JPS6091982A - デキストラン−サツカラ−ゼの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の目的は、酵素を産生°する細菌培養上澄液を出
発原料として、Ｗ累、テキストランーサッカラーゼを同
時的に精製し濃縮する方法に関する。

テキストランは、蔗糖の＃素転１花によって得られるグ
ルコーズポリマーである。この多糖類はその分子量によ
って様々な工業的利用が試みられている。例えば高分子
量のテキストランは石油工業に粘性増強剤として、中程
度分子量のテキストランは食品工業に、また低分子量の
ものは医薬品工業に利用さ第１ていることが指摘できる
。

多数の細菌株のうち、テキストランーサッヵラーゼ活性
を有するものは、ンクトバチルス、ストレプトコッカス
、またはロイコノストック属ＫＪ！＋している。この最
后のもののうち、ロイコノストック・メセンテロイド（
Ｌｅｕｃｏｎｏｅｔｏｃ　Ｍｅｅｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ
）ＮＲＲＬ　Ｂ　５１２ｆｐ１株は蔗糖の存在下に培養
されるときは＃素テキストランーザッヵラーセを排出し
、特に安定性、優れた生産性ならび＾ｌ：病源性と云う
極めて興味深い特性を示し、工業利用が可能である。さ
らにこの細菌株から得られたテキストランーサツカラー
ゼは、＆めて分枝の少７エい’ＥＭ幼デギストンン（９
５チがα１−＋６グリコシド結合）で水忙町溶のものを
胎生する。こうした性質は工業手極めて興味深いものが
ある。

ロイコノストック・メセンテロイドＢ５１２ｆＦ）のテ
キストランーサンヵラーセをオリ用゛スるテキストラン
の酵素合成」業プロセスは、現実には様々な不都合が存
在する。

事実、工業プロセスは大型仕様の醗醇タンク内でデキス
トシンーサッカラーゼ酵素を生産する点にあるが、いっ
たん細菌り、メセンテロイド凪Ｂ　５１２（Ｆｌが排出
した酵素は、僅かにあるいは全（ｆＩＩ製されないま＼
その基質である蔗糖と接触するので、そこでは、合成条
件を有効に制御できないま＼に粗デキストランが産生ず
る。引きっＶきこのデキストランは回収と精製を目的と
して種々な物理−化学的処理をうけ、この反応の綜合収
率はその為に比較的低い。

本発明では、ロイコノストック・メセンテロイドのテキ
ストラン−サラカラー七酵素の精製を経済的に行う方法
の発明を目的とし、就中、連続的に作用する酵素の生産
プロセス中に容易に組入れうる方法が対象である。簡単
でかつ著るしく有効な、今日の発明の目的でもある精製
技術に関連して借られた高い生産性が、工業上のこの酵
素製剤の利用を正当化し、とりわけ合成条件の精確な制
御によって当該応用分野ごとに様々なタイプのデキスト
ランを生産する事を可能ならしめているのである。

酵素的合成プロセスの近年の発達は、研究者達ｔｌＷ素
ｆｉＩＩ製問題を横側する事を余儀なくさせている。こ
の目的に対し、て多数の精製技術が利用されてきたが、
−例としてｒ過及びその変形としての限外Ｐ遍、及び超
限外Ｐ通、遠心分離、クロマトグラフィー、沈殿、いわ
ゆる相の相互部分的混合現象を利用して近年開発された
液−液抽出をあげる事ができる。この問題に対して引用
し得る事はＭ、Ｒ，クラの研究（応用生化学及び生物工
学誌２巻７１及び９５頁、アカデミツク・プレス社刊１
９７７年及び米国特許第１４４１３０号）であり、彼は
、ポリエチレングリコールとデキストランの２種のポリ
マー間の相の相互部分的混合を利用する各種酵素の精製
技術を述べている。すなわち、この両者は、ある濃度範
囲の水溶液では、元来混じり合はないものであり、しか
も、作業条件で２つの相の一方または他方忙対する溶解
度、あるいはその親和性を変数として培養液中に存在す
る物質の分配を生ずる明確な２つの液相の出現をもたら
すのである。

