
ープレス、連続遠心機等の低速遠心分離も利用できる。
ーションの繰り返し、（２）濾紙、布などを用いた濾過
などがある。また、（３）従来から用いられているシャ
ープレス、連続遠心機等の低速遠心分離も利用できる。
本発明では上記方法により分画した膜画分を可溶化し
てフラクトース脱水素酵素を単離する。
てフラクトース脱水素酵素を単離する。
膜画分の化溶化法としては、界面活性剤、例えば非イ
オン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活
性剤を膜画分に添加して行なう。界面活性剤の種類およ
び添加量は使用する細菌細胞により種々異なるものであ
る。例えばグルコノバクター属細菌では界面活性剤とし
て非イオン界面活性剤、例えばトリトンＸ−100を膜画
分の蛋白質量に対して0.05〜5.0重量％添加することが
好ましい。
オン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活
性剤を膜画分に添加して行なう。界面活性剤の種類およ
び添加量は使用する細菌細胞により種々異なるものであ
る。例えばグルコノバクター属細菌では界面活性剤とし
て非イオン界面活性剤、例えばトリトンＸ−100を膜画
分の蛋白質量に対して0.05〜5.0重量％添加することが
好ましい。
細菌細胞を破砕した後、ポリエチレンイミンを添加す
ることなく、膜画分のみを分離する方法としては、種々
の界面活性剤を添加した後、高速遠心分離により可溶化
した膜酵素と膜残渣とに分画する。しかし、この方法で
は大量の細菌細胞を材料とする場合には不適当である。
ることなく、膜画分のみを分離する方法としては、種々
の界面活性剤を添加した後、高速遠心分離により可溶化
した膜酵素と膜残渣とに分画する。しかし、この方法で
は大量の細菌細胞を材料とする場合には不適当である。
（効 果） 本発明では細菌細胞からフラクトース脱水素酵素を得
るに当り、細菌細胞を破砕した後、凝集剤を添加して膜
画分を凝集させ、これを分画することによって、可溶化
工程での高速遠心分離操作を省略できる。
るに当り、細菌細胞を破砕した後、凝集剤を添加して膜
画分を凝集させ、これを分画することによって、可溶化
工程での高速遠心分離操作を省略できる。
本発明の製造方法によれば大量のフラクトース脱水素
酵素を製造する場合でも、特殊な装置は必要ない。
酵素を製造する場合でも、特殊な装置は必要ない。
したがって、本発明の製造法によればフラクトース脱
水素酵素を大量に製造することが容易となり、フラクト
ース脱水素酵素を利用した新しい臨床検査薬等の開発に
大きく貢献するものと思われる。
水素酵素を大量に製造することが容易となり、フラクト
ース脱水素酵素を利用した新しい臨床検査薬等の開発に
大きく貢献するものと思われる。
（実施例） 以下本発明を実施例を用いて説明する。
実施例中、フラクトース脱水素酵素の活性測定は、以
下の方法に従った。
下の方法に従った。
下記測定試薬混合液0.9mlを25℃で５分加温し、試料
（フラクトース脱水素酵素力価１〜４単位/ml程度）を
0.1ml加え撹拌し、正確に５分後、Fe2（SO4）３・デュ
パノール液を0.5ml加え、20分静置後、3.5mlの蒸留水を
加えた後、660mmにおける吸光度を測定した。フラクト
ース脱水素酵素の力価は、下記式に従って算出する。
（フラクトース脱水素酵素力価１〜４単位/ml程度）を
0.1ml加え撹拌し、正確に５分後、Fe2（SO4）３・デュ
パノール液を0.5ml加え、20分静置後、3.5mlの蒸留水を
加えた後、660mmにおける吸光度を測定した。フラクト
ース脱水素酵素の力価は、下記式に従って算出する。
測定試薬混合液 マッキルバイン緩衝液pH4.5 0.7ml 1Mフラクトース溶液 0.1 0.1Mフェリシアン化カリ溶液 0.1 0.9ml Fe2（SO4）３・デュパノール溶液 SDS（ソディウムドデシルサルフェイト） 3g Fe2（SO4）３・XH2O 5g 85％リン酸 95ml を蒸留水に溶解し１にする。
実施例 1. 140の培養槽でグルコノバクター・インダストリウ
ス（Gluconobacter industrius）IFO−3260を培養し、
約1kgの菌体を得た。この菌体をガラス・ビーズですり
潰して、菌体を破壊した。菌体破砕液10に、ポリエチ
レンイミン5gを添加し、膜画分を凝集させた。これをフ
イルターを用いて濾過処理を行い、フラクトース脱水素
酵素が存在する膜画分と細胞質由来の溶液部とを分離し
た。分離した膜画分10に非イオン界面活性剤トリトン
Ｘ−100を200gを加え、膜画分からフラクトース脱水素
酵素を可溶化した。つぎに、この溶液を再びフイルター
を用いて濾過処理を行い、膜残渣とフラクトース脱水素
酵素を含む溶液とを分離した。得られたフラクトース脱
水素酵素の力価）を表１に示した。
ス（Gluconobacter industrius）IFO−3260を培養し、
約1kgの菌体を得た。この菌体をガラス・ビーズですり
潰して、菌体を破壊した。菌体破砕液10に、ポリエチ
レンイミン5gを添加し、膜画分を凝集させた。これをフ
イルターを用いて濾過処理を行い、フラクトース脱水素
酵素が存在する膜画分と細胞質由来の溶液部とを分離し
た。分離した膜画分10に非イオン界面活性剤トリトン
Ｘ−100を200gを加え、膜画分からフラクトース脱水素
酵素を可溶化した。つぎに、この溶液を再びフイルター
を用いて濾過処理を行い、膜残渣とフラクトース脱水素
