JP2016508742A - 構成的プロモーター - Google Patents
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Abstract
Description
この目的は、特許請求される主題により達成される。
a)配列番号1のpCS1のサイズ変異体であって、好ましくは、配列番号2、3、4、5、6、7、および8からなる群から選択される核酸配列からなるかもしくはこれを含む、サイズ変異体、
b)配列番号1のpCS1の突然変異体、もしくはa)のサイズ変異体の突然変異体であって、配列番号1の配列もしくはサイズ変異体と少なくとも60%の相同性を有する突然変異体、
c)ハイブリッド体であって、
・配列番号1のpCS1、a)のサイズ変異体、およびb)の突然変異体からなる群から選択される配列、ならびに
・配列番号1のpCS1、a)のサイズ変異体、b)の突然変異体、および異種配列からなる群から選択される、少なくとも1つのさらなる配列
を含むハイブリッド体、または
d)a)もしくはb)のサイズ変異体もしくは突然変異体の核酸配列のうちの何れかと厳密な条件下でハイブリダイズする配列
である。
i)少なくとも約60%のヌクレオチド配列同一性を有する相同体、
ii)配列内または配列の遠位端の一方もしくは両方における、1つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を介して、配列番号1のpCS1またはそのサイズ変異体のヌクレオチド配列を改変することにより得られる相同体であって、好ましくは80bp〜1500bp、または200bp〜1500bp、より好ましくは、少なくとも200bpのヌクレオチド配列を有する相同体、および
iii)Pichia pastoris以外の種に由来する類似体
からなる群から選択される。
a)前記POIを発現させる条件下で、細胞系を培養する工程と、
b)POIを回収する工程と
を含む方法も提供する。
a)真核細胞を大きな増殖速度で培養する工程と、
b)細胞を小さな増殖速度でさらに培養する工程と、
c)工程a)およびb)の細胞培養物の試料を用意する工程と、
d)前記試料中で転写解析を実施し、転写物レベルを、細胞の天然pGAPプロモーターの転写物レベルと比較する工程と、
f)好ましくは、天然pGAPプロモーターと比較して、少なくとも1.1倍、好ましくは、少なくとも1.2倍、好ましくは、少なくとも1.3倍、好ましくは、少なくとも1.4倍、好ましくは、少なくとも1.5倍、好ましくは、少なくとも1.6倍、好ましくは、少なくとも1.7倍、好ましくは、少なくとも1.8倍、好ましくは、少なくとも1.9倍、好ましくは、少なくとも2倍、好ましくは、少なくとも3倍、好ましくは、少なくとも4倍、好ましくは、少なくとも5倍、好ましくは、少なくとも10倍、または少なくとも15倍である、同定された構成的プロモーターの転写物レベルを決定することにより、大小の増殖速度で、天然pGAPプロモーターと比較して、転写強度の大きな構成的プロモーターを選択する工程と
を含む方法も提供する。
・少なくとも約60%のヌクレオチド配列同一性、好ましくは、親配列に対して、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%の程度の相同性または配列同一性を有する相同体、および/または
・親ヌクレオチド配列、たとえば、pCS1配列または鋳型として使用されるサイズ変異体の配列を改変して、たとえば、配列内または配列の遠位端の一方もしくは両方における、1つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換による突然変異をもたらすことにより得られる相同体であって、好ましくは、80bp〜1500bp、または200bp〜1500bp、または234bp〜1488bp、好ましくは、少なくとも100bp、少なくとも200bp、好ましくは、少なくとも300bp、より好ましくは、少なくとも400bp、少なくとも500bp、少なくとも600bp、少なくとも700bp、少なくとも800bp、少なくとも900bp、または少なくとも1000bpのヌクレオチド配列を有する(すなわち、これらを含むかまたはこれらからなる)相同体、ならびに
・Pichia pastoris以外の種に由来する類似体
からなる群から選択される。
下記の例は、新規のプロモーターを同定し、Pichia pastoris内のその発現特性を解析するのに使用される材料および方法を例示する。
P.pastoris内で強力に発現する遺伝子の同定
強力な遺伝子およびそのそれぞれのP.pastorisのプロモーターを同定するために、DNAマイクロアレイを使用して、遺伝子発現パターンの解析を行った。グリセロール回分およびグルコース制限(ケモスタット)中で増殖させたP.pastoris細胞について解析した。
補充物質を伴わずに最小培地により増殖しうる、野生型P.pastoris株(CBS2612:CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を使用した。
発酵は、最終作業容量を2.5Lとして、Miniforsリアクター(Infors−HT、Switzerland)により実施した。
6.0gのCuSO4・5H2O、0.08gのNaI、3.36gのMnSO4・H2O、0.2gのNa2MoO4・2H2O、0.02gのH3BO3、0.82gのCoCl2、20.0gのZnCl2、65.0gのFeSO4・7H2O、0.2gのビオチン、および5.0mlのH2SO4(95%〜98%)
を含有した。
2gのクエン酸一水和物(C6H8O7・H2O)、39.2gのグリセロール、20.8gのNH4H2PO4、0.5gのMgSO4・7H2O、1.6gのKCl、0.022gのCaCl2・2H2O、0.8mgのビオチン、および4.6mlのPTM1微量元素塩原液
を含有した。HClを添加して、pHを5とした。
632gのグリセロール、8gのMgSO4・7H2O、22gのKCl、および0.058gのCaCl2・2H2O
を含有した。
