KR20160002763A - 구성 프로모터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 pCS1의 핵산 서열, 또는 서열번호 1의 크기 변이체, 돌연변이체 또는 하이브리드, 또는 이들의 조합물인 기능적 활성 변이체를 포함하는 피키아 파스토리스의 천연 서열인, 프로모터를 포함하는 단리된 핵산 서열, 상기 프로모터를 포함하는 발현 작제물 및 발현 숙주 세포, 상기 프로모터의 조절하에 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 진핵 세포로부터 구성 프로모터를 동정하는 방법, 및 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연결되는 경우, 높거나 낮은 성장 속도에서 천연 pGAP 프로모터의 조절하보다 높은 발현 수준으로 숙주 세포에서 이의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다.
Description
본 발명은 강력한 구성 프로모터를 포함하는 단리된 핵산 서열 및 이러한 프로모터의 조절하에 진핵 세포에서 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질의 성공적인 생산은 진핵 숙주를 이용하여 달성되었다. 가장 유명한 예는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 등의 효모, 아스퍼길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 또는 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 등의 사상균, 또는, 예를 들면, CHO 세포 등의 포유동물 세포이다. 몇몇 단백질의 생산은 높은 속도로 용이하게 달성되지만, 다수의 기타 단백질은 상대적으로 낮은 수준으로만 수득된다.
숙주 생물체에서 유전자의 이종 발현은 일반적으로 숙주 생물의 안정한 형질전환을 가능하게 하는 벡터를 필요로 한다. 벡터는 코딩 서열의 5' 말단에 인접한 기능적 프로모터를 갖는 유전자를 제공한다. 이에 의해 전사가 조절되고, 이러한 프로모터 서열에 의해 개시된다. 현재까지 사용된 대부분의 프로모터는 통상 세포 내에 고농도로 존재하는 단백질을 코딩하는 유전자에서 유래되었다.
제EP0103409A2호는 해당 작용 경로에서 특정 효소의 발현과 관련된 효모 프로모터의 용도, 즉 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제, 포스포르글리세레이트 뮤타제, 헥소키나제 1 및 2, 글루코키나제, 포스포프럭토즈 키나제, 알돌라제 및 해당계 조절 유전자의 용도를 개시한다.
국제공개공보 제WO 97/44470호는 번역 신장 인자 1(TEF1) 단백질 및 효모에서 단백질의 이종 발현에 적합한 리보솜 단백질 S7을 위해 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)로부터의 효모 프로모터를 개시하고, 제EP1951877A1호는 이종 단백질의 생산을 위한 피. 파스토리스(P. pastoris) TEF1 프로모터의 용도를 개시한다.
국제공개공보 제WO2005003310호는 유지성 효모 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipplytica)로부터 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 또는 포스포글리세레이트 뮤타제의 프로모터를 사용하여 효모에서 목적 코딩 서열을 발현시키는 방법을 제공한다.
피키아 파스토리스의 메탄올 대사 경로에 관여하는 유전자로부터 유래하는 프로모터 서열은 미국 특허 제US4808537호 및 제US4855231호(알콜 옥시다제 AOX1, AOX2) 및 제US6730499B1호(포름알데히드 데하이드로게나제 FLD1)에 개시되어 있다. 제US20080153126A1호는 AOX1 프로모터에 기반하는 돌연변이형 프로모터 서열을 포함한다.
AOX1 프로모터는 단지 메탄올에 반응하여 유도되고, 예를 들면, 글루코즈 또는 에탄올 등의 기타 탄소원에 의해 억제된다. 메탄올은, 이의 독성 및 가연성에 대해 잠재적으로 위험하기 때문에, 특정 제품의 제조에서 사용하기에 적합하지 않다는 단점이 있다. 따라서, AOX1 프로모터의 대안이 요구되고 있다.
문헌[참조: Vassileva et al., J. Biotechnol. (2001) 88: 21-35]은 AOX1 프로모터의 대체물로서 다카피 발현 카세트를 사용하여 피. 파스토리스에서 HBsAg를 발현시키기 위한 GAP 프로모터의 용도를 기재한다. 구성 시스템은 중기 단계에서 세포의 유지를 가능하게 하기 위해 연속 배양용으로 제안되었다.
피키아 파스토리스에서 사용된 프로모터는 메탄올 등의 특정 기질 상에서 활성적이도록 엄격하게 규제되거나(예: pAOX 또는 pFLD), 이들은 다수의 상이한 조건, 배지 및 기질에서 구성적으로 활성이다. 구성 프로모터 중에서, 특히 GAP 및 TEF 프로모터는 재조합 단백질 생산을 위해 강력하고 유용한 것으로 기재되어 있다.
그러나, 양 구성 프로모터(constitutive promoter)의 활성은 유가식 생산 프로세스 동안 일정하게 강력하지 않은 것으로 밝혀졌다. 특히 프로세스의 후기 단계에서, 세포 성장 속도가 느린 경우, 또한 프로모터의 활성도 낮아지고, 따라서 목적 유전자(GOI)의 발현 수준 및 생산 수율을 제한한다[참조: Stadlmayr et al. 2010. J Biotechnol. 150: 519-529].
적합한 프로모터의 선택은, 에놀라제(ENO), 트리오즈 포스페이트 이소머라제(TPI) 또는 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제(PGI) 등의 매우 농후한 당분해 효소가 pGAP 및 pTEF만큼 강력한 프로모터를 갖지 않는 경우에도 직감적 또는 합리적이지 않다[참조: Stadlmayr et al. 2010. J Biotechnol. 150: 519-529; Gasser et al. 2010. Metabolic Engineering 12:573-580].
문헌[참조: Qin et al., Applied and Environmental Microbiology (2011) 3600-3608]은 GAP 프로모터 라이브러리 및 상이한 활성의 다양한 돌연변이체를 기재한다.
국제공개공보 제WO2007/015178 A2호는 재조합 단백질의 분비 생산을 유도할 수 있는 번역 융합 파트너, 및 피. 파스토리스 cDNA 라이브러리를 기재한다.
중국 특허공보 제102180954 A호는 앵커형 단백질로서 피. 파스토리스 세포벽 단백질 GCW14를 사용한 세포 표면 표시 시스템을 기재한다.
고수율로 단리할 수 있는 발효 생성물을 생산하는 개량된 재조합 진핵 세포주를 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 목적은 간단하고 효율적인 재조합 생산 방법에 적합한 대체 조절 요소를 제공하는 것이다.
상기 목적은 특허청구된 주제에 의해 해결된다.
본 발명에 따라서, 서열번호 1의 pCS1 핵산, 또는 서열번호 1의 크기 변이체, 돌연변이체 또는 하이드리드, 또는 이들의 조합물인 이의 기능적 활성 변이체를 포함하는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 천연 서열인 프로모터를 포함하는 단리된 핵산 서열이 제공된다.
특정 양상에 따라서, 서열번호 1의 pCS1 핵산 서열, 또는 서열번호 1의 크기 변이체, 돌연변이체 또는 하이브리드, 또는 이들의 조합물인 이의 기능적 활성 변이체를 포함하거나 이루어지는 피키아 파스토리스의 천연 서열인 프로모터를 포함하는 단리된 핵산 서열로서, 상기 기능적 활성 변이체가 pCS1, 특히 서열번호 1의 pCS1 핵산 서열과 실질적으로 동일한 활성을 나타내는, 단리된 핵산 서열이 제공된다.
구체적으로, 상기 pCS1 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 서열과 동일하다.
바람직하게는 본 발명의 핵산 서열은 국제공개공보 제WO2007/015178 A2호에 수록된 서열번호 87의 핵산 서열(즉, 본원의 서열번호 24)과 동일하지 않다.
구체적으로, 기능적 활성 변이체는
a) 서열번호 1의 pCS1의 크기 변이체, 바람직하게는 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 서열번호 1의 pCS1의 크기 변이체;
b) 서열번호 1의 pCS1의 돌연변이체 또는 상기 a)의 크기 변이체의 돌연변이체로서, 서열번호 1 또는 크기 변이체와 적어도 60% 상동성을 갖는 돌연변이체;
c) - 서열번호 1의 pCS1, 상기 a)의 크기 변이체 및 상기 b)의 돌연변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열; 및
- 서열번호 1의 pCS1, 상기 a)의 크기 변이체, 상기 b)의 돌연변이체 및 이종성(heterologous) 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 서열을 포함하는 하이브리드; 또는
d) 상기 a) 또는 b)의 크기 변이체 또는 돌연변이체 핵산 서열 중의 어느 하나와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 서열이다.
