RU1839191C - Способ получени полипептидов в бесклеточной системе трансл ции - Google Patents

Description

Изобретение относитс  х молекул рной биологии и биотехнологии, а именно к способам получени  полипептидов в бесклеточных системах. Преимущественной областью использовани   вл етс  препаративный синтез биологически активных пептидов и белков.

Известен способ препаративного синтеза полипептидов методом генной инженерии , основанным на внедрении в живую клетку чужеродной ДНК, генетический материал которой экспрессируетс  аппаратом клетки-хоз ина 1-3.

К недостаткам этого известного способа относ тс  ограничени , накладываемые клеткой на продукты экспрессии гена. Это св зано со сложностью выделени  продукта экспрессии трансформированными клетками , летальностью некоторых целевых продуктов дл  клетки-продуцента, элиминированием трансформированных плазмид из клетки, протеолитической деградацией или агрегацией продукта чужеродного гена, В результате только весьма ограниченный набор белков может быть эффективно синтезирован известным спосо- бом.

Известен способ препаративной экспрессии генов, основанный на использовании непрерывной бесклеточной системы сопр женной транскрипции/трансл ции 4. Непрерывные бесклеточные системы сопр женной транскрипции/трансл ции свободны от ограничений, накладываемых клеткой, и обеспечивают препаративную экспрессию практически любых генов в виде молекулы ДНК, сконструированной нужным образом.

К недостаткам этого известного способа относ тс  ограничени  на использование бесклеточных систем эукариот. Дело в том, что при-экспрессии генов указанным способом используютс  эндогенные РНК- полимеразы того объекта, из которого приготовлена бесклеточна  система сопр женной транскрипции /трансл ции. Это приводит к необходимости использовани  специальных методик выделени  клеточного экстракта, обеспечивающих сохранность активности эндогенных РНК- полимераз. Более того, в клетках эукариот процессы транскрипции и трансл ции, как правило, разнесены в пространстве и во времени: процесс транскрипции осуществл етс  в клеточном  дре, а процесс трансл ции происходит в цитоплазме клетки после соответствующих модификаций мРНК. В св зи с этим получить надежную систему сопр женной системы транскрипции/трансл ции на основе экстрактов эукариотических клеток до насто щего времени не удалось. Единственный метод, обеспечивающий надежное получение таких экстрактов , основан на получении экстракта S30 из

бактериальных клеток Esherlchia coli. Однако данный способ также имеет существенный недостаток: вс ка  плазмида, содержаща  интересующий нас клонированный ген, имеет в своем составе ген селекции (ген устойчивости к какому-либо антибиотику), который также находитс  под промотором РНК-полимеразы Е. coli и экспрессируетс  столь же эффективно, как и интересующий нас ген. В результате в про5 цессе функционировани  дополнительно к нужному продукту в системе экспрессируетс  побочный продукт.

В качестве прототипа выбран способ препаративного синтеза полипептидов в

0 бесклеточных системах трансл ции непрерывного действи  с использованием матричных РНК, состо щий в том, что в бесклеточных системах трансл ции осуществл ют непрерывное удаление из реакци5 онной смеси продуктов реакции, включа  синтезированный полипептид, и непрерывное восстановление концентрации низкомолекул рных субстратов 5. Указанный способ позвол ет осуществл ть препара0 тивный синтез практически любых полипептидов в бесклеточных системах трансл ции, полученных из клеток любых организмов.

Так, например, известен способ синтеза кальцитонина в бесклеточной системе

5 трансл ции непрерывного действи  на основе лизата из зародышей пшеницы. В 1 мл бесклеточной системы содержитс  0,5 мл лизатз зародышей пшеницы, 0,1 нмоль мРНК кальцитонина, 64 мкг креатинфосфо0 киназы, 10 мкг ингибитора рибонуклеаз из плаценты человека, по 0,1 мкг ингибиторов протеаз (апротинин, пепстатин, лейпептин) в буфере: 40 мМ HEPES, рН 7,6, 75 мМ Г ацетата, 1,9 мМ Мд2+ ацетата, 0,25 мМ спер5 мидина, 6 мМ дитиотреита, 1,5% глицерина, 2 мМ АТР, 50 мкМ GTP, 8 мМ креатинфосфа- та, 25 мкМ Н лейцина (активность 50 Ки/ммоль) и по 25 мкМ остальных 19 аминокислот .