2gのクエン酸一水和物(C6H8O7・H2O)、99.42gのグルコース一水和物、22gのNH4H2PO4、1.3gのMgSO4・7H2O、3.4gのKCl、0.02gのCaCl2・2H2O、0.4mgのビオチン、および3.2mlのPTM1微量元素塩原液
を含有した。HClを添加して、pHを5とした。
グリセロール回分期の終点と、グルコースケモスタットの定常状態条件において試料を採取した。光学濃度または酵母の乾燥質量の決定、定性的顕微鏡観察、および細胞生存解析としての日常的なサンプリングを、各発酵時に並行して行った。マイクロアレイ解析のために、試料を採取し、以下の通りに処理した。最適なクェンチングのために、9mLの細胞培養液を、5%の氷冷フェノール(Sigma)溶液(無水エタノール中)4.5mLと速やかに混合し、アリコート分割した。2mLずつを、あらかじめ冷却した回収試験管(GE healthcare、NJ)内で遠心分離し(13200rpmで1分間にわたり)、上清を完全に除去し、試験管を、RNA精製まで−80℃で保管した。
RNAは、供給元の指示書(Ambion、US)に従い、TRI試薬を使用して単離した。細胞ペレットを、TRI試薬中に再懸濁させ、FastPrep24(M.P.Biomedicals、CA)を、5m s-1で、40秒間にわたり使用して、ガラスビーズによりホモジナイズした。クロロホルムを添加した後、試料を遠心分離し、イソプロパノールを添加することにより、全RNAを水性相から沈殿させた。ペレットを、70%のエタノールで洗浄し、乾燥させ、RNアーゼ非含有水中に再懸濁させた。RNA濃度は、Nanodrop1000分光光度計(NanoDrop製、DE)を使用してOD260を測定することにより決定した。試料に由来する残りのDNAは、DNA free Kit(Ambion、CA)を使用して除去した。10μgのRNAと同等な試料容量を、RNアーゼ非含有水中で50μLまで希釈し、次いで、DNアーゼ緩衝液IおよびrDNアーゼIを添加し、37℃で30分間にわたりインキュベートした。DNアーゼ不活化試薬の添加後、試料を遠心分離し、上清を、未使用の試験管に移した。RNA濃度を、上記で記載した通りに再度決定した。加えて、RNAナノチップ(Agilent)を使用して、RNAの完全性を解析した。試料の増幅および標識付け〜ハイブリダイゼーションにわたるマイクロアレイワークフローをモニタリングするため、Spike In Kit(Agilent、製品番号:5188−5279)を、陽性対照として使用した。Spike In Kitは、アデノウイルスに由来する10の異なるポリアデニル化転写物を含有し、これを、固有のRNA試料と併せて増幅し、標識付けし、共ハイブリダイズする。試料は、Quick Amp Labelling Kit(Agilent、製品番号:5190−0444)を使用して、Cy3およびCy5により標識付けした。そこで、500ngの精製試料RNAを8.3μLのRNアーゼ非含有水中で希釈し、2μLのSpike AまたはB、および1.2μLのT7プロモータープライマーを添加した。混合物を、65℃で10分間にわたり変性させ、氷上で5分間にわたり保った。次いで、8.5μLのcDNAマスターミックス(試料1例当たり:4μLの5倍濃度のfirst strand緩衝液、2μLの0.1MのDTT、1μLの10mMのdNTPミックス、1μLのMMLV−RT、0.5μLのRNAse out)を添加し、40℃で2時間にわたりインキュベートし、次いで、15分間にわたり65℃に移行させ、5分間にわたり氷上に置いた。転写マスターミックス(試料1例当たり:15.3μLのヌクレアーゼ非含有水、20μLの転写緩衝液、6μLの0.1MのDTT、6.4μLの50%のPEG、0.5μLのRNアーゼ阻害剤、0.6μLの無機ホスファターゼ、0.8μLのT7 RNAポリメラーゼ、2.4μLのシアニン3またはシアニン5)を調製し、各試験管に添加し、40℃で2時間にわたりインキュベートした。得られた、標識付けされたcRNAを精製するために、RNeasy Mini Kit(Qiagen、型番74104)を使用した。試料は、−80℃で保管した。cRNA濃度および標識付け効率の定量化を、Nanodrop分光光度計で行った。
Gene Expression Hybridisation Kit(Agilent、型番5188−5242)を、標識付けされた試料cRNAのハイブリダイゼーションのために使用した。ハイブリダイゼーション試料を調製するために、300ngずつのcRNA(Cy3およびCy5)および6μLの10倍濃度のブロッキング剤を、ヌクレアーゼ非含有水で、24μLの最終容量まで希釈した。1μLの25倍濃度の断片化緩衝液の添加後、混合物を、60℃で30分間にわたりインキュベートした。次いで、25μLのGEx Hybridisation Buffer HI−RPMを添加して、反応を停止させた。13,200rpmで1分間にわたる遠心分離の後、試料を氷上で冷やし、速やかにハイブリダイゼーションのために使用した。社内でデザインされたP.pastoris特異的オリゴヌクレオチドアレイ(AMAD−ID:026594、8×15Kカスタムアレイ、Agilent)を使用した。Microarray Hybridisation Chamber User Guide(Agilent G2534A)に従い、マイクロアレイハイブリダイゼーションを行った。まず、ガスケットスライドのカバーを取り外し、Agilentラベルを上向きにしてチャンバー基部上に置いた。試料(アレイ1つ当たり40μL)を、8つの四角の各々の中央部にロードした。次いで、マイクロアレイスライドを、ガスケットスライド上に注意深く置き(Agilentラベルを下向きにして)、チャンバーカバーをかけ、クランプで固定した。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションオーブン内、65℃で17時間にわたり行った。走査する前に、マイクロアレイチップを洗浄した。そこで、チャンバーを取り外し、洗浄緩衝液1中に浸漬しながら、サンドイッチスライドを互いから引き離した。マイクロアレイを、洗浄緩衝液1を伴う別のディッシュに直接移し、1分間にわたり洗浄し、洗浄緩衝液2(温度を少なくとも30℃とする)に移し、さらに1分間にわたり洗浄した。スライドの縁辺部をティッシュペーパーと接触させることによりマイクロアレイスライドを乾燥させた後、スライドを、スライドホルダーに入れた(Agilentラベルを上向きにして)。スライドホルダーをカルーセルに入れ、走査を開始した。