바람직하게는, 서열번호 1의 pCS1의 크기 변이체는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6 중의 어느 하나로 이루어져 있다.
특정 실시형태에 따라, 상기 기능적 활성 변이체는
i) 적어도 약 60% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 상동체(homolog);
ii) 서열번호 1의 pCS1의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 크기 변이체를, 바람직하게는 80bp 내지 1500bp, 또는 200bp 내지 1500bp, 보다 바람직하게는 적어도 200bp의 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열 내에서 또는 상기 서열의 원위 말단(distal end)의 어느 하나 또는 둘 다에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형시킴으로써 수득할 수 있는 상동체; 및
iii) 피키아 파스토리스 이외의 다른 종으로부터 유래하는 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
구체적으로, 본 발명의 기능적 활성 변이체는 pCS1과 실질적으로 동일한 프로모터 활성을 갖는다.
특정 실시형태에 따라, 핵산은, 핵산이 목적 단백질(Protein of Interest, POI)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 자연적으로 연관되지 않는, 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된다.
특정 양상에 따라, 핵산 서열은 POI의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드 유전자를 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 신호 펩티드 유전자는 POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 인접하여 배치되어 있다.
따라서, 본 발명은 구체적으로 POI의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 핵산 서열에 관한 것이고, 바람직하게는 상기 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 인접하여 배치되어 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물, 바람직하게는 자가 복제 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 발현 작제물, 또는 숙주 세포의 염색체 DNA 내로 통합되는 벡터를 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 핵산 서열 또는 본 발명의 발현 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포, 바람직하게는 진핵 세포, 보다 바람직하게는 효모 또는 사상균 세포, 보다 바람직하게는 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 피키아(pichia) 속의 효모 세포를 제공한다.
특정 양상에 따라, 상기 재조합 숙주 세포는 핵산 서열의 복수 카피 및/또는 발현 작제물의 복수 카피를 포함한다. 예를 들면, 재조합 세포는 2, 3, 4 또는 그 이상의 카피(유전자 카피 수, GCN)를 포함한다.
구체적으로, 재조합 숙주 세포는 포유동물, 곤충, 효모, 사상균 및 식물 세포, 바람직하게는 효모, 바람직하게는 피키아 파스토리스 균주 CBS 704, CBS 2621, CBS 7435, CBS 9173-9189, DSMZ 70877, X-33, GS115, KM71 및 SMD1168로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 X-33 이외의 피. 파스토리스 균주이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 복수 세포의 안정한 배양물을 제공한다.
본 발명은 추가로,
a) 세포주를 POI를 발현시키는 조건하에 배양하는 단계, 및
b) POI를 회수하는 단계를 포함하는,
본 발명의 핵산 서열 또는 프로모터, 또는 본 발명의 발현 작제물, 및 상기 프로모터의 전사 조절하에 POI를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하여 POI를 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, POI는, 예를 들면, 세포주를 최대 성장 속도보다 낮은 성장 속도, 전형적으로 세포의 최대 성장 속도의 90% 미만, 바람직하게는 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만 또는 0.2% 미만으로 배양함으로써 성장-제한 조건하에 발현된다. 전형적으로, 최대 성장 속도는 특정 숙주 세포에 대해 개별적으로 결정된다.
특정 실시형태에 따라, 세포주는 배치식, 유가식 또는 연속 배양 조건하에 및/또는 제한된 탄소 기질을 함유하는 배지에서 배양된다.
구체적으로, 배양은 배치식 단계, 이어서, 유가식 단계 또는 연속 배양 단계로 개시하는 생물반응기에서 수행된다.
구체적으로, 숙주 세포는 높은 성장 속도(예: 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 최대 성장 속도까지)의 단계 동안 탄소원 농후 배지에서 성장하고, 바람직하게는 규정 최소 배지를 공급함으로써 탄소원을 제한하면서 낮은 성장 속도(예: 최대 성장 속도의 90% 미만, 바람직하게는 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 또는 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 또는 0.2% 미만)의 단계 동안 POI를 생성한다. 구체적으로, 규정 최소 배지는 전사-유도 탄소원을 포함하지 않는다.
POI는 구체적으로, 바람직하게는 항체 또는 이의 단편을 포함한 치료학적 단백질, 효소 및 펩티드, 단백질 항생제, 독소 융합 단백질, 탄수화물-단백질 접합체, 구조 단백질, 조절 단백질, 백신 및 백신 유사 단백질 또는 입자, 프로세스 효소, 성장 인자, 호르몬 및 사이토카인, 또는 구체적으로 본 발명의 프로모터의 전사 조절하에 목적 유전자를 발현하는 재조합 세포 배양물의 세포 대사물질을 포함하는 POI의 대사물질로부터 선택된 이종성 단백질이다.
본 발명은 추가로
a) 진핵 세포를 높은 성장 속도로 배양하는 단계;
b) 상기 세포를 낮은 성장 속도로 추가로 배양하는 단계;
c) 단계 a) 및 b)의 세포 배양물의 샘플을 제공하는 단계;
d) 상기 샘플에서 전사 분석을 수행하고, 전사 수준을 상기 세포의 천연 pGAP 프로모터의 전사 수준과 비교하는 단계; 및
f) 천연 pGAP 프로모터와 비교하여 적어도 1.1배, 바람직하게는 적어도 1.2배, 바람직하게는 적어도 1.3배, 바람직하게는 적어도 1.4배, 바람직하게는 적어도 1.5배, 바람직하게는 적어도 1.6배, 바람직하게는 적어도 1.7배, 바람직하게는 적어도 1.8배, 바람직하게는 적어도 1.9배, 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3배, 바람직하게는 적어도 4배, 바람직하게는 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 10배 또는 적어도 15배 높은 동정된 구성 프로모터를 바람직하게는 측정함으로써 높거나 낮은 성장 속도에서 천연 pGAP 프로모터와 비교하여 높은 전사 강도를 갖는 구성 프로모터를 선택하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 전사 수준은, 예를 들면, 세포 배양물의 적어도 2개의 샘플, 즉 적어도 0.05h-1, 바람직하게는 적어도 0.06h- 1 , 또는 적어도 0.07h-1, 적어도 0.08h-1, 적어도 0.09h-1, 적어도 0.1h-1 등의 높은 성장 속도를, 예를 들면, 0.15h-1의 성장 속도에서 나타내는 제1 샘플, 및 제1 샘플 미만, 예를 들면, 0.05h-1, 바람직하게는 0.04h-1 미만, 0.03h-1 미만, 또는 0.02h-1 미만 등의 낮은 성장 속도를, 예를 들면, 0.015h-1의 성장 속도에서 나타내는 제2 샘플을 검사함으로써 0.01 내지 0.2h-1 범위, 바람직하게는 0.015 내지 0.15h-1 범위 내의 높은 성장 속도 및 낮은 성장 속도에서 측정된다. 전사 수준은, 예를 들면, 하기 실시예 11에 따라 DNA 마이크로어레이를 사용하는 유전자 발현 패턴의 분석에 의해 구체적으로 결정된다.
본 발명은 추가로, 목적 단백질(POI)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연결되는 경우, 바람직하게는 핵산 서열로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 POI를 생산하는 방법에 있어서 높거나 낮은 성장 속도에서 천연 pGAP 프로모터의 조절하보다 높은 발현 수준으로 숙주 세포에서 이의 발현을 유도하는, 프로모터를 포함하거나 이들로 이루어진 단리된 핵산 서열의 용도로서, 상기 배양은 배치식 단계, 이어서 유가식 단계 또는 연속 배양 단계로 개시하는 생물반응기에서 수행되는, 용도를 제공한다.