0 Бесклеточную систему помещают в

 чейку дл  ультрафильтрации фирмы

Amicon и провод т синтез полипептидов

при температуре 25°С. Отбор продуктов

трансл ции, включающих целевой продукт

5 и продукты распада, (AMP, GDP, пирофос- фат и неорганический фосфат) осуществл ют через полупроницаемую мембрану с одновременной подачей субстратов в виде АТР, GTP и аминокислот в течение 20 ч. В результате за врем  работы бесклеточной

истемы трансл ции получают 10 нмоль альцитонина, что составл ет 100 пмоль олипептида на 1 пмоль мРНК,

К недостаткам этого способа относитс  евозможность экспрессии генетического атериала в виде ДНК. Основанный на бес- леточных системах трансл ции, данный пособ использует матричные РНК. Это оз- ачает, что дл  реализации способа необхо- има дополнительна  работа по синтезу атричных РНК тем или иным способом. В о же врем  основна  масса полипептидов белков в живых клетках закодирована в иде молекул ДНК. Различными генно-ин- енерными манипул ци ми в насто щее рем  выделено огромное число генов в ви- е молекул ДНК. Кроме того, синтез и раз- ножение искусственных генов в виде олекул ДНК представл ет собой несрав- енно более простую задачу, чем наработка атричных РНК.

Целью изобретени   вл етс  унифика- и  способа препаративного получени  олипептидов в бесклеточных системах и

В бесклеточных системах трансл ции прерывного действи , в процессе работы орых осуществл етс  непрерывное вы- дение продуктов трансл ции, в том числе ипептидов, AMP, ADP, GDP, CDP, UDP, фосфатов и неорганических фосфатов, дновременным введением в систему суб- эатов в виде аминокислот, АТР, GTP, СТР, Р дл  поддержани  их исходной концен-

к;

вышение выхода и чистоты целевого про-

п Д

KI BI

п п с

С

U

т ации, используютс  гены белков в виде м элекул ДНК, имеющих промоторныеучаст- Ki, специфичные к чужеродным экзогенным Р К-полимеразам, а в систему трансл ции добавл ютс  экзогенные РНК-полимеразы, ответствующие выбранным промоторам. Сущность предложенного способа за- очаетс  в следующем. Экстракты прока- отических или эукариотических клеток, держащие рибосомы и все компоненты парата трансл ции, но свободные от эн- енных мРНК и ДНК, готов т известными тодами. К экстракту добавл ют низкомоД м

лекул рные компоненты транскрипции и трансл ции (аминокислоты, АТР, GTP, СТР, U Р), ген в виде молекулы ДНК, имеющие лидерный участок,  вл ющийс  промоторов дл  экзогенной РНК-полимеразы, причем така  конструкци  может быть использована как в виде фрагмента ДНК, та : и в виде плазмиды, экзогенную РНК- шмеразу, специфичную дл  выбранного мотора, а также в случае необходимости

ибиторыэндогенных РНК-полимераэор- изма, из которого получен экстракт. Ре5

5

0

0 5

акционную смесь внос т в резервуар, ограниченный от окружающего пространства полупроницаемой перегородкой, где и протекает процесс сопр женной транскрипции/трансл ции . Полупроницаема  перегородка может быть как органического, так и неорганического происхождени . В качестве полупроницаемой перегородки могут быть использованы ультрафильтраци- 0 онные мембраны, полые волокна, микрс ап- сулы или пленки, оболочка которых представл ет собой полиэлектролитные комплексы. Дл  предотвращени  остановки процесса из резервуара через полупрони- 5 цаемую перегородку непрерывно отвод т продукты транскрипции (неорганические фосфаты, ADP, GDP, CDP, UDP) и трансл ции (синтезированный полипептид, AMP, GDP, неорганические фосфаты и пирофос- фаты).