画像は、G2565AA Microarrayスキャナー(Agilent)により、50nmの分解能で走査し、Agilent Feature Extraction9.5ソフトウェアにインポートした。Agilent Feature Extraction9.5は、スポット強度の定量化のために使用した。次いで、さらなる標準化およびデータ解析のために、生の平均スポット強度データを、オープンソースのソフトウェアRにインポートした。
eGFPを、細胞内で発現させるレポーター遺伝子として使用する、新規に同定されたプロモーターであるpCS1についての、P.pastoris内の比較プロモーター活性研究
新規に同定されたプロモーターの特性を解析するために、振とうフラスコスクリーニングを、以下の通りに実施した。グリセロールを炭素供給源として含有する富栄養培地により、24時間にわたる前培養(プロセスの回分期をシミュレートする)を行った後、最小培地およびグルコースフィードビーズによる主培養(プロセスのグルコース制限流加期をシミュレートする)を行った。緑色蛍光タンパク質(eGFP)を、プロモーター活性についての細胞内レポータータンパク質として使用した。
P.pastorisの野生型株(CBS2612:CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を、宿主株として使用した。株の形質転換は、E.coliのための複製起点(pUC19)、E.coliおよび酵母内の選択のための抗生剤耐性カセット(Zeocinに対する耐性を付与するSh ble遺伝子)、複数のクローニング部位、およびS.cerevisiaeのCYC1転写ターミネーター、およびP.pastorisのゲノム(3’側のAOX1領域)への組込みのための遺伝子座からなる、対象の遺伝子(GOI)のための発現カセットを含む、pPUZZLEと名付けられた自社製のベクター(Stadlmayrら、J.Biotechnol、2010、150(4):519〜29)により実行した。
pCS1プロモーター(配列番号)は、開始コドンATGまでの985bpにわたる、CS1遺伝子(例1を参照されたい)の5’側非コード領域を含み、PCR(Phusion Polymerase、New England Biolabs)により、表2に示すプライマーを使用して、P.pastorisのゲノムDNAから増幅した。配列は、pPUZZLE発現ベクターであるpPM1aZ10_eGFPにクローニングし、ApaIおよびSbfIで切断する結果として、pPM1aZ10_pCS1_eGFPをもたらした。加えて、一般に使用されるプロモーターであるグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター(P.pastorisのpGAP、ここでは、配列番号13)を含有するベクターであるpPM1aZ10_pGAP_eGFPを、基準として使用した。ApaIおよびSbfI制限部位を使用して、プロモーターを、eGFP遺伝子の開始コドンの上流に挿入した(表2および3を参照されたい)。プロモーター配列の正確さは、サンガーシークエンシングにより検証した。
エレクトロコンピテントのP.pastorisへの電気穿孔(2kV、4ミリ秒、GenePulser、BioRad)の前に、全てのプラスミドを、3’側のAOXゲノム組込み領域内で、AscIにより直鎖化した。
GCNとは、P.pastorisのゲノムに組み込まれる、レポータータンパク質発現カセットの数を表す。pCS1またはpGAPの制御下でeGFPを発現させるクローンのGCNは、下記の例5でさらに記載される通りに決定した。eGFPの発現レベルは、例2cにおける通りに解析した。例示的に、各プロモーター1つずつのクローンについての結果を、表5に示す。新規のpCS1プロモーターの制御下においてeGFPを発現させるクローンは、スクリーニング培養物中に同じGCNを伴う、pGAPプロモーター下において発現させるクローンと比較して、2倍量のeGFPを産生した。
作製プロセス様条件におけるpCS1プロモーター活性を評価するため、各々が1コピーずつのeGFPの発現カセット(例2dを参照されたい)を保有する、1つのpCS1クローン(pCS1_eGFP#4)および1つのpGAPクローン(pGAP_eGFP#2)の流加培養を実施した。
6.0gのCuSO4・5H2O、0.08gのNaI、3.36gのMnSO4・H2O、0.2gのNa2MoO4・2H2O、0.02gのH3BO3、0.82gのCoCl2、20.0gのZnCl2、65.0gのFeSO4・7H2O、0.2gのビオチン、および5.0mlのH2SO4(95%〜98%)
を含有した。
2gのクエン酸一水和物(C6H8O7・H2O)、39.2gのグリセロール、12.6gのNH4H2PO4、0.5gのMgSO4・7H2O、0.9gのKCl、0.022gのCaCl2・2H2O、0.4mgのビオチン、および4.6mlのPTM1微量元素塩原液
を含有した。HClを添加して、pHを5とした。
464gのグルコース一水和物、5.2gのMgSO4・7H2O、8.4gのKCl、0.28gのCaCl2・2H2O、0.34mgのビオチン、および10.1mLのPTM1微量元素塩原液
を含有した。
異なる培地組成および増殖条件によるpCS1プロモーターの活性について、より多くの情報を得るために、pCS1_eGFP#4株を、異なる炭素供給源を含有するYP培地中、異なるpH値、合成最小培地中で培養した。試料は、主培養物への接種の24および48時間後に採取し、例2cで記載した通りに、フローサイトメトリーにより解析した。
ヒト血清アルブミン(HSA)を、細胞外発現レポーター遺伝子として使用する、新規に同定されたプロモーターであるpCS1についての、P.pastoris内の比較プロモーター活性研究
