JP3941998B2 - コエンザイムｑ１０の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品等として用いられているコエンザイムＱ10の製造に関する。さらに詳細には、コエンザイムＱ10の生合成に関するキー酵素であるコエンザイムＱ10側鎖合成酵素、すなわちデカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子をＳａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌より単離し、これを微生物に導入することによりコエンザイムＱ10を生成させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のコエンザイムＱ10の製造法は、タバコなどの植物由来のコエンザイムを単離してその側鎖長を合成法により調整する等によって工業的には生産されている。
また、コエンザイムＱ10は細菌や酵母などの微生物から高等動植物に至るきわめて幅広い生物により生産されることが知られているが、微生物を培養してその菌体より本物質を抽出する方法が最も有効な一つの製造法であると考えられ、実際の工業的な生産にも用いられている。しかしながら、これらの方法では、生成量が少なかったり、操作が煩雑であったりして、生産性が良くなかった。
【０００３】
コエンザイムＱ10の生物による生合成経路については、原核生物と真核生物では一部異なっているが、いずれも多くの酵素が関与した多段階の複雑な反応によって生成されている。しかし、基本的には大きく３つのステップ、すなわち、コエンザイムＱ10のプレニル側鎖のもとになるデカプレニル２燐酸を合成するステップ、キノン環のもとになるパラヒドロキシ安息香酸を合成するステップ、そして、これらの２つの化合物を結合させて置換基を順次変換してコエンザイムＱ10を完成させるステップよりなっている。これらの反応の中で、生合成反応全体の律速であると言われ、コエンザイムＱ10の側鎖の長さを決定している反応、すなわちデカプレニル２燐酸合成酵素の反応は最も重要な反応であると考えられる。そこで、コエンザイムＱ10を効率よく生産させる為には、生合成に関与するキー遺伝子、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子を単離して生産増強に利用することが有効であると考えられるが、その遺伝子源としてはコエンザイムＱ10を比較的多量に生産している真菌類が有力な候補となる。
【０００４】
これまでにデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（特開平９−１７３０７６）やＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（特開平１０−５７０７２）などいくつかの種類の微生物より分離されているが、本来これらの微生物ではコエンザイムＱ10の生産性が十分とはいえず、これらの微生物では効率的な培養や分離精製などは出来ていなかった。そこで、さらにコエンザイムＱ10を高生産する微生物由来の本酵素遺伝子を単離することが望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の生産に関する問題を解決するべく、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌由来のコエンザイムＱ10の側鎖合成遺伝子を単離してこれを利用することにより、微生物によってコエンザイムＱ10を効率よく生産することを目的とする。
上記目的を達成する為に、本発明では、まず、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌よりコエンザイムＱ10の生合成に関与するキー遺伝子、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子を単離した。そして、該遺伝子を大腸菌などの微生物に導入して発現させることにより、コエンザイムＱ10を効率よく生産させることが可能となった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、コエンザイムＱ10を比較的多量に生産しているＳａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌からデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を分離するための検討を重ね、該遺伝子を分離することに成功した。
【０００７】
即ち本発明は、配列番号１に記載のＤＮＡ配列、又はこの配列において１若しくは複数の塩基が欠失、追加、挿入、置換されたＤＮＡ配列を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明はまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又はこの配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、追加、挿入、置換されたアミノ酸配列を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質、さらにこのタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【０００８】
さらに本発明は、上記ＤＮＡを含有する発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、従来知られているベクター系いずれを用いても良く、例えば発現用ベクターｐＵＣＮＴへ配列番号１の配列を有するＤＮＡを導入してなる、ｐＮＴＳａ１が提供される。
本発明は、宿主微生物を上記ＤＮＡにて形質転換してなる形質転換体もまた、提供する。本発明の宿主微生物としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが好適に用いられる。
【０００９】
本発明はさらに、上記形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコエンザイムＱ10を生成蓄積し、これを採取する工程からなるコエンザイムＱ10の製造方法を提供する。本発明の方法において用いる、宿主微生物としては特に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが好適に用いられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの産生するコエンザイムＱは、コエンザイムＱ8 であるが、本発明の方法によって、コエンザイムＱ10を産生させることが可能となった。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、コエンザイムＱ10を比較的多量に生産しているＳａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌から本酵素遺伝子を分離するための検討を重ねたところ、ＰＣＲ法によって該遺伝子の断片を取得することに成功した。
【００１１】
既知のデカプレニル２燐酸合成酵素、及び本酵素と類縁で鎖長の違うコエンザイムＱの長鎖プレニル鎖合成酵素であるポリプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子の配列を比較し、その相同性の高い領域についてＰＣＲプライマーを各種合成した。そしてこれらのプライマーを種々組み合わせ、ＰＣＲの条件をいろいろ検討したところ、プライマーＤＰＳ−１（５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＮＹＴＮＣＡＹＧＡＹＧＡＹＧＴ−３’）及びＤＰＳ−１ １ＡＳ（５’−ＡＲＹＴＧＮＡＤＲＡＡＹＴＣＮＣＣ−３’）を用い（なお、ここで示した配列中の、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、そしてＮはＧ、Ａ、ＴまたはＣを示す。）、ＰＣＲを９４℃、３分間の熱処理の後、９４℃、１分→４３℃、２分→７２℃、２分のサイクルを４０回繰り返すことにより、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８の染色体遺伝子から本酵素遺伝子の約２２０ｂｐの断片が増幅してくることを、その遺伝子の塩基配列を解析することにより明らかにした。
【００１２】
そこで次に本酵素遺伝子の全長を取得するためには、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８の染色体遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ラムダファージベクターに挿入して組換えファージライブラリーを作製する。そのプラークをナイロン膜に転写した後、標識した該ＰＣＲ断片を用いてプラークハイブリダイゼーションを行えば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子全長を持つクローンを取得することができる。
【００１３】
得られたクローンに含まれるデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子について塩基配列の決定を行ったところ、配列表の配列番号１に示した配列を持つことが明らかとなり、この配列から予想できるアミノ酸配列にはデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子として特徴的な配列がみられる。
【００１４】
