JPS5878586A - コレステロ−ルオキシダ−ゼの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコレステロールオキシダーゼの精製方法に関す
る０本発明はコレステロールオキシダーゼ活性を有する
微生物生育培地から実質的に純粋なコレステロールオキ
シダーゼを得るのに特に有用である。

本発明以前は、コレステロールオキシダーゼの精製は非
常に困難な問題であった。たとえばコレステロールオキ
シダーゼを生産する多くの微生物は、膜結合の形態で酵
素を生産する。これらの微生物からコレステロールオキ
シダーゼを分離精製する為には、先ずコレステロールオ
キシダーゼを洗浄剤抽出により膜から分離する１次いで
溶媒−塩沈澱及び両親媒性（ａａｐｈｉｐｈｉｌｉｃ　
）クロマトグラフィーを含む複雑な方法において有用な
純度の生産物を得る。他の微生物は細胞外にコレステロ
ールオキシダーゼを生産する。しかしながら、このコレ
ステロールオキシダーゼの精製及び回収も困難であうた
。

酵素精製方法は、疎水性又は親和性クロマドグ（２） ラフイーのような特殊な吸着−脱着方法の使用によりあ
る場合には簡素化されている。これらの方法は酵素特異
性リガンド、即ち１４Ｉｓと弱い共有結合を形成する物
質を含む、これらのリガンドはそれ自身が通常は共有結
合により安定な支持体へ結合されている。これらの方法
は通常、高価なリガンド及び／又はリガン、ドを支持体
に結合させる為の適当な化学反応を見出す為費用のかか
る実験を含む。

支持体へ結合する特殊なりガントを用いる、コレステロ
ールオキシダーゼを精製する為の一つの方法は日本特許
公開公報第３７８８５／　１９７９号に記載されている
。この方法では“コレステロールオキシダーゼの基質類
憤体”を高分子量多糖類のような担体へ結合する。この
文献の方法は、リガンドを担体へ結合する為に酸基を必
要とするのでコレステロールオキシダーゼ基質類似体と
して胆じゅう酸の使用を必要とする０例えばこの文献に
記載の好ましい態様において胆じゅう酸類似体を最初に
カルボジイミドと反応させる。このカルボシイ（３） ミドは次いで高分子量多糖類と反応してリガンド結合支
持体を生成する。これは複雑で時間のかかる方法で−あ
る。

リガンドを結合する為の支持体を使用しない一つの方法
がラフイ等によるＣｈｅｓｓ、　Ｐｈａｒ（Ｂｕｌｌ、
＋２６　（９）　、２７９９〜２８０４　（１９７Ｂ）
に１コレステロール上の親和性クロマトゲラフィードオ
キシダーゼの精製”と題して記載されている。

この文献はその標題が示すように親和性クロマトグラフ
ィーのリガンドとしてコレステロール自身の使用を開示
している。コレステロールを用いた有用なりロマトグラ
フィーベッドを形成する為に、文献はコレステロールを
沸騰させ、コレステロールを水に沈澱しうるようにする
ことを開示している。この方法によりコレステロールオ
キシダーゼは精製することができるが、この方法にはい
くつ（４） クロマトグラフィー材料から溶出する。多くの目的の為
にコレステロールオキシダーゼ溶液中の高レベルのドラ
イド＾−１００はそれ自体汚染物であり、そして除去さ
れねばならない０例′えば、高レベルの界面活性剤を含
む溶液からコレステロール　矛キシダーゼを凍結乾燥す
ることは不可能でないにしても困難である。この高レベ
ルの界面活性剤を除去する為に必要な次の工程では、望
ましくない量のコレステロールオキシダーゼの活性が失
なわれる。この方法のもう一つの欠点は精製すべきコレ
ステロールオキシダーゼがコレステロール、クロマトグ
ラフィー材料を含む反応を触媒し、それによって前記材
料を減成し、そして汚染物として望ましくない過酸化水
素を生成することである。過酸化水素は強力な酸化剤で
あり、そして酵素の安定性を減少させるので最終生成物
中に含まれるのは望ましくない、またコレステロールオ
キシダーゼに過酸化水素の生成を測定する分析に頻繁に
用いられる。＊素調製物の汚染物として過酸化水素は、
この調製物を用いることによる分（５） 析に悪影響を及ぼす。