分泌型レポータータンパク質であるHSAの発現についての、新規に同定されたプロモーターの特性を解析するために、振とうフラスコスクリーニングを、以下の通りに実施した。グリセロールを炭素供給源として含有する富栄養培地中で、24時間にわたる前培養(プロセスの回分期をシミュレートする)を行った後、緩衝処理された富栄養培地(2%のグルコース)中で、主培養を行った。主培養物には、0.5%のグルコースを、12時間ごとにフィードした。
P.pastorisの野生型株(CBS2612:CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を、宿主株として使用した。株の形質転換は、pPUZZLEと名付けられた自社製のベクター(Stadlmayrら、J.Biotechnol、2010年12月、150(4):519〜29)により実行し、陽性の形質転換体の選択は、Zeocin耐性に基づいた。ヒト血清アルブミン(HSA)の分泌性発現のために、その天然の分泌リーダー配列を使用した。
例2bで増幅したプロモーターを、pPUZZLE発現ベクターであるpPM1aZ10_HSAにクローニングする結果として、pPM1aZ10_pCS1_HSAをもたらした。加えて、一般に使用されるグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター(pGAP)を含有するベクターであるpPM1aZ10_pGAP_HSAを、基準として使用した。ApaIおよびSbfI制限部位を使用して、プロモーターを、HSA遺伝子の開始コドンの上流に挿入した(表3を参照されたい)。プロモーター配列の正確さは、サンガーシークエンシングにより検証した。
P.pastorisへの電気穿孔(P.pastorisのための標準的な形質転換プロトコールを使用する)の前に、AscI制限酵素を使用して、全てのプラスミドを直鎖化した。陽性の形質転換体の選択は、25μg/mLのZeocinを含有するYPD(1リットル当たり:10gの酵母抽出物、20gのペプトン、20gのグルコース、20gの寒天)プレート上で実施した。例2cで記載した通りに、コロニーPCRを使用して、形質転換されたプラスミドの存在を確認した。
pCS1プロモーターの制御下でHSAを発現させるP.pastoris株の流加培養
作製プロセス様条件におけるHSAの発現を駆動するpCS1の能力について解析するため、1コピーのHSA発現カセット(例3を参照されたい)を保有する、1つのpCS1クローン(pCS1_HSA#1)の流加培養を実施した。
6.0gのCuSO4・5H2O、0.08gのNaI、3.36gのMnSO4・H2O、0.2gのNa2MoO4・2H2O、0.02gのH3BO3、0.82gのCoCl2、20.0gのZnCl2、65.0gのFeSO4・7H2O、0.2gのビオチン、および5.0mlのH2SO4(95%〜98%)
を含有した。
39.2gのグリセロール、27.9gのH3PO4(85%)、7.8gのMgSO4・7H2O、2.6gのKOH、9.5gのK2SO4、0.6gのCaSO4・2H2O、0.4mgのビオチン、および4.6mLのPTM1微量元素塩原液
を含有した。pHは、発酵槽への滅菌濾過後において、5.85に調整した。
550gのグルコース一水和物、6.5gのMgSO4・7H2O、10gのKCl、0.35gのCaCl2・2H2O、0.4mgのビオチン、および12mLのPTM1微量元素塩原液
を含有した。
選択されたクローンの遺伝子コピー数(GCN)の決定
発現強度は、P.pastorisのゲノムに組み込まれた発現カセットの数と相関することが多い。したがって、選択されたクローンの遺伝子コピー数を決定した。ゲノムDNAは、DNeasy Blood&Tissue Kit(Quiagen、型番69504)を使用して単離した。遺伝子コピー数は、定量的PCRを使用して決定した。そこで、SensiMix SYBR Kit(Bioline、QT605−05)を使用した。Sensi Mix SYBRは、それぞれのプライマー(Prielhoferら、2013、Microb.Cell.Fact.、12:5において与えられている)および試料と混合し、リアルタイムPCRサイクラー(Rotor Gene、Qiagen)内のリアルタイム解析に適用した。全ての試料は、三連または四連で解析した。Rotor Geneソフトウェアは、データ解析のために使用した。
ブタカルボキシペプチダーゼB(CpB:carboxypeptidase B)を、細胞外発現レポーター遺伝子として使用する、新規に同定されたプロモーターであるpCS1についての、P.pastoris内の比較プロモーター活性研究
新規に同定されたプロモーターの特性を解析するために、振とうフラスコスクリーニングを、以下の通りに実施する。グリセロールを炭素供給源として含有する富栄養培地中で、24時間にわたる前培養を行った後、富栄養培地による主培養を行う。
P.pastorisの野生型株(CBS2612:CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を、宿主株として使用する。株の形質転換は、pPUZZLEと名付けられた自社製のベクター(Stadlmayrら、J.Biotechnol、2010年12月、150(4):519〜29)により実行し、陽性の形質転換体の選択は、Zeocin耐性に基づく。ブタカルボキシペプチダーゼB(CpB)の分泌性発現のために、酵母アルファ接合因子リーダー配列を使用する。
例2bで増幅したプロモーターを、pPUZZLE発現ベクターであるpPM1aZ30_aMF_CpBにクローニングする結果として、pPM1aZ30_pCS1_aMF_CpBをもたらす。加えて、一般に使用されるグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター(pGAP)を含有するベクターであるpPM1dZ30_pGAP_CpBを、基準として使用する。ApaIおよびSbfI制限部位を使用して、プロモーターを、CpB遺伝子の開始コドンの上流に挿入する。プロモーター配列の正確さは、サンガーシークエンシングにより検証する。
P.pastorisへの電気穿孔(P.pastorisのための標準的な形質転換プロトコールを使用する)の前に、AscI制限酵素を使用して、プラスミドを直鎖化する。陽性の形質転換体の選択は、25μg/mLのZeocinを含有するYPD(1リットル当たり:10gの酵母抽出物、20gのペプトン、20gのグルコース、20gの寒天)プレート上で実施する。例2cで記載した通りに、コロニーPCRを使用して、形質転換されたプラスミドの存在を確認する。
