KR20030022274A

KR20030022274A - 히드록실화 콜라겐 유사 화합물의 제조 방법

Info

Publication number: KR20030022274A
Application number: KR10-2003-7000435A
Authority: KR
Inventors: 드브루인에릭크리스티안; 베르텐마크빌렘테오도르; 드볼프프레드릭안톤
Original assignee: 아토 비.브이.
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2003-03-15
Also published as: CA2415464A1; EP1299526A1; WO2002004615A1; JP2004516010A; WO2002004615A8; AU2001272851A1; US20030166149A1

Abstract

본 발명은 히드록실화 프롤린 잔기를 함유하는 콜라겐 유사 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 프롤린 잔기의 히드록실화가 진균, 바람직하게는 효모, 특히 한세눌라 폴리모르파 유래의 프롤릴 히드록실제에 의해 이루어지는 재조합 콜라겐 유사 화합물의 제조 방법이 특히 중요하다. 또한, 본 발명은 콜라겐 유사 올리고펩티드, 예컨대 젤라틴 가수분해물, 특히 젤라톤 또는 펩톤을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 상기 프롤릴 히드록실라제에 의한 프롤린 잔기의 히드록실화를 조절하는 방법에 관한 것이다.

Description

히드록실화 콜라겐 유사 화합물의 제조 방법{METHOD FOR THE PRODUCTION OF HYDROXYLATED COLLAGEN-LIKE COMPOUNDS}

콜라겐은 섬유상 단백질의 한 부류를 일컫는 총괄적 명칭이다. 콜라겐의 구조는 3중 나선 도메인의 형성을 가능하게 하는 -(Gly-Xaa-Yaa)_n- 트리플릿의 1차 서열 반복부를 포함하는 3개의 폴리펩티드 사슬의 조립체인 것이 특징이다. 생합성시 콜라겐을 형성하는 폴리펩티드 사슬은 몇가지의 번역후 변형을 겪는다. 이들 변형 중 가장 두드러진 것은 아마도, 반복되는 -(Gly-Xaa-Yaa)_n- 트리플릿의 Yaa 위치의 프롤린 잔기가 4-히드록시프롤린으로 히드록실화되는 것일 것이다. 단백질 사슬이 37℃에서, 그리고 4℃에서 3중 나선 구조로 폴딩되려면 Yaa-위치의 프롤린 잔기의 적당수가 히드록실화되는 것이 필수적이며, 비히드록실화 젤라틴은 시험관내에서 3중 나선 구조를 형성하지 못한다. 히드록실화가 일어나지 않는다면, 펩티드 사슬은 비나선형으로 남게 되어, 안정한 콜라겐 구조로 스스로 조립될 수 없다. -Gly-Xaa-Yaa- 트리플릿의 Yaa 위치의 프롤린의 4-히드록시프롤린으로의 히드록실화에 관여하는 효소는 프롤릴 4-히드록실라제이다.

콜라겐은 수많은 의료 분야, 예컨대 미용 성형, 조직 공학 및 상처 치료제 분야에서 생체재료로서 사용된다. 젤라틴은 변성되어 부분적으로 분해된 콜라겐이다. 또한, 콜라겐은 캡슐, 외과용 스폰지, 상처 치료제, 백신, 약물 전달 시스템 등의 각종 의약 및 약학 분야에서 사용되고 있으며, 겔화제로서 식품 산업에서도 사용되고 있고, 사진 산업에서도 사용되고 있다. 천연 콜라겐(및 젤라틴)의 가장 대표적인 공급원은 동물 뼈와 가죽이다. 그러나, 특히 고급 의료 용도뿐 아니라, 일정한 조성의 콜라겐 또는 젤라틴이 요구되는 용도에서는 대체 공급원이 필요하다는 인식이 오래 전부터 있었다. 특히 미생물에 의한 콜라겐의 생산은, 동물 또는 인간 콜라겐 공급원을 사용하는 경우, 특히 이러한 콜라겐을 일정 형태로 사람이 섭취하는 경우 수반되는 면역 관련 위험, 바이러스 관련 위험 및 프리온 관련 위험을 경감시킨다는 점에서 유익할 것이다. 일반적으로, 콜라겐의 생산을 위한 적절한 진핵 미생물은 진균이며, 특히 효모가 사용된다. 하등 진핵 생물은 폴딩되지 않은 단일 사슬 비히드록실화 전구체 콜라겐을 히드록실화 3중 나선 콜라겐으로 전환시키는 번역후 세포소기관을 보유하고 있지 않다는 것이 일반적으로 알려져 있다. 특히 최근 지식에 의하면 진균, 특히 효모에는 효소 프롤릴 4-히드록실라제가 없다. 하등 미생물, 예컨대 진균, 특히 효모가 히드록실화 3중 나선 콜라겐을 생산할 수 있도록 하기 위해서는 동물(인간) 기원의 프롤릴 4-히드록실라제를 미생물 숙주에서 동시 발현시켜야 한다.

몇몇 문헌은 프롤릴 히드록실라제를 동시 발현하는 효모에서의 히드록실화콜라겐 생산에 대해 개시하고 있다.

WO 93/07889에는 효모 세포를 비롯한 각종 세포에서 재조합 DNA 시스템을 이용하여 프로콜라겐 또는 콜라겐을 합성하는 것에 대해 기술되어 있다. 상기 문헌에서는 본래 프롤릴 4-히드록실라제를 발현하는 동물 세포가 사용된다. 번역후 효소가 없는 세포를 프롤릴 4-히드록실라제와 같은 효소를 암호화하는 유전자로 형질전환시킬 수 있다. 실시예에서는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 재조합(이종) 콜라겐 유전자 및 프롤릴 4-히드록실라제에 대한 재조합(이종) 유전자로 형질전환시키는 방법에 대해 기술하고 있다.

WO 97/14431은 효모에서 재조합 프로콜라겐(비히드록실화 콜라겐)을 생산하는 것에 관한 문헌이다. 상기 문헌에서는 "효모는 프로콜라겐의 프롤린 잔기를 히드록실화하는 데 필요한 효소를 합성하지 않는다"라고 명시하고 있다. 닭 프롤릴 4-히드록실라제를 효모 균주 GY5196 및 GY5198에 도입하자 최대 35℃에서 안정한 3중 나선 구조가 생성되었다고 개시하고 있다. 콜라겐 3중 나선 구조의 분석 결과를 통해 히드록시프롤린이 존재한다는 것을 직접적으로 증명하였다.

WO 97/38710에는 콜라겐을 암호화하는 서열을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 번역후 효소 또는 이의 서브유닛을 암호화하는 서열을 포함하는 제2 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에서의 콜라겐 생산에 대해 기술되어 있다. 효모 세포, 예컨대 사카로마이세스 세레비지에, 피키아 파스토리스 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 비롯한 각종 숙주 세포가 언급되어 있다. 실시예에서는 사카로마이세스 세레비지에 및 피키아 파스토리스에서의 발현을 위한 인간 프롤릴 4-히드록실라제에 대한 유전자 및 인간 콜라겐 III형에 대한 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 구성 방법에 대해 기재되어 있다. 상기 문헌은 피키아 파스토리스에서 인간 프롤릴 4-히드록실라제 및 3중 나선형의 인간 콜라겐 III가 모두 발현됨을 입증한다.

또한, 최근 과학 문헌에서는 번역후 효소 프롤릴 4-히드록실라제가 효모에서 동시 발현되기 위한 요건을 예시하였다. Vuorela 등의 문헌(1997)[EMBO J. 16, 6702-6712] 및 Vaughan등의 문헌(1998)[DNA Cell Biol. 17, 511-518]에 의하면, 먼저 프롤릴 히드록실라제를 발현하도록 효모 피키아 파스토리스를 조작하였고, 이후에 III형 프로콜라겐에 대한 유전자를 도입하면 이 효모는 히드록실화된 기능적인 3중 나선 프로콜라겐 III을 생산하는 것으로 나타났다. Toman 등의 문헌(2000)[J. Biol. Chem, vol. 275, 5월 8일 발행(www.jbc.org, M002284200)]에는 재조합 인간 I형 프로콜라겐의 생산에 대해 기술하고 있는데, 닭 프롤릴 4-히드록실라제가 동시 발현되면 조직 유래 I형 콜라겐과 비교하여 상기 재조합 인간 I형 콜라겐의 프롤린 함량의 82%가 히드록실화되어 안정한 3중 나선 구조를 이루게 된다.

히드록실화 콜라겐의 생산을 위해 효모에 대해 이종인 프롤릴 4-히드록실라제를 효모에 도입하는 방법에는 몇가지 단점이 있다. 프롤릴 4-히드록실라제의 발현을 위한 정보를 포함하는 적절한 유전자 작제물을 구성하기 위한 추가 단계를 수행할 필요가 있다. 효모 세포에 추가 유전자 작제물을 도입하는 것은 효모에 더 큰 부담을 부가하여 형질변환 효율을 감소시키고, 그 결과 효모의 성공적인 형질변환을 위해서 더 많은 재료가 필요하게 된다. 동물(인간) 히드록실라제의 동시 발현은효모에 의한 콜라겐(및 젤라틴) 생산 수율을 상대적으로 더 감소시킨다(Vuorela 등(1997) EMBO J. 16, 6702-6712 및 Keizer-Gunnik 등(2000) Matrix Biology 19, 29-36). 예컨대 피키아 파스토리스에서의 재조합 인간 프롤릴 4-히드록실라제의 과발현은 젤라틴 수율을 감소시키는 것 외에도, 세포 형태 변화와 성장 억제를 유발한다.