本発明は、複雑な支持リガンドの使用を含まず、一方間
時に高レベルの界面活性剤又は過酸化水素のような他の
物質で汚染されない生成物を生ずるコレステロールオキ
シダーゼ楕製法の提供に関する問題を解決することを目
的とする。

この問題は、 （ａ）精製すべきコレステロールオキシダーゼの溶液を
クロマトグラフィ組成物と接触させてコレステロ−少オ
キシダーゼを練成物上に吸着させ、（ｂ）クロマトグラ
フィー組成物から溶液を分離し、゛そして（ｃ）クロマ
トグラフィー組成物を、界面活性剤を含む溶離液と接触
させてコレステロールオキシダーゼを回収する工程を含
むコレステロールオキシダーゼの精製法において、（１
）クロマトグラフィー組成物が、コレステロールオキシ
ダーゼの非基質である非結合、水不溶性ステロイドを含
み、そして （２）溶離液中の界面活性剤の濃度が溶離液の０．００
０１〜ｌＯ重量％であることを特徴とする特許 コレステロールオキシダーゼの精製法を提供することに
より解決される。

本発明は前記クロマトグラフィー組成物の使用を必要と
する。このような組成物を用いる場合、吸着コレステロ
ールオキシダーゼは、非常に低レベルの界面活性剤を含
む溶離液によりクロマトグラフィー組成物から除、かれ
る、３βステロイドはクロマトグラフィー組成物とコレ
ステロールオキシダーゼとの間に特殊な結合を容易に形
成することができ、そしてそれ故好ましい。しかしなが
ら３αステロイド並びに３位に２重結合を有する化合物
も有用である。イオン交換クロマトグラフィー材料によ
る、生育培地を含むコレステロールオキシダーゼの前処
理によりコレステロールオキシダーゼの収率が更に改良
される。一層の改良において、溶離液中に少量の金属塩
を組み入れることにより、溶離液に必要な界面活性剤レ
ベルが更に一層減じられることを見出した。この方法に
より非常に低濃度の界面活性剤汚染物しか含まない、そ
して実質的に過酸化水素を含まないコレステロ（７） −ルオキシダーゼが高収率で製造される。

工程（ａ）におけるコレステロールオキシダーゼを含む
溶液が、イオン交換クロマトグラフィー材料と接触した
微生物生育培地である場合、本発明方法は特に有用であ
る。

ステロイドは、互いに結合してシクロペンタノパーヒド
ロフェナントレンと呼ばれる構造単位を形成する一連の
４（ｌの炭素環からなる化合物である０本発明方法に有
用であるステロイドは水不溶性である。即ち、ステロイ
ド核は酸基のような可溶化基で置換されない、（“不溶
性”という表現は、゛コレステロール自身と同じオーダ
ーの大きさの溶解性を意味する。）コレステロールの溶
解性は０．２■／１００ｍ１未満であ名０例えばカルボ
キシル基を有するステロイドである胆じゆう酸は、非結
合層じゅう酸を含むクロマトグラフィー組成物が工程の
間に熔解するので本発明方法に有用でない０本発明方法
に有用な好ましいステロイドは３βステロイドである０
、この明細書全体を通じて、ステロイド核の番号付は並
びに種々の基質の配置（８） の命名、即ちα又はβは、慣用通りに行う、３βステロ
イドは、非常に特異的なコレステロールオキシダーゼ−
リガンド共役物を容易に形成することができる。おそら
く、それはコレステロール自身が３β配置をとっており
、そしてそれ数本発明の範囲内のクロマトグラフィー組
成物として特に。