流加発酵は、例2dで記載した培地を使用して、例4で記載した通りに行う。
ヒト血清アルブミン(HSA)を、細胞外発現レポーター遺伝子として使用する、新規に同定されたプロモーターであるpCS1についての、P.pastorisのマルチコピークローン内の比較プロモーター活性研究
GCNにより、HSA産生がさらに増強されうるのかどうかについて探索するため、Marxら(2009)により記載されている通りに、HSAを発現させるPCS1クローンを、形質転換後ベクター増幅法により増幅した。相同組換えによりrDNA遺伝子座に組み込まれるベクターを作り出した。増幅は、抗生剤濃度の段階的な増大に基づく選択により行った。
P.pastorisの野生型株(CBS2612:CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を、宿主株として使用した。株の形質転換は、リボソームDNA遺伝子座のNTS領域を組込み部位として含有する、ベクターpPUZZLEの変異体により実行し(Marxら、2009、FEMS Yeast Res.、9(8):1260〜70)、陽性の形質転換体の選択は、Zeocin耐性に基づいた。ヒト血清アルブミン(HSA)の分泌性発現のために、その天然の分泌リーダー配列を使用した。
P.pastorisへの電気穿孔(P.pastorisのための標準的な形質転換プロトコールを使用する)の前に、SpeI制限酵素を使用して、プラスミドを直鎖化した。陽性の形質転換体の初期選択は、25μg/mLのZeocinを含有するYPD(1リットル当たり:10gの酵母抽出物、20gのペプトン、20gのグルコース、20gの寒天)プレート上で実施した。例2cで記載した通りに、コロニーPCRを使用して、形質転換されたプラスミドの存在を確認した。Marxら(FEMS Yeast Res.、2009年12月、9(8):1260〜70)において記載されている通り、高Zeocin濃度(50、100、および500μg/mLのZeocin)を含有するYPD寒天プレート上におけるクローンの反復画線培養により、遺伝子コピー数の増幅を行った。
抗体断片(Fab)を、細胞外発現レポーター遺伝子として使用する、新規に同定されたプロモーターであるpCS1についての、P.pastoris内の比較プロモーター活性研究
新規に同定されたプロモーターの特性を解析するために、振とうフラスコスクリーニングを、以下の通りに実施した。グリセロールを炭素供給源として含有する富栄養培地により、24時間にわたる前培養を行った後、富栄養培地による主培養を行った。
P.pastorisの野生型株(CBS2612:CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を、宿主株として使用した。例2bで増幅したpCS1プロモーターを、HyHEL抗体のLCまたはFab−HCをGOIとして含有するpPUZZLE発現ベクターにクローニングした。ApaIおよびSbfI制限部位を使用して、プロモーターを、Fab遺伝子の開始コドンの上流に挿入した。配列を検証した後、両立可能な制限酵素であるMreIおよびAgeIを使用することにより、両方の鎖のための発現カセットを、1つのベクターに組み合わせた。
P.pastorisへの電気穿孔(P.pastorisのための標準的な形質転換プロトコールを使用する)の前に、AscI制限酵素を使用して、プラスミドを直鎖化した。陽性の形質転換体の選択は、25μg/mLのZeocinを含有するYPD(1リットル当たり:10gの酵母抽出物、20gのペプトン、20gのグルコース、20gの寒天)プレート上で実施した。例2cで記載した通りに、コロニーPCRを使用して、形質転換されたプラスミドの存在を確認した。
流加発酵は、例2dで記載した培地を使用して、例4で記載した通りに同様に行った。
pCS1の変異体の比較
pCS1プロモーターの長さ変異体を、例2aで記載した通りにクローニングし、例2cで記載した通りに同様にスクリーニングする。pCS1(基準の長さ)およびpGAPの制御下で発現させるクローンを、対照として使用した。pCS1およびその変異体のフォワードプライマーおよび長さを、表13に列挙する。
前記プロモーターの制御下でeGFPを発現させるクローン内の、プロモーターの発現強度の、増殖制限条件下、大小の増殖速度における検証
a)株
「対象のプロモーター」の制御下でeGFPを発現させる宿主株(たとえば、Pichia pastoris)と、pGAPの制御下でeGFPを発現させる株を使用して、発現レベルを比較する。
これらの株を、最終作業容量を1.0Lとする、DASGIPバイオリアクターを使用して、ケモスタット内、2つの一定の比増殖速度(希釈速度を設定することによる、1つの小さな比増殖速度と1つの大きな比増殖速度)で培養する。
6.0gのCuSO4・5H2O、0.08gのNaI、3.36gのMnSO4・H2O、0.2gのNa2MoO4・2H2O、
0.02gのH3BO3、0.82gのCoCl2、20.0gのZnCl2、65.0gのFeSO4・7H2O、0.2gのビオチン、および5.0mlのH2SO4(95%〜98%)
を含有する。
2gのクエン酸一水和物(C6H8O7・H2O)、39.2gのグリセロール、12.6gのNH4H2PO4、
0.5gのMgSO4・7H2O、0.9gのKCl、0.022gのCaCl2・2H2O、0.4mgのビオチン、および4.6mlのPTM1微量元素塩原液
を含有する。HClを添加して、pHを5とする。
2.5gのクエン酸一水和物(C6H8O7・H2O)、55.0gのグルコース一水和物、21.75gの(NH4)2HPO4、1.0gのMgSO4・7H2O、2.5gのKCl、0.04gのCaCl2・2H2O、0.4mgのビオチン、および2.43mLのPTM1微量元素塩原液
を含有する。HClを添加して、pHを5とする。