WO 96/39529에는, 포유동물(인간) 프리프로콜라겐 시그널이 목적하는 이종 단백질에 작동가능하게 연결되어 있는 숙주 세포로부터의 이종 단백질의 분비에 대해 기술하고 있다. 특히 한세눌라 폴리모르파가 숙주 세포로서 언급되어 있다. 또한, 이 문헌은 H. 폴리모르파에서 내생 콜라겐 유사 화합물을 생산하는 것에 대해서도 기술하고 있다. 상기 문헌의 저자는 H. 폴리모르파 상청액 중의 단백질로부터 얻은 14개의 아미노산 잔기 및 13개의 아미노산 잔기 각각의 2개의 말단 서열을 기초로 하여, 이 단백질이 콜라겐 관련 단백질과 동종이라는 결론을 내렸다. 14개 및 13개 아미노산 잔기의 2가지 서열은 Gly-Pro-Pro 반복부(WO 96/39529의 서열 목록 서열 번호 8 및 서열 번호 9 참조)로서 기록되어 있다. 발견된 서열과 공지 콜라겐 서열의 매칭 분석에 의하면 공지 화합물은 히드록실화 프롤린을 함유한다고 기재되어 있다. WO 96/39529는 H. 폴리모르파에 의해 분비되는 콜라겐 유사 단백질 중의 히드록시프롤린의 존재에 대해 분명히 기술하고 있지 않을 뿐만 아니라, H. 폴리모르파가 콜라겐 유사 화합물을 분비한다는 관찰로부터 어떠한 종류의 유용성도 제시하고 있지 않다.

본 발명은 히드록실화 프롤린 잔기를 함유하는 콜라겐 유사 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

도 1: H. 폴리모르파에 의한 재조합 젤라틴의 구성적 발현. 화살표는 15 kDa의 젤라틴 생성물을 나타낸다.

도 2: H. 폴리모르파에 의한 재조합 젤라틴의 메탄올 유도 발현. 화살표는 15 kDa의 젤라틴 생성물을 나타낸다.

도 3: SDS-PAGE, YPD 배지에서 배양한 H. 폴리모르파 세포로부터 얻은 단백질을 코마시 브릴리언트 블루로 염색함. M: 저분자량 단백질 마커(파마시아). 레인 1, 70℃에서 열 처리하고 세포를 제거한 후의 상청액; 레인 2, 40%(부피) 아세톤에 침전시킨 단백질; 레인 3, 40% 침전물을 제거하고 40%(부피) 아세톤 상청액을 80%(부피) 아세톤으로 만든 후 침전시킨 단백질. 화살표는 38 kDa의 콜라겐 유사 단백질을 나타낸다.

도 4: H. 폴리모르파 세포를 배양한 YPD 배지의 SDS-PAGE. M: 저분자량 단백질 마커(파마시아). 레인 1, 세포를 제거한 후의 YPD 배지; 레인 2, 배지의 40%(부피) 아세톤 침전물; 레인 3: 40% 침전물을 제거하고 40%(부피) 아세톤 상청액을 80%(부피) 아세톤으로 만든 후 침전시킨 단백질.

도 5: 펩톤을 보충한 배지에서의 글루코스 반회분식 발효 중에 H. 폴리모르파에 의해 생산된 세포외 단백질의 SDS-PAGE. 배양 상청액 10 ㎕를 각 웰에 로딩하였다. 레인 1, 2, 3; 각각 발효 24, 40, 70시간 후에 해당. M: 광범위한 정밀 단백질 스탠더드(바이오-래드). 38 kDa 내생 단백질 밴드가 관찰된다.

발명의 개요

본 발명의 목적은 히드록실화 프롤린 잔기를 함유하는 콜라겐 및 콜라겐 유사 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 진균, 특히 효모는 전구체 콜라겐의 프롤린 잔기의 번역후 히드록실화에 관여하는 효소를 보유하고 있지 않다는 것을 교시하는 최신 기술에서 일반적으로 인식되고 있는 것과는 달리 일부 진균, 특히 단세포 진균이 프롤릴 히드록실라제 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 당해 기술에서는 히드록실화 콜라겐을 얻기 위해서는 동물(인간) 프롤릴 4-히드록실라제를 동시 발현시켜야 한다고 교시한다. 본 발명자들은 어떠한 이종(외생) 프롤릴 4-히드록실라제도 동시 발현시키지 않고 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시켜서 재조합 콜라겐을 생산하였다. 상기 내생 히드록실라제 활성은 일부 원핵생물 및 기타 생물에서 관찰되는, 유리 프롤린 상에만 작용할 수 있고, 펩티드에 혼입된 프롤린 잔기에는 작용할 수 없는 프롤린 히드록실라제 활성(Shibasaki 등(1999) Tetrahedron Letters 40, 5227-5230)과는 근본적으로 다르다.

발명의 상세한 설명

놀랍게도, 외생 동물(인간) 프롤릴 4-히드록실라제의 발현을 위한 어떤 형태의 정보도 없이 마우스 I형 콜라겐 서열을 포함하는 발현 시스템만을 이용하여 H. 폴리모르파를 형질전환시켜서 히드록실화 콜라겐을 얻었다. 이로써, H. 폴리모르파는 예상외로 내생 프롤릴 히드록실라제 활성을 나타내었다. 실험은 효모 H. 폴리모르파를 이용하여 수행하였지만, 다른 효모와 사상균에도 적용할 수 있다. 따라서,본 명세서에서 사용된 "진균" 또는 "진균의"이란 용어는 효모는 물론 사상균을 포괄하는 의미로 사용된다.

본 발명자들은 진균 프롤릴 히드록실라제 활성을 발견한 것 외에도 이 활성이 조절 가능하다는 것을 발견하였다. 미생물의 배양을 위해 사용되는 배양 또는 발효 배지(중의 성분)에 따라 프롤린 잔기의 히드록실화는 유도되거나 억제될 수 있다. 동물 조직(예, 췌장) 유래의 효소(트립신) 가수분해물을 배지 중에 함유시키면 콜라겐 유사 화합물에서 프롤린 잔기의 진균에 의한 히드록실화가 유도된다. 가수분해물 중에 존재하는 특정 보조인자가 진균 프롤릴 히드록실라제 활성에 있어서 일정 역할을 할 수 있지만, 근본적인 역할은 젤라틴 또는 콜라겐 유사 화합물의 가수분해로부터 생성된 올리고펩티드에 의한 것이다. 완전한(intact) 젤라틴 또는 콜라겐 유사 화합물 역시 프롤릴 히드록실화를 위한 유도인자로서 작용할 수 있지만, 이들 화합물의 비겔화 부분이 실용적인 목적에는 더 적합하다. 비교적 순수한 젤라틴 가수분해물은 젤라톤(gelatone)이라는 상표명으로 시판되고 있으며, 동물 조직 가수분해물은 펩톤(peptone)으로서 시판되고 있다. 미생물용 배양 또는 발효 배지에서 젤라틴 가수분해물 및/또는 동물 조직 가수분해물을 제외시키면 진균에 의한 프롤린 잔기의 가수분해가 일어나는 것을 막을 수 있다.

실시예에서는 펩톤의 존재하에 H. 폴리모르파를 배양하면 히드록실화 콜라겐 유사 생성물이 얻어진다는 것을 보여준다. 무기물/최소 배지의 존재하에 임의의 보충성분 없이, 또는 카사미노산(카사미노 가수분해물)을 보충하여 발효시키면 히드록실화가 일어나지 않는다. 히드록실라제 활성 차이의 가장 큰 원인은 펩톤의 자극효과인 것으로 추정된다. 각종 동물 세포와 유사하게 세포 표면에 있는 콜라겐 수용체가 관여할 수 있다. 이러한 점에서 특이적인 부분 아미노산 서열이 일정 역할을 할 수 있다.

본래 콜라겐은 약 9.5의 비교적 높은 등전점(pI)을 갖는다. 그 결과, 조심스럽게 분리 및 분해를 실시한다면 이의 가수분해물 역시 유사한 정도의 비교적 높은 등전점을 가질 수 있다. 실시예에서 사용된 펩톤은 pI가 약 9.5이다. 비교예에서는 pI가 약 4.5인 순수한 젤라틴의 트립신 분해물의 < 10 kDa 분획이 사용되었다. 펩톤에 의해 유도된 히드록실화 정도와 < 10 kDa 젤라틴 분획에 의해 유도된 히드록실화 정도를 비교하면 펩톤에 의해 유도된 히드록실화 정도가 평균 5배 더 큰 것으로 나타났다. 따라서, 유도인자로서 등전점이 비교적 높은 콜라겐 유사 단백질을 사용하는 것이 이롭다. 등전점의 경우 최적값이 존재하는 것으로 생각된다.

콜라겐 유사 단백질 외의 다른 단백질도 히드록실라제 활성에 대해 유도 효과를 나타낼 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 단백질은 바람직하게는 등전점이 높으면서 히드록시프롤린 잔기를 함유하는 것이 바람직하다. 예컨대, 익스텐신이 이 두가지 성질을 모두 갖는다. 익스텐신은 식물의 성장, 조절, 스트레스 반응, 세포-세포 인식 및 번식 생리에 있어서 일정 역할을 하며, 식물계 전반에 널리 분포되어 있다. 익스텐신은 히드록시프롤린 풍부 당단백질이며, 염기성 아미노산인 세린, 발린, 티로신, 리신 역시 풍부하고, 일부 예에서는 트레오닌도 풍부한 당단백질이다. 폴리펩티드 주쇄는 반복되는 히드록시프롤린을 포함한다. 자연 상태에서는 히드록시프롤린 성분은 글리코실화가 많이 되어 있다.

젤라틴 또는 콜라겐 유사 올리고펩티드 외에도 펩톤 중의 1종 이상의 성분이, 경우에 따라서는 이들이 함께 H. 폴리모르파 내의 히드록실라제에 대한 보조인자(들)로서 작용할 수 있다. 동물 프롤릴-히드록실라제에 대한 공지된 보조인자로는 아스코르브산, α-케토글루타레이트 및 Fe²⁺가 있다.