デキストラン−サッカラーゼ産生株の培養液は。

除去が大切な他の細胞外酵素を含んでいる。就中、ロイ
コノストック・メセンテロイド型の株によって排出され
、蔗糖を利用し得る蔗糖分解性酵素２種、すなわちレバ
ン−サッカラーゼ及びインベルターゼが存在する。この
両酵素は特に不都合であり、一つにはデキストラン収率
を低下させ、一つにはデキストラン生産の十分な制御を
妨害するからである。この２種の汚染活性は次の模式図
に省く事ができる； ブドー糖の存在は汚染活性となる：事実、デキストラン
−サッカラーゼのみの溶液は蔗糖の存在により遊離型の
ブドウ糖を全く生産しない。それ故に、テキストラン−
サッカラーゼ活性の測定に際し、精製の進捗に応じて表
われるブドー糖と果糖の相対パーセントの分析が酵素純
度の尺度である。

本発明の目的は、相の相互部分的混合による独自ガ液−
液抽出を活用してデキストランーサツカラーゼ酵素の精
製と濃縮を同時的に効率良く、簡単かつ経済的に実施し
うる方法を提出して、上述の諸欠点を補う点にある。

本発明の目的は、さらに、細胞外ｒｆ？素を産生ずる細
菌ロイコノストック・メセ□ンテロイドの蔗糖培養液を
出発原料としてデキストラン−サラカラー七酵素を同時
的に精製し濃縮する方法にあって。

前述の培宜液をＪ、デキストランを含損するものであり
、第１段においてはポリエーテル水溶液を培養液に対し
、その中で混合し得ない２つの相が出現する如き量で添
加し、次ぎにこの培養液を２種のポリマーと生物−化学
的物質との緊密で長時間にわたる接触が確保しうるよう
攪拌下に維持し、さらにＪ　２段に於いては、デキスト
２ンに富む培養液の下方相をポリエーテルに富む上方相
と分＃ｔし、その際、下方相はデキストランーザッヵラ
ーゼを富化せしめた酵素製剤を構成する点にある。

この方法は分離によって培養液を２つの相として表わす
ニ 一層の１つはデキストランに富む重い相で零に近い分配
系数： に＝Ｏ上方相／Ｃ下方相 をもつ濃縮され精製されたデキストラン−サッカ２−七
酵素を含んでいる。

〜今１つはポリエーテルに富むずっと軽い相で不純分を
含み、就中、汚染酵素活性と同様にたん白質と蔗糖を含
む、除去されるべき相である。

本発明の方法において利用しつるポリニーデルの例とし
て指摘しうるものは次の通りであるニーポリエチレンク
リコール（Ｐ、［、Ｇ、）−ボリプロヒレンクリコール 及び次の如きこれらの訪導体： −メトギシポリエチレンダリコール ートリメチルアミン・ポリエチレンクリコール ーホリエブーレングリコールのスルホン酸塩、ブよと一
一一 使用するポリエーテルの平均分子量は通常４００〜２．
ＯＤＤである。この分子量は培養液中に存在するテキス
トランの性質によって選定する。

添加するポリエーテルの量は一般に、その趨加後の培養
液のポリアルコール製表が１〜１５重量％となる如きも
のである。最適濃度は培養液中のテキストラン製置によ
って決める。

この方法は室温で、即ち最高でも３０℃に等しい温匿で
十分活動する。さらに培養液のｐＲは一般に４．５〜７
の間にある。

方法の便宜上、予じめ培養液からたとえば遠心分ｉａｅ
　Ｋよって細胞を除去することが１利である。

前記Ｍ、Ｒ，クラの研究によれば、（目の相互部分的混
合現象を利用１して酵素を精製しつる事が判っている。

一方、酵素は精製過程において２つの相に分配される’
１１．．Ｌかしながら酵素の精製部分は埒。

ら上方のＰＥＧ相で得られ、下方のテキストラン相は元
来細胞残渣及び培養液中に存在する不純分の捕捉に役立
っている事が明らかとなってきた。

そこで、出願人が確認した点は、本発明の方法において
はデキストランーサソカラーーピのはｙ全量が下方相の
デキストラ／に随伴し、他の汚染酵素活性は尋ら上方相
のポリエーテルに移行する事であった。下方のデキスト
２ン相は凍だテギストランーザツカラーー＋ｉ酵素製剤
ビＪとして役立ち、したがってそれだけにますますこの
精製が一層濃縮を伴う事になって下方相の体積は相の相
互部分的混合を５けた培養液の体積のｌｊｌ、％に相当
する。

当然ながら、この方法は２つないしそれ以上の多段操作
が可能である。それは順次前段の終る下方相が、場合に
より操作の容易さのために若干希釈した後、同様の操作
条件下に相の相互的部分混合によって新たに抽出をうけ
るのである。