試料は、定常状態条件(少なくとも5容量の交換後)において採取し、プレートリーダー(Infinite200、Tecan、CH)を使用して、eGFPの発現について解析する。そこで、試料を光学濃度(OD600)5まで希釈する。発酵は、二連で実施する。発現データは、例2d)で記載した通りに、バイオリアクター1槽当たりの相対蛍光を計算することにより比較する。
大小の比増殖速度で高度な転写を可能とするP.pastorisプロモーターの同定
大小の増殖速度で高度な転写を可能とするプロモーターを同定するために、DNAマイクロアレイを使用して、遺伝子発現パターンの解析を行った。大小の増殖速度で大きな転写強度を表す遺伝子を、トランスクリプトミクスデータから選択した。そこで、P.pastoris細胞を、例10b)で記載した通りに、ケモスタット培養により、それぞれ、0.15および0.015h-1の大小の比増殖速度で増殖させた。マイクロアレイハイブリダイゼーション、マイクロアレイ解析、データ収集および統計学的査定のためのサンプリング、RNA精製、試料調製は、例1c)、1d)、1e)、および1f)で記載した通りに行う。マイクロアレイデータを、大小の増殖速度条件の両方においてシグナル強度が大きな遺伝子についてブラウズすることにより、大小の増殖速度で転写強度の大きな遺伝子およびそれぞれのプロモーターを同定した。第2の基準として、シグナル強度は、両方の条件において、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAP、GAPDHおよびTDH3と同義)遺伝子のシグナル強度より大きいものとする。プロモーターを単離するために、それぞれの遺伝子の開始コドンであるATGの約1000bp上流の核酸断片を増幅した。
大小の比増殖速度で高度な転写を可能とするP.pastorisプロモーターの同定
大小の増殖速度で高度な転写を可能とするプロモーターを同定するために、DNAマイクロアレイを使用して、遺伝子発現パターンの解析を行った。大小の増殖速度で大きな転写強度を表す遺伝子を、トランスクリプトミクスデータから選択した。そこで、P.pastoris細胞を、例10b)で記載した通りに、ケモスタット培養により、それぞれ、0.15および0.015h-1の大小の比増殖速度で増殖させた。マイクロアレイハイブリダイゼーション、マイクロアレイ解析、データ収集および統計学的査定のためのサンプリング、RNA精製、試料調製は、例1c)、1d)、1e)、および1f)で記載した通りに行う。マイクロアレイデータを、大小の増殖速度条件の両方においてシグナル強度が大きな遺伝子についてブラウズすることにより、大小の増殖速度で転写強度の大きな遺伝子およびそれぞれのプロモーターを同定した。第2の基準として、シグナル強度は、両方の条件において、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAP、GAPDHおよびTDH3と同義)遺伝子のシグナル強度より大きいものとする。プロモーターを単離するために、それぞれの遺伝子の開始コドンであるATGの約1000bp上流の核酸断片を増幅した。
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
[1]
配列番号1のpCS1核酸配列を含むPichia pastorisの天然配列、あるいは配列番号1のサイズ変異体、突然変異体、もしくはハイブリッド体、またはこれらの組合せであるその機能的に活性な変異体であるプロモーターを含む単離核酸配列。
[2]
前記プロモーターが、配列番号1のpCS1の核酸配列、あるいは配列番号1のサイズ変異体、突然変異体、もしくはハイブリッド体、またはこれらの組合せである、その機能的に活性な変異体からなる、[1]に記載の核酸配列。
[3]
前記機能的に活性な変異体が、配列番号1のpCS1の核酸配列と実質的に同じ活性を呈示する、[1]または[2]に記載の核酸。
[4]
前記機能的に活性な変異体が、
a)配列番号1のpCS1のサイズ変異体であって、好ましくは配列番号2、3、4、5、6、7、および8からなる群から選択される核酸配列、最も好ましくは配列番号2、3、4、5、もしくは6からなる核酸配列、を含むかもしくはこれからなる、サイズ変異体、
b)配列番号1のpCS1の突然変異体、もしくはa)のサイズ変異体の突然変異体であって、配列番号1の前記配列もしくは前記サイズ変異体と少なくとも60%の相同性を有する突然変異体、
c)ハイブリッド体であって、
・配列番号1のpCS1、a)のサイズ変異体、およびb)の突然変異体からなる群から選択される配列、ならびに
・配列番号1のpCS1、a)のサイズ変異体、b)の突然変異体、および異種配列からなる群から選択される、少なくとも1つのさらなる配列
を含む、ハイブリッド体、または
d)a)もしくはb)のサイズ変異体もしくは突然変異体の核酸配列のうちの何れかと厳密な条件下でハイブリダイズする配列
である、[1]または[2]に記載の核酸配列。
[5]
前記機能的に活性な変異体が、
i)少なくとも約60%のヌクレオチド配列同一性を有する相同体、
ii)前記配列内または前記配列の遠位端の一方もしくは両方における、1つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を介して、配列番号1のpCS1またはそのサイズ変異体のヌクレオチド配列を改変することにより得られる相同体であって、好ましくは80bp〜1500bp、より好ましくは、少なくとも200bpのヌクレオチド配列を有する相同体、および
iii)Pichia pastoris以外の種に由来する類似体
からなる群から選択される、[1]〜[4]の何れか一に記載の核酸配列。
[6]
対象のタンパク質(POI:protein of interest)をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、この核酸が、前記POIをコードする前記ヌクレオチド配列と天然では会合しない、[1]〜[5]の何れか一に記載の核酸配列。
[7]
前記POIの分泌を可能とするシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、好ましくは、前記シグナルペプチドをコードする核酸配列が、前記POIをコードする前記ヌクレオチド配列の5’端に隣接して配置される、[6]に記載の核酸配列。