本発明において、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に示すＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列である。配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質には、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するものが含まれる。コドンは縮重しているため、配列番号２に示すアミノ酸配列から予測されるＤＮＡ配列としては、配列番号１を含んで複数挙げられ、これらの配列を有するＤＮＡにはデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。
【００１５】
本発明において、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号１及び配列番号２に示すアミノ酸配列から予測されるＤＮＡ配列を有するものに限らず、発現して得られたタンパク質がデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有する限り、これらのＤＮＡ配列において１若しくは複数の塩基が欠失、追加、挿入、置換されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡも含まれる。本発明において、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質には、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に限らず、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有する限り、この配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、追加、挿入、置換されたアミノ酸配列を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
【００１６】
デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を発現させるためには、適当なプロモーターの下流に該遺伝子を接続することが必要であるが、例えば遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素によって切り出したり、ＰＣＲによって酵素をコードする遺伝子部分のみを増幅させたりした後、プロモーターを持つベクターに挿入することにより発現ベクターとすることができる。本発明において、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込む発現用ベクターとしては特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミドに、適当なプロモーターを組み込んだものが挙げられる。大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９等が挙げられ、プロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター等が挙げられる。また、本発明においては発現用ベクターとして、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｘ（以上、ファルマシア社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII、ｐＵＣ１９（東洋紡社製）、ｐＭＡＬＣ２、ｐＥＴ−３Ｔ、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４/ ０３６１３に記載）等を用いることもできる。このうち、ｐＵＣＮＴが好適に用いられ、具体的な例としては、発現用ベクターｐＵＣＮＴに配列番号１に示すＤＮＡ配列を有する遺伝子を挿入すれば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐＮＴＳａ１を作製することができる。
【００１７】
そして、該酵素遺伝子の発現ベクターを適当な微生物に導入することによりコエンザイムＱ10の生産に利用することが可能となる。宿主微生物としては特に限定されず、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが好適に用いられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとしては特に限定されず、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＢＬ−２１、ＪＭ１０９、ＮＭ５２２、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＤＨ５等が挙げられる。このうちＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αが好適に用いられ、例えば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐＮＴＳａ１を大腸菌に導入した場合には、大腸菌が本来は生産しないコエンザイムＱ10を、著量生産するように変換できる。この大腸菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＮＴ Ｓａ１）は通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−６８４４として寄託されている。
【００１８】
また、宿主微生物として川向らが作製したオクタプレニル２リン酸合成酵素遺伝子破壊大腸菌菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＯ２２９（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９７年、第１７９巻、３０５８−３０６０頁）はコエンザイムＱ8 が生産できないため、これを宿主として用いることによりさらにコエンザイムＱ10を高生産する事ができる。
本遺伝子は単独で用いるほか、他の生合成に関与する遺伝子と同時に微生物に導入して発現させることにより、さらに良い効果が期待できる。
【００１９】
本発明で得られた形質転換体を、常法に従い、培養し、培養物中からコエンザイムＱ10を採取することにより、コエンザイムＱ10を製造することができる。宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである場合は、培地として、ＬＢ培地や、グルコースやカザミノ酸を含むＭ９培地を用いることができる。プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピルチオガラクトシドやインドリル−３−アクリル酸のような薬剤を培地に加えてもよい。培養は例えば、３７℃で１７〜２４時間行い、この際必要により通気や攪拌を行ってもよい。本発明において、得られたコエンザイムＱ10は精製を行ってもよく、粗精製物として用いてもよく、用途により適宜選択することができる。得られた培養物からコエンザイムＱ10を単離するには公知の分離・精製法を適宜組み合わせることができる。公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈殿等の溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、及び、（ＳＤＳ−）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。本発明において得られたコエンザイムＱ10の用途は特に限定されず、医薬品等に好適に用いることができる。
【００２０】
【実施例】
（実施例１）
Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８の染色体ＤＮＡをＣ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎらの方法（Ｇｅｎｅ、５７（１９８７）２６７−２７２）で調製した。既知の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の遺伝子との相同性からＰＣＲに用いるプライマーＤＰＳ−１（５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＮＹＴＮＣＡＹＧＡＹＧＡＹＧＴ−３’）及びＤＰＳ−１ １ＡＳ（５’−ＡＲＹＴＧＮＡＤＲＡＡＹＴＣＮＣＣ−３’）を設計した。なお、ここで示した配列中の、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、そしてＮはＧ、Ａ、ＴまたはＣを示す。これらを用いてＰＣＲを９４℃、３分間の熱処理の後、９４℃、１分→４３℃、２分→７２℃、２分のサイクルを４０回繰り返すことにより行い、１．２％アガロースゲル電気泳動により分析した。
【００２１】
そして得られた約２２０ｂｐの断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標） ＢｒａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用ベクターにクローニングし、ｐＴ７−ＳａＤＰＳを得た。ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標） ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ＡｍｐｔｉＴａｑ（登録商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行い配列を決定した。その結果、配列表の配列番号１の７１７から９２４までの塩基配列に示す配列が得られた。この翻訳配列に長鎖プレニル鎖を持つプレニル２燐酸合成酵素に特徴的な領域の配列「ＧＤＦＬＬＧＲＡ」が見出せたことにより、得られた配列はデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子の一部であることが想定された。