Одновременно в резервуар подают аминокислоты , АТР, GTP, СТР, UTP дл  восстановлени  их исходной концентрации. Синтезированный полипептид собирают на колонке с сорбентом, а продукты транскрипции и трансл ции собирают в специальном резервуаре дл  их последующей регенерации. Соотношени  компонентов в реакционной смеси, ионные и температурные услови  синтеза определ ютс  свойствами организмов, из которых приготовлены бесклеточные системы и экзогенные РНК- полимеразы. Диапазон этих условий достаточно широк. Способ позвол ет осуществл ть сопр женную транскрипцию/трансл цию в экстрактах из таких организмов , дл  которых сопр жение процессов трансл ции и транскрипции in vivo невозможно, Предлагаемый способ обеспечивает препаративный синтез полипептидов с посто нно высокой скоростью в течение дес тков часов с выходом функционально активного продукта (полипептида) 1-10 нмоль с 1 мл реакционной смеси.

На фиг.1,2,3,4,5 изображены графики зависимости количества синтезируемого полипептида (нмоль) от времени синтеза (ч).

Дл  катализа реакции из бесклеточной системы транскрипции/трансл ции из ре- 0 тикулоцитов кролика вз то 10 мл реакционной смеси до и через 0,5 ч после начала работы.

Дл  катализа реакции из непрерывной бесклеточной системы транскрипции/трансл ции из ретикулоцитов кролика вз то также 10 мкл раствора А, содержащего продукты экспрессии, через 5.7,9 и 12 ч после начала работы непрерывной системы.

Пример 1. Сопр женна  транскрипци /трансл ци  фермента дигидрофолат

редуктазы с плазмиды, содержащей ген ди- гидрофолат редуктазы под промотором SP6 полимеразы, в бесклеточной прокариотиче- ской системе трансл ции из Е. coll.

Получают плазмиду, содержащую ген дигидрофолат редуктазы под промотором SP6 полимеразы.

Сопр женную систему транскрипции/трансл ции готов т следующим образом .

1 мл реакционной смеси содержит 350 мкл S30 экстракта из Е. coll, 0,2 мг тРНК, 0,1 мг плазмиды, 20000 U SP6 полимеразы, 0,1 мг пируват киназы, 50 U рибонуклеазного ингибитора из плаценты человека, по 5 мкг ингибиторов протеаз (леупептина, химости- на) и с:2-макроглобулина в буфере А: 50 мМ , рН 7,5, 14 мМ MgCte, 100 мМ КАс, 2 мМ СаАс2, 1 мМ АТР, 0,4 мМ GTP, 0,4 мМ СТР, 0,4 мМ UTP, 10 мМ фосфоенолпирува- та, 4,0 мМ дитиотреита, 50 мкМ спермидина, 10 мкг лейковорина, 40 мкМ рифампицина, ингибитора РНК-полимеразы Е. coll., 30 мкМ 35S Met с удельной радиоактивностью 800 МКи/ммоль и по 30 мкМ каждой из остальных 19 аминокислот.

Синтез провод т при температуре 37°С в реакционной  чейке. Питательную смесь пропускают со скоростью 1.5 мл в 1 ч. Отбор целевого продукта и продуктов распада осуществл ют путем отбора питательной смеси ,прошедшей через ультрафильтрационную мембрану, с одновременной подачей в  чейку буфера А в течение 24 ч.

В течение всего времени синтез продукта проходит с посто нной скоростью (фиг. 1). В результате синтезируют 680 пмоль фермента дигидрофолат редуктазы за 24 ч рабо- ты. Синтезированный фермент функционально активен. Удельна  активность полученного фермента составл ет 0, ед. активности на 1 пмоль синтезированного фермента.

В данном случае плазмида содержит ген дигидрофолат редуктазы под промотором SP6 полимеразы и ген/3-лактамазы под промотором РНК-полимераэы Е, coll. Поскольку в систему ввод т ингибитор РНК- полимеразы Е. coli рифампицин, в системе синтезировалс  только целевой продукт дигидрофолат редуктаза высокой чистоты, не содержащий каких-либо примесей / -лакта- мазы.