この多段精製方法は向流作動型液−液抽出塔内で連続的
に実施しうる。

本発明の方法を以下の実施例によって例証する。

その説明には次の定義が必要である。

酵素活性の定義 蔗糖を出発原料として、主として３種の酵素反応が生じ
うる： カラーゼ −ｎ　Ｇ−Ｆ　ｎＧ　＋ｎ？ インベルターゼ Ｇ−Ｆ　：蔗糖 Ｇ　：ブドー糖 Ｆ　：果糖 デキストラン−サッカラーゼ酵素は果糖のみを遊ａする
。レバン−サッカラーゼはブドー糖のみを遊離し、イン
ベルターゼは果糖とブドー糖の等量を遊離する。

蔗糖分解活性の測定でブドー糖生産が観察できる時は、
それは汚染活性、インベルターゼあるいはレバン−サッ
カラーゼの結果である。しかしながら、こうした結果を
明確に衾現しうるようブドー糖生産を、ひろく優先的に
存在しているレバン−サッカラーゼ活性に帰因せしめた
。かくして。

レバン−サラカラー七及びデキストラン−サッカラーゼ
の表中に見られる活性が定量された：すなわち： レバンーザツカラーゼ活性（Ｏ１２） ：遊離ブドー糖全量 デキストラン−サッカラーゼ活性（ＵＤＢ）：遊離果糖
全量 全蔗糖分解活性二果糖十ブドー糖 測定方法 １、　酵素活性の測定 ブドー糖及び果糖を％異的に検定するＫは酵素的検定方
法（ヘキソキナ−七／　ＡＴＰ、グルコ−・ズー６−ホ
スフエート・デヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＰ”、ホスホ−
グルコ−イソメラーゼ）を用いた。

全蔗糖分解活性はＤＮＳ　（ジニトロサリチル酸）試薬
を用いる還元糖全量（ブドー糖十果ａ）の検定を利用し
た：サムナー、Ｊ、Ｂ、生（物）化学雑誌４７巻５頁１
９２１年八 へ。たん白質の測定 ローリ−法を適用した； ローリ−、Ｏ，Ｈ，ローズプラ、Ｎ、Ｍ、、ファー。

Ａ、Ｌ、及びランドール、　Ｒ，Ｍ、生物化学雑誌１９
６巻（１９５１年）２６５−：、’７５頁３、　ポリマ
ー＠（デキストランまたはレバン）の測定 まず、存在しているポリエチレングリコール及びオリゴ
糖類を、分離限界１００，０００をもつ中空済紙筒（ア
ミコン社＃りＫよる限外濾過で除去し、ついでポリマー
をアンメロン試薬ニよって＠定ニスコツト、　Ｔ、Ａ、
及びメルヒン、Ｍ、Ｈ。

（１９５３年）分相化学雑誌２５巻、１６５６貰レバン
はＰ　、ヘルローの記載せる技術によって船具的に検定
できる。ツールーズＩＥＩ！１立応用科学研究所、工学
博士論文題Ｉｎ（１９８０年９゜デキストランはこの力
γ表ではｖｊ否と１農ら１ｆい串が証明された。

活性の言１算原理： 蔗糖（平均分子量３４２　）　１　”’Ｐは、ポリマー
（レバンまたはデキストラン：七ツマ−としての分子量
：　１６２　）の形で０．４ン４ｓ！及び遊離ｍ（果糖
またはブドー稲；分子量１８０）を０．５２６〜を生ず
る。

活性は、溶液の雌又はたん白質のキ当りをｊｌｉ位とし
て測定する。１４を位は、醋酸す！・リウム綾衝液２０
　ｍＭ、ｐＨ５，２中、３０℃で毎時１ツの蔗糖が転化
する皿を表わす。

培養液上澄液の生産 醗酵タンク内で、蔗糖の存任下に細菌ロイコノストック
・メセンテロイドＮＫ（Ｌ　Ｂ　５１２（Ｆ）を発育さ
せる。醗酵に邑っては蔗糖分解酵素及び特にテキストラ
ン−サラカラー七が細菌によって培養液内に排出される
。テキストラン−ザラカラー（酵素は培養液中でテキス
トランを合成する。

醗酵が停止すると、存在する細胞を遠心分離除去し、培
養液の上澄液を回収して精製プロセスにまわす。

実施例　１ この実施例では、上述したごとくにして取得した培養液
の上澄液の５００ｍ１Ｃ，次第［’ＰＪ’ｌｉＧ　１，
５００の５０％（重量／容量）水溶液の１７５峨を添加
処理し、磁力攪拌によって培養液の均質化を計る。