【００２２】
（実施例２）
Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子と思われる２２０ｂｐのＤＮＡ断片を持つｐＴ７−ＳａＤＰＳベクターＤＮＡ０. ０３μg を用い、ＰＣＲ用のプライマーＳａ−１Ｓ（５’−ＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＧＡＡＡＣＧＣＡＣＣＡ−３’の配列を持つ）及びＳａ−２ＡＳ（５’−ＴＧＧＴＧＣＧＴＴＴＣＧＴＣＴＧＧＴＣＴＣ−３’の配列を持つ）を用いてＰＣＲ（９４℃、３分→（９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、１分）×２５サイクル繰り返し→７２℃、５分→４℃）を行い、１．２％アガロース（宝酒造製）によるゲル電気泳動を行い、約１４５ｂｐの断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標） ＢｒａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した。このＤＮＡ断片約１００ｎｇを用い、ＥＣＬダイレクト核酸ラベリングシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて化学発光標識した。
【００２３】
（実施例３）
Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動を行った。このゲルをアルカリ（０. ５Ｍ ＮａＯＨ、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）で変成させ、中和（０. ５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７. ５）、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）した後、ハイボンドＮ＋フィルター（アマシャム社製）をゲルに重ね、２０×ＳＳＣを用いて一晩、サザントランスファーさせた。そのフィルターを乾燥し、８０℃で２時間焼付けを行った後、ＥＣＬダイレクト核酸ラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）でサザンハイブリダイゼーションと検出を行った。すなわち、ゴールドハイブリダイゼーション液（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて４２℃、１時間プレハイブリダイズした。
【００２４】
化学発光標識したプローブを９５℃で５分間加熱後、氷中で急冷し、プレハイブリダイズ処理したフィルターのプレハイブリダイズ液に添加し、４２℃で２２時間ハイブリダイズさせた。このフィルターを６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ溶液を用いて４２℃で２０分２回洗浄後、２×ＳＳＣ溶液を用い室温で５分２回洗浄した。このフィルターをエンハンスドケミルネセンス試薬（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に浸した後、Ｘ線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したバンドを検出した。
その結果、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した約１０ｋｂｐの断片に強くハイブリダイズしていた。
【００２５】
（実施例４）
Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、０. ８％アガロースによるゲル電気泳動を行い、約１０ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片をゲルより切り出して精製することにより、クローン化に用いるＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をλ−ＤＡＳＨIIファージキット（ストラテジーン社製）を用いてそのファージのＥｃｏＲＩサイトに組み込み、インビトロパッケージングキット（アマシャム社製）でパッケージングを行った。そして、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）に感染させてＮＺＹ平板培地（５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ ＮＺアミン、１８ｇ／Ｌ 寒天（ｐＨ７. ５））上にＮＺＹ軟寒天培地（ＮＺＹ平板培地の寒天のみ８ｇ／Ｌ）とともに重層してプラークとした。これをハイボンドＮ＋フィルター（アマシャム社製）にトランスファーしアルカリ（０. ５Ｍ ＮａＯＨ、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）で変成した後、中和（０. ５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７. ５）、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）、乾燥し、８０℃で２時間焼付けを行った。
【００２６】
焼き付け後のフィルター９枚を用い、実施例３と同様にプレハイブリダイゼーション、化学発光標識したプローブを用いたハイブリダイゼーションを行い、このフィルターを洗浄した。このフィルターを乾燥後、Ｘ線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したスポットに対応するファージのプラークを分離した。この分離したプラークのファージを上記と同様の方法で大腸菌に感染させてプラークとし、フィルターに写して再びハイブリダイゼーションを行い、確認を行ったところ、６株のファージが選択できた。
【００２７】
このファージの懸濁液を用い、上記のＳａ−１Ｓ及びＳａ−２ＡＳを用いＰＣＲを行ったところ、６株に１４５ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。そこで組み換えλ−ＤＡＳＨＩＩファージ粒子からラボマニュアル遺伝子工学（村松正實編、丸善株式会社、１９９０年）に従って、ファージＤＮＡを調製した。調製したファージＤＮＡを、サブクローニングするため、制限酵素ＳａｌＩ、ＳａｃＩで切断し、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動を行った。このゲルをアルカリ（０. ５Ｍ ＮａＯＨ、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）で変成させ、中和（０. ５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７. ５）、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）した後、ハイボンドＮ＋フィルター（アマシャム社製）をゲルに重ね、２０×ＳＳＣを用いて一晩、サザントランスファーさせた。そのフィルターを乾燥し、８０℃で２時間焼付けを行った後、ＥＣＬダイレクト核酸ラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）でサザンハイブリダイゼーションと検出を行った。すなわち、ゴールドハイブリダイゼーション液（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて４２℃、１時間プレハイブリダイズした。
【００２８】
化学発光標識したプローブを９５℃で５分間加熱後、氷中で急冷し、プレハイブリダイズ処理したフィルターのプレハイブリダイズ液に添加し、４２℃で２２時間ハイブリダイズさせた。このフィルターを６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ溶液を用いで４２℃で２０分２回洗浄後、２×ＳＳＣ溶液を用い室温で５分２回洗浄した。このフィルターをエンハンスドケミルネセンス試薬（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に浸した後、Ｘ線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したバンドを検出した。
【００２９】
その結果、制限酵素ＳａｌＩで切断した約４．５ｋｂとＳａｃＩで切断した約３．５ｋｂの断片に強くハイブリダイズしていた。ファージＤＮＡを、制限酵素ＳａｌＩ、ＳａｃＩで切断し、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動を行った。そして黒く感光したバンドに相当する位置の大きさの制限酵素消化断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標） ＢｒａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標） ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ＡｍｐｔｉＴａｑ（登録商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行い配列を決定した。
【００３０】