Пример 2. Сопр женна  транскрипци /трансл ци  /3 -лактамазы с фрагмента ДНК, содержащего ген / -лактамазы и короткий участок промотора Т7 полимеразы, в

бесклеточной прокариотической системе трансл ции из Е. coll.

Получают плазмиду, содержащую ген предшественника/3-лактамазы и промотор

дл  Т7 полимеразы.

Сопр женную систему транскрипции/трансл ции готов т следующим образом .

1 мл реакционной смеси содержит 350

мкл S30 экстракта из Е. coli, 0,1 мг тРНК, 0,04 мг фрагмента ДНК, 30000 U T7 полимеразы , 0,1 мг пируват киназы, 50 U рибонуклеазного ингибитора из плаценты человека, по 5 мкг ингибиторов протеаз {леупептина,

химостина)ио:2-макроглобулина в буфере А: 50 мМ , рН 7,5,14 мМ MgCfc, 100 мМ КАс, 2 мМ СаАс2, 1 мМ АТР, 0,4 мМ GTP, 0,4 мМ СТР, 0,4 мМ UTP, 10 мМ фосфоенолпи- рувата, 4,0 мМ дитиотреита, 50 мкМ спермидина , 10 мкг лейковорина, 40 мкМ рифампицина, 30 мкМ 3Н Leu с удельной радиоактивностью 1,7 Ки/ммоль и по 30 мкм каждой из остальных 19 аминокислот.

Синтез провод т при температуре 37°С

в реакционной  чейке. Питательную смесь пропускают со скоростью 2 мл в 1 ч. Отбор целевого продукта и продуктов распада осуществл ют путем отбора питательной смеси ,прошедшей через

ультрафильтрационную мембрану, с одновременной подачей в  чейку буфера А в течение 20 ч.

В течение всего времени синтез продукта проходит с посто нной скоростью (фиг.2).

В результате синтезируют 250 пмоль/3 -лактамазы за 20 ч работы системы.

Пример 3. Сопр женна  транскрипци /трансл ци  дигидрофолат редуктазы с плазмиды, содержащей ген дигидрофолат

редуктазы под промотором SP6 полимеразы в бесклеточной эукариотической системе трансл ции из зародышей пшеницы.

Получают плазмиду, содержащую ген дигидрофолат редуктазы под промотором

SP6 полимеразы.

Сопр женную систему транскрипции/трансл ции готов т следующим образом .

1 мл инкубационной смеси содержит

320 мкл экстракта из зародышей пшеницы, 0.1 мг плазмиды, содержащей ген дигидрофолат редуктазы, 20000 U SP6 полимеразы, 0,1 мг пируват киназы, 50 U рибонуклеазного ингибитора из плаценты человека, по 5

мкг ингибиторов протеаз (леупептина, химо- статина) и а 2-макроглобулина в буфере А: 40 мМ HEPES, рН 7,6, 2,5 мМ МдАса, 70 мМ КАс. 1 мМ АТР. 0,4 мМ GTP, 0,4 мМ СТР, 0,4 мМ UTP, 0,25 мМ спермидина, 4,0 мМ дитиотреита , 6 мМ креатинфосфата, 20 мкМ 14С Leu с удельной радиоактивностью 21 мКи/ммоль, 20 мкМ каждой из 19 остальных аминокислот.

Синтез провод т при температуре 24°С в реакционной  чейке. Питательную смесь пропускают со скоростью 2 мл в 1 ч. Отбор целевого продукта и продуктов распада осуществл ют путем отбора питательной смеси ,прошедшей через ультрафильтрационную мембрану, с одновременной подачей в  чейку буфера А в течение 24 ч.

В течение всего времени синтез продукта проходит с посто нной скоростью (фиг.З). В результате синтезируют 5 нмоль фермента дигидрофолат редуктазы за 24 ч работы. Синтезированный фермент функционально активен. Удельна  активность полученного фермента составл ет 0, ед. активно- сти на 1 пикомоль синтезированного фермента .