따라서, 본 발명은 진균 프롤릴 히드록실라제를 이용하는 것을 특징으로 하는, 히드록실화 프롤린 잔기를 함유하는 콜라겐 유사 화합물의 제조 방법을 제공한다. 프롤릴 히드록실라제는 단세포 진균, 바람직하게는 효모, 특히 한세눌라 폴리모르파에서 유래된 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 진균 프롤릴 히드록실라제에 의한 프롤린 잔기의 히드록실화가 콜라겐 유사 올리고펩티드, 예컨대 젤라틴 가수분해물, 특히 젤라톤 또는 펩톤의 첨가에 의해 조절되는, 히드록실화 프롤린 잔기를 함유하는 콜라겐 유사 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. 콜라겐 유사 올리고펩티드는 등전점이 7 이상인 것이 바람직하며, 등전점이 8 이상인 것이 더 바람직하고, 9 이상인 것이 더욱 더 바람직하다. 이론적으로 폴리-리신 또는 폴리-아르기닌의 경우 12 이상의 pI값을 얻을 수 있다. 자연에서는 pI값이 11.5 이상인 단백질은 거의 발견되지 않는다. 다른 구체예에서 진균 프롤릴 히드록실라제에 의한 프롤린 잔기의 히드록실화는 익스텐신의 첨가에 의해 조절된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서는 재조합 콜라겐 유사 화합물을 제조한다. 재조합이란 숙주 생물의 임의의 유전적 조작을 칭하는 것으로, 그 예로는 콜라겐유사 화합물 또는 진균 히드록실라제를 암호화하는 외생(이종) 유전자의 도입 및 콜라겐 유사 화합물 또는 진균 히드록실라제 및/또는 이의 조합체를 암호화하는 내생 유전자의 과발현이 있다.

재조합 단백질의 생산 및 적절한 발현 벡터의 구성 방법은 그 자체로 공지되어 있는 방법에 따라 실시할 수 있으며, 예를 들어 Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY, 1989] 및 Ausubel 등의 문헌[Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY 1989]에서 찾아볼 수 있다. 이러한 방법들에는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전자 재조합이 포함된다.

몇종의 독특한 유형의 콜라겐이 소, 양, 돼지, 닭 및 인간 콜라겐을 비롯하여 척추동물 콜라겐에서 확인되었다. 19종의 공지된 콜라겐에 대한 종합적인 고찰이 WO 97/38710에 개시되어 있다. 본 발명의 방법에서는 천연 콜라겐을 암호화하는 임의의 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합체를 포함하는 발현 벡터 또는 다중 발현 벡터를 사용할 수 있다. 발현 벡터에는 프로콜라겐 생산을 위해 부가적인 정보를 포함시킬 수 있다. 프로콜라겐이란 3량체로의 조립, 가용성, 정제 또는 기타 기능을 보조하는 역할을 하는 부가적인 C-말단 및/또는 N-말단 펩티드를 가진 콜라겐을 말하며, 이는 일정 단계에서 N-프로테이나제, C-프로테이나제 또는 기타 단백질에 의해 절단되어 콜라겐이 된다. 발현 벡터에 이러한 정보를 포함시키면 콜라겐(고도로 정렬된 3량체 구조) 또는 젤라틴(조립되지 않은 구조 또는 무작위로 조립된 구조)의 형성에 대해 조절이 가능하게 된다.

또한, 발현 벡터에는 구성적 프로모터와 유도성 프로모터, 개시 시그널, 선별 마커, 분비 시그널을 비롯하여 다수의 적절한 전사 및 번역 구성요소 중 임의의 것을 도입할 수 있다.

본 발명의 방법은 콜라겐 유사 화합물의 제조에 관한 것으로, (공지된) 천연 콜라겐의 제조에 국한되지 않는다. Gly-Xaa-Yaa 반복부 또는 Gly-Xaa-Yaa 반복부의 스트레치를 포함하는 단백질을 암호화하는 비천연 서열 역시 진균 히드록실라제에 의해 히드록실화된다. 콜라겐 유사 화합물은 천연 및 비천연 콜라겐 모두를 칭한다. 콜라겐 유사 화합물은 합성된 것일 수 있으며, 그 예로는 콜라겐 성질, 부분적인 비콜라겐 성질 또는 전체적인 비콜라겐 성질을 갖고/갖거나 하이드로콜로이드성, 비하이드로콜로이드성, 친수성 또는 소수성을 갖는 주문 제작된 아미노산 서열이 있다. 본 발명에 따른 콜라겐 유사 화합물은 Gly-Xaa-Yaa 트리플릿의 스트레치를 포함하고, 바람직하게는 Gly-Xaa-Yaa 트리플릿의 5개 이상, 보다 바람직하게는 10개 이상의 연속 반복부를 포함한다. 콜라겐 유사 화합물의 콜라겐 성질이 나타나려면 5개 이상, 바람직하게는 10개 이상의 Gly-Xaa-Yaa 트리플릿의 스트레치가 프롤린 및 히드록시프롤린에 풍부하게 존재하여야 한다. 변이가 발생하기도 하지만, 천연 포유동물 콜라겐은 Gly-Xaa-Yaa 트리플릿의 스트레치에서 Gly를 비롯하여 총 아미노산의 수의 약 20%가 프롤린 및/또는 히드록시프롤린이다. 일반적으로 히드록시프롤린은 Yaa 위치에서 발견된다. 어류, 특히 냉수성 어류에서는 프롤린 및/또는 히드록시프롤린의 비율이 훨씬 더 낮은데, 예컨대 15% 이하 또는 10% 이하로 존재한다. 비천연의 합성 또는 주문 제작된 콜라겐 유사 화합물의 경우 프롤린 잔기의 비율을 임의로 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 콜라겐 유사 화합물은 5개 이상, 바람직하게는 10개 이상의 연속적인 Gly-Xaa-Yaa 트리플릿의 반복부를 포함하며, 이 트리플릿의 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 15% 이상이 프롤린 및/또는 히드록시프롤린 잔기를 포함한다.

일단 프롤릴 히드록실라제 활성이 H. 폴리모르파에서 확인되면, 이 활성에 관여하는 효소를 분리할 수 있다. 서로 다른 효모 추출물을 분류하여 히드록실화 활성을 유발할 가능성이 있는 단백질 군(들)으로 범위를 좁혀나가서, 최종적으로 특이적 단백질을 분리할 수 있다. 보다 구체적으로는, 컬럼 크로마토그래피, 특히 친화성 크로마토그래피를 적용하여 효소를 정제 및/또는 분리할 수 있다. 예를 들어, 효모 프롤릴 4-히드록실라제의 정제 및/또는 분리는 펩톤 함유 배지에서 배양한 H. 폴리모르파의 세포 용해물을 폴리 L-프롤린/GPP 친화성 컬럼에 적용하여 수행할 수 있다(K.I. Kivirikko 및 R. Myllyla, Methods Enzymol. 1987). 용출물로서 폴리 L-프롤린/GPP(3 mg/㎖)이 적합하다. 그 후, 예컨대 수퍼덱스(Superdex) 200을 이용하여 겔 여과 단계를 수행한다.

프롤릴 4-히드록실라제 활성은 2-옥소[1-¹⁴C]글루테레이트의 히드록실화 + 탈카르복실화를 기초로 한 시험관내 분석에 의해 모니터링할 수 있다[K.I. Kivirikko 및 R. Myllyla, Methods Enzymol. 1982]. 정제된 효소에 대해 대량 핑거 프린팅을 실시할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 진균, 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파 유래의 프롤릴 4-히드록실라제에 관한 것이다.

분리된 진균 프롤릴 4-히드록실라제의 서열은 표준 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 분리된 진균 프롤릴 4-히드록실라제의 서열을 기초로 하여 이 효소를 암호화하는 유전 정보를 동정할 수 있다. 보다 구체적으로, H. 폴리모르파 프롤릴 4-히드록실라제의 N-말단 아미노산 서열과 1 이상의 내부 아미노산 서열을 함께 결정한다. 축퇴 프라이머를 포함하여 특이적 프라이머를 제작하여, 표준 방법을 이용하여 프롤릴 4-히드록실라제 유전자를 동정하고 분리하고 증폭시키는 데 상기 프라이머를 사용할 수 있다. 예를 들어, 제작된(축퇴) 프라이머를 사용하여 후속 클로닝에 사용할 수 있는 유전자를 (RT)PCR에 의해 분리한다.

공지 히드록실라제와의 상동성을 기초로 하여 올리고뉴클레오티드의 (축퇴) 스트레치를 제작하고, 이를 효모 DNA와 하이브리드화하는 데 사용할 수 있다. 이 목적을 위해 특히 유용한 것은 프롤릴 히드록실라제 효소의 젤라틴 또는 콜라겐 유사 화합물 결합 도메인일 수 있다. 보다 구체적으로, 동물 프롤릴 4-히드록실라제의 알파 서브유닛을 기초로 한 프로브를 사용하여, H. 폴리모르파로부터 분리된 게놈 DNA 또는 mRNA에 대해 저엄중도 올리고뉴클레오티드 하이브리드화를 수행함으로써 유전자를 분리할 수 있다. 마지막으로 동물 및 바이러스 히드록실라제의 촉매적으로 중요한 알파 서브유닛 서열을 기초로 한 축퇴 프라이머를 사용하여 프롤릴 4-히드록실라제를 암호화하는 유전자를 분리할 수 있다.

H. 폴리모르파로부터 분리된 프롤릴 4-히드록실라제에 대한 유전자를 기초로하면 다른 진균, 특히 다른 효모 균주에서 관련 유전자를 동정하는 것이 가능하다. 다른 효모 균주의 관련 유전자는 아마도 H. 폴리모르파 유래의 프롤릴 4-히드록실라제와 유사한 활성을 지닌 유사한 단백질을 생성할 것이다.