その結果、配列表の配列番号１の１１２４にＳａｌＩサイトが、１２４１にＳａｃＩサイトが存在することが判り、Ｃ末端までを両断片とも含まなかったので、２つの制限酵素のうち、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の中の前の方に存在しているＳａｌＩについて残りの制限断片を調べたところ３ｋｂｐの断片に、ＳａｃＩ断片の終わりの部分を含む終止コドンまでを含んでいた。これら３つの制限酵素断片を解析することによりデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の全配列を明らかにすることができた。３つのＤＮＡ断片のうちの、約１. ６ｋｂｐのＤＮＡについてその塩基配列を決定したが、その結果を配列表の配列番号１に示す。また、このＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００３１】
得られた配列を、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０年、第２６５巻、１３１５７−１３１６４頁に記載のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子と比較したところ、アミノ酸配列では約４８％の相同性を有していた。また、特開平９−１７３０７６に記載のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ由来のデカプレニル２燐酸合成酵素と比較したところ、アミノ酸では４９％の相同性を有していた。
【００３２】
（実施例５）
調製したファージＤＮＡよりデカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子部分のみを切り出す為、合成ＤＮＡプライマーＳａ−Ｎ１（５’−ＡＡＣＡＴＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＧＧ−３’の配列を持つ）及びＳａ−Ｃ（５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＣＴＴＧＡＣＣＴＡＧＴＣＡＡＣＡＣ−３’の配列を持つ）を用いて実施例３と同様にＰＣＲを行い、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断した後、発現用ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４/ ０３６１３に記載）に挿入してデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐＮＴＳａ１を作製した。得られた発現ベクター、ｐＮＴＳａ１の制限酵素地図を図１に示す。なお、ＤＰＳとは、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子のコード領域を意味する。
【００３３】
（実施例６）
作製したデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクターｐＮＴＳａ１を大腸菌ＤＨ５αに導入し、１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃、一晩振とう培養し、菌を遠心分離（３０００回転、２０分間）で集めた。
【００３４】
この菌体を１ｍＬの３％硫酸水溶液に懸濁し、１２０℃、３０分間熱処理後、２ｍＬの１４％水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に１２０℃、１５分間熱処理した。この処理液に３ｍＬのヘキサン・イソプロパノール（１０：２）を添加して抽出し、遠心分離の後、その有機溶媒層１. ５ｍＬを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを２００μＬのエタノールに溶解し、その２０μＬを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、ＬＣ−１０Ａ）により分析した。分離には逆相カラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ、２５０×４. ６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２０Ａ）を用い、エタノール・メタノール（２：１）を移動相の溶媒として使用して分離させ、２７５ｎｍの波長の吸光度で生成したコエンザイムＱ10を検出した。結果を図２に示した。図２に示すように、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによって、組換え大腸菌では、大腸菌が本来生産しないコエンザイムＱ10を、生産するようになったことが分かった。
【００３５】
得られた組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＮＴ Ｓａ１）は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１１年８月１７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４４）。
【００３６】
（実施例７）
川向らが作製したオクタプレニル２リン酸合成酵素遺伝子破壊大腸菌菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＯ２２９は、該遺伝子がスペクチノマイシン耐性プラスミド上（ｐＫＡ３）に保持された状態で維持され、該プラスミドが脱落すると致死になることが判っている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １９９７年、第１７９巻、３０５８−３０６０頁）。この破壊株にｐＮＴＳａ１を導入するため、ＫＯ２２９にｐＮＴＳａ１を導入後、アンピシリンを含む１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃、一晩振とう培養し、その１％を新たなアンピシリンを含む１０ｍＬのＬＢ培地に継植後、さらに３７℃、一晩振とう培養する事を９回繰り返した後、アンピシリンを含むＬＢプレート培地で生育し、スペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地で生育し無い株を選択した。
【００３７】
（実施例８）
実施例７で作製したｐＮＴＳａ１を導入したＫＯ２２９株を１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃、一晩振とう培養し、菌を遠心分離（３０００回転、２０分間）で集めた。
【００３８】
この菌体を１ｍＬの３％硫酸水溶液に懸濁し、１２０℃、３０分間熱処理後、２ｍＬの１４％水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に１２０℃、１５分間熱処理した。この処理液に３ｍＬのヘキサン・イソプロパノール（１０：２）を添加して抽出し、遠心分離の後、その有機溶媒層１. ５ｍＬを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを２００μＬのエタノールに溶解し、その２０μＬを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、ＬＣ−１０Ａ）により分析した。分離には逆相カラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ、２５０×４. ６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２０Ａ）を用い、エタノール・メタノール（２：１）を移動相の溶媒として使用して分離させ、２７５ｎｍの波長の吸光度で生成したコエンザイムＱ10を検出した。結果を図３に示した。図３に示すように、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによって、大腸菌が本来生産しないコエンザイムＱ10を、生産するようになり、また、コエンザイムＱ8 を生産できる大腸菌に比べてコエンザイムＱ10を、著量生産するように変換できた。
【００３９】
【発明の効果】
コエンザイムＱ10の生合成に関するキー酵素、デカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子をＳａｉｔｏｅｌｌａ属の真菌より単離し、配列決定を行った。また、これを大腸菌に導入して発現させることに成功した。本発明の方法を用いることにより医薬品等として用いられているコエンザイムＱ10を効率的に製造することができる。
【００４０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を持つプラスミド、ｐＮＴＳａ１の制限酵素地図を示す。
【図２】デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌ＤＨ５αにおいて、生産されたコエンザイムＱ10を高速液体クロマトグラフィーによって検出したチャートを示す。
【図３】デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌ＫＯ２２９において、生産されたコエンザイムＱ10を高速液体クロマトグラフィーによって検出したチャートを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品等として用いられているコエンザイムＱ10の製造に関する。さらに詳細には、コエンザイムＱ10の生合成に関するキー酵素であるコエンザイムＱ10側鎖合成酵素、すなわちデカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子をＳａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌より単離し、これを微生物に導入することによりコエンザイムＱ10を生成させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のコエンザイムＱ10の製造法は、タバコなどの植物由来のコエンザイムを単離してその側鎖長を合成法により調整する等によって工業的には生産されている。