Пример 4. Сопр женна  транскрипци /трансл ци  хлорамфеникол ацетилт- рансферазы с плазмиды, содержащей ген хлорамфеникол ацетилтрансферазы под промотором SP6 полимеразы, в бесклеточной эукариотмческой системе трансл ции из ретикулоцитов кролика.

Получают плазмиду, содержащую ген хлорамфеникол ацетилтрансферазы под пр мотором SP6 полимеразы.

Сопр женную систему транскрипции/трансл ции готов т следующим образом .

1 мл инкубационной смеси содержит 600 мкл лизата из ретикулоцитов кролика, 0,1 мг плазмиды, содержащей ген хлорамфеникол ацетилтрансферазы под промотором SP6 РНК-полимеразы, 30000 U SP6 полимеразы, 0,1 мг пируват киназы, 50 U рибонуклеазного ингибитора из плаценты человека, по 5 мкг ингибиторов протеаз (ле- упептина, химостатина) и «2-макроглобули- на в буфере А: 25 мМ HEPES, рН 7,6, 1,5мМ МдАс2, 100 мМ КАс, 1 мМ АТР, 0,4 мМ GTP, 0,4 мМ СТР, 0,4 мМ UTP, 0,25 мМ спермиди- на, 4,0 мМ дитиотреита, 6 мМ креатинфосфата , 20 мкМ 35S Met с удельной радиоактивностью 800 мКи/ммоль, 20 мкМ каждой из 19 остальных аминокислот.

Синтез провод т при температуре 34°С в реакционной  чейке. Питательную смесь пропускают со скоростью 1,5 мл в 1 ч. Отбор целевого продукта и продуктов распада осу- ществл ют путем отбора питательной смеси ,прошедшей через ультрафильтрационную мембрану, с одновременной подачей в  чейку буфера А в течение 34 ч.

В течение всего времени синтез продукта проходил с посто нной скоростью (фиг.4). В результате синтезируют 2,5 нмоль фермента хлорамфеникол ацетилтрансферазы за 34 ч работы. Синтезированный фермент функционально активен.

Пример 5. Сопр женна  транскрипци /трансл ци  фермента дигидрофолат редуктазы с плазмиды, содержащей ген дигидрофолат редуктазы под промотором SP6 полимеразы, в бесклеточной эукариотиче- ской системе трансл ции из ретикулоцитов кролика.

Получают плазмиду, содержащую ген дигидрофолат редуктазы под промотором SP6 полимеразы.

Сопр женную систему транскрипции/трансл ции готов т следующим образом .

1 мл инкубационной смеси содержит 600 мкл лизата из ретикулоцитов кролика, 0,1 мг плазмиды, содержащей ген дигидрофолат редуктазы, 30000 U SP6 полимеразы, 0,1 мг пируват киназы, 50 U рибонуклеазного ингибитора из плаценты человека, по 5 мкг ингибиторов протеаз (леупептина, химостатина ) и о2-макроглобулина в буфере А: 25мМНЕРЕ5,рН7,6, 1,5мММдАс2, 100 мМ КАс, 1 мМ АТР, 0,4 мМ GTP, 0,4 мМ СТР, 0,4 мМ UTP, 0,25 мМ спермидина, 4,0 мМ дитиотреита , 6 мМ креатинфосфата, 20 мкМ 14С Leu с удельной радиоактивностью 21 мКи/ммоль, 20 мкМ каждой из 19 остальных аминокислот.

Синтез провод т при температуре 34°С в реакционной  чейке. Питательную смесь пропускают со скоростью 2 мл в 1 ч. Отбор целевого продукта и продуктов распада осуществл ют путем отбора питательной смеси ,прошедшей через ультрафильтрационную мембрану, с одновременной подачей в  чейку буфера А в течение 20 ч.

В течение всего времени синтез продукта проходит с посто нной скоростью (фиг.5). В результате синтезируют 7,0 нмоль фермента дигидрофолат редуктазы за 20 ч работы . Синтезированный фермент функционально активен. Удельна  активность полученного фермента составл ет 0, ед. активности на 1 пмоль синтезированного фермента.