有用であると思われる。からである、ステロイドの混合
物も有用である。

有用な水不溶性３βステロイドである化合物の頬には、
例えばコレステロールエステル及びエーテルが含まれる
。これらは、コレステロールの３β水酸基がエステル、
即ち０ＯＣＲ基へ転化されたか、又はエーテル、即ちＯ
Ｒ基へ転化されたコレステロール誘導体である０本発明
方法の目的には、Ｒ基は好ましくは炭素数１〜約１８の
アルキル基である。これらのうち、低級アルキル基、即
ち炭素数１〜６のアルキル基が、以下に記載するように
クロマトグラフィー床を形成するのに用いる水混和性有
機溶媒に容易に分散しそして本発明方法におけるコレス
テロールオキシダーゼの回収（９） を改良するので、好ましい、他の有用なＲ基には、非可
溶化基で置換されたフェニルのようなアリール、及び非
可溶化基で様々に置換されたアルキルが含まれる。

水不溶性３βステロイド化合物のもう一つの好ましい頬
には、３β水酸基が、プロミドもしくはクロリドのよう
なハロゲン、またはニトレート、クロロホルメートもし
くはメルカプタンのような他のイオンで置換されたコレ
ステロール誘導体が含まれる。

前記コステロール誘導体は好ましい水不溶性３β−ステ
ロイドであるが、他のステロイド及びその誘導体も有用
である。他の有用なステロイドにはβ−エステムＪレオ
イル（β−ｅｓｔｅｍｌｏｉｌ　）　、並びに、シトス
テロール、スチグマステロール、カンペステロール、デ
スモスチロール及びエルゴステロールのような植物ステ
ロールが含まれる。３β−ステロールから誘導したある
４−エン−３−オンステロイド、例えばコレステノン及
びシトステノンも有用である０本発明方法においてクロ
マ（１０） トゲラフイー組成物として有用な水不溶性３βステロイ
ドの特殊な例は次の通りである。即ちコレステリルアセ
テート、コレステリルプロミド、コレステリルクロリド
、コレステリルホルメート、コレステリルオレ−ト、コ
レステリルニトレート、コレステリルオレート、コレス
テリルパルミテート、コレステリルブチルエーテル、コ
レステリルブチルエチルエーテル、コレステリルメチル
エーテル、コレニー４−エン−３−オン、コブロスタン
−３α−オール。

前記ステロイドのうちコブロスタン−３α−オールは、
有用である３αステロイドの例である。

コレニー４−エン−３−オンは、３位に２重結合を有す
るステロイドの例である。

非結合形態の前記ステロイドを含むクロマトグラフィー
組成物は充填床の形態で用いるのが有利である。“充填
床”という表現は、精製すべき溶液が通過することがで
きる十分な多孔性を備えた物質の体積又は嵩を意味する
。“非結合゛という表現は、ステロイドが日本特許公開
公報第３７８８５／　１９７９号の多糖類支持体のよう
な支持体と反応しないことを意味する。前記組成物は場
合によっては、緩衝剤、不純物及び濾過助剤のような他
の成分を含む、更に組成物は場合によってはポリマービ
ーズのような成分を含み、組成物に多孔性を付与する。

精製すべきコレステロールオキシダーゼの溶液は前記ス
テロイドの充填床を単に通過する。

コレステロールオキシダーゼはステロイドに吸着され、
一方不純物を含む溶液の残りは、充填床を通過し、そし
てそれ故クロマトグラフィー組成物から分離される、吸
着コレステロールオキシダーゼを含むクロマトグラフィ
ー組成物は次いで溶離剤で洗浄し、コレステロールオキ
シダーゼを除去する。（溶離剤は一つの物質をもう一つ
の物質から抽出する液体であり、この場合はコレステロ
ールオキシダーゼをクロマトグラフィー組成物から抽出
する。）溶離剤による洗浄に先立って緩衝液で吸着コレ
ステロールオキシダーゼを含むベッドを洗浄することは
望ま：しい場合が多い。