また、コエンザイムＱ10は細菌や酵母などの微生物から高等動植物に至るきわめて幅広い生物により生産されることが知られているが、微生物を培養してその菌体より本物質を抽出する方法が最も有効な一つの製造法であると考えられ、実際の工業的な生産にも用いられている。しかしながら、これらの方法では、生成量が少なかったり、操作が煩雑であったりして、生産性が良くなかった。
【０００３】
コエンザイムＱ10の生物による生合成経路については、原核生物と真核生物では一部異なっているが、いずれも多くの酵素が関与した多段階の複雑な反応によって生成されている。しかし、基本的には大きく３つのステップ、すなわち、コエンザイムＱ10のプレニル側鎖のもとになるデカプレニル２燐酸を合成するステップ、キノン環のもとになるパラヒドロキシ安息香酸を合成するステップ、そして、これらの２つの化合物を結合させて置換基を順次変換してコエンザイムＱ10を完成させるステップよりなっている。これらの反応の中で、生合成反応全体の律速であると言われ、コエンザイムＱ10の側鎖の長さを決定している反応、すなわちデカプレニル２燐酸合成酵素の反応は最も重要な反応であると考えられる。そこで、コエンザイムＱ10を効率よく生産させる為には、生合成に関与するキー遺伝子、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子を単離して生産増強に利用することが有効であると考えられるが、その遺伝子源としてはコエンザイムＱ10を比較的多量に生産している真菌類が有力な候補となる。
【０００４】
これまでにデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（特開平９−１７３０７６）やＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（特開平１０−５７０７２）などいくつかの種類の微生物より分離されているが、本来これらの微生物ではコエンザイムＱ10の生産性が十分とはいえず、これらの微生物では効率的な培養や分離精製などは出来ていなかった。そこで、さらにコエンザイムＱ10を高生産する微生物由来の本酵素遺伝子を単離することが望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の生産に関する問題を解決するべく、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌由来のコエンザイムＱ10の側鎖合成遺伝子を単離してこれを利用することにより、微生物によってコエンザイムＱ10を効率よく生産することを目的とする。
上記目的を達成する為に、本発明では、まず、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌よりコエンザイムＱ10の生合成に関与するキー遺伝子、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子を単離した。そして、該遺伝子を大腸菌などの微生物に導入して発現させることにより、コエンザイムＱ10を効率よく生産させることが可能となった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、コエンザイムＱ10を比較的多量に生産しているＳａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌からデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を分離するための検討を重ね、該遺伝子を分離することに成功した。
【０００７】
即ち本発明は、配列番号１に記載のＤＮＡ配列、又はこの配列において１若しくは複数の塩基が欠失、追加、挿入、置換されたＤＮＡ配列を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明はまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又はこの配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、追加、挿入、置換されたアミノ酸配列を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質、さらにこのタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【０００８】
さらに本発明は、上記ＤＮＡを含有する発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、従来知られているベクター系いずれを用いても良く、例えば発現用ベクターｐＵＣＮＴへ配列番号１の配列を有するＤＮＡを導入してなる、ｐＮＴＳａ１が提供される。
本発明は、宿主微生物を上記ＤＮＡにて形質転換してなる形質転換体もまた、提供する。本発明の宿主微生物としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが好適に用いられる。
【０００９】
本発明はさらに、上記形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコエンザイムＱ10を生成蓄積し、これを採取する工程からなるコエンザイムＱ10の製造方法を提供する。本発明の方法において用いる、宿主微生物としては特に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが好適に用いられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの産生するコエンザイムＱは、コエンザイムＱ8 であるが、本発明の方法によって、コエンザイムＱ10を産生させることが可能となった。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、コエンザイムＱ10を比較的多量に生産しているＳａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌から本酵素遺伝子を分離するための検討を重ねたところ、ＰＣＲ法によって該遺伝子の断片を取得することに成功した。
【００１１】
既知のデカプレニル２燐酸合成酵素、及び本酵素と類縁で鎖長の違うコエンザイムＱの長鎖プレニル鎖合成酵素であるポリプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子の配列を比較し、その相同性の高い領域についてＰＣＲプライマーを各種合成した。そしてこれらのプライマーを種々組み合わせ、ＰＣＲの条件をいろいろ検討したところ、プライマーＤＰＳ−１（５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＮＹＴＮＣＡＹＧＡＹＧＡＹＧＴ−３’）及びＤＰＳ−１ １ＡＳ（５’−ＡＲＹＴＧＮＡＤＲＡＡＹＴＣＮＣＣ−３’）を用い（なお、ここで示した配列中の、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、そしてＮはＧ、Ａ、ＴまたはＣを示す。）、ＰＣＲを９４℃、３分間の熱処理の後、９４℃、１分→４３℃、２分→７２℃、２分のサイクルを４０回繰り返すことにより、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属に属する真菌、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８の染色体遺伝子から本酵素遺伝子の約２２０ｂｐの断片が増幅してくることを、その遺伝子の塩基配列を解析することにより明らかにした。
【００１２】
そこで次に本酵素遺伝子の全長を取得するためには、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８の染色体遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ラムダファージベクターに挿入して組換えファージライブラリーを作製する。そのプラークをナイロン膜に転写した後、標識した該ＰＣＲ断片を用いてプラークハイブリダイゼーションを行えば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子全長を持つクローンを取得することができる。
【００１３】
得られたクローンに含まれるデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子について塩基配列の決定を行ったところ、配列表の配列番号１に示した配列を持つことが明らかとなり、この配列から予想できるアミノ酸配列にはデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子として特徴的な配列がみられる。
【００１４】
本発明において、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に示すＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列である。配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質には、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するものが含まれる。コドンは縮重しているため、配列番号２に示すアミノ酸配列から予測されるＤＮＡ配列としては、配列番号１を含んで複数挙げられ、これらの配列を有するＤＮＡにはデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。
【００１５】