구체적으로, 상기 발현 수준은, 예를 들면, 세포 배양물의 적어도 2개의 샘플, 즉 적어도 0.05h-1, 바람직하게는 적어도 0.06h-1, 또는 적어도 0.07h-1, 적어도 0.08h-1, 적어도 0.09h-1, 적어도 0.1h-1 등의 높은 성장 속도를, 예를 들면, 0.05h-1, 바람직하게는 0.04h-1 미만, 0.03h-1 미만, 0.02h-1 미만 등의 낮은 성장 속도를, 예를 들면 0.015h-1의 성장 속도에서 나타내는 제 2 샘플을 검사함으로써 0.01 내지 0.2h-1범위, 바람직하게는 0.015h-1 내지 0.15h- 1범위 내의 높은 성장속도 및 낮은 성장 속도에서 측정된다. 발현 수준은 구체적으로 성장 제한 조건 하에서 결정된다. 예를 들면, 당-제한 캐모스타트 배양과 같은 성장 제한 조건하에서 발현 강도를 결정하는 예는, 하기 실시예 10에 따라 높은 성장 속도 또는 낮은 성장 속도에서 제공된다.
구체적으로, 상기 발현 수준은 pGAP 프로모터와 비교하여 적어도 1.1배, 바람직하게는 적어도 1.2배, 바람직하게는 적어도 1.3배, 바람직하게는 적어도 1.4배, 바람직하게는 적어도 1.5배, 바람직하게는 적어도 1.6배, 바람직하게는 적어도 1.7배, 바람직하게는 적어도 1.8배, 바람직하게는 적어도 1.9배, 바람직하게는 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3배, 바람직하게는 적어도 4배, 바람직하게는 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 10배 또는 적어도 15배 높다.
특정 양상에 따라, 본 발명의 단리된 핵산 서열 또는 본 발명의 발현 작제물은 핵산 서열 및/또는 발현 작제물로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 POI를 생산하는 방법에 사용되고, 바람직하게는 상기 배양은 배치식 단계, 이어서 유가식 단계 또는 연속 배양 단계로 개시하는 생물반응기에서 수행된다.
도 1은 피. 파스토리스의 핵산 서열 pCS1(985bp, 서열번호 1), 및 pCS1 및 5' 말단의 추가 뉴클레오티드, 또는 피. 파스토리스에서 CS1의 발현을 촉진하는 pCS1 단편을 포함하고 1488bp(서열번호 2), 767bp(서열번호 3), 500bp(서열번호 4), 344bp(서열번호 5), 234bp(서열번호 6), 138bp(서열번호 7) 및 85bp(서열번호 8)을 포함하는 DNA 서열인 프로모터 서열이다.
도 2는, i) 균주 GS115, CBS7435 및 CBS2612(PAS_chr1-4_0586), 코딩 서열(서열번호 9), 번역된 서열(XM_002490678.1, 서열번호 10); 및
ii) 균주 DSMZ70382(PIPA02805), 코딩 서열(서열번호 11), 번역된 서열(서열번호 12)의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 코딩하는 CS1의 서열이다.
도 3은 피. 파스토리스(GS115)(서열번호 13)의 천연 pGAP 프로모터 서열이다.
도 2는, i) 균주 GS115, CBS7435 및 CBS2612(PAS_chr1-4_0586), 코딩 서열(서열번호 9), 번역된 서열(XM_002490678.1, 서열번호 10); 및
ii) 균주 DSMZ70382(PIPA02805), 코딩 서열(서열번호 11), 번역된 서열(서열번호 12)의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 코딩하는 CS1의 서열이다.
도 3은 피. 파스토리스(GS115)(서열번호 13)의 천연 pGAP 프로모터 서열이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 특정 용어는 다음 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "탄소원" 또는 "탄소 기질"은 숙주 생물체 또는 생산 세포주에 의해 대사될 수 있는 것 등의 미생물의 에너지원으로 적합한 발효성 탄소 기질, 전형적으로 공급원 탄수화물, 복합 영양 물질 등과 같이, 특히 정제된 형태, 최소 배지 또는 원료로서 제공되는, 단당류, 올리고당류, 다당류, 글리세롤을 포함한 알콜류로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공급원을 의미한다. 탄소원은 단일 탄소원 또는 상이한 탄소원의 혼합물로서 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "탄소 기질 농후한 조건"은 구체적으로, 진핵 세포용 영양물과 같이, 세포 정장에 적합한 종류 및 양의 탄소 기질을 지칭한다. 탄소원은 기초 배지 또는 복합 배지 등의 배지에서 제공될 수 있지만, 또한 정제된 탄소원을 함유하는 (화학적으로) 정의된 배지에서 제공될 수 있다. 세포 배양 프로세스의 성장 단계에서 사용하기 위한 탄소원은 또한 본원에서 "기초 탄소원"으로 불리우고, 전형적으로 세포 성장을 제공하는 양으로 제공되어, 예를 들면, 표준 배양하 단계 동안 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과의 생존율을 나타내는, 예를 들면, 적어도 5g/L 세포 건조 중량, 바람직하게는 적어도 10g/L 세포 건조 중량 또는 적어도 15g/L 세포 건조 중량의 세포 밀도를 수득한다.
성장 단계에서, 탄소원은 전형적으로 과량 또는 잉여량으로 사용되고, 이는, 예를 들면, 고도의 비성장 속도를 갖는 세포주의 배양 동안 생물량을 증가시키기 위한 과다 제공 에너지로서 이해된다.
이러한 잉여량은 특히, 제한된 탄소 기질을 함유하는 배지로 세포 배양물을 공급하는 동안보다 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 50배 또는 적어도 100배 높고 측정가능한 발효 브로쓰에서 잔류 농도를 달성하기 위해 성장-제한된 조건하에 사용된 탄소원의 과다한 제한된 양으로 존재한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "보충 탄소원"으로 본원에서 또한 지칭되는 용어 "탄소 기질 제한 조건" 또는 "제한된 탄소원"은 특히 최대 성장 속도 미만의 조절된 성장 속도를 갖는 배양 프로세스에서 생산 세포주에 의한 발효 생성물의 생산을 촉진하는 종류 및 양의 탄소 기질을 구체적으로 지칭하는 것으로 이해된다. 생산 단계는 구체적으로, 예를 들면, 배치식, 유가식 및 연속 배양 프로세스에서 성장 단계를 수반한다.
일반적으로, 세포 배양 프로세스는 배치식 배양, 연속식 배양 및 유가식 배양으로 분류된다. 배치식 배양은 소량의 씨드 배양액을 배지에 첨가하고, 추가의 배지를 첨가하거나 배양액을 배양 중에 배출하지 않고서 세포를 성장시키는 배양 프로세스이다. 연속 배양은 배지를 배양 중에 연속적으로 첨가하고 배출하는 배양 프로세스이다. 배치식 배양과 연속식 배양의 중간이고 세미-배치식 배양으로도 지칭되는 유가식 배양은, 배지를 배양 중에 연속적 또는 순차적으로 첨가하지만, 연속식 배양과 달리, 배양액을 연속적으로 배출시키지 않는 배양 프로세스이다.
성장 제한 영양 기질을 배양물에 공급하는 것에 기초하는 유가식 프로세스가 구체적으로 바람직하다. 단일 유가식 또는 반복 유가식 발효를 포함하는 유가식 전략은 생물반응기에서 높은 세포 밀도에 도달하기 위해 바이오-산업 프로세스에서 전형적으로 사용된다. 탄소 기질의 조절된 첨가는 배양물의 성장 속도에 직접 영향을 미치고, 오버플로 대사 또는 불필요한 대사 부산물의 형성을 회피하는 역할을 한다. 탄소원 제한 조건하에, 탄소원은 구체적으로 유가식 프로세스의 공급물에 함유될 수 있다. 이에 의해, 탄소 기질은 제한 양으로 제공된다.
또한, 본원에 기재된 케모스태트 또는 연속 배양물에서, 성장 속도는 엄밀하게 제한될 수 있다.
탄소원의 "제한된 양"은, 성장-제한 조건하, 예를 들면, 생산 단계 또는 생산 방식에서 생산 세포주를 유지하는데 필요한 탄소원의 양으로서 본원에서 이해된다. 이러한 제한된 양은 유가식 프로세스에서 사용될 수 있고, 여기서 탄소원은 공급 배지에 함유되고, 생물량을 낮은 비성장 속도로 유지하면서, 예를 들면, POI를 생성하기 위해 지속된 에너지 전달을 위해 낮은 공급 속도로 배양물에 공급된다. 공급 배지는 전형적으로 세포 배양물의 생산 단계 중에 발효 브로쓰에 첨가된다.
탄소원의 제한된 양은, 예를 들면, 표준 (탄수화물) 검정으로 측정되는 소정 역치 미만 또는 검출 한계 미만인, 세포 배양 브로쓰에서 탄소원의 잔존량에 의해 측정될 수 있다. 잔존량은 전형적으로 발효 생성물의 수거시에 발효 브로쓰에서 측정될 것이다.
탄소원의 제한된 양은, 시간당 계산된 평균 양을 측정하기 위해, 예를 들면, 배양 시간당, 전체 배양 프로세스에 걸쳐, 예를 들면, 유가식 단계에 첨가된 양으로 측정되는 바와 같이, 발효기에 탄소원의 평균 공급 속도를 정의함으로써 또한 측정될 수 있다. 이러한 평균 공급 속도는 세포 배양물에 의한 보충 탄소원의 완전 사용을 보장하기 위해 낮게, 예를 들면, 0.6g L-1h-1(초기 발효 용적 L 및 시간 h당 탄소원 g) 내지 25g L-1h-1, 바람직하게는 1.6g L-1h-1 및 20g L-1h-1로 유지된다.
탄소원의 제한된 양은 또한 비성장 속도를 측정함으로써 결정될 수 있고, 비성장 속도는 생산 단계 중에 낮게, 예를 들면, 최대 비성장 속도보다 낮게, 예를 들면, 소정 범위 이내, 예를 들면, 0.001h-1 내지 0.20h-1, 또는 0.02h-1 내지 0.20h-1, 바람직하게는 0.02h-1 내지 0.15h-1의 범위로 유지된다.
진핵 세포 배양물에 적합하게 사용된 임의 종류의 유기 탄소가 사용될 수 있다. 특정 실시형태에 따라, 탄소원은 글루코즈, 프럭토즈, 갈락토즈 또는 만노즈 등의 헥소즈, 사카로즈 등의 이당류, 글리세롤 또는 에탄올 등의 알콜 또는 이들의 혼합물이다.
특히 바람직한 실시형태에 따라, 기초 탄소원은 글루코즈, 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 혼합물, 및 복합 영양 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 기초 탄소원은 글리세롤이다.
추가의 특정 실시형태에 따라, 보충 탄소원은 글루코즈, 프럭토즈, 갈락토즈 및 만노즈 등의 헥소즈, 사카로즈 등의 이당류, 글리세롤 또는 에탄올 등의 알콜 또는 이들의 혼합물이다. 바람직한 실시형태에 따라, 보충 탄소원은 글루코즈이다.
구체적으로, 상기 방법은 기초 탄소원으로 글리세롤을 사용하고 보충 탄소원으로 글루코즈를 사용할 수 있다.
구체적으로, 본원에 사용된 공급 배지는 화학적으로 정의되고 메탄올을 함유하지 않는다.
세포 배양 배지, 예를 들면, 유가식 프로세스에서 최소 배지 또는 공급 배지와 관련하여 용어 "화학적으로 정의된" 또는 "정의된"은, 모든 화학 성분 및 (폴리)펩티드이 공지되어 있는 생산 세포주의 시험관내 세포 배양에 적합한 배양 배지를 의미해야 한다. 전형적으로, 화학적으로 정의된 배지는 동물 유래 성분을 전혀 함유하지 않고, 순수한 및 일정한 세포 배양 환경을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "세포주"는 장기간에 걸쳐 증식하는 능력을 획득한 특정 세포형의 확립된 클론을 지칭한다. 용어 "숙주 세포주"는 이러한 폴리펩티드에 의해 매개된 폴리펩티드 또는 세포 대사물질을 생산하기 위해 대사 경로의 내인성 또는 재조합 유전자 또는 생성물을 발현시키기 위해 사용되는 세포주를 지칭한다. "생산 숙주 세포주" 또는 "생산 세포주"는 POI 등의 생산 프로세스의 생성물을 수득하기 위해 생물반응기에서의 배양에 사용 준비가 된 세포주인 것으로 통상 이해된다. 용어 "진핵 숙주" 또는 "진핵 세포주"는, POI 또는 숙주 세포 대사물질을 생성하기 위해 배양될 수 있는 임의의 진핵 세포 또는 생물을 의미해야 한다. 당해 용어는 인간을 포함하지 않는 것이 잘 이해된다.
본 발명의 특히 바람직한 진핵 숙주 세포에 따라, 세포 또는 세포주는 포유동물, 곤충, 효모, 사상균 및 식물 세포주, 바람직하게는 효모로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
구체적으로 바람직한 효모는 피키아(Pichia), 칸디다(Candida), 토룰롭시스(Torulopsis), 아르술라(Arxula), 헨세눌라(Hensenula), 야로위아(Yarrowia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 코마가타엘라(Komagataella), 바람직하게는 메틸로트로픽 효모로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특히 바람직한 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris), 케이. 파피이(K. phaffii) 또는 케이 슈도파스토리스(K. pseudopastoris)이다.
숙주 세포주와 관련하여 용어 "세포 배양물" 또는 "배양"(또한 "발효"로 명명됨)은 세포의 성장, 분화 또는 지속적 생존률(활성 또는 정지 상태에서)에 유리한 조건하에서 인공, 예를 들면, 시험관내 환경, 특히 당해 산업계에 공지된 방법에 따라 조절된 생물반응기에서 세포의 유지를 의미한다.
본 발명의 배양 배지를 사용하여 세포 배양물을 배양하는 경우, 세포 배양물은 세포 배양물의 배양을 지지하기에 적합한 조건하에 배양 용기 중의 배지 또는 기질과 접촉시킨다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 배양 배지는 당해 기술분야에 공지되어 있는 표준 세포 배양 기술에 따라 세포를 배양하기 위해 사용된다. 본 발명의 다양한 양상에서, 진핵 세포, 특히 효모 또는 사상균의 성장에 사용될 수 있는 배양 배지가 제공된다.
세포 배양 배지는 조절된, 인공 및 시험관내 환경에서 세포를 유지하고 성장시키는데 필요한 영양소를 제공한다. 세포 배양 배지의 특징 및 조성은 특정 세포 요건에 의존하여 변화한다. 중요한 파라미터는 삼투압, pH 및 영양소 제형을 포함한다. 영양소의 공급은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 연속 또는 불연속 모드로 수행할 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 배양 배지는 재조합 단백질의 생산에 특히 유용하다.
배치식 프로세스는 세포의 배양에 필요한 모든 영양소가 발효 중에 추가 영양소의 추가 공급 없이 초기 배양 배지에 함유되는 배양 모드인 반면, 유가식 프로세스에서는, 배치 단계 후에, 하나 이상의 영양소가 공급에 의해 배양물에 공급되는 공급 단계를 실시한다. 영양소 공급의 목적은 재조합 단백질의 양을 또한 증가시키기 위해 생물량의 양을 증가시키는 것이다. 대부분의 배양 프로세스에서, 공급 모드는 결정적이고 중요하지만, 본 발명의 프로모터를 사용하는 본 발명은 특정 배양 모드와 관련하여 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 유가식 프로세스이다. 구체적으로, 목적 재조합 POI를 코딩하는 핵산 작제물로 형질전환된 숙주 세포는 성장 단계 배지에서 배양되고, 목적 재조합 POI를 생산하기 위해 생산 단계 배지로 이행한다.
공급 배지는 액체 형태 또는 또 다른 형태, 예를 들면, 고체, 예를 들면, 정제 또는 기타 지속 방출 수단, 또는 가스, 예를 들면, 이산화탄소로서 배양 배지에 첨가될 수 있다. 또한, 바람직한 실시형태에 따라, 세포 배양 배지에 첨가된 보충 탄소원의 제한된 양은 심지어 0일 수 있다. 바람직하게는, 제한된 탄소 기질의 조건하에, 배양 배지 중의 보충 탄소원의 농도는, 적합한 표준 검정으로 측정, 예를 들면, 성장 세포 배양물에 의한 소비시 배양 배지 중의 잔류 농도로서 결정되는 바와 같이, 0 내지 1g/L, 바람직하게는 0.6g/L 미만, 보다 바람직하게는 0.3g/L 미만, 보다 바람직하게는 0.1g/L 미만, 바람직하게는 1 내지 50mg/L, 보다 바람직하게는 1 내지 10mg/L, 특히 바람직하게는 1mg/L 이하이다.
바람직한 방법에서, 탄소원의 제한된 양은 생산 단계의 말기 또는 발효 프로세스의 산출, 바람직하게는 발효 생성물의 수거시에 발효 브로쓰에서 결정되는 검출 한계 미만인 세포 배양물 중의 잔존량을 제공한다.
바람직하게는, 보충 탄소원의 제한된 양은, 0.001h-1 내지 0.20h-1, 또는 0.02h-1 내지 0.20h-1, 바람직하게는 0.02h-1 내지 0.15h-1의 범위와 같이 최대 비성장 속도보다 낮은 비성장 속도를 유지하기 위해 성장이 제한되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 숙주 세포는 연속 모드, 예를 들면, 케모스타트로 배양된다. 연속 발효 프로세스는 생물반응기 내로 신선한 배양 배지의 공급의 정의된 일정한 연속 공급 속도를 특징으로 하고, 이에 의해 배양 브로쓰는 동일한 정의된 일정한 연속 제거 속도로 생물반응기로부터 동시에 제거된다. 배양 배지, 공급 속도 및 제거 속도를 동일한 일정한 수준에서 유지함으로써, 생물반응기 중의 배양 파라미터 및 조건이 일정하게 유지된다.
본원에 기재된 안정한 세포 배양물은 구체적으로는 유전자 특성을 유지하고, 구체적으로 POI 생산 수준을 높게, 예를 들면, 약 20세대 배양 후, 바람직하게는 적어도 30세대 배양 후, 보다 바람직하게는 적어도 40세대, 가장 바람직하게는 적어도 50세대 배양 후, 적어도 ㎍ 수준으로 유지하는 세포 배양물을 지칭하는 것으로 이해된다. 구체적으로, 산업적 규모의 생산에 사용되는 경우, 거대한 이점이 있는 것으로 간주되는 안정한 재조합 숙주 세포주가 제공된다.
본 발명의 세포 배양물은, 예를 들면, 용적 및 기술적 시스템 둘 다와 관련하여, 영양소의 공급에 기반하는 배양 모드, 특히 유가식 또는 배치식 프로세스, 또는 연속식 또는 세미-연속식 프로세스(예: 케모스타트)에서 산업적 제조 규모의 방법에 특히 유리하다.
용어 "발현" 또는 "발현 시스템" 또는 "발현 카세트"는 목적하는 코딩 서열 및 조절 서열을 작동가능한 연결로 함유하는 핵산 분자를 지칭하고, 따라서 이들 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주는 코딩된 단백질 또는 숙주 세포 대사물질을 생산할 수 있다. 형질전환을 실시하기 위해, 발현 시스템은 벡터에 포함될 수 있지만, 관련 DNA도 또한 숙주 염색체에 통합될 수 있다. 발현은 폴리펩티드 또는 대사물질을 포함하는 분비된 또는 비-분비된 발현 생성물을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 "발현 작제물" 또는 "벡터" 또는 "플라스미드"는, 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉 재조합 유전자의 전사, 및 적합한 숙주 생물에서 이들의 mRNA의 번역에 요구되는 DNA 서열로서 정의된다. 발현 벡터 또는 플라스미드는 통상 숙주 세포에서 자가 복제 기원, 선택가능한 마커(예: 아미노산 합성 유전자, 또는 제오신, 카나마이신, G418 또는 하이그로마이신 등의 항생물질에 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 터미네이터를 포함하고, 이들 성분은 함께 작동적으로 연결된다. 본원에 사용된 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 뉴클레오티드 서열을 통합한 게놈 뿐만 아니라 자가 복제 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 발현 작제물은 구체적으로 상기 프로모터의 전사 조절하에 POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터는 POI의 코딩 서열과 천연적으로 연관되지 않는다.
뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 또는 단백질과 관련하여 본원에 사용된 용어 "이종성(heterologous)"은 소정 숙주 세포에 대해 외래, 즉 천연에서 발견되지 않는 것과 같은 "외인성"이거나 소정 숙주 세포에서 천연적으로 발견되는, 즉 "내인성"인 화합물을 지칭하지만, 이종 작제물의 맥락에서, 예를 들면, 이종성 핵산을 사용한다. 내인적으로 발견되는 이종성 뉴클레오티드 서열은 또한 비천연에서, 예를 들면, 세포에서 예상되거나 천연적으로 발견되는 양보다 많은 양으로 생산될 수 있다. 이종성 뉴클레오티드 서열, 또는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 가능하게는 내인성 뉴클레오티드 서열의 서열과 상이하지만, 내인적으로 발견되는 동일한 단백질을 코딩한다. 구체적으로, 이종성 뉴클레오티드 서열은 자연에서 숙주 세포에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 것들이다. 임의의 재조합 또는 인공 뉴클레오티드 서열은 이종성인 것으로 이해된다. 이종성 폴리뉴클레오티드의 예는, 예를 들면, 하이브리드 프로모터를 수득하기 위해, 본 발명에 따른 프로모터와 천연적으로 연관되지 않거나 본원에 기재된 바와 같이 코딩 서열에 작동적으로 연결된 뉴클레오티드 서열이다. 이 결과, 하이브리드 또는 키메라 폴리뉴클레오티드가 수득될 수 있다. 이종성 화합물의 추가 예는 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 POI 코딩 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 본 발명의 프로모터이고, 내인성 천연-발생 POI 코딩 서열은 통상 작동가능하게 연결되지 않는다.
본 발명의 문맥에서 본원에 사용된 용어 "변이체"는 구체적으로는, 예를 들면, 크기 변이, 예를 들면, 신장 또는 단편화, 돌연변이, 하이브리드화(서열의 조합 포함)에 의해 또는 특정 상동성 또는 유사성 정도를 갖는, 모친 서열로부터 유래된 임의의 서열을 지칭한다.
본 발명은 구체적으로, 예를 들면, 피. 파스토리스의 야생형 프로모터 또는, 예를 들면, 야생형 또는 재조합 진핵 세포에서 특이적 유전자의 전사를 조절할 수 있는 이의 기능적 활성 변이체인 프로모터를 제공한다.
본 발명의 문맥에서 본원에 사용된 용어 "천연"은 구체적으로, 이의 환경과 천연적으로 연관되는 생물의 개개 구조 또는 성분을 지칭한다. 그러나, 천연 구조 또는 성분은 천연적으로 연관된 환경으로부터 단리되고 단리된 천연 구조 또는 성분으로 제공되는 것이 이해된다. 이러한 단리된 천연 구조 또는 성분은 또한 인공 또는 합성 기원일 수 있고, 여전히 천연 기원의 것과 동일한 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태가, 예를 들면, 단리된 형태의 천연 구조 또는 성분을 지칭하지만, 예를 들면, 단리된 핵산 서열, 아미노산 서열, 발현 벡터, 형질전환된 숙주 세포 및 재조합 단백질을 구체적으로 지칭하는 본 발명의 재료, 방법 및 용도는 "인공"이고, 따라서 "자연의 법칙"의 결과로서 간주되지 않는다.
기능적 활성 변이체 프로모터는, 돌연변이에 의해 프로모터 서열 pCS1(서열번호 1)로부터 유래할 수 있고, 따라서 "모친" 서열로서 pCS1을 사용하여 재조합 세포주에서 프로모터로서 사용하기에 적합한 서열을 생산한다. 이러한 변이체 프로모터는 소정 특성을 갖는 이들 라이브러리 구성원을 선택함으로써 돌연변이 서열의 (pCS1) 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 변이체 프로모터는 동일한 또는 심지어 개선된 특성을 가질 수 있고, 예를 들면, "성장-속도 독립적 기능"으로 본원에서 구체적으로 이해되는 높고 낮은 성장 속도에서 실질적으로 동일한 프로모터 기능 및 강도와 함께 POI 생산을 뒷받침하기 위해 프로모터 강도가 개선될 수 있다.
변이체 프로모터는, 예를 들면, 피키아 파스토리스 이외의 진핵생물 종 또는 케이. 락티스(K. lactis), 제트. 로우시(Z. rouxii), 피. 스티피티스(P. stipitis), 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha) 등의 피키아 이외의 속의 자가 서열로부터 유래할 수 있다. 구체적으로, 상응하는 피. 파스토리스 유전자와 천연적으로 연관된 자가 프로모터 서열은 이의 기능적 활성 변이체를 생산하기 위해 자체로 또는 모친 서열로서 사용될 수 있다. 구체적으로, pCS1와 유사한 프로모터는 CS1과 유사한 유전자와 천연적으로 연관되는 것을 특징으로 한다(서열번호 9 또는 11의 아미노산 서열 참조). 이러한 유사한 프로모터 서열 또는 이의 기능적 활성 변이체의 특성은 표준 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 뉴클레오티드 또는 프로모터 서열의 "기능적 활성" 변이체는 구체적으로, 예를 들면, 서열 내에 또는 당해 서열의 원위 말단의 어느 하나 또는 둘 다에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 모친 서열의 변형으로부터 발생하는 돌연변이 서열을 의미하고, 이러한 변형은 이러한 서열의 활성에 영향(특히 손상)을 미치지 않는다.
구체적으로, 본 발명에 따르는 프로모터 서열의 기능적 활성 변이체는
- 모친 서열과 적어도 약 60% 뉴클레오티드 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 정도의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 상동체; 및/또는
- pCS1의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 크기 변이체의 서열 등의 모친 뉴클레오티드 서열을, 바람직하게는 80bp 내지 1500bp 또는 200bp 내지 1500bp 또는 234bp 내지 1488bp, 바람직하게는 적어도 100bp, 적어도 200bp, 바람직하게는 적어도 300bp, 보다 바람직하게는 적어도 400bp, 적어도 500bp, 적어도 600bp, 적어도 700bp, 적어도 800bp, 적어도 900bp 또는 적어도 1000bp의 뉴클레오티드 서열을 갖는(즉 포함하거나 이루어지는), 서열 내에서 또는 상기 서열의 원위 말단의 어느 하나 또는 둘 다에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형시킴으로써 수득할 수 있는 상동체; 및
- 피키아 파스토리스 이외의 다른 종으로부터 유래하는 유사체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
구체적으로 바람직한 기능적 활성 변이체는 적어도 80bp, 바람직하게는 적어도 100bp, 바람직하게는 적어도 200bp, 바람직하게는 적어도 250bp, 바람직하게는 적어도 300bp, 보다 바람직하게는 적어도 400bp, 적어도 500bp, 적어도 600bp, 적어도 700bp, 적어도 800bp, 적어도 900bp, 또는 적어도 1000bp, 바람직하게는 최대 1500bp의 뉴클레오티드 서열을 갖는(즉, 포함하거나 이루어지는), 프로모터 서열의 변형, 신장 및/또는 단편에 의해 본 발명에 따르는 프로모터로부터 유래하는 것들이다.
본원에 기재된 모친 프로모터 서열의 기능적 활성 단편은 구체적으로 돌연변이유발 방법을 통해 수득할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용된 용어 "돌연변이유발"은, 예를 들면, 비-코딩 또는 코딩 영역에 적어도 하나의 변화를 갖는 이의 변이체를 수득하도록 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 및/또는 치환을 통해 뉴클레오티드 서열의 돌연변이를 제공하는 방법을 지칭한다. 돌연변이유발은 랜덤, 세미-랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이를 통한 것일 수 있다. 전형적으로, 거대 랜덤화 유전자 라이브러리는, 구체적으로 목적하는 유전자형 또는 표현형에 따라 선택될 수 있는 높은 유전자 다양성으로 생산될 수 있다.
본 발명에 따르는 프로모터의 일부 바람직한 기능적 활성 변이체는 pCS1의 크기 변이체 또는 구체적으로는 단편, 바람직하게는 프로모터 뉴클레오티드 서열의 3' 말단을 포함하는 것들, 예를 들면, 3' 말단으로부터 5' 말단까지의 소정 범위, 예를 들면, 적어도 80bp, 바람직하게는 적어도 100bp, 바람직하게는 적어도 200bp, 바람직하게는 적어도 300bp, 보다 바람직하게는 적어도 400bp, 적어도 500bp, 적어도 600bp, 적어도 700bp, 적어도 800bp, 적어도 900bp 또는 적어도 1000bp의 뉴클레오티드 서열의 길이를 갖는 특정 길이를 수득하기 위해, 5' 말단 영역의 특정 길이 및 삽입 또는 결실, 예를 들면, 5' 말단에서 뉴클레오티드 서열의 신장 또는 컷-오프를 갖는 프로모터 뉴클레오티드 서열 중의 하나로부터 유래하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단을 포함하는 것들이다.
본 발명의 신장된 크기 변이체는 바람직하게는 pCS1 서열의 5' 말단에 하나 이상의 추가의 뉴클레오티드(들), 예를 들면, 세포 기원에서 야생형 pCS1 서열과 천연적으로 연관되는 것들을 포함한다.
예를 들면, pCS1의 기능적 활성 변이체는 pCS1a(서열번호 2), pCS1b(서열번호 3), pCS1c(서열번호 4), pCS1d(서열번호 5), pCS1e(서열번호 6), pCS1f(서열번호 7) 및 pCS1g(서열번호 8)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 따라서 80 내지 1500bp 범위의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, pCS1의 기능적 활성 변이체는 pCS1a(서열번호 2), pCS1b(서열번호 3), pCS1c(서열번호 4), pCS1d(서열번호 5) 및 pCS1e(서열번호 6)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
본 발명의 기능적 활성 변이체는 또한, 예를 들면, pCS1 또는 이의 기능적 활성 단편으로서 자격을 갖는 하나 이상의 임의의 서열, 예를 들면, 적어도 2개의 이러한 모친 서열, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 모친 서열의 조합, 예를 들면, pCS1a, pCS1b, pCS1c, pCS1d, pCS1e, pCS1f 및 pCS1g로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 바람직하게는 pCS1a, pCS1b, pCS1c, pCS1d 및 pCS1e로 이루어진 그룹으로부터 선택된 pCS1 신장된 서열 또는 단편의 2개 이상의 조합으로부터 발생하는, pCS1의 하이브리드 또는 이의 임의의 기능적 활성 변이체, 특히 임의의 모친 크기 변이체 또는 단편 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 또 다른 실시형태에서, 하이브리드는 pCS1 또는 이의 임의의 기능적 활성 변이체, 특히 크기 변이체 또는 단편 서열 및, 예를 들면, 피. 파스토리스에서 pCS1 서열과 천연적으로 연관되지 않는 이종성 서열로부터 선택된 적어도 하나의 서열로 구성된다.
본 발명의 프로모터의 기능적 활성 변이체는 추가로 엄격한 조건하에 pCS1 프로모터 또는 이의 임의의 기능적 활성 크기 변이체 또는 단편, 돌연변이체 또는 하이브리드 핵산 서열과 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "하이브리드화" 또는 "하이브리드화하는"은 적절한 조건하에 이중 가닥을 형성하도록 2개의 핵산 서열이 안정한 특정의 수소 결합으로 서로 어닐링하는 프로세스를 의미하는 것으로 의도된다. 2개의 상보성 서열 또는 충분한 상보성 서열 사이의 하이브리드화는 사용되는 작동 조건 및 특히 엄격성(stringency)에 의존한다. 엄격성은 상동성 정도를 의미하는 것으로 이해될 수 있고, 엄격성이 보다 높으면, 서열 사이의 상동성 퍼센트가 보다 높다. 엄격성은 특히 2개 핵산 서열의 염기 조성 및/또는 이들 2개 핵산 서열 사이의 부정합 정도에 의해 정의될 수 있다. 조건, 예를 들면, 염 농도 및 온도를 변경함으로써, 소정 핵산 서열은 단지 이의 정확한 상보체(높은 엄격성)와 하이브리드화하거나 임의의 관련 서열(낮은 엄격성)과 하이브리드화시킬 수 있다. 온도의 증가 또는 염 농도의 감소는 하이브리드화 반응의 선택성을 증가시키는 경향이 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 문구 "엄격한 하이브리드화 조건하에 하이브리드화하는"은 바람직하게는 특정한 엄격성의 조건하에 하이브리드화하는 것을 지칭하는 것으로 이해된다. 바람직한 실시형태에서, "엄격한 하이브리드화 조건"은 2개의 핵산 서열의 상동성이 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%인 조건, 즉 이러한 하이브리드화 중에 수득된 이중 가닥이 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%의 A-T 결합 및 C-G 결합인 경우에만 가능한 조건이다.
엄격성은 반응 파라미터, 예를 들면, 하이브리드화 용액에 존재하는 이온 종의 농도 및 종류, 변성제의 성질 및 농도 및/또는 하이브리드화 온도에 의존할 수 있다. 적절한 조건은, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989]에 기재된 바와 같이 당해 기술분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 기능적 활성 변이체는 구체적으로 pCS1과 실질적으로 동일한 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본원에서 사용된 용어 "실질적으로 동일한 활성"은 구체적으로는 실질적으로 동일하거나 개선된 프로모터 강도, 구체적으로는 프로모터의 발현 및 전사 강도 및, 구체적으로는 숙주 세포의 성장 속도와 독립적으로 결정되는 프로모터 강도와 관련하여 이의 실질적으로 동일하거나 개선된 특징, 예를 들면, pCS1와 실질적으로 동일한 발현 또는 전사 강도, 예를 들면, +/- 20% 또는 +/- 10% 및/또는 숙주 세포의 천연 pGAP 프로모터보다 높은, 예를 들면, 동일한 숙주 세포 종류, 동일한 배양 조건 및 POI 등의 발현 생성물을 코딩하는 동일한 핵산을 사용하는 적합한 시험 시스템에서 측정할 때, pGAP 프로모터 강도와 비교하여 적어도 1.1배 증가, 또는 적어도 1.2배 증가, 바람직하게는 적어도 1.3배 증가, 바람직하게는 적어도 1.4배 증가, 바람직하게는 적어도 1.5배 증가, 바람직하게는 적어도 1.6배, 바람직하게는 적어도 1.7배, 바람직하게는 적어도 1.8배, 바람직하게는 적어도 1.9배 및 바람직하게는 적어도 2배 증가 또는 그 이상, 예를 들면, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배 또는 적어도 최대 15배 활성에 의해 나타나는 바와 같은 활성을 지칭한다.
용어 "상동성"은 2개 이상의 뉴클레오티드 서열이 상응하는 위치에서 특정 정도, 100%에 근접한 정도까지 동일하거나 보존된 염기 쌍을 갖는 것을 나타낸다. 본 발명의 상동성 서열은 전형적으로 적어도 약 60% 뉴클레오티드 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 70% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
본 발명에 따르는 상동성 프로모터 서열은 바람직하게는 뉴클레오티드 서열의 적어도 특정 부분, 예를 들면, 각각의 프로모터 뉴클레오티드 서열의 3' 영역을 포함하는 부분, 바람직하게는 각각의 프로모터 뉴클레오티드 서열의 3' 말단까지의 특정 길이를 갖는 부분, 예를 들면, 80bp 내지 1500bp, 바람직하게는 200bp 내지 1500bp, 보다 바람직하게는 234 내지 1488bp; 바람직하게는 적어도 100bp, 바람직하게는 적어도 200bp, 바람직하게는 적어도 300bp, 보다 바람직하게는 적어도 400bp, 적어도 500bp, 적어도 600bp, 적어도 700bp, 적어도 800bp, 적어도 900bp, 또는 적어도 1000bp의 길이를 갖는 부분에서 피.파스토리스의 임의의 pCS1, pCS1a, pCS1b, pCS1c, pCS1d, pCS1e, pCS1f 및 pCS1g 프로모터 뉴클레오티드 서열, 및 피키아 파스토리스 이외의 종으로부터 유래하는 유사체와 특정의 상동성을 갖는다. 구체적으로, 적어도 이들 부분은 바람직하게는 각각의 프로모터 뉴클레오티드 서열의 3' 말단 서열을 포함하여 300 내지 1000bp 범위 내에서 상동성이다.
유사한 서열은 전형적으로 다른 종 또는 균주로부터 유래한다. 이는 피키아 파스토리스 이외의 종으로부터 유래하는 본 발명의 임의의 유사한 프로모터 서열이 상동성 서열, 즉 본원에 기재된 특정 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있음이 명백하게 이해된다. 따라서, 용어 "상동성"은 또한 유사한 서열을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명은 또한 특정 상동성을 포함하는 유사한 서열 및 이의 상동체를 지칭한다.
유전자의 뉴클레오티드 서열과 관련하여 "퍼센트(%) 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 및 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고서, 서열 정렬 및 갭 도입 후에 DNA 서열 중의 뉴클레오티드 서열과 동일한 후보 DNA 서열 중의 뉴클레오티드 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 뉴클레오티드 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은, 예를 들면, 공공적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당해 기술분야의 숙련가의 범위 내에 있는 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하는 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
핵산, POI 또는 기타 화합물과 관련하여 본원에 사용된 용어 "단리된" 또는 "단리"는, "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록, 천연적으로 연관될 수 있는 환경으로부터 충분히 분리된 이러한 화합물을 지칭한다. "단리된"은 반드시 다른 화합물 또는 물질과의 인공 또는 합성 혼합물의 배제, 또는 기초 활성을 간섭하지 않고, 예를 들면, 불완전한 정제에 기인하여 존재할 수도 있는 불순물의 존재를 반드시 의미하는 것은 아니다. 특히, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 또한 화학적으로 합성된 것들을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 핵산과 관련하여, 용어 "단리된 핵산" 또는 "단리된 핵산 서열"이 종종 사용된다. 이 용어는, DNA에 적용되는 경우, 이것이 기원하는 생물의 천연 발생 게놈에서 직접 인접하고 있는 서열로부터 분리되는 DNA 분자를 지칭한다. 예를 들면, "단리된 핵산"은 벡터, 예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로 삽입되거나 원핵 또는 진핵 세포 또는 숙주 생물의 게놈 DNA 내로 통합된 DNA 분자를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따르는 용어 "단리된 핵산"은 pCS1 서열이 CS1 단백질을 코딩하는 핵산에 연결되어 있는 것을 제외한다. "단리된 핵산"(DNA 또는 RNA 중의 어느 하나)은 추가로, 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접 생산되고 이의 생산 동안 존재하는 기타 성분으로부터 분리된 분자를 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 용어 "작동적으로 연결된"은, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 기능이 상기 핵산 분자 상에 존재하는 적어도 하나의 다른 뉴클레오티드 서열에 의해 영향을 받는 방식으로, 단일 핵산 분자, 예를 들면, 벡터 상의 뉴클레오티드 서열의 연관성을 지칭한다. 예를 들면, 프로모터는, 당해 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우, 재조합 유전자의 코딩 서열과 작동적으로 연결된다. 추가의 예로서, 단일 펩티드를 코딩하는 핵산은, 성숙 단백질의 모체 또는 성숙 단백질 등과 같이 단백질을 분비된 형태로 발현시킬 수 있는 경우, POI를 코딩하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된다. 구체적으로, 서로 작동적으로 연결된 이러한 핵산은 신호 펩티드를 코딩하는 핵산과 POI를 코딩하는 핵산 서열 사이에 추가 요소 또는 핵산 서열 없이 직접 연결될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 프로모터 활성은 이의 전사 효율에 의해 평가될 수 있다. 이는 프로모터로부터 mRNA 전사의 양을 측정함으로써 노던 블롯팅에 의해 직접 결정될 수 있거나, 예를 들면, 프로모터로부터 발현된 유전자 생성물의 양을 측정함으로써 간접적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 프로모터는 구체적으로 개시, 조절, 또는 그렇지 않으면 코딩 DNA의 발현을 매개 또는 제어한다.
본 발명의 프로모터는 구체적으로는 구성 프로모터, 즉 유도 필요성 또는 제어 가능성 없이 발현을 조절하는 프로모터로서 이해된다. 따라서, 특정 수준에서 연속 및 안정한 발현이 있다. 숙주 세포의 모든 성장 단계 또는 성장 속도에서 높은 프로모터 강도의 고유한 기능 때문에, 본 발명의 구성 프로모터는 숙주 세포주의 유가식 배양에 특히 유용하다. 종래 기술의 구성 프로모터는 성장-제한 조건, 예를 들면, 유가식 프로세스에서 낮은 강도의 단점을 갖거나, 숙주 세포가 높은 성장 속도, 예를 들면, 중기 대수기에서 유지되는 실시형태에서 사용되었다.
본 발명의 프로모터 강도는 구체적으로 높거나 낮은 빈도로 당해 프로모터에서 발생하는 전사 개시의 효율에 의해 나타낸 이의 전사 강도를 지칭한다. 전사 강도가 보다 높으면, 당해 프로모터에서 보다 많은 빈도의 전사가 발생할 것이다. 프로모터 강도는, 소정 mRNA 서열이 종종 전사되는 방법을 결정하여, 다른 유전자에 비해 일부 유전자의 전사를 위해 높은 우선도를 효과적으로 제공함으로써 보다 높은 전사 농도를 유도하기 때문에 중요하다. 대량으로 요구되는 단백질을 코딩하는 유전자는, 예를 들면, 전형적으로 비교적 강력한 프로모터를 갖는다. RNA 폴리머라제는 한번에 하나의 전사 작업을 수행할 수 있기 때문에, 이의 작업이 효율적으로 되도록 우선순위를 부여해야 한다. 프로모터 강도의 차이는 이러한 우선순위 부여를 가능하게 하도록 선택된다. 본 발명에 따라, 프로모터는, 숙주 세포의 대사 또는 성장 속도와 독립적으로, 예를 들면, 세포 배양의 높은 및 낮은 성장 속도의 단계에서 및 구체적으로는 탄소원과 독립적으로 비교적 강력하여, 구체적으로는 일정한 수준에서 대략 최대 활성 상태를 나타낸다.
상대 강도는 숙주 세포로서 사용된 세포의 개개 pGAP 프로모터 등의 표준 프로모터와 관련하여 통상 결정된다.
전사의 빈도는 일반적으로, 예를 들면, 적합한 검정, 예를 들면, RT-PCR 또는 노던 블롯팅에서 전사의 양에 의해 결정되는 바와 같이, 전사 속도로서 이해된다. 목적 유전자를 발현시키기 위한 프로모터의 강도는 통상 발현 수준 또는 높은 발현 수준/속도를 지지하는 능력으로 이해된다. 예를 들면, 본 발명의 프로모터의 발현 및/또는 전사 강도는 피. 파스토리스인 숙주 세포에서 결정되고, 피. 파스토리스의 천연 pGAP 프로모터와 비교된다.
전사 속도는 마이크로어레이 상에서의 전사 강도 또는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)로 결정될 수 있고, 여기서 마이크로어레이 또는 qRT-PCR 데이터는, 높은 성장 속도에서의 조건과 낮은 성장 속도에서의 조건, 또는 상이한 배지 조성을 사용한 조건 사이의 발현 수준의 차이, 및 천연 pGAP 프로모터와 비교되는 높은 신호 강도를 나타낸다. 적합한 시험 시스템은 하기 실시예 11에 구체적으로 기재되어 있다.
본 발명의 프로모터는 숙주 세포에서 천연 pGAP 프로모터(종종 "상동성 pGAP 프로모터"로 불리움)와 비교하여 적어도 110%의 전사 속도 또는 전사 강도에 의해 반영되는 비교적 높은 전사 강도를 나타낸다. 바람직하게는, 전사 속도 또는 강도는, 예를 들면, 탄소 기질 농후 조건(예: 배치식 배양) 또는 탄소 기질 제한 조건(예: 케모스타트 또는 유가식 배양)하에 결정되는 것과 같이, POI 생산용 숙주 세포로서 선택된 진핵 세포에서 결정된 바와 같이, 천연 pGAP 프로모터와 비교하여, 적어도 110%, 바람직하게는 적어도 120%, 또는 적어도 130%, 특히 바람직한 경우에 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배 또는 적어도 약 15배 또는 심지어 이보다 높다.
바람직하게는, 전사 분석은 바람직하게는 qRT-PCR, DNA 마이크로어레이, RNA 서열분석 및 전사체 분석을 사용하여 정량적 또는 반-정량적이다.
발현 속도는, 예를 들면, 하기 실시예 부분에 기재된 바와 같이, eGFP 등의 리포터 유전자의 발현 양에 의해 결정될 수 있고, 시험 시스템은 실시예 10에 구체적으로 기재되어 있다. pCS1 프로모터는, 용액에서 클론을 배양할 때, 천연 pGAP 프로모터와 비교하여 적어도 110%의 비교적 높은 전사 속도를 갖는다.
본 발명의 프로모터는 목적 유전자의 발현 수준에 의해 반영되는 비교적 높은 발현 강도를 나타내고, 이는 종종 "상동성 pGAP 프로모터"로 불리는 숙주 세포에서 천연 pGAP 프로모터와 비교하여 적어도 110%이다. 바람직한 발현 강도는, 예를 들면, 탄소 기질 농후 조건(예: 배치식 배양) 또는 탄소 기질 제한 조건(예: 케모스타트 또는 유가식 배양)하에 결정되는 것과 같이, POI 생산용 숙주 세포로서 선택된 진핵 세포에서 결정된 바와 같이, 천연 pGAP 프로모터와 비교하여, 적어도 110%, 바람직하게는 적어도 120%, 또는 적어도 130%, 특히 바람직한 경우에 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배 또는 적어도 약 15배 또는 심지어 이보다 높다.
천연 pGAP 프로모터는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)를 코딩하는 gap 유전자의 발현을 개시하고, 이는 대부분의 살아있는 생물에 존재하는 구성 프로모터이다. GAPDH(EC 1＼2＼1＼12), 해당 및 당신생의 주요 효소는 동화 및 이화 탄수화물 대사에 중요한 역할을 담당한다. 따라서, pGAP 프로모터는, 구성(예를 들면, 특정 탄소원을 공급함으로써 유도할 수 없음) 프로모터인 것으로 이해되어도, 성장 속도의 증가와 함께 프로모터 강도 증가를 나타내는 대사 프로모터이다. 따라서, pGAP 프로모터는 낮은 성장 속도를 특징으로 하는 단계에서 숙주 세포주의 배양 중에 효율적 생산 프로세스에 거의 적합하지 않다.
대조적으로, 본 발명의 프로모터는 놀랍게도 숙주 세포 배양의 모든 성장 단계에서 일정하게 높은 전사 수준으로 이의 프로모터 강도를 (기본적으로) 유지한다.
천연 pGAP 프로모터는 구체적으로, 비변형된(비-재조합) 또는 재조합 진핵 세포를 포함하여, 동일한 종 또는 균주의 천연 진핵 세포와 유사한 방식으로 재조합 진핵 세포에서 활성적이다. 이러한 천연 pGAP 프로모터는 내인성 프로모터, 따라서 진핵 세포에 상동성인 것으로 이해되고, 비교 목적을 위한 표준 또는 참조 프로모터로서 사용된다.
예를 들면, 피. 파스토리스의 천연 pGAP 프로모터는, 예를 들면, 도 3에 제시된 서열: 피. 파스토리스의 천연 pGAP 프로모터 서열(GS115)(서열번호 13)을 갖는 피. 파스토리스에서 GAPDH의 발현을 조절하기 위해 사용된 바와 같이, 비변형된 내인성 프로모터 서열이다. 피. 파스토리스가 본 발명에 따르는 POI 생산용 숙주로서 사용되는 경우, 본 발명에 따르는 프로모터의 전사 강도 또는 속도는 피. 파스토리스의 이러한 천연 pGAP 프로모터와 비교된다.
또 다른 예로서, 에스, 세레비지아에의 천연 pGAP 프로모터는, 에스. 세레비지아에에서 GAPDH의 발현을 조절하기 위해 사용된 바와 같이 에스. 세레비지아에 중의 비변형된 내인성 프로모터 서열이다. 에스. 세레비지아에가 본 발명에 따르는 POI 생산용 숙주로서 사용되는 경우, 본 발명에 따르는 프로모터의 전사 강도 또는 속도는 에스. 세레비지아에의 이러한 천연 pGAP 프로모터와 비교된다.
따라서, 본 발명에 따르는 프로모터의 상대 발현 또는 전사 강도는 통상적으로 POI 생산용 숙주로서 사용되는 동일한 종 또는 균주의 세포의 천연 pGAP 프로모터와 비교된다.
구체적으로, 본 발명의 프로모터는 바람직하게는, 예를 들면, 농후한 해당 효소 또는 당신생 효소, 세포내 프로테아제 또는 숙주 세포로부터 분리되는 프로테아제 등의 리보솜 단백질 또는 효소를 코딩하는 유전자에 자연히 작동적으로 연결된 프로모터 등의 대사 프로모터가 아니다.
pCS1의 발현 강도 또는 전사 강도를 적어도 갖는 본 발명의 프로모터가 특히 바람직하다. pGAP 프로모터를 참조로서 사용하는 비교용 프로모터 강도는, 예를 들면, 세포 배양물에서 마이크로어레이, 노던 블롯, RNA 서열분석