次いでデキストラン丁（方）相をＤＩＧの上（方）相か
ら分離する。この両相の１部分を分析Ｋかける。

さらにつｙい℃テキストラン相の２．７　ｍｌを採取し
、これを醋酸ナトリウム緩衝液２０ｒｎＭ、ｐＨ５，２
により４５峨迄希釈し、さらに相の相互部分的混合によ
って第２段の分離を実施してＰ’ＥＧ溶液１１７ｍ１を
加える。

得られた結果を以下の諸ｐにとりまとめた。

この結果（ＩＡ及びＩＢ）はプロセスの、Ｉ￥１段量（
３５％）　（Ｊ）　ｌ／　／＜ンの存在が明らかで、こ
の椹は上澄液中にレバン〜サツカラーセが存在すること
を示している。刀１１５るにこのレバンはデキストラン
とは逆にＰＥＧ相中に専ら（９０％）移行する。

表１Ｂにとりまとめた結果が示すものはブドー糖及び果
糖のみの＃［ではもっばらＰＦｆＧ相に移行し、その分
配係数に＝（ＯＰＥＧ土方相上方（Ｃデキストラン下方
相）がそれぞれブドー糖忙対して０．８４゜果糖に対し
て０．６５である（次の表１０参照）事である。

表１０の結果を吟味して確認できた点は濃度効果の点で
、デキスト２ンーサツカラーゼ活性のはとんと全部（９
０ｍ）が初期溶液の体積の約５−に相当する体積中にて
回収されているからである。

加うるに、培養液上澄液を出発原料として実施した相互
部分的混合が、デキストラン−サッカラーゼ活性の９０
饅を含有する初期溶液中に存在するデキスト２ンの僅か
［５３％のみが下方相に回収される峙長を認めている。

１Ｄ表にまとめた結果が示す所は第１段の相互部分的混
合の途次においてデキストラン−サッカラーゼ活性の本
質部分がデキストラン丁（方ン相に移行り、しかもレバ
ン−サッカラーゼはこの両相に同等に分配され、それぞ
れデキストラン−サッカラーゼに対しては０．００２５
３．またレバン−サッカラーゼに対しては０．０３３な
る分配係数をもつ事である。第２段の相互部分的混合に
おいてはデキストラン−サッカラーゼ活性の全部がデキ
ストラン相に移行する（分配係数÷０）。

実施例　２ この実施例では２段相互部分的混合法によりデキストラ
ン−サッカラーゼの精製及びこのものにたん白質（牛ア
ルブミンンを添加してその精製プロセスに対する影響を
吟味する点を例証する。第１段では培養液の上澄液２０
０ｍｆｆ１に対し牛アルブミン４１４４４を添加する。

次いでこの上澄液を実施例１に記述した２段プロセスに
したがって処理する。第１段で５０％（重量／容量）の
Ｐ訪１．５００の溶液５２峨を添加した。第２段におい
ては第１段から出て（るテキストラン相の６　ｍＱをと
り、実施例１％にて使用した緩衝液を用いて６３唯まで
希釈、さらにＰｉＧの１０．３ｍｌを加えて相の相互部
分的混合を実施する。得られた結果は第２表にまとめた
。そこでは、テキストラン相から大−ｆｉｔＫ（約９０
％〕除去されたたん白質が存在するにも拘らず、テキス
トランーサツカラーゼの特異的活性製置をテキストラン
相が示している。

実施例　に の実施例では、実施例１、に記載のプロセスで処理する
が、ただ一段である。培養液の上澄液２７９ｍＱに、Ｐ
ｆｆｉＧ　８９　ｍｌｌ［より外生的イ：ｙ　−＜　ル
ｐ　−ゼ１ｚｏ、ｏｏｏ単位を６≦加した。このインベ
ルターセ単位の添加は過剰のインベルターービの存在が
精製品質に及ぼす影響なｕ１究する目的のものである。

その結果は第６ａ表にまとめた。インへルター七単位の
過剰な存在はテキストラン相中のテＡ−ストラン−サッ
カラーゼの精製に伺らの変化も与えず、インへルターゼ
単位の９７％以上がＰＥＧ上方相に移行する事が判明し
た。

収率は６Ｂ表に示す。得られた分配係数はそれぞれデキ
ストランーサツカラーゼに対して０．００２゜インベル
ターゼに対して１３７である。

実施例　４ この実施例に於いては１段精製法で処理した。

前もって精製したデキストランーサツカラーゼ溶液４ｏ
ｍｃに、外生的インベルターゼの存在下にＰｌｆｆｌ溶
液１３．５ｍｌを添加する。得た結果を第４表に示す。

前述した実施例３と同様に、ＰＪＩＣＧ相内にはもはや
デギストランーサツカラーゼ活性は存在せス、シかもイ
ンベルターゼ活性の本質部分はＰＪＣＧ土方相上方置を
占めている事を確認した。