진균, 특히 효모의 프롤릴 4-히드록실라제를 암호화하는 분리된 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에 도입하여 이를 미생물 숙주를 형질전환시키는 데 사용할 수 있다. 발현 벡터는 또한 동물(인간) 콜라겐 유전자를 포함할 수 있다. 구체적으로, 진균, 특히 단세포 진균 또는 진균 유사 진핵 미생물을 형질전환시켜서 진균, 특히 효모의 프롤릴 히드록실라제를, 바람직하게는 재조합 콜라겐과 함께 발현시킬 수 있다. 히드록실화 콜라겐을 생산하기 위해 효모 프롤릴 4-히드록실라제를, 바람직하게는 재조합 콜라겐과 함께 발현시키는 데에는 효모 세포가 특히 바람직하다.

본 발명의 또 다른 측면은 진균 내생(동종) 콜라겐 유사 화합물의 생산에 관한 것이다. Gly-Xaa-Yaa 트리플릿의 스트레치, 보다 구체적으로 Gly-Pro-Pro 트리플릿의 스트레치를 포함하는 폴리펩티드를 효모, 특히 한세눌라 폴리모르파로부터 동정하고 분리할 수 있다. 효모(한세눌라 폴리모르파) 프롤릴 4-히드록실라제가 작용하면, 이 콜라겐 유사 화합물이 히드록실화된다. 구체적으로 Yaa 위치의 프롤린 잔기는 4-히드록시 프롤린으로 히드록실화된다. 이러한 미생물(내생 효모) 콜라겐 유사 화합물은 동물 또는 인간 콜라겐의 대용물이 될 수 있다. 천연의 비-동물 단백질에는 프리온과 바이러스가 없다. 효모에서의 내생 히드록실라제 활성은 H. 폴리모르파의 성장을 억제하지 않으며, 콜라겐 유사 화합물의 수율을 감소시키지 않는다. 다른 진균은 내생(히드록실화) 콜라겐 유사 화합물의 발현을 위한 유전자와세포소기관(의 일부)을 보유할 수 있다. 그러므로, 다른 발현 숙주, 예컨대 진균, 특히 효모를 내생 H. 폴리모르파 콜라겐 유사 화합물의 생산에 이용할 수 있다.

이러한 측면에서 본 발명은 진균 또는 진균 유사 진핵 미생물을 배양하는 단계, 및 내생 진균 콜라겐 유사 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 내생 진균 콜라겐 유사 화합물을 생산하는 방법을 제공한다. 진균은 단세포 진균인 것이 바람직하고, 효모, 특히 한세눌라 폴리모르파인 것이 바람직하다. 내생 효모 콜라겐 유사 화합물은 H. 폴리모르파로부터 생산된 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면 H. 폴리모르파 프롤릴 4-히드록실라제는 히드록실화 콜라겐 유사 화합물의 생산을 위해 H. 폴리모르파에서, 또는 다른 미생물 숙주에서 (과)발현시킬 수 있다. 콜라겐 유사 화합물은 미생물 숙주에 대해 외생(이종성) 또는 내생(동종성)일 수 있다. 프로테옴 기법을 이용하여 H. 폴리모르파의 콜라겐 유사 단백질을 암호화하는 유전자를 분리할 수 있다. 겔 내에서 단백질을 트립신으로 분해한 후, Q-tof 분석에 의해 내부 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 이어서, 축퇴 프라이머 제작과 (RT)PCR을 이용하여 콜라겐 유사 단백질을 암호화하는 유전자를 분리할 수 있다. 본 발명에 따르면 콜라겐 유사 화합물을 암호화하는 H. 폴리모르파 유전자(들)는 H. 폴리모르파 또는 다른 미생물 숙주에서, 바람직하게는 (히드록실화) 콜라겐 유사 화합물의 생산을 위해 진균 프롤릴 4-히드록실라제와 함께 (과)발현시킬 수 있다.

본 발명에 따른 생산을 위한 바람직한 숙주는 진균 또는 진균 유사 진핵 미생물이다. 적절한 사상균으로는 아스퍼질러스(Aspergillus), 리조푸스(Rhizopus)및 트리코더마(Trichoderma) 속에 속하는 것들이 있다. 특히 히드록실화 콜라겐 또는 콜라겐 유사 화합물의 생산에 유용한 시스템은 단세포 진균, 특히 효모 세포이다. 상업적 규모의 단백질 생산을 위한 산업적으로 이용가능한 바람직한 효모 세포로는 한세눌라 폴리모르파, 피키아 파스토리스, 사카로마이세스 세레비지에, 클루이버로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lypolitica) 및 크립토코커스 커바터스(Cryptococcus curvatus)가 있으며, 다른 미생물 숙주 역시 이용가능한 지 시험해 볼 수 있다.

특히 유용한 미생물은 메틸 요구성 효모 한세눌라 폴리모르파이다. 메탄올 상에서 배양하면 메탄올 대사의 주요 효소, 예컨대 MOX, DAS 및 FMDH가 유도되며, 이들 효소가 총 세포 단백질의 최대 30∼40%를 차지할 수 있다. MOX, DAS 및 FMDH 생산을 암호화하는 유전자는 매우 강력한 유도성 프로모터에 의해 조절이 가능하다. 이들 프로모터 중 1종만을 또는 2종 또는 3종 모두를 함께 사용하여 H. 폴리모르파에서 이종 유전자의 높은 발현 수준을 달성할 수 있다. 목적하는 콜라겐 및/또는 진균 프롤릴 히드록실라제를 암호화하는 유전자를 유도성 H. 폴리모르파 프로모터의 제어 범위에 들도록 발현 벡터로 클로닝한다. 생성물의 분비를 원한다면 효모에서의 분비를 위한 시그널 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 S. 세레비지에 프리프로-접합 인자 α1를 목적하는 콜라겐 및/또는 진균 프롤릴 히드록실라제에 대한 암호화 서열과 프레임 내에서 융합시킨다. 또한, 발현 벡터는 URA3 또는 LEU2와 같은 영양요구성 마커를 포함할 수 있다.

공지된 기법을 적용하여 발현 벡터로 H. 폴리모르파 숙주 세포를 형질전환시킨다. H. 폴리모르파의 특히 유용한 특징은 최대 100 카피의 발현 벡터를 게놈으로 자발적으로 통합시킬 수 있는 점이다. 대부분의 통합된 DNA는 헤드 투 테일(head to tail) 배열을 나타내는 다량체를 형성한다. 통합된 외부 DNA는 몇개의 재조합 균주에서, 비선별적 조건에서도 유사분열이 안정한 것으로 나타났다. 많은 수의 카피가 통합되는 현상은 추가로 시스템의 높은 생산 잠재성에 기여한다.

전술한 바와 같이, 히드록실라제 활성은 숙주 생물의 배양 또는 발효 배지에 적절한 유도인자를 첨가함으로써 조절할 수 있다. 전술한 바와 같이 적절한 유도인자는 콜라겐 유사 올리고펩티드이다. 이러한 적절한 유도인자는 반드시 실시예에서 주로 사용한 펩톤과 같은 동물 기원의 콜라겐 유사 올리고펩티드일 필요는 없다. 적절한 유도인자는 (1) 미생물 또는 식물 시스템에서 재조합에 의해 생산된 것일 수 있거나, (2) 전술한 바와 같이 H. 폴리모르파 유래의 내생 효모 콜라겐 유사 단백질일 수 있거나, 또는 (3) 화학적으로 합성된 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 특별한 이점은 완벽하게 동물 성분이 없는 재조합 콜라겐- 또는 젤라틴 생산 시스템이 얻어진다는 것이다.

실시예 1

재료 및 방법

효모 균주 및 플라스미드

베타-이소프로필말레이트 디하이드로게나제(LEU2)에 결함이 있는 H. 폴리모르파 균주 NCYC 495 leu1.1을 재조합 젤라틴 생산에 사용하였다. 메탄올 유도 젤라틴 발현에는LEU선별 마커, 가나마이신 내성 마커와, 메탄올 옥시다제(MOX) 프로모터 및 아미노 옥시다제(AMO) 종결부위를 보유하는 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 pHIPX4를 사용하였다. 구성적 젤라틴 발현에는 플라스미드 pHIPX7을 사용하였으며, 이 플라스미드는 발현카세트가 MOX 프로모터 대신에 전사 연장 인자(TEF1)프로모터를 보유한다는 것을 제외하고는 pHIPX4와 동일한 것이다. 벡터 pCOL1A1-1으로부터의, S. 세레비지에 α-접합 인자 프리프로 시그널 및 마우스 I형 콜라겐의 1.0 kb의 나선형 도메인을 포함하는 1268 bp의 HindIII/XhoI 단편을 벡터 pHIPX4 및 pHIPX7의 HindIII/SalI 부위에 삽입하였다. 이로써 pHIPX4-1A1 및 pHIPX7-1A1을 얻었다. Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재된 대로, 또는 제조업자의 프로토콜에 따라서 모든 분자 기법을 수행하였다.

H. 폴리모르파의 형질전환

형질전환에 사용되는 플라스미드를 ScaI으로 선형화하였다. 일렉트로포레이션에 의한 H. 폴리모르파의 형질전환은 Faber 등의 문헌(1994)[Hansenula polymorpha. Curr. Genet., 25, 305-310]에 따라서, GenePulser(바이오-래드)를 사용하여 수행하였다. 최소 글루코스 플레이트 상에서 37℃에서 3일간 배양한 후, PCR 확인을 위해 몇개의 콜로니를 선별하였다. 1A1-1 FW-프라이머: 5'-CTTCCCAGATGTCCTATGGCTATGATG-3' 및 AMO-프라이머: 5'TGTCCTTGGTCTCCTTGTGCACG-3'을 사용하여 어떤 전처리도 하지 않고 세포를 직접 PCR에 사용하였다.