[8]
[1]〜[7]の何れか一に記載の核酸配列を含む発現構築物であって、好ましくは、自己複製型ベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞の染色体DNAに組み込まれるベクターもしくはプラスミドである発現構築物。
[9]
[1]〜[7]の何れか一に記載の核酸配列、または[8]に記載の発現構築物を含む組換え宿主細胞であって、好ましくは、真核細胞、より好ましくは、酵母または糸状菌細胞、より好ましくは、Saccharomyces属またはPichia属の酵母細胞である宿主細胞。
[10]
前記核酸配列の複数コピー、および/または前記発現構築物の複数コピーを含む、[9]に記載の組換え宿主細胞。
[11]
哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌、および植物細胞からなる群から選択され、好ましくは、酵母、好ましくは、P.pastorisのCBS 704、CBS 2612、CBS 7435、CBS 9173〜9189、DSMZ 70877、X−33、GS115、KM71、およびSMD1168株のうちの何れかである、[9]または[10]に記載の組換え宿主細胞。
[12]
[9]、[10]、または[11]の何れか一に記載の複数の細胞の、安定的培養物。
[13]
[1]〜[7]の何れか一に記載のプロモーター、もしくは[8]に記載の発現構築物、および前記プロモーターの転写制御下でPOIをコードする核酸を含む組換え宿主細胞系、または[9]〜[11]の何れか一に記載の組換え宿主細胞を培養することにより、POIを作製する方法であって、
a)前記POIを発現させる条件下で、前記細胞系を培養する工程と、
b)前記POIを回収する工程と
を含む方法。
[14]
前記POIを、増殖制限条件下で発現させる、[13]に記載の方法。
[15]
前記細胞系を、回分、流加、もしくは連続培養条件下で、かつ/または制限炭素基質を含有する培地中で培養する、[13]または[14]に記載の方法。
[16]
前記培養を、回分期で始め、流加期または連続培養期を後続させて、バイオリアクター内で実施する、[15]に記載の方法。
[17]
前記POIが、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生剤、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセシング酵素、増殖因子、ホルモン、ならびにサイトカイン、またはPOIの代謝物を含む治療用タンパク質から選択される異種タンパク質である、[13]〜[16]の何れか一に記載の方法。
[18]
真核細胞に由来する構成的プロモーターを同定する方法であって、
a)真核細胞を大きな増殖速度で培養する工程と、
b)前記細胞を小さな増殖速度でさらに培養する工程と、
c)工程a)およびb)の細胞培養物の試料を用意する工程と、
d)前記試料中で転写解析を実施し、転写物レベルを、前記細胞の天然pGAPプロモーターの転写物レベルと比較する工程と、
f)好ましくは、前記天然pGAPプロモーターと比較して、少なくとも1.1倍である、同定された構成的プロモーターの転写物レベルを決定することにより、大小の増殖速度で、前記天然pGAPプロモーターと比較して、転写強度の大きな構成的プロモーターを選択する工程と
を含む方法。
[19]
対象のタンパク質(POI:protein of interest)をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結されると、大小の増殖速度において、天然pGAPプロモーターの制御下より高い発現レベルで、宿主細胞内のその発現を方向付けるプロモーターを含む単離核酸配列の使用であって、好ましくは、回分期で始め、続いては流加期または連続培養期にバイオリアクター内で実施される、前記核酸配列で形質転換された宿主細胞の培養によって前記POIを作製する方法における使用。
[20]
前記発現レベルを、0.015〜0.15h -1 の範囲内の大きな増殖速度および小さな増殖速度で決定する、[19]に記載の使用。
[21]
前記発現レベルが、前記pGAPプロモーターと比較して、少なくとも1.1倍である、[19]または[20]に記載の使用。
[22]
[1]〜[7]の何れか一に記載の単離核酸配列または[8]に記載の発現構築物の使用であって、好ましくは、回分期で始め、続いて流加期または連続培養期にバイオリアクター内で実施される、前記核酸配列および/または前記発現構築物で形質転換された宿主細胞の培養によってPOIを作製する方法における使用。
Claims (22)
- 配列番号1のpCS1核酸配列を含むPichia pastorisの天然配列、あるいは配列番号1のサイズ変異体、突然変異体、もしくはハイブリッド体、またはこれらの組合せであるその機能的に活性な変異体であるプロモーターを含む単離核酸配列。
- 前記プロモーターが、配列番号1のpCS1の核酸配列、あるいは配列番号1のサイズ変異体、突然変異体、もしくはハイブリッド体、またはこれらの組合せである、その機能的に活性な変異体からなる、請求項1に記載の核酸配列。
- 前記機能的に活性な変異体が、配列番号1のpCS1の核酸配列と実質的に同じ活性を呈示する、請求項1または2に記載の核酸。
- 前記機能的に活性な変異体が、
a)配列番号1のpCS1のサイズ変異体であって、好ましくは配列番号2、3、4、5、6、7、および8からなる群から選択される核酸配列、最も好ましくは配列番号2、3、4、5、もしくは6からなる核酸配列、を含むかもしくはこれからなる、サイズ変異体、
b)配列番号1のpCS1の突然変異体、もしくはa)のサイズ変異体の突然変異体であって、配列番号1の前記配列もしくは前記サイズ変異体と少なくとも60%の相同性を有する突然変異体、
c)ハイブリッド体であって、
・配列番号1のpCS1、a)のサイズ変異体、およびb)の突然変異体からなる群から選択される配列、ならびに
・配列番号1のpCS1、a)のサイズ変異体、b)の突然変異体、および異種配列からなる群から選択される、少なくとも1つのさらなる配列
を含む、ハイブリッド体、または