酵素を含む溶液とを分離した。得られたフラクトース脱
水素酵素の力価）を表１に示した。
比較例 1. 25培養槽でグルコノバクター・インダストリウス
（Gluconobacter industrius）IFO−3260を培養し、50g
の菌体を得た。この菌体をフレンチプレスで破砕した。
（Gluconobacter industrius）IFO−3260を培養し、50g
の菌体を得た。この菌体をフレンチプレスで破砕した。
破砕した菌体を68,000×Ｇで高速遠心分離を90分行
い、膜画分を分離した。分離した膜画分0.2に非イオ
ン界面活性剤、トリトンＸ−100を4g添加して可溶化を
行った。
い、膜画分を分離した。分離した膜画分0.2に非イオ
ン界面活性剤、トリトンＸ−100を4g添加して可溶化を
行った。
可溶化後、再び68,000×Ｇの高速遠心分離を60分行
い、膜残渣とフラクトース脱水素酵素を含む溶液とに分
離した。得られたフラクトース脱水素酵素の精製収率と
純度（蛋白質1mg当りのフラクトース脱水素酵素の活性
値）を表２に示した。
い、膜残渣とフラクトース脱水素酵素を含む溶液とに分
離した。得られたフラクトース脱水素酵素の精製収率と
純度（蛋白質1mg当りのフラクトース脱水素酵素の活性
値）を表２に示した。
本発明のフラクトース脱水素酵素の精製方法によっ
て、従来の約５倍の大量精製が、従来法とほぼ同じ収率
で、しかも高速遠心分離処理の必要なく容易に行えるよ
うになったことがわかる。
て、従来の約５倍の大量精製が、従来法とほぼ同じ収率
で、しかも高速遠心分離処理の必要なく容易に行えるよ
うになったことがわかる。
Claims (1)
- 【請求項１】フラクトース脱水素酵素を産生し得る細菌
細胞を破砕した後、ポリエチレンイミンを添加して細菌
細胞膜を凝集させ、膜画分のみを分離し、膜画分中の膜
酵素を可溶化し、フラクトース脱水素酵素を分離するこ
とを特徴とするフラクトース脱水素酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15331388A JP2508808B2 (ja) | 1988-06-20 | 1988-06-20 | フラクト―ス脱水素酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15331388A JP2508808B2 (ja) | 1988-06-20 | 1988-06-20 | フラクト―ス脱水素酵素の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01320984A JPH01320984A (ja) | 1989-12-27 |
| JP2508808B2 true JP2508808B2 (ja) | 1996-06-19 |
Family
ID=15559761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15331388A Expired - Fee Related JP2508808B2 (ja) | 1988-06-20 | 1988-06-20 | フラクト―ス脱水素酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2508808B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170045590A1 (en) * | 2015-08-10 | 2017-02-16 | Toshiba Medical Systems Corporation | Magnetic resonance imaging apparatus and magnetic resonance imaging method |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5914390A (en) * | 1997-05-12 | 1999-06-22 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Methods for increasing yields of recombinant proteins |
| CN110590967A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-12-20 | 中国海洋大学 | 一种从海参漂烫液中回收富含海参多糖有机质的方法 |
-
1988
- 1988-06-20 JP JP15331388A patent/JP2508808B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170045590A1 (en) * | 2015-08-10 | 2017-02-16 | Toshiba Medical Systems Corporation | Magnetic resonance imaging apparatus and magnetic resonance imaging method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01320984A (ja) | 1989-12-27 |
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