実施例　５ この実施例では、この発明の方法にしたがい醗酵上澄液
１５０１１１ｉ！を処理したが、そのさい連続的に５段
の相互部分的混合を適用した。これは、連続式抽出塔で
得られるものの代表とみなした定量的８１画にしたがっ
ている。得られた結果を５ａ表にまとめた。デキストラ
ンーサツカラーゼ活性の全部が実質的に、２０倍以上の
濃縮係数にてデキストラシ相内にとどまっている事が確
認できる。

加うるＫ、レバン−サッカラーゼ単位の７５％以上は除
去された。比活性度はｉ、ｏｏｏ倍以上に高まった。デ
キストランーサッカラーセの分配係数−は（１００２の
近傍にある。

収率は５Ｂ表に示す通りである。

最後に１ａ縮及び精製は、醗酵の終点の残留蔗糖の急速
除去を併行的に行い、したがって基質が欠如したテキス
トランの合成を阻止する事で安定化した環境のもとで実
施する点に注意を払う必要がある。事実、酵素溶液中の
テキストラン濃度を最大限に制限する事が重要である。

第１Ａ表 第　１Ｂ表 第１Ｄ衣 第　７１　ｂｌ） 第　４表 第　５ａ表 第　５ｂ表 手　続　ンｉｆ）　ｊ−に　ｌシ（ 昭和５５９年　９月Ｃｒ」 特許庁長官　殿 １　事件の表示 昭和５９年特許願第８８５５３号 ２　発明の名称 デキストランーリツカラ−１！の精製方法３　補正をす
る者 事（’ｌとの関係　特Ｗ１出願人 名　称　ソシ゛［ア・プシオナル・Ｊ−ルノ・）７１：
デーヌ４代理人 住　所　東京都千代］１旧永ｆｆ１町１丁目１１Ｗｔ２
８弓相豆第１０ビルディング８階　電話　５８１−９３
７１６　補正の対象 明ｉ書のタイゾ浄ｆＬｔ ７　補正の内容 別紙のとおり（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　細胞外酵素を趙生ずる細菌ロイコノストック・メ
   センテロイドの蔗糖培養液を出発原料としてデキストラ
   ンーサツカラーゼ酵素を同時的に精製しかつ濃縮する方
   法であって、前記培養液がテキストランを含む方法にお
   いて、第１段においてはポリエーテル水溶液を培養液に
   対し。 前記培養液中で混合し得ない２つの相が出現する如き量
   で添加し、次にこの培養液を２種のポリマーと生（物）
   −化学的物質との緊密で長時間にわたる接触が確保しう
   るよう攪拌下１に維持し、さらに、第２段にお（・ては
   、テキストランに富む培養液の下方相をポリエーテルに
   富む土方相と分離し、そのさい下方相がテキストラン−
   サッカラーゼを富化せしめた酵素製剤を構成することを
   性徴とする方法。 ２、　前記ポリエーテルが分子量４００から２０，００
   ０の間にあるポリグリコールであることを特徴とする特
   許請求の範囲１に記載の方法。 ６、添加後の培養液のポリエーテル含有量が１〜１５重
   量％の間にあることを特徴とする特許請求の範囲１又は
   ２に記載の方法。 ４、　温良が３０℃以下及びｐＨが４．５から７におい
   て実施することを特徴とする特許請求の範囲１〜己のい
   ずれかに記載の方法。 ５、培養液を予じめ細胞除去処理にかけることを特徴と
   する特１ｔ’Ｆ　請求の範囲１〜４のいずれかに記載の
   方法。 ６　各段の処理醇液がその前段終了後に取得したテキス
   トラン相罠よって構成されている連続多段プロセスで実
   施することを特徴とする特許請求の範囲１〜５のいずれ
   かに９５＋載の方法。 ｌ　向流作動式液−液抽出塔内で連続的に実施すること
   を特徴とする特許請求の範囲６に記載の方法。 ８、　細菌ロイコノストック・メセンテロイドａＢ５１
   ２（Ｆ）のテキストラン−サッカラーゼ酵素の′ｎＩ製
   に適用することを特徴とする特許請求の範囲１〜７のい
   ずれかに記載の方法。