d)a)もしくはb)のサイズ変異体もしくは突然変異体の核酸配列のうちの何れかと厳密な条件下でハイブリダイズする配列
である、請求項1または2に記載の核酸配列。 - 前記機能的に活性な変異体が、
i)少なくとも約60%のヌクレオチド配列同一性を有する相同体、
ii)前記配列内または前記配列の遠位端の一方もしくは両方における、1つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を介して、配列番号1のpCS1またはそのサイズ変異体のヌクレオチド配列を改変することにより得られる相同体であって、好ましくは80bp〜1500bp、より好ましくは、少なくとも200bpのヌクレオチド配列を有する相同体、および
iii)Pichia pastoris以外の種に由来する類似体
からなる群から選択される、請求項1〜4の何れか一項に記載の核酸配列。 - 対象のタンパク質(POI:protein of interest)をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、この核酸が、前記POIをコードする前記ヌクレオチド配列と天然では会合しない、請求項1〜5の何れか一項に記載の核酸配列。
- 前記POIの分泌を可能とするシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、好ましくは、前記シグナルペプチドをコードする核酸配列が、前記POIをコードする前記ヌクレオチド配列の5’端に隣接して配置される、請求項6に記載の核酸配列。
- 請求項1〜7の何れか一項に記載の核酸配列を含む発現構築物であって、好ましくは、自己複製型ベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞の染色体DNAに組み込まれるベクターもしくはプラスミドである発現構築物。
- 請求項1〜7の何れか一項に記載の核酸配列、または請求項8に記載の発現構築物を含む組換え宿主細胞であって、好ましくは、真核細胞、より好ましくは、酵母または糸状菌細胞、より好ましくは、Saccharomyces属またはPichia属の酵母細胞である宿主細胞。
- 前記核酸配列の複数コピー、および/または前記発現構築物の複数コピーを含む、請求項9に記載の組換え宿主細胞。
- 哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌、および植物細胞からなる群から選択され、好ましくは、酵母、好ましくは、P.pastorisのCBS 704、CBS 2612、CBS 7435、CBS 9173〜9189、DSMZ 70877、X−33、GS115、KM71、およびSMD1168株のうちの何れかである、請求項9または10に記載の組換え宿主細胞。
- 請求項9、10、または11の何れか一項に記載の複数の細胞の、安定的培養物。
- 請求項1〜7の何れか一項に記載のプロモーター、もしくは請求項8に記載の発現構築物、および前記プロモーターの転写制御下でPOIをコードする核酸を含む組換え宿主細胞系、または請求項9〜11の何れか一項に記載の組換え宿主細胞を培養することにより、POIを作製する方法であって、
a)前記POIを発現させる条件下で、前記細胞系を培養する工程と、
b)前記POIを回収する工程と
を含む方法。 - 前記POIを、増殖制限条件下で発現させる、請求項13に記載の方法。
- 前記細胞系を、回分、流加、もしくは連続培養条件下で、かつ/または制限炭素基質を含有する培地中で培養する、請求項13または14に記載の方法。
- 前記培養を、回分期で始め、流加期または連続培養期を後続させて、バイオリアクター内で実施する、請求項15に記載の方法。
- 前記POIが、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生剤、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセシング酵素、増殖因子、ホルモン、ならびにサイトカイン、またはPOIの代謝物を含む治療用タンパク質から選択される異種タンパク質である、請求項13〜16の何れか一項に記載の方法。
- 真核細胞に由来する構成的プロモーターを同定する方法であって、
a)真核細胞を大きな増殖速度で培養する工程と、
b)前記細胞を小さな増殖速度でさらに培養する工程と、
c)工程a)およびb)の細胞培養物の試料を用意する工程と、
d)前記試料中で転写解析を実施し、転写物レベルを、前記細胞の天然pGAPプロモーターの転写物レベルと比較する工程と、
f)好ましくは、前記天然pGAPプロモーターと比較して、少なくとも1.1倍である、同定された構成的プロモーターの転写物レベルを決定することにより、大小の増殖速度で、前記天然pGAPプロモーターと比較して、転写強度の大きな構成的プロモーターを選択する工程と
を含む方法。 - 対象のタンパク質(POI:protein of interest)をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結されると、大小の増殖速度において、天然pGAPプロモーターの制御下より高い発現レベルで、宿主細胞内のその発現を方向付けるプロモーターを含む単離核酸配列の使用であって、好ましくは、回分期で始め、続いては流加期または連続培養期にバイオリアクター内で実施される、前記核酸配列で形質転換された宿主細胞の培養によって前記POIを作製する方法における使用。
- 前記発現レベルを、0.015〜0.15h-1の範囲内の大きな増殖速度および小さな増殖速度で決定する、請求項19に記載の使用。
- 前記発現レベルが、前記pGAPプロモーターと比較して、少なくとも1.1倍である、請求項19または20に記載の使用。
- 請求項1〜7の何れか一項に記載の単離核酸配列または請求項8に記載の発現構築物の使用であって、好ましくは、回分期で始め、続いて流加期または連続培養期にバイオリアクター内で実施される、前記核酸配列および/または前記発現構築物で形質転換された宿主細胞の培養によってPOIを作製する方法における使用。
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