本発明方法に有用な充填床を形成する一つの特にこのま
しい方法では、最初にステロイド（又はステロイド混合
物）を水不混和性有機溶媒に懸濁サセる。ステロイドの
表面をぬらし、そして均一な懸濁液が生成できるような
溶媒を選択する。この懸濁液、へ約９０容量％までの水
を添加する。均一充填床は、単に得られた懸濁液を濾過
手段上に注ぐことにより形成する。濾過手段は濾紙片で
あるか、又は好ましい態様ではガラス管の一端に詰めた
ガラスウールプラグの形態である。結果としてカラム形
状の非常に均一充填床が得られる。充填されたカラムは
大量の水で洗浄し、痕跡程度の水不混和性有機溶媒を除
去する。有用な水不混和性有機溶媒には、例えばメタノ
ール、エタノール、プロパツール及びジメチルスルホキ
シドが含まれる。

本発明方法は溶液からコレステロールオキシダーゼを分
離し、そして精製するのに有用である。

本発明方法は、コレステロールオキシダーゼが生産され
た微生物生育培地、例えば使用又は少なくとも一部使用
された培地からコレステロールオキ（１３） シダーゼを分離し、そして精製するのに特に有用である
０本発明方法は、コレステロールオキシダーゼが細胞外
に生産された生育培地からコレステロールオキシダーゼ
抽出するのに特に有用である。

細胞外コレステロールオキシダーゼを生産する有れる。

微生物を好気的に生育させることによりコレステロール
オキシダーゼを生産した後、微生物細胞を使用生育培地
から濾過するのが好ましい、微生物がコレステロールオ
キシダーゼを内部に生産する場合は、この濾過工程の前
に酵素製造に慣用であるように細胞を破壊する必要があ
る。得られた細胞を含まない生育培地には、コレステロ
ールオキシダーゼの他く、最初の生育媒質の残留物、並
びに微生物成長の他の生産物が含まれる。この細（１４
） 胞を含まない生育培地自体は水不溶性ステロイドクロマ
トグラフィー組成物と接触させることにより精製される
が、多くの場合に、コレステロールオキシダーゼ精製に
先立って、微生物によって生産された。他の生産物のあ
るものを最初に除くことが望ましい、好ましくはこの前
処理において、酵素溶液をＤＥＡＥ又はＴＥＡＥ−セル
ロース（３次元架橋多糖類の官能基上にジエチルアミノ
エチル又はトリエチルアミノエチル基を有する微塩基性
アニオン交換体）、又はＣＭナセルース（３次元架橋ポ
リマー上にカルボキシメチル官能基を有する微酸性カナ
。オン交換体）によるイオン交換クロマトグラフィーに
付す。

この前処理工程の為の他の有用な物質は、スノーク及び
クラインによる米国特許第４０５５４６９号に記載され
ている。この前処理工程は最終生成物におけるコレステ
ロールオキシダーゼ活性のロスをきたさないことが見出
された。

精製すべきコレステロールオキシダーゼ含有溶液を水不
溶性ステロイドと接触させて本発明方法を実施する。こ
の接触工程は種々の方法で実施することができる０例え
ばステロイドをコレステロールオキシダーゼ含有溶液へ
単に添加することによって（バッチ方式）か又は、より
好ましくは前記方法により調製した充填床もしくは充填
カラムを使用することによって実施する。コレステロー
ルオキシダーゼ含有溶液を単にカラム上へ注ぎ、そして
コレスチロールオキシダーゼをステロイドに吸着させる
。コレステロールオキシダーゼを除いた溶液は、溶液を
カラムに通過させるか、又はバッチ方式においては濾過
することによりステロイド−から分離する。

コレステロールオキシダーゼをステロイドへ吸着させ、
そして残りの溶液を分離した後、コレステロールオキシ
ダーゼを、ステロイドを界面活性剤溶液で洗浄すること
によりステロイドから遊離する。この溶離工程の前に、
コレステロールオキシダーゼが吸着している。、ステロ
イドを場合によっては緩衝溶液で洗浄する−ことにより
中性ｐＨへ平衡化する。適切な緩衝剤には、ホスフェー
ト及びジメチルグルタレートが含まれる。