배지 조성

형질전환체의 선별을 위한 최소 글루코스 플레이트는 아미노산이 없는 1.34%의 효모 질소 베이스(딥코), 1% 글루코스 및 1.5% 아가를 함유하였다. 무기물 글루코스 배지를 사용하여 반회분식 발효 발현 실험을 위한 H. 폴리모르파를 예비배양하였으며, 상기 배지는 1 리터당 황산암모늄 2.5 g, 황산마그네슘 7수화물 0.25 g, 인산2수소칼륨 삼수화물 0.7 g, 인산2수소나트륨 일수화물 3.0 g, 효모 추출물 0.5 g, 글루코스 50 g, 비오틴 0.02 mg, 티아민 0.6 mg 및 비쉬니악(Vishiniac) 미량 원소 용액 1 ㎖를 함유하였다.

발효 기본 염 배지는 1 리터당 인산(85%) 26.7 ㎖, 황산칼슘 이수화물 0.93 g, 황산칼륨 18.2 g, 황산마그네슘 7수화물 14.9 g, 수산화칼륨 4.13 g 및 미량 원소 4.3 ㎖를 함유하였다. 미량 염 용액은 1 리터당 염화구리 이수화물 4.5 g, 요오드화칼륨 0.09 g, 염화망간 4수화물 3.5 g, 몰리브덴나트륨 이수화물 0.2 g, 붕산 0.02 g, 황산코발트 7수화물 1.08 g, 황산아연 7수화물 42.3 g, 황산철 7수화물 65.0 g, 티아민 0.6 g, 비오틴 0.2 g 및 황산(96%) 5.0 ㎖를 함유하였다.

H. 폴리모르파에 의한 젤라틴의 발효 생산

H. 폴리모르파 형질전환체의 반회분식 발효는 1 ℓ용량의 발효기(애플리콘)에서 수행하였다. 발효 시작시에 발효기는 FBS 배지 450 ㎖를 포함하였고, 여기에 정해진 시점에 10%(중량/부피) 카사미노산 용액(머크) 50 ㎖, 10%(중량/부피) 펩톤 용액(Duchefa) 50 ㎖ 또는 한외여과된 10%(중량/부피) 펩톤 용액 50 ㎖를 첨가하였다.

회분 단계 동안 탄소원으로서 60 g/ℓ(중량/부피)의 글루코스를 사용하였다. 온도는 37℃로 설정하였고, 교반 속도는 500 rpm, 통기 속도는 1 ℓ/분이었다. 최적의 결과를 위해 수산화암모늄(25%)을 사용하여 pH를 5.0으로 조절하였다. 발효기에 예비배양물 50 ㎖를 접종하였다. 회분 단계의 글루코스가 완전히 소모되면, 통기 속도와 교반 속도를 각각 2 ℓ/분 및 1000 rpm으로 증가시켰다. 12 ㎖/ℓ의 미량 염을 함유하는 50% 글루코스(중량/부피) 용액을 10 ㎖/시간의 속도로 공급하여 반회분식 단계를 개시하였다. 25% 수산화암모늄을 첨가하여 pH를 5.0으로 유지하였다.

습윤 세포 중량이 약 180 g/ℓ에 도달하면 카세인 가수분해물 5 g 또는 펩톤 5 g을 배지에 더 첨가하였다. 그 후 pHIPX7-1A1 형질전환체에 의한 구성적 젤라틴 발현의 경우에는 글루코스 반회분식 단계를 계속하였다. pHIPX4-1A1 형질전환체에 의한 젤라틴의 메탄올 유도 반응의 경우, 12 ㎖/ℓ의 미량 염을 함유하는 100% 메탄올을 공급하여 메탄올 반회분식 단계를 개시하였다. 공급 속도는 초기에는 1 ㎖/시간으로 설정하였고, 서서히 증가시켜서 최대 8 ㎖/시간이 되게 하였다. 반회분식 단계 중에 산소 제한을 피하기 위해 용존 산소 농도를 20% 이상으로 유지하였다. 발효 전반에 걸쳐 약 12시간 간격으로 2 ㎖의 배양 시료를 취하였다. 시료를 20,000 g에서 1분간 스핀하고, 상청액은 1회용 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과하였다.

나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), N-말단 단백질 시퀀싱 및 이뮤노블로팅

Mini PROTEAN II 시스템(바이오-래드)에서 환원 변성 조건하에 SDS-PAGE를 수행하였다. 겔은 코마시 브릴리언트 블루(CBB R-350)로 염색하였다. N-말단 단백질 시퀀싱을 위해 Mini Trans-Blot Cell(바이오-래드) 내에서 1시간 동안 100 V를 인가하여 단백질을 Immobilon P^SQ(밀리포어) 상에 블로팅하였다. 이전 완충액은 10% 메탄올 1 리터당 2.2 g의 CAPS(pH 11)이었다. 블롯을 코마시 브릴리언트 블루(CBB R-350)로 염색하고, 선별된 밴드를 절단하였다. 에드만-분해법을 이용하여 N-말단 시퀀싱을 실시하였다.

이뮤노블로팅을 위해서 단백질을 PVDF 필터 상에 전기영동에 의해 이전시키고, 필터를 TBST(0.1 M Tris-HCl, pH 7.5; 1.5 M NaCl; 0.1% Tween-20) 중의 5% 탈지 우유 분말로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 필터를 모노클로날 항-myc항체(로쉐; TBST 중의 1% 탈지 우유 중에 1:20,000으로 희석시킨 것)와 밤새 항온처리한 후, TBST로 세척하고, 알칼라인 포스파타제(AP)에 접합된 2차 항체(염소 항-마우스 항체, 시그마; TBST 중의 1% 탈지 우유 중에 1:10,000으로 희석시킨 것)와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 필터를 TBST로 세척한 다음, AP 완충액(0.1 M Tris-HCl, pH 9.5; 0.5 M MgCl₂; 및 0.1 M NaCl)으로 헹구었다. 5-브로모 4-클로로 3-인도일 포스페이트(50 mg/㎖) 33 ㎕ 및 니트로-블루 테트라졸륨(50 mg/㎖)(USB) 66 ㎕를 함유하는 AP 완충액 10 ㎖ 중에서 필터를 항온처리함으로써 항체 결합을 검출하였다.

히드록실화 정도

내생(실시예 2 참조) 콜라겐 단백질 및 재조합 단백질 중의 Gly-Xaa-Yaa 트리플릿의 Yaa 위치의 프롤린 잔기의 히드록실화 정도는 다음과 같이 계산하였다.연속 아미노산 시퀀싱 단계에서의 글리신, 프롤린 및 히드록시프롤린 피크의 발달 및 쇠퇴를 연속 단계에서 얻은 각 아미노산의 상대적 시그널 강도를 비교하여 분석하였다.

먼저, 동일한 아미노산의 새로운 시그널을 단독으로 발생시키지 못한 단계, 예컨대 단계 4, 5, 7, 8 및 10에서 히드록시프롤린에 대해 쇠퇴 속도를 분석하였다. 그 후 새로운 프롤린 또는 히드록시프롤린 시그널을 발생시킨 시퀀싱 단계에 대해 상기 쇠퇴 속도를 내삽하였으며, 이전 단계에서부터 유지되는 프롤린 또는 히드록시프롤린 시그널을 새로운 시그널로부터 감하여 각 단계에서 얻은 추가 시그널(보정된 시그널)을 구하였다. 또한, 이 시그널을 연속 트리플릿의 경우 관찰되는 민감도의 전반적인 느린 쇠퇴 속도에 대해 보정하였다. 마지막으로, 시퀀싱 단계 3, 6 및 9에서의 보정된 프롤린 및 히드록시프롤린 시그널의 합을 단계 2, 5 및 8에서의 보정된 프롤린 시그널과 비교하였으며, 이때 연속 단계에서의 보정된 시그널은 대략 등몰량의 물질에 상응한다고 가정한다.

P_i-1= P_i+ CㆍO_i

상기 식에서, P 및 O는 각각 보정된 프롤린 및 히드록시프롤린 피크 높이이며, i는 시퀀싱 단계의 수이고, C는 프롤린 및 히드록시프롤린 시그널의 상대 강도와 관련된 미지의 전환율이다. C는 상기 식으로부터 계산할 수 있기 때문에, 프롤린 잔기 i(글리신 잔기 i+1의 바로 인접한 N-말단쪽)의 히드록실화 정도는 다음과 같이 계산할 수 있다.

%OH_m= 100 x CㆍO_i/(P_i+ CㆍO_i)

결과

재조합 히드록실화 젤라틴의 구성적 생산 및 메탄올 유도 생산

이론적 분자량이 28 kDa인 젤라틴 분자를 암호화하는 1.0 kb의 마우스COL1A1cDNA에 융합된 S. 세레비지에 α-접합 인자 프리프로 시그널을 포함하는, 벡터 pCOL1A1-1으로부터의 1268 bp HindIII/XhoI DNA 단편을 H. 폴리모르파 발현 벡터 pHIPX7 및 pHIPX4에 클로닝하였다. 이렇게 얻은 벡터 pHIPX7-1A1 및 pHIPX4-1A1를 사용하여 H. 폴리모르파를 형질전환시켜서, 재조합 젤라틴 발현이 각각 구성적으로, 그리고 메탄올 유도에 의해 일어나게 하였다.

콜로니 PCR 후에, 무기물 FBS 배지 중의 발효를 위한 형질전환체를 선별하였다. SDS-PAGE 분석 결과, 각각 pHIPX7 및 pHIPX4를 사용하는 세포외 배지에서의 젤라틴의 구성적 생산 및 메탄올 유도 생산이 확인되었다(각각 도 1 및 2 참조). 발현 배지에 펩톤을 보충하였다. 겉보기 분자량이 15 kDa인 COL1A1의 분해 산물을 모든 발효물에서 관찰할 수 있었다. 서로 다른 발효물의 15 kDa의 젤라틴 단백질 밴드를 블롯으로부터 절단해 내어 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 서로 다른 발효 과정에서 생산된 젤라틴의 N-말단 아미노산 서열이 하기 표 1에 제시되어 있다.