Использование изобретени  дает возможность препаративной экспрессии практически любых генов в виде молекул ДНК в любых бесклеточных системах трансл ции. Способ может служить важным дополнением , а в некоторых случа х и альтернативой генно-инженерным методам и методу препаративной экспрессии генов в бесклеточной системе. Способ не требует специальной наработки матричных РНК, что значительно упрощает и удешевл ет его в сравнении с известным способом препара- тивного синтеза полипептидов и белков в бесклеточных системах трансл ции.

(56) 1. Graham F.L., van der Eb A.J. - Virology, 1973, v.52, p.456.

2. Grammar W.J. - In: Genetic Engineering, 1982, v.3, p.53. (ed. Wllllamson R.), Academic Press Inc., London.

3. Frazer A.C., Curtlss R. - Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1975, v.69, p.1.

4. Baranov V.I,, Morozov I.Yu., Ortlepp S.A., Spirln A.S. - Gene, 1989, v.84, p.463.

5. Spirln A.S., Baranov V.I., Ryabova LA,, Ovodov S.Yu., Alakhov Yu.B. - Science, 1988, v.242, p.1162.

Claims (14)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ ТРАНСЛЯЦИИ, включающий экспрессию генов в бесклеточной системе сопр женной транскрипции/трансл ции, непрерывное выведение продуктов экспрессии генов, в том числе полипептидов, AMP, n ADP, GDP, CDP, UDP, пирофосфатов и не- органических фосфатов, с одновременным введением в систему субстратов в виде аминокислот, АТР, GTP, CTP, UTP дл  поддержани  их исходной концентрации, от- jc пинающийс  тем, что, с целью унификации способа и повышени  выхода и чистоты целевого продукта, экспрессируют гены белков в виде молекул ДНК, имеющих про- моторные участки, специфичные к чуже- зо родным экзогенным РНК-полимеразам, а в систему трансл ции добавл ютс  экзогенные РНК-полимеразы, соответствующие выбранным промоторам.

2. Способ по п.1, отличающийс  тем, 35 что ген в виде молекулы ДНК имеет промотор , специфичный к фаговой РНК-полиме- разе, а в систему добавлена соответствующа  фагова  РНК-полимера- за.«О

3. Способ по п.2, отличающийс  тем, что в системе используетс  РНК-полимера- за фага Т7.

4. Способ по п.2, отличающийс  тем, 45 что в системе используетс  РНК-полимера- за фага SP6.

5. Способ по п.1, отличающийс  тем, что в бесклеточной системе трансл ции используетс  ген в виде амплифицированно- го фрагмента ДНК.

6. Способ по п.1, отличающийс  тем, что в бесклеточной системе трансл ции используетс  ген, наход щийс  в плазмиде.

7. Способ по п.1, отличающийс  тем, что используетс  прокариотическа  бесклеточна  система.

8. Способ по п.7, отличающийс  тем, что прокариотическа  бесклеточна  система основана на экстрактах из E.coll.

9. Способ по п.8, отличающийс  тем, что в систему добавлены ингибиторы эндогенных РНК-полимераз.

10. Способ по п.1, отличающийс  тем, что используетс  эукариотическа  бесклеточна  система.

11. Способ по п.10. отличающийс  тем, что эукариотическа  бесклеточна  система основана на экстрактах из клеток растений .

12. Способ по п.11, отличающийс  тем, что используютс  экстракты из зародышей пшеницы.

13. Способ по п.10, отличающийс  тем, что эукариотическа  бесклеточна  система основана на лизатах клеток животных.

14. Способ по п.13, отличающийс  тем, что используютс  лизаты ретикулоцитов кролика.

е

9

to

р го

р со

р .ь.

О ел

р Ь)

р

CD

ел

I

СО

со со

а

СП

го о

w

О

Синтезированные белки, ймоль

Л -,

i

к

§

5 о

о

I,

0

510 16

Врем , ч

Редактор

Составитель Л. Р бова

Техред М.МоргенталКорректор С. Юско

Заказ 3404Тираж Подписное

НПО Поиск Роспатента 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., 4/5

/

/

20

26