溶離液は界面活性剤を含む水溶液である。任意の広範囲
の界面活性剤、例えばカチオン性及びアニオン性界面活
性剤、並びに非イオン性界面活性剤が有用、である、有
用な界面活性剤は、例えばポリ（エチレングリコール）
、ポリ　（ビニルアルコール）、ポリエーテル、ポリエ
ステル、ポリハライド、ポリ　（オキシエチレン）アル
コール、ポリ（グリシドール）、オクチルフェニルポリ
エトキシエタノール及びアルキルポリエトキシエタノー
ルのような非イオン性界面活性剤であ、カチオン性界面
活性剤は例えばセチルトリメチルアンモニウムクロリド
のような第４級アンモニウム化合物が有用である。デオ
キシコレート及びナトリウムドデシルサルフェートのよ
うなアニオン性界面活性剤も有用である。好ましい界面
活性剤は、非イオン性界面活性剤トライトンＸ−１０（
Ｆ’（ペンシルバニア州、ライラデルフィアのロームア
ンドハース社から入手できるオクチルフェニルポリエト
キシエタノール）及びタージトール（Ｔｅｒｇｉ　ｔｏ
ｌ）（１７） １５−５−Ｐ（ユニオンカーバイド社から入手できる、
アルキル基の炭素数が７のアルキルポリエトキシエタノ
ール）である、これらの界面活性剤は低濃度の吸着コレ
ステロールオキシダーゼを高いパーセントで溶出する。

界面活性剤の混合物も溶離液中で有用である。

溶離液中の界面活性剤の量は、主に溶離剤中の金属塩の
存在又は不存在に依存する。界面活性剤の量は、少しで
はあるが特定のステロイド、特定の界面活性剤及びｐＨ
１並びに他の要因にも依存する。界面活性剤の最適量は
、これら他の因子を選択したならば容易に決定される。

一般に溶離液中の界面活性剤の有用な量は溶離液の０．
００１〜１０重量％である。金属塩を用いる場合、前記
範囲の下限の濃度の界面活性剤を有する溶離剤が有用で
あるが、この範囲の上限の界面活性剤濃度は金属塩を用
いない場合に必要である０本発明の利点は、金属塩が不
存在の場合でさえ比較的低レベルの界面活性剤しか必要
としないことである。好ましい態様では、溶離剤は１重
量％以下の界面活（１８） 性剤を含む。

本発明の特に好ましい態様では、金属塩を溶離液中で界
面活性剤と共に用いる。金属塩の使用により、ステロイ
ドからコレステロールオキシダーゼを少量の界面活性剤
を用いて除去することができる。金属塩溶液単独ではス
テロイドからコレステロールオキシダーゼ、を溶離せず
、そして同様に非常に低レベルの界面活性剤単独ではス
テロイドからコレステロールオキシダーゼを溶離しない
のでこれは特に驚くべきことである。金属塩と組合せた
低レベルの界面活性剤はコレステロールオキシダーゼを
非常に有効に溶離する。

有用な金属塩には、リチウム、ナトリウム又はカリウム
クロリド又はプロミドのようなハロゲン化物が含まれる
。他の有用な金属塩にはサルフェート及びニトレートが
含まれる。

金属塩は広範囲の濃度にわたって溶離液に存在する。界
面活性剤の量に関する場合と同様に、金属塩の最適濃度
は、他の本□発明方法におけるパラメーターを選択した
なら簡単な実験により容易に決定される。一般に金属塩
の量は０．００５〜１．０モル（Ｍ）である。

コレステロルオキシダーゼを含む溶離剤は種々の方法に
有用である０例えばこの溶離剤はコレステロール分析の
為の湿式分析に直接的に有用である。場合によっては溶
離剤を更に処理して、凍結乾燥によるような乾燥形態で
コレステロールオキシダーゼを回収する。

例において特にことわらない限り以下の操作を通用する
。

酵素生産 地方の土壌から単離したストレプトミセスのある種（ｓ
ｐｅｃｉｅｓ　）を、栄葺培地を含む２．８１容フエル
ンバソハフラスコ中で好気的に生育した。栄養培地には
、５００ｍＪｌ中にグリセリン０．５％、酵母抽出物２
．０％及び痕跡程度の塩を含むホスフェート０．２％が
含まれた（重量％）、２４時間後に細胞を濾過により除
去した。コレステロールオキシダーゼは細胞を含ｉない
生育培地（ＣＦＭ　）中に残留した。