本発明において、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡには、配列番号１及び配列番号２に示すアミノ酸配列から予測されるＤＮＡ配列を有するものに限らず、発現して得られたタンパク質がデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有する限り、これらのＤＮＡ配列において１若しくは複数の塩基が欠失、追加、挿入、置換されたＤＮＡ配列を有するＤＮＡも含まれる。本発明において、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質には、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に限らず、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有する限り、この配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、追加、挿入、置換されたアミノ酸配列を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
【００１６】
デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を発現させるためには、適当なプロモーターの下流に該遺伝子を接続することが必要であるが、例えば遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素によって切り出したり、ＰＣＲによって酵素をコードする遺伝子部分のみを増幅させたりした後、プロモーターを持つベクターに挿入することにより発現ベクターとすることができる。本発明において、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込む発現用ベクターとしては特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミドに、適当なプロモーターを組み込んだものが挙げられる。大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９等が挙げられ、プロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター等が挙げられる。また、本発明においては発現用ベクターとして、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｘ（以上、ファルマシア社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII、ｐＵＣ１９（東洋紡社製）、ｐＭＡＬＣ２、ｐＥＴ−３Ｔ、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４/ ０３６１３に記載）等を用いることもできる。このうち、ｐＵＣＮＴが好適に用いられ、具体的な例としては、発現用ベクターｐＵＣＮＴに配列番号１に示すＤＮＡ配列を有する遺伝子を挿入すれば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐＮＴＳａ１を作製することができる。
【００１７】
そして、該酵素遺伝子の発現ベクターを適当な微生物に導入することによりコエンザイムＱ10の生産に利用することが可能となる。宿主微生物としては特に限定されず、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが好適に用いられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとしては特に限定されず、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＢＬ−２１、ＪＭ１０９、ＮＭ５２２、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＤＨ５等が挙げられる。このうちＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αが好適に用いられ、例えば、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐＮＴＳａ１を大腸菌に導入した場合には、大腸菌が本来は生産しないコエンザイムＱ10を、著量生産するように変換できる。この大腸菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＮＴ Ｓａ１）は通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−６８４４として寄託されている。
【００１８】
また、宿主微生物として川向らが作製したオクタプレニル２リン酸合成酵素遺伝子破壊大腸菌菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＯ２２９（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９７年、第１７９巻、３０５８−３０６０頁）はコエンザイムＱ8 が生産できないため、これを宿主として用いることによりさらにコエンザイムＱ10を高生産する事ができる。
本遺伝子は単独で用いるほか、他の生合成に関与する遺伝子と同時に微生物に導入して発現させることにより、さらに良い効果が期待できる。
【００１９】
本発明で得られた形質転換体を、常法に従い、培養し、培養物中からコエンザイムＱ10を採取することにより、コエンザイムＱ10を製造することができる。宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである場合は、培地として、ＬＢ培地や、グルコースやカザミノ酸を含むＭ９培地を用いることができる。プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピルチオガラクトシドやインドリル−３−アクリル酸のような薬剤を培地に加えてもよい。培養は例えば、３７℃で１７〜２４時間行い、この際必要により通気や攪拌を行ってもよい。本発明において、得られたコエンザイムＱ10は精製を行ってもよく、粗精製物として用いてもよく、用途により適宜選択することができる。得られた培養物からコエンザイムＱ10を単離するには公知の分離・精製法を適宜組み合わせることができる。公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈殿等の溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、及び、（ＳＤＳ−）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。本発明において得られたコエンザイムＱ10の用途は特に限定されず、医薬品等に好適に用いることができる。
【００２０】
【実施例】
（実施例１）
Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８の染色体ＤＮＡをＣ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎらの方法（Ｇｅｎｅ、５７（１９８７）２６７−２７２）で調製した。既知の長鎖プレニル２燐酸合成酵素の遺伝子との相同性からＰＣＲに用いるプライマーＤＰＳ−１（５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＮＹＴＮＣＡＹＧＡＹＧＡＹＧＴ−３’）及びＤＰＳ−１ １ＡＳ（５’−ＡＲＹＴＧＮＡＤＲＡＡＹＴＣＮＣＣ−３’）を設計した。なお、ここで示した配列中の、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、そしてＮはＧ、Ａ、ＴまたはＣを示す。これらを用いてＰＣＲを９４℃、３分間の熱処理の後、９４℃、１分→４３℃、２分→７２℃、２分のサイクルを４０回繰り返すことにより行い、１．２％アガロースゲル電気泳動により分析した。
【００２１】
そして得られた約２２０ｂｐの断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標） ＢｒａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用ベクターにクローニングし、ｐＴ７−ＳａＤＰＳを得た。ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標） ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ＡｍｐｔｉＴａｑ（登録商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行い配列を決定した。その結果、配列表の配列番号１の７１７から９２４までの塩基配列に示す配列が得られた。この翻訳配列に長鎖プレニル鎖を持つプレニル２燐酸合成酵素に特徴的な領域の配列「ＧＤＦＬＬＧＲＡ」が見出せたことにより、得られた配列はデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子の一部であることが想定された。
【００２２】
（実施例２）
Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子と思われる２２０ｂｐのＤＮＡ断片を持つｐＴ７−ＳａＤＰＳベクターＤＮＡ０. ０３μg を用い、ＰＣＲ用のプライマーＳａ−１Ｓ（５’−ＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＧＡＡＡＣＧＣＡＣＣＡ−３’の配列を持つ）及びＳａ−２ＡＳ（５’−ＴＧＧＴＧＣＧＴＴＴＣＧＴＣＴＧＧＴＣＴＣ−３’の配列を持つ）を用いてＰＣＲ（９４℃、３分→（９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、１分）×２５サイクル繰り返し→７２℃、５分→４℃）を行い、１．２％アガロース（宝酒造製）によるゲル電気泳動を行い、約１４５ｂｐの断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標） ＢｒａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した。このＤＮＡ断片約１００ｎｇを用い、ＥＣＬダイレクト核酸ラベリングシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて化学発光標識した。