확인된 N-말단은 실제로 재조합COL1A1cDNA 유전자 생성물의 내부 서열이다. 또한, 배지에 펩톤을 보충하면 생성물 중의 프롤린이 4-히드록시프롤린으로 히드록실화되었다.

관찰된 15 kDa 콜라겐 단편이 배양 배지에 첨가된 펩톤에서 유래한 것일 가능성을 배제하기 위해, 새로운 발효물에서는 저분자량 펩톤 분획을 사용하였고, 배지 중의 펩톤 잔존물로부터 재조합 젤라틴 생성물을 조심스럽게 분리하였다. 10%(중량/부피) 펩톤 용액 중에서 50 ㎖를 10 kDa 컷-오프 필터를 사용하여 한외 여과하였다. 필터 막을 통과한 펩톤의 저분자량 성분 및 펩티드를 pHIPX4-1A1 형질전환체를 사용하는 발현 실험 중에 발효 배지에 첨가하였다. < 10 kDa의 첨가된 한외여과 펩톤 분획으로 SDS-PAGE를 한 결과, 10 kDa 이상의 단백질 밴드는 없는 것으로 나타났다(도면으로 나타내지 않음). 그 후 세포에 의해 발현 및 분비된 재조합 젤라틴 단편을 같은 유형의 새로운 10 kDa 컷-오프 필터를 사용하여 한외여과하고, 증류수로 3회 세척하여 남아 있는 < 10 kDa의 펩톤 잔존물을 제거하였다. 한외여과한 후 세척한 발효 상청액으로 SDS-PAGE를 한 결과 15 kDa에서 밴드가 나타났다(도면으로 나타내지 않음). SDS-PAGE 및 블로팅 후에 얻은 정제된 15 kDa 생성물로 N-말단 시퀀싱을 한 결과 재조합 젤라틴의 내부 서열과 히드록실화 프롤린의 존재가 확인되었다(표 1).

내생 H. 폴리모르파 단백질의 폴리[Gly-Pro-Pro] 스트레치(실시예 2)와 재조합 젤라틴의 서열을 비교할 때 서로 달랐던 점과, 시퀀싱 데이타의 일부 노이즈로 인해, 재조합 젤라틴의 Yaa 위치에서의 히드록실화 정도를 재료 및 방법 섹션에서 기술한 절차에 따라 계산하는 것이 어려웠다. 여러 측정법에서 Yaa 위치의 Hyp/(Pro + Hyp)의 추정치는 25∼50 mol%였으며, 평균값은 약 35 mol%였다.

배양 배지에 첨가된 보충물에 대한 유도의 특이성을 조사하기 위해, 펩톤을(1) 콜라겐과 마찬가지로 프롤린이 풍부한 카사미노산, (2) 유리 히드록시프롤린, (3) 펩톤의 전체 아미노산 조성을 모의한 유리 아미노산의 혼합물, (4) 트립신으로 미리 분해시킨 다음 열 처리하여 트립신을 다시 불활성화시킨 후 한외여과하여 > 10 kDa의 분획을 제거한 순수한 젤라틴(즉, 아미노가 제거되고 부분적으로 분해된 동물 콜라겐 I 및 III형), (5) 합성 폴리프롤린 및 (6) 합성 폴리-4-히드록시프롤린과 비교하였다. 그 결과는 하기 표 1에 기재되어 있다: 배양 배지 중에 히드록실화된 젤라틴의 < 10 kDa 분해물만을 사용한 경우 H. 폴리모르파에서 발현 중에 재조합 젤라틴의 특이적 펩티딜-프롤릴-4-히드록실화가 일어났다. 펩톤과 비교해보면 얻어진 재조합 젤라틴의 히드록실화 정도는 낮았다(5∼10%).

적절한 콜라겐 유사 유도인자 펩티드가 반드시 동물 유래의 것일 필요는 없으며, (1) 미생물 또는 식물 시스템에서 재조합에 의해 생산된 것이거나, (2) H. 폴리모르파에서 검출되는 것과 같은 내생 효모 콜라겐 유사 단백질이거나(실시예 2 참조), 또는 (3) 화학적으로 합성된 것일 수 있다. 따라서, 완벽하게 동물 성분이 없는 재조합 콜라겐- 또는 젤라틴 생산 시스템을 얻을 수 있다. 각종 동물 세포와 유사하게 세포 표면에 있는 콜라겐 수용체가 관련될 수 있다.

관찰된 프롤린-히드록실화 활성에 관여하는 펩톤의 활성 성분을 규명하기 위해, 동물 프롤릴-히드록실라제에 대한 공지된 특정 보조인자를 함유하는 조성물을 제조하였다. 펩톤 중의 이들 보조인자의 가능한 역할은 히드록실화 효소의 활성화에 관여하는 것일 수 있다. 발효 배지에, 특히 아스코르브산, α-케토글루타레이트, Fe²⁺설페이트를 보충하였다. H. 폴리모르파에서 재조합 젤라틴이 발현되는 중에 이 조성물을 발효 배지(무기물/최소 배지)에 (2회) 첨가하였다. 생성된 젤라틴의 히드록실화는 관찰되지 않았다. 따라서, 상기 보조인자는 H. 폴리모르파에서의 재조합 젤라틴의 히드록실화에 필수적인 것은 아니다.

다양한 조건에서 생산된 젤라틴의 N-말단 아미노산 서열
구성적 발현배양 배지 보충물	N-말단 아미노산 서열
-	GFQGPPGEP
카사미노산(1%)	GFQGPPGEP
펩톤(1%)	GFQGPZGEZ
유리 4-히드록시프롤린	GFQGPPGEP
MeOH 유도 발현성장 인자 보충물
카사미노산(1%)	GFQGPPGEP
펩톤(1%)	GFQGPZGEZ
< 10 kDa 펩톤 분획	GFQGPZGEZ
유리 아미노산	GFQGPPGEP
유리 4-히드록시프롤린	GFQGPPGEP
< 10 kDa 소 젤라틴 트립신 분해물	GFQGPZGEZ
폴리-L-프롤린	GFQGPPGEP
폴리-L-4-히드록시프롤린	GFQGPPGEP
Z = 4-히드록시프롤린

결론: 외생 히드록실라제를 사용하지 않고 H. 폴리모르파에 의해 히드록실화된 재조합 젤라틴을 생산하는 것이 가능하다. 이 생산은 발현 방식, 즉 구성적 발현인지 또는 MeOH 유도 발현이지에 따라 달라진다. 4-히드록시프롤린 잔기는 트리플릿의 Yaa 위치에서만 발견된다. 또한, 발효 배지에 펩톤을 사용함으로써 H. 폴리모르파의 프롤릴 히드록실라제 활성을 조절하는 것이 가능하다.

실시예 2

약어: CAPS, 3-시클로헥실아미노-1-프로판설폰산; CBB, 코마시 브릴리언트블루; HPLC, 고성능 액체 크로마토그래피; Hyp, 4-히드록시프롤린; PAGE, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; SDS, 나트륨 도데실 설페이트; vvm, 분당 발효 브로스의 부피(L)당 (공기의) 부피(L); YPD, 효모 추출물, 펩톤 및 덱스트로스.

재료 및 방법

효모 균주

모든 실험에 효모 균주 한세눌라 폴리모르파 NCYC 495를 사용하였다.

진탕 플라스크에서의 배양 배지 및 배양 조건

YPD 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 2% 글루코스; Duchefa), 또는 1 리터당 황산암모늄 2.5 g, 황산마그네슘 7수화물 0.25 g, 인산2수소칼륨 삼수화물 0.7 g, 인산2수소나트륨 일수화물 3.0 g, 효모 추출물 0.5 g, 글루코스 50 g, 비오틴 0.02 mg, 티아민 0.6 mg 및 비쉬니악 미량 원소 용액 1 ㎖를 함유하는 무기물 글루코스 배지 중에서 37℃에서 H. 폴리모르파를 배양하였다.

반회분식 발효에서의 배양 배지 및 배양 조건

1 ℓ용량의 발효기(애플리콘)에서 H. 폴리모르파의 반회분식 발효를 수행하였다. 발효 시작시에 발효기는 발효 기본 염 배지 500 ㎖를 포함하였고, 여기에 카세인 가수분해물(머크) 5 g 또는 펩톤(Duchefa) 5 g을 첨가하였다. 발효 기본 염 배지는 1 리터당 인산(85%) 26.7 ㎖, 황산칼슘 이수화물 0.93 g, 황산칼륨 18.2 g, 황산마그네슘 7수화물 14.9 g, 수산화칼륨 4.13 g 및 미량 원소 4.3 ㎖를 함유하였다. 미량 원소는 1 리터당 염화구리 이수화물 4.5 g, 요오드화칼륨 0.09 g, 염화망간 4수화물 3.5 g, 몰리브덴나트륨 이수화물 0.2 g, 붕산 0.02 g, 황산코발트 7수화물 1.08 g, 황산아연 7수화물 42.3 g, 황산철 7수화물 65.0 g, 티아민 0.6 g, 비오틴 0.02 g 및 황산(96%) 5.0 ㎖를 함유하였다. 회분식 배양 단계 동안에는 탄소원으로서 60 g/ℓ의 글루코스를 사용하였다. 온도는 37℃로 설정하였고, 교반 속도는 500 rpm, 통기 속도는 1 vvm이었다. 수산화암모늄(25%)을 사용하여 pH를 5.0으로 조절하였다.