試料調製 ストレプトミセス微生物の発酵から得られた細胞を含ま
ない濾液（ＣＰＭ）は透明な暗褐色流体（ｐＨ８，３）
であった、微生物により生産された着色物質により生じ
た暗色は、ＣＦ　Ｍ　ｌ　ｍ　１当りＤＢＡＢセルロー
”Ｘ　Ｏ，６ｇを添加し、２０分間攪拌し、そして濾過
することによりオキシダーゼ活性をロスすることなく除
かれた。コレステロールオキシダーゼは透明な黄琥珀色
濾液フラクシツン（Ｄ　Ｅ）（ｐＨ１８，３）に残留し
た。酵素活性は４℃で貯蔵した時少なくとも１週間安定
であった。

コレステロールオキシダーゼ活性分析 酵素活性はベックマン２５に分光光度針で３７℃、４３
０ｎ−においてパーオキシダーゼ合体（ｃｏｕｐｌｅｄ
　）反応により連続的に測定した０分析混合物には１ｍ
ｊｔ中に、カリウムホスフェート緩１％、ホースラディ
シエバーオキシダーゼ２８マイクログラム　（３，８プ
ル７°ロガリン単位）及び（２１） ７．８ミリモル溶液として添加した。５分間の温度平衡
化の後、コレステロールオキシダーゼを添加して反応を
開始した。コレチロールオキシダーゼ１単位とは、前記
分析条件下で１分当り１マイクロモルの過酸化水素を生
成するものと定義する。

蛋白質分析 蛋白質分析はＬｏｗｒｙ法に従って実施した。牛血清ア
ルブミンを蛋白質対照とした。（０」ルＯＭｒｙ＋Ｎ、
Ｔ、　Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ＋Ａ、　Ｌ、　Ｐａｒｒ　
ａｎｄ　Ｒ，Ｊ、　Ｒａｎｄａｌｌ。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｃｖ＋、、１９３．　　２６５−２
７５゜１９５１）。

カラム床から酵素を溶離するのに用いる濃度はＧａｒｅ
ｗａｌにより記載されているようにして測定した（Ｈ，
Ｓ、　Ｇａｒｅｗａｌ＋＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　
、＋５　’Ｌ　３１９−．３２４．　１９７３）。

（２２） をメタノールに懸濁した。水を最終体積約２０％になる
まで攪拌しながら添加した。一般に水で湿潤することが
できるが、水に不溶性である材料を底に沈降させた。充
填されたカラムはｐＨ７，０の０．０１Ｍカリウムホス
フェート緩衝液で平衡化した。試料を充填されたカラム
へ適用し、次いで連続的に緩衝液洗浄及び、溶離剤洗浄
（界面活性剤単独又は界面活性剤塩のいずれか）を行な
い、引きで最早明らかでない時吸着剤は完全に再生され
た）。

Ｎ 例において、多くの場合に、精製すべき溶液中で最初に
測定した活性より大なる活性がカラムから回収されるこ
とに注目されたい、これは少なくとも幾分かは精製の間
にコレステロールオキシダーゼインヒビターが除去され
ることによると思われる。

例１　コレステロールオキシダーゼの精製細胞を含まな
い培地４８．５　ｍ　ｌ中の粗酵素フラクシヨンを得、
モしてＤ’Ｅ　Ａ　Ｂセルロースイオン交換クロマトグ
ラフィーに付した。コレステＩＪ　Ｊレフロリド１．０
ｇを用いてクロマトグラフィーカラムを調製し、−モし
て粗酵１　（ＤＢ濾液）を通用した。