【００２３】
（実施例３）
Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動を行った。このゲルをアルカリ（０. ５Ｍ ＮａＯＨ、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）で変成させ、中和（０. ５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７. ５）、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）した後、ハイボンドＮ＋フィルター（アマシャム社製）をゲルに重ね、２０×ＳＳＣを用いて一晩、サザントランスファーさせた。そのフィルターを乾燥し、８０℃で２時間焼付けを行った後、ＥＣＬダイレクト核酸ラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）でサザンハイブリダイゼーションと検出を行った。すなわち、ゴールドハイブリダイゼーション液（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて４２℃、１時間プレハイブリダイズした。
【００２４】
化学発光標識したプローブを９５℃で５分間加熱後、氷中で急冷し、プレハイブリダイズ処理したフィルターのプレハイブリダイズ液に添加し、４２℃で２２時間ハイブリダイズさせた。このフィルターを６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ溶液を用いて４２℃で２０分２回洗浄後、２×ＳＳＣ溶液を用い室温で５分２回洗浄した。このフィルターをエンハンスドケミルネセンス試薬（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に浸した後、Ｘ線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したバンドを検出した。
その結果、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した約１０ｋｂｐの断片に強くハイブリダイズしていた。
【００２５】
（実施例４）
Ｓａｉｔｏｅｌｌａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔａ ＩＦＯ １０７４８の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、０. ８％アガロースによるゲル電気泳動を行い、約１０ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片をゲルより切り出して精製することにより、クローン化に用いるＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をλ−ＤＡＳＨIIファージキット（ストラテジーン社製）を用いてそのファージのＥｃｏＲＩサイトに組み込み、インビトロパッケージングキット（アマシャム社製）でパッケージングを行った。そして、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）に感染させてＮＺＹ平板培地（５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ ＮＺアミン、１８ｇ／Ｌ 寒天（ｐＨ７. ５））上にＮＺＹ軟寒天培地（ＮＺＹ平板培地の寒天のみ８ｇ／Ｌ）とともに重層してプラークとした。これをハイボンドＮ＋フィルター（アマシャム社製）にトランスファーしアルカリ（０. ５Ｍ ＮａＯＨ、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）で変成した後、中和（０. ５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７. ５）、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）、乾燥し、８０℃で２時間焼付けを行った。
【００２６】
焼き付け後のフィルター９枚を用い、実施例３と同様にプレハイブリダイゼーション、化学発光標識したプローブを用いたハイブリダイゼーションを行い、このフィルターを洗浄した。このフィルターを乾燥後、Ｘ線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したスポットに対応するファージのプラークを分離した。この分離したプラークのファージを上記と同様の方法で大腸菌に感染させてプラークとし、フィルターに写して再びハイブリダイゼーションを行い、確認を行ったところ、６株のファージが選択できた。
【００２７】
このファージの懸濁液を用い、上記のＳａ−１Ｓ及びＳａ−２ＡＳを用いＰＣＲを行ったところ、６株に１４５ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。そこで組み換えλ−ＤＡＳＨＩＩファージ粒子からラボマニュアル遺伝子工学（村松正實編、丸善株式会社、１９９０年）に従って、ファージＤＮＡを調製した。調製したファージＤＮＡを、サブクローニングするため、制限酵素ＳａｌＩ、ＳａｃＩで切断し、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動を行った。このゲルをアルカリ（０. ５Ｍ ＮａＯＨ、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）で変成させ、中和（０. ５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７. ５）、１. ５Ｍ ＮａＣｌ）した後、ハイボンドＮ＋フィルター（アマシャム社製）をゲルに重ね、２０×ＳＳＣを用いて一晩、サザントランスファーさせた。そのフィルターを乾燥し、８０℃で２時間焼付けを行った後、ＥＣＬダイレクト核酸ラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）でサザンハイブリダイゼーションと検出を行った。すなわち、ゴールドハイブリダイゼーション液（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて４２℃、１時間プレハイブリダイズした。
【００２８】
化学発光標識したプローブを９５℃で５分間加熱後、氷中で急冷し、プレハイブリダイズ処理したフィルターのプレハイブリダイズ液に添加し、４２℃で２２時間ハイブリダイズさせた。このフィルターを６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ溶液を用いで４２℃で２０分２回洗浄後、２×ＳＳＣ溶液を用い室温で５分２回洗浄した。このフィルターをエンハンスドケミルネセンス試薬（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に浸した後、Ｘ線フィルムに密着させて感光させ、黒く感光したバンドを検出した。
【００２９】
その結果、制限酵素ＳａｌＩで切断した約４．５ｋｂとＳａｃＩで切断した約３．５ｋｂの断片に強くハイブリダイズしていた。ファージＤＮＡを、制限酵素ＳａｌＩ、ＳａｃＩで切断し、０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動を行った。そして黒く感光したバンドに相当する位置の大きさの制限酵素消化断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標） ＢｒａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標） ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ＡｍｐｔｉＴａｑ（登録商標） ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を行い配列を決定した。
【００３０】
その結果、配列表の配列番号１の１１２４にＳａｌＩサイトが、１２４１にＳａｃＩサイトが存在することが判り、Ｃ末端までを両断片とも含まなかったので、２つの制限酵素のうち、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の中の前の方に存在しているＳａｌＩについて残りの制限断片を調べたところ３ｋｂｐの断片に、ＳａｃＩ断片の終わりの部分を含む終止コドンまでを含んでいた。これら３つの制限酵素断片を解析することによりデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の全配列を明らかにすることができた。３つのＤＮＡ断片のうちの、約１. ６ｋｂｐのＤＮＡについてその塩基配列を決定したが、その結果を配列表の配列番号１に示す。また、このＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００３１】
得られた配列を、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０年、第２６５巻、１３１５７−１３１６４頁に記載のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子と比較したところ、アミノ酸配列では約４８％の相同性を有していた。また、特開平９−１７３０７６に記載のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ由来のデカプレニル２燐酸合成酵素と比較したところ、アミノ酸では４９％の相同性を有していた。