무기물 글루코스 배지에서 밤새 배양한 배양물 50 ㎖를 발효기에 접종하였다. 회분식 발효 단계의 글루코스가 완전히 소모되면, 발효기에 카세인 가수분해물 5 g, 또는 펩톤 5 g을 더 첨가하였다. 이 단계와 발효 시작시에 동일한 종류의 보충물을 일관적으로 사용하였다. 그 후, 통기 속도는 2 vvm, 교반 속도는 1000 rpm으로 증가시키고, 12 ㎖/ℓ의 미량 염을 함유하는 50%(중량/부피) 글루코스 용액을 10 ㎖/시간의 속도로 공급함으로써 반회분식 단계를 개시하였다. 25% 수산화암모늄을 첨가하여 pH를 5.0으로 유지하였다. 전체 발효 과정 동안 산소 제한을 피하기 위해 용존 산소 농도를 20% 이상으로 유지하였다. 세포 습윤 중량이 약 300 g/ℓ에 도달할 때 발효를 중단하였다. 발효 전 과정 동안 약 12시간 간격마다 2 ㎖의 배양 시료를 취하였다. 마이크로 원심분리기에서 20,000 g로 시료를 1분간 스핀하고, 1회용 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상청액을 여과하였다.

H. 폴리모르파 세포의 열 처리

H. 폴리모르파 세포의 열 처리는 다음과 같이 수행하였다. H. 폴리모르파의 20 ㎖ 배양물을, 1회용 10 x 4 x 45 mm 큐벳을 사용하여 코닝 비색계 254에서 측정한 600 nm에서의 흡광도가 1.5가 될 때까지 배양하였다. 3,000 g에서 10분간 원심분리하여 세포를 회수하고, 100 mM NaCl로 4회 세척하여 배지 성분을 제거한 다음, 100 mM NaCl 0.5 ㎖ 중에 재현탁시켰다. 1.5 ㎖ 플라스틱 튜브(에펜도르프)에 세포를 넣고 밀폐하여 70℃ 수조에서 20분간 열 처리하고, 1분간 얼음 위에 둔 다음, 마이크로 원심분리기에서 20,000 g로 원심분리하였다. 세포의 현미경 분석 결과 열 처리는 검출가능한 세포 용해를 일으키지 않았음이 확인되었다. 콜라겐 단백질의 존재를 확인하기 위해 상청액을 분석하였다.

차별 아세톤 침전

미리 0℃로 냉각시킨 아세톤을, 열 처리된 H. 폴리모르파 세포에서 세포를 제거한 냉각시킨 상청액에 적하하였다. 얻어진 단백질 침전물을 마이크로 원심분리기에서 20,000 g로 15분간 원심분리하였다.

히드록시프롤린 검출

먼저, 피어스에서 구입한 비신코닌산(BCA) 분석을 이용하여 단백질의 양을 측정하였다. 진공 건조시킨 10 ㎍ 단백질 시료를 워터스 피코 택(Waters Pico Taq) 워크스테이션(워터스 코포레이션) 상에서 110℃하에 밤새 6 N HCl 증기 중에서 가수분해하였다. 유리 히드록시프롤린의 검출은 Creemers 등의 문헌(1997)[BioTechniques 22:656-658]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

총 아미노산 조성

히드록시프롤린 검출에 대해 설명한 바와 같이 단백질(10 ㎍)을 가수분해하였다. AccQ Taq 방법(워터스 코포레이션)을 이용하여 유리 아미노산을 6-아미노퀴놀릴-N-히드록시숙신이미딜 카르바메이트-유도체화하였다. 유도체화된 아미노산을자스코(Jasco) 820-FP 검출기와 워터스 노바팩(Waters Novapak) C18 역상 컬럼이 구비된 워터스 600 S HPLC 시스템 상에서 분석하였다.

SDS-PAGE 및 N-말단 시퀀싱

Laemmli(1970)[Nature, 227:680-685]의 완충액 시스템을 이용하여 바이오-래드 Mini PROTEAN II 시스템(7 cm x 10 cm) 상에서 환원 조건하에, 변성제로서 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 사용하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 실시하였다. 0.5 mm 두께의 15% 아크릴아미드 겔을 사용하였다. 겔은 10% 아세트산을 함유하는 물 중의 10% MeOH 중의 0.1% 코마시 브릴리언트 블루(PhastGel Blue R-350, 파마시아)로 1시간 동안 염색하고, 700 ㎖의 물을 포함한 1 L 비이커에 겔을 넣고 마그네트론에서 10분간 끓여서 탈색시켰다. N-말단 단백질 시퀀싱을 위해, Mini Trans-Blot Cell(바이오-래드)에서 1시간 동안 100 V를 인가하여 단백질을 Immobilon P^SQ(밀리포어)에 블로팅하였다. 이전 완충액은 10% 메탄올 1 리터당 2.2 g CAPS(pH 11)이었다. 블롯을 코마시 브릴리언트 블루(Phastgel Blue R-350)로 염색하고, 선별한 밴드를 절단하였다. 에드만-분해법을 이용하여 N-말단 시퀀싱을 수행하였다. 시퀀싱 반응에서 4-히드록시프롤린의 양을 정량하였다.

결과

교반 플라스크 배양물로부터 콜라겐 단백질의 분리 및 정제

YPD 배지에서 배양한 H. 폴리모르파 세포를 세척한 후 열 처리하여 단백질을 방출시켰다. 38 kDa의 단백질 밴드가 관찰되었으며, 도 3의 레인 1의 SDS-PAGE 분석 결과를 참조하라. 70℃ 대신에 37℃에서 항온처리하였을 때, 세척된 H. 폴리모르파로부터 단백질은 방출되지 않았다. 전술한 발효 배지와는 달리, 세포를 교반 플라스크에서 배양한 YPD 배지는 SDS-PAGE 분석 결과(도 4, 레인 1)에 나타난 바와 같이 단백질 밴드를 포함하지 않았다. 이는 또한 도 3의 단백질이 배지로부터 유래된 것이 아니라 세포 그 자체로부터 유래된 것임을 나타낸다. 세포의 현미경 분석 결과 열 처리는 검출가능한 세포 용해를 유발하지 않았음이 확인되었기 때문에, 단백질은 아마도 세포 표면에서 유래된 것일 것이다. 교반 플라스크에서와는 달리, 발효기에서는 관찰된 단백질이 아마도 전단력으로 인해 세포로부터 방출된 것으로 보인다. 교반 플라스크에서 배양하여 세척 및 열 처리한 세포로부터 방출된 단백질의 가능한 콜라겐 성질을 조사하기 위해, 방출된 H. 폴리모르파 단백질에 대해 차별 아세톤 침전을 실시하였다. Werten 등의 문헌(1999)[Yeast 15:1087-1098]에서는 80 부피%의 아세톤에서 침전되는 재조합 콜라겐 유사 단백질로부터 40 부피%에서 침전되는 비콜라겐 세포외 피키아 파스토리스 단백질을 분리하기 위해 차별 아세톤 침전을 이용하였다. 세척된 H. 폴리모르파 세포의 열 처리에 의해 방출된 단백질의 일부는 40 부피% 아세톤에서 침전되었다(도 3, 레인 2). 40% 아세톤 침전물을 제거하고 상청액 중의 아세톤 농도를 40 부피%에서 80 부피%로 증가시키자, 다른 단백질이 침전되었다(도 3, 레인 3). 이 분획을 40∼80% 아세톤 침전물로 칭한다. 아세톤 침전 전에 출발 부피보다 5배 적은 부피의 물에 단백질 침전물을 용해시켰으므로, 아세톤 침전은 농축 효과도 발휘하였다. 20 ㎖ 교반 플라스크 배양물로부터 얻은 40∼80% 침전물의 SDS-PAGE 겔에서 크기가 약 38 kD인 가장 두드러진 단백질 밴드는 코마시 염색 밴드의 강도로부터 추정하면 약 1 ㎍의 단백질에 해당하였다. 세포를 배양한 YPD 배지로도 차별 아세톤 침전을 실시하였으나, 뚜렷한 단백질 밴드가 검출되지 않았다(도 4, 레인 2 및 3).

히드록시프롤린 분석 결과 열 처리에 의해 세척된 세포로부터 얻은 단백질의 40∼80% 아세톤 침전물은 이 단백질 침전물을 건조시켜 가수분해한 후 8%(중량/중량) 히드록시프롤린을 함유한다는 것을 알 수 있었다. 세포 유래의 단백질의 40% 아세톤 침전물에서는 히드록시프롤린이 검출되지 않았다. 전체 아미노산 조성을 분석하여 40∼80% 침전물에서 세포 유래의 단백질의 콜라겐 성질을 추가로 확인하였다. 다량의 글리신(26.2 mol%), 프롤린(9.9 mol%) 및 4-히드록시프롤린(9.8 mol%)이 관찰되었다. 이는 이 분획에서 콜라겐 단백질이 전체적으로 풍부하다는 것을 나타낸다.

이후에, 아세톤 침전 분획 각각에서 가장 풍부한 단백질, 즉 40% 아세톤 침전물 중의 40 kD 단백질 및 40∼80% 아세톤 침전물 중의 38 kD 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 결정하였으며, 이것을 도 3에 나타내었다. 이 결과는 표 2에 기재되어 있다. 40% 아세톤 침전물 중의 40 kD 단백질의 N-말단 서열(표 2)은 콜라겐이 아니었으며, 40∼80% 아세톤 침전물 중의 38 kD 단백질의 N-말단은 7개 이상의 연속 [Gly-Pro-Hyp] 트리플릿으로 이루어졌다. 시퀀싱이 21개 아미노산 다음에서 끝났기 때문에 연속 [Gly-Pro-Hyp] 트리플릿이 더 많이 존재할 가능성도 있다. 알고 있는 바에 의하면 연속 [Gly-Pro-Pro]/[Gly-Pro-Hyp] 트리플릿의 이와 같은 긴 스트레치는 어떤 동물 콜라겐에도 존재하지 않는다.