次いでカラムを緩衝溶液（５１９ｍ＆）で洗浄シ［Ｆ］ た、吸着酵素を次いで０．１％トライトンｘ−ｔｏ。

１９ｍＩｔを用いてカラムから溶離した。弓１き＠も）
で界面活性剤を、アンノく一うイＰＸＡＤ−２ビーズ上
へ吸着させることによりｉｌＩ製物力＼ら除去した。

即ち０．１％ドライドＰｘ−１ｏｏ溶出液１ｍｌ当りビ
ーズ５ｍｇを室温で２０分間攪拌し、次（、ｓで濾過に
より除去してＸＡＤ濾液を製造した。

表１は方法全体を通じて各溶液の分析を示す。

分析は用いた溶液の体積に関して実施した。

オキシダーゼの比活性はこの方法の結果１１８倍まで増
大した（１４．２Ｕ／蛋白質１ｗ対０．１２Ｕ／蛋白質
１■）、また表１に示すよう番こ、出発活性の６ｇ％（
合計単位４６）が最終物質中で回収された。ＸＡＤ−２
ビーズ濾過工程の前に出発活性の９５％（合計単位６５
）が回収された。

以下余白 例２　コレステロールオキシダーゼの吸着剤こして有用
な化合物 試験化合物（表２に示す）０．１ｇを含むパスツールピ
ペットカラムを前述の如く調製した。コステロールオキ
シダーゼ０．４５単位を含む酵素調製物を各カラムへ適
用した。カラムをｐＨ７，０の１０ｍＭカリウムホスフ
ェ、−ト緩衝液３　ｍ　ｌで洗浄し、［Ｆ］ 次いで吸着剤を緩衝液中の０．１％トライトンＸ−１０
０を用いてカラムから溶離した。一般に界面活性剤溶出
液は透明で無色であった０表２に示すごとり、コレステ
リルニトレート、コレステリルクロリド及びコレステリ
ルホルメートは用いた非常に有効な物質であった。

以下余白 表２ 溶離した最初の 化　　　合　　　物　　　溶液の活性％コレステリルア
セテート　　　　　　７８コレステリルプロミド　　　
　　　　７８コレステリルクロリド　　　　　　　１１
６コレステリルホルメート１０９ コレステリルニトレート２９ コレステリルニトレート　　　　　　１２４コレステリ
ルオレート　　　　　　　２０コレステリルパルミテー
ト　　　　　６７コレステリルブチルエーテル　　　　
７８コレステリルエチルエーテル　　　　６０コレステ
リルメチルエーテル　　　　６２コレスー４−エン−３
−オン　　　　８９コブロスタン−３α−オール　　　
　８９１　コレステロールオキシダーゼの溶離剤として
の種々め界面活性剤 第３表に示す種々の界面活性剤をコレステロールオキシ
ダーゼの溶離剤として試験した。コレステリルアセテー
ト含有パスツールピペットカラム（床ボリューム０．５
　ｍ　ｌ　）を調製し、そして２ｍｌ中に２．４単位を
含むコレステロールオキシダーゼ調製物を通用した。各
カラムを２　ｍ　ｊｉの水、０．１％界面活性剤及び１
．０％界面活性剤で連続的に溶離した。水で活性は全く
溶離しなかった０表３に［有］ 示すように非イオン性活性剤、タージトール１５−８−
７及びドライド八−１００は０．１％濃度で非常に有効
であり、そしてそれより高濃度によっても更に酵素は溶
離しなかった。デオキシコレート界面活性剤に関しては
、低レベルの界面活性剤によって、カラムへ通用した最
初の活性の４％のみしか回収されなかった。

以下余白 （２８） 表３ １．０ 護（コレステロールオキシダーゼの界面活性剤溶離に関
する塩の有益な影響 コレステリルアセテート含有パスツールピペットカラム
（比容積０．４　ｍ　ｌ　）を調製し、０．１％ト■ ライドンＸ−１００次いで水で洗浄した（界面活性剤濃
度は重量基準）、２ｍＪ中にコレステロールオキシダー
ゼ１．８６単位を含むＤＥＡＥセルロースフラクシリン
を前述のごとくして得、そして各カラムへ適用した。　
２ｍ＃の水、０．００５％ドライドＰｘ−１００、表４
ニ記ｒａ（Ｄ濃度０：）塩（ＬｉＣ１゜ＮａＣ１又はＫ
ＣＩ　）を含む０．００５％ドライド八へ１００で連続
的にカラムを溶離した。０．００゛５％濃度のドライド
Ｐｘ−１ｏ　ｏ単独ではカラムからコレステロールオキ
シダーゼを溶離しないことが観察された。ｏ、ｏｉ〜１
．ＯＭの塩単独でも溶離剤として有効でないことが見出
された。しかしながら少量のドライドＰＸ−１ｏ　Ｏ（
０，０Ｏ５％）を表４に示すとと＜０．０１〜０．５Ｍ
濃度の塩と合わせた時、酵素回収はすぐれ、特に０．Ｏ
ＩＭ及び０゜０５ＭのＬｉＣ１を用いた場合にすぐれた
結果が得（３０） られた、０．００５％トライトンＸ−１００塩溶液でカ
ラムをｆ４離した後、０．１％ドライド八へ１００溶液
でカラムを溶離した。各場合に、最初のコレステロール
オキシダーゼ活性の実質的にすべての残りがカラムから
回収された。