【００３２】
（実施例５）
調製したファージＤＮＡよりデカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子部分のみを切り出す為、合成ＤＮＡプライマーＳａ−Ｎ１（５’−ＡＡＣＡＴＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＧＧ−３’の配列を持つ）及びＳａ−Ｃ（５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＣＴＴＧＡＣＣＴＡＧＴＣＡＡＣＡＣ−３’の配列を持つ）を用いて実施例３と同様にＰＣＲを行い、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断した後、発現用ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４/ ０３６１３に記載）に挿入してデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐＮＴＳａ１を作製した。得られた発現ベクター、ｐＮＴＳａ１の制限酵素地図を図１に示す。なお、ＤＰＳとは、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子のコード領域を意味する。
【００３３】
（実施例６）
作製したデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクターｐＮＴＳａ１を大腸菌ＤＨ５αに導入し、１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃、一晩振とう培養し、菌を遠心分離（３０００回転、２０分間）で集めた。
【００３４】
この菌体を１ｍＬの３％硫酸水溶液に懸濁し、１２０℃、３０分間熱処理後、２ｍＬの１４％水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に１２０℃、１５分間熱処理した。この処理液に３ｍＬのヘキサン・イソプロパノール（１０：２）を添加して抽出し、遠心分離の後、その有機溶媒層１. ５ｍＬを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを２００μＬのエタノールに溶解し、その２０μＬを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、ＬＣ−１０Ａ）により分析した。分離には逆相カラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ、２５０×４. ６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２０Ａ）を用い、エタノール・メタノール（２：１）を移動相の溶媒として使用して分離させ、２７５ｎｍの波長の吸光度で生成したコエンザイムＱ10を検出した。結果を図２に示した。図２に示すように、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによって、組換え大腸菌では、大腸菌が本来生産しないコエンザイムＱ10を、生産するようになったことが分かった。
【００３５】
得られた組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＮＴ Ｓａ１）は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１１年８月１７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４４）。
【００３６】
（実施例７）
川向らが作製したオクタプレニル２リン酸合成酵素遺伝子破壊大腸菌菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＯ２２９は、該遺伝子がスペクチノマイシン耐性プラスミド上（ｐＫＡ３）に保持された状態で維持され、該プラスミドが脱落すると致死になることが判っている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １９９７年、第１７９巻、３０５８−３０６０頁）。この破壊株にｐＮＴＳａ１を導入するため、ＫＯ２２９にｐＮＴＳａ１を導入後、アンピシリンを含む１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃、一晩振とう培養し、その１％を新たなアンピシリンを含む１０ｍＬのＬＢ培地に継植後、さらに３７℃、一晩振とう培養する事を９回繰り返した後、アンピシリンを含むＬＢプレート培地で生育し、スペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地で生育し無い株を選択した。
【００３７】
（実施例８）
実施例７で作製したｐＮＴＳａ１を導入したＫＯ２２９株を１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃、一晩振とう培養し、菌を遠心分離（３０００回転、２０分間）で集めた。
【００３８】
この菌体を１ｍＬの３％硫酸水溶液に懸濁し、１２０℃、３０分間熱処理後、２ｍＬの１４％水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に１２０℃、１５分間熱処理した。この処理液に３ｍＬのヘキサン・イソプロパノール（１０：２）を添加して抽出し、遠心分離の後、その有機溶媒層１. ５ｍＬを分離し、減圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを２００μＬのエタノールに溶解し、その２０μＬを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製、ＬＣ−１０Ａ）により分析した。分離には逆相カラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ、２５０×４. ６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２０Ａ）を用い、エタノール・メタノール（２：１）を移動相の溶媒として使用して分離させ、２７５ｎｍの波長の吸光度で生成したコエンザイムＱ10を検出した。結果を図３に示した。図３に示すように、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させることによって、大腸菌が本来生産しないコエンザイムＱ10を、生産するようになり、また、コエンザイムＱ8 を生産できる大腸菌に比べてコエンザイムＱ10を、著量生産するように変換できた。
【００３９】
【発明の効果】
コエンザイムＱ10の生合成に関するキー酵素、デカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子をＳａｉｔｏｅｌｌａ属の真菌より単離し、配列決定を行った。また、これを大腸菌に導入して発現させることに成功した。本発明の方法を用いることにより医薬品等として用いられているコエンザイムＱ10を効率的に製造することができる。
【００４０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を持つプラスミド、ｐＮＴＳａ１の制限酵素地図を示す。
【図２】デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌ＤＨ５αにおいて、生産されたコエンザイムＱ10を高速液体クロマトグラフィーによって検出したチャートを示す。
【図３】デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌ＫＯ２２９において、生産されたコエンザイムＱ10を高速液体クロマトグラフィーによって検出したチャートを示す。
Claims (10)
- 配列番号１に記載のＤＮＡ配列、又はこの配列において１若しくは複数の塩基が欠失、追加、挿入、置換されたＤＮＡ配列からなり、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列、又はこの配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、追加、挿入、置換されたアミノ酸配列からなり、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質。
- 請求項２記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 発現用ベクターに請求項１又は３記載のＤＮＡを組み込んでなる発現ベクター。
- 宿主微生物を請求項１又は３記載のＤＮＡにて形質転換してなる形質転換体。
- 宿主微生物を請求項４記載の発現ベクターにて形質転換してなる形質転換体。
- 宿主微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである請求項５又は６記載の形質転換体。
- Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αである請求項７記載の形質転換体。
- 形質転換体は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＮＴ Ｓａ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４４）である請求項８記載の形質転換体。
- 請求項５、６、７、８又は９記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコエンザイムＱ10を生成蓄積し、これを採取する工程からなるコエンザイムＱ10の製造方法。
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