[Gly-Xaa-Yaa]의 Yaa 위치의 프롤린 잔기만이 히드록실화되었다. 이러한 엄격한 서열 특이성은 동물 콜라겐에서 관찰되는 것과 동일하다. 연속 아미노산 시퀀싱 단계에서의 글리신-, 프롤린- 및 히드록시프롤린 피크의 발달 및 쇠퇴는 연속 단계에서 얻은 각 아미노산의 시퀀싱 크로마토그램에서의 상대적 시그널 강도를 비교하여 분석하였다. 이에 의하면, 3개의 가장 N-말단의 [Gly-Xaa-Yaa] 트리플릿의 Yaa 위치에서의 히드록실화 정도는 50∼65 mol%인 것으로 추정되었다. Xaa 위치의 프롤린은 히드록실화되지 않았기 때문에, 처음 3개의 [Gly-Pro-Pro] 트리플릿에서의 총 프롤릴 히드록실화 정도는 25∼28 mol%였다. 트리플릿의 Xaa 위치에서의 프롤린 빈도가 낮은 스트레치에서는 평균 히드록실화 정도가 Yaa 위치에서 발생하는 정도와 거의 같은, 즉 50∼65 mol%일 것이다. 전술한 아미노산 분석 결과는 총 프롤릴 히드록실화 정도가 세척 및 열 처리된 세포의 40∼80% 아세톤 침전물에서 약 50 mol%임을 나타낸다.

600 nm에서의 흡광도가 0.100인 20 ㎖의 교반 플라스크 배양물로부터 분리한 38 kDa 단백질은 코마시 염색 밴드의 강도로부터 추정하면 약 0.5 ㎍의 단백질(즉, 저밀도 세포 배양물 1 ℓ당 방출된 단백질 25 ㎍)에 해당하는 것이다. 시퀀싱 크로마토그램은 이 양이 에드만 분해시에 확인된 아미노산 수율에 해당하는 것임을 보여주었다.

열 처리된 H. 폴리모르파 세포의 아세톤 분류 단백질의 N-말단 아미노산 서열
단백질 크기(kD)	침전물	N-말단 아미노산 서열
40(도 3, 레인 2의 밴드)	40% 아세톤	EASLGFDLGVQATDGSXKTA
38(도 3, 레인 3의 밴드)	40∼80% 아세톤	GPZGPZGPZGPZGPZGPZGPX
Z = 4-히드록시프롤린, X = 미확인 아미노산 잔기

세포 밀도가 높은 반회분식 발효물에서의 콜라겐 유사 단백질의 분석

38 kD 단백질은 H. 폴리모르파 교반 플라스크 배양물로부터 분리한 것(상기한 바와 같은 것)일 뿐 아니라, 펩톤을 보충한 세포 밀도가 높은 반회분식 배양물의 세포외 배지에서도 확인할 수 있다. 발효 중에 발효 브로스의 시료를 취하여 원심분리 및 미세여과에 의해 세포를 제거한 후 SDS-PAGE로 분석하였다(도 5).

코마시 염색 밴드의 강도로부터 추정시 38 kD 단백질은 발효 후기에 약 50 mg/ℓ의 농도로 존재한다. 이 단백질이 교반 플라스크 배양물로부터 분리한 것과 동일한 지를 확인하기 위해, N-말단 아미노산 서열을 결정하였다(표 3; 표 1도 참조). 실제로 이는 사실인 것으로 확인되었다.

서로 다른 배지에서의 글루코스 반회분식 발효 중에 세포외 배지로부터 분리한 내생 H. 폴리모르파 38 kDa 단백질 밴드의 N-말단 아미노산 서열(도 5 참조)
단백질 크기(kD)	배지 반회분식	N-말단 아미노산 서열
38	CSD	GPPGPPGPPG
38	PSD	GPZGPZGPZG
Z = 4-히드록시프롤린, CSD = 카세인 가수분해물 보충 덱스크로스 배지,PSD = 펩톤 보충 덱스트로스 배지

그러나, 이번에는 히드록시화가 일어나지 않았다. 발효 후기에 존재하는 총 세포외 단백질의 아미노산 분석 결과 높은 글리신 및 프롤린 함량(각각 18 및 10 mol%)이 확인되었으며, 이는 콜라겐 단백질 도메인이 전체적으로 크게 기여하였음을 나타낸다. 히드록시프롤린은 실제로 아미노산 분석에서 존재하지 않았다.

열 처리는 교반 플라스크 배양물과는 달리, 발효기에서 배양한 세포로부터콜라겐 유사 단백질을 분리하기 위해 반드시 필요한 절차는 아니다. 발효기에서의 교반으로 인한 전단력에 의해 세포로부터 단백질이 물리적인 힘에 의해 방출될 수가 있다.

반회분식 발효 실험에서 발효 기본 염 배지에 카세인 가수분해물 대신에 펩톤을 보충한 경우 배지에서도 38 kD 단백질이 관찰되었다. N-말단 시퀀싱 결과 몇개의 연속 [Gly-Pro-Pro] 트리플릿의 동일한 1차 아미노산 서열이 확인되었으나, 가장 C-말단 위치의 트리플릿의 프롤린은 4-히드록시프롤린으로 히드록실화되었다(표 3). 펩톤의 존재와 관계없이 다수의 N-말단 [Gly-Pro-Pro] 트리플릿이 있는 동일한 38 kD 단백질이 확인되었기 때문에, 이 단백질이 펩톤으로부터 유래된 것일 가능성을 배제할 수 있다.

배양 배지에 첨가된 보충물에 대한 유도의 특이성을 조사하기 위해, 표 1에 제시된 것과 유사한 실험을 내생 H. 폴리모르파 젤라틴 생산에 대해 수행하였다. 38 kDa 밴드의 분석 결과 15 kDa 재조합 밴드의 생산에 대해서 얻은 결과와 동일한 결과가 얻어졌음을 알았다. 펩톤 및 < 10 kDa 펩톤 분획이 존재하는 경우에만 히드록시프롤린 잔기가 관찰되었으며, 이는 구성적 발현인지 또는 MeOH 유도 발현인지와 무관하였다. 카사미노산, 유리 4-히드록시프롤린 또는 유리 아미노산을 배양 배지에 첨가하는 것은 히드록시프롤린 잔기의 형성을 유도하지 않았다.

38 kD 단백질의 [Gly-Pro-Hyp] 트리플릿의 가장 C-말단 위치에서만이 4-히드록시프롤린이 나타났기 때문에, 배양 배지에서 완전히 분해된 펩톤 유래의 유리 4-히드록시프롤린이 단백질 합성 중에 단백질로 혼입되었을 가능성은 크게 없는 것같다. 이러한 특이성은 프롤린의 것과는 다른 4-히드록시프롤린-특이적 코돈(들) 및 tRNA의 존재를 필요로 하거나, 또는 콜라겐 암호화 mRNA의 서열 구성 또는 새롭게 합성된 미완결된 단백질 스트레치의 리보좀 매개 인식을 필요로 할 것이다. 실제로 대조 실험을 통해 유리 히드록시프롤린의 혼입이 콜라겐 생성물에서의 히드록시프롤린의 발생의 원인이 아닌 것임이 확인되었다. 따라서, 피키아 파스토리스(Vuorela 등, 1997) 및 사카로마이세스 세레비지에(Vaughan 등, 1998)에 대한 기존의 연구 보고와는 달리, H. 폴리모르파는 [Gly-Xaa-Yaa] 서열의 Yaa 위치의 프롤린을 4-히드록시프롤린으로 부위 특이적 방식으로 히드록실화하는 내생 프롤릴 4-히드록실라제를 포함한다고 결론지을 수 있다.

H. 폴리모르파의 내생 효소는 H. 폴리모르파에서 발현된 재조합 단백질의 히드록실화에 사용될 수 있거나, 또는 이 효소는 이종 숙주에서 각종 재조합 단백질 기질의 히드록실화를 위한 재조합 효소로서 발현될 수 있다.

Claims

진균 프롤릴 히드록실라제를 이용하는 것을 특징으로 하는, 히드록실화 프롤린 잔기를 함유하는 콜라겐 유사 화합물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 프롤릴 히드록실라제는 단세포 진균, 바람직하게는 효모, 보다 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula Polymorpha)에서 유래된 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 콜라겐 유사 화합물은 진균 또는 진균 유사 진핵 미생물에서 제조되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 진균은 단세포 진균, 바람직하게는 효모인 것인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 콜라겐 유사 화합물은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula Polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지에(Saccaromyces cerevisiae), 클루이버로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lypolitica) 또는 크립토코커스 커바터스(Cryptococcus curvatus)에서, 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파에서 제조되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 재조합 콜라겐 유사 화합물이 제조되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 재조합 콜라겐 유사 화합물은 숙주 생물에 대해 외생인 것인 방법.
제6항에 있어서, 재조합 콜라겐 유사 화합물은 숙주 생물에 대해 과발현된 내생 콜라겐 유사 화합물인 것인 방법.
진균 또는 진균 유사 진핵 미생물을 배양하는 단계 및 내생 진균 콜라겐 유사 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 내생 진균 콜라겐 유사 화합물을 제조하는 방법.
제9항에 있어서, 내생 진균 콜라겐 유사 화합물은 한세눌라 폴리모르파로부터 제조된 것인 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 진균은 단세포 진균, 바람직하게는 효모, 특히 한세눌라 폴리모르파인 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 진균 프롤릴 히드록실라제에 의한 프롤린 잔기의 히드록실화는 젤라틴 가수분해물, 특히 젤라톤 또는 펩톤과 같은 콜라겐 유사 올리고펩티드의 첨가에 의해 조절되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 콜라겐 유사 올리고펩티드는 등전점이 7 이상, 바람직하게는 8 이상, 보다 바람직하게는 9 이상인 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 진균 프롤릴 히드록실라제에 의한 프롤린 잔기의 히드록실화는 익스텐신의 첨가에 의해 조절되는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따라 얻을 수 있는 콜라겐 유사 화합물.
진균, 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파 유래의 프롤릴 히드록실라제.