以下余白 （３１） 肚精製工程に及ぼす外部からの物質の影響細胞を含まな
い培地（ＣＦＭ）から直接得られたフラクションと、Ｄ
Ｅｆ４Ｅセルロースクロマトグラフィー（ＤＩりに更に
付したフラクシヨンの二つのフラクションを、コレステ
リルクロリド各１．’Ｏｇを含む別々のカラムへ適用し
た。カラムを１０ミリモルホスフエート緩衝液、次いで
０．１％ドライドへ−１００で溶離し、そして得られた
酵素調製物の活性を分析した。ＣＦＭフラクシ日ンから
の吸着活性はＤＥフラクシッンからの１９．２０に比べ
９．２Ｕであった。

肛　コレステロールオキシダーゼを吸着させる為のコレ
ステロールアセテートカラム及びコレステリルクロリド
カラムの反復使用 コレステリルアセテ−）　０．１　ｇ及びコレステリル
クロリド０．１ｇを含むカラムを調製した０種々の濃度
のコレステロールオキシダーゼ（表５に示す）を各カラ
ムへ適用した。各カラムを３　ｍ　ｌの１０ミリモルカ
リウムホスフェート緩衝液（ｐＨ（３３） ７．０）で洗浄し、次いで酵素を３　ｍ　ｌの前記緩（
ｉした。水をカラムに通して、残留したドライド声Ｘ−
１００を除去し、そして吸着剤を再生した。

コレステロールオキシダーゼを再びこれらのカラムへ適
用し、そしてこの操作を合計６回反復した。

表５に示すごとく、各吸着剤は試行の間の水洗により再
生した。

以下余白 （３４） 表５ 溶離単位 コレステリル　　コレステリル 試行　適用単位　アセ、テート　　　クロリド１　　　
０．４５　　　　０．３５　　　　　０．５２２　　　
０．３２　　　　０．３７　　　　　０．４３３　　　
０．４４　　　　０，５０　　　　　０．５３４　　　
０．４４　　　　０．５３　　　　　０．５６５　　　
０．４３　　　　０，４９　　　　　０．５２６　　　
０．４１　　　　０．４７　　　　　０．４９コレステ
ロールオキシダーゼは例えば試料中のコレステロール量
の定量に有用であり、そして精製コレステロールオキシ
ダーゼはこのような定量を改良するので、本発明は工業
的に適用することができることは明らかである。

以下余白 （３５）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ａ）＄％製すべきコレステローオキシダーゼの溶液と
   クロマトグラフィー組成物とを接触させて前記コレステ
   ロールオキシダーゼを前記組成物上に吸着させ、 （ｂ）前記溶液を前記クロマトグラフィー組成物から分
   離し、そして （ｃ）前記クロマトグラフィー組成物を、界面活性剤を
   含む溶離液と接触させて前記コレステロールオキシダー
   ゼを回収する工程を含むコレステロールオキシダーゼの
   精製方法において、（１）前記クロマトグラフィー組成
   物がコレステロールオキシダーゼの非基質である非結合
   、水不溶性ステロイドを含み、そして （２）前記溶離液中の前記界面活性剤の濃度が溶離液の
   ０．０００１〜１０重量％であることを特徴とするコレ
   ステロールオキシダーゼの精製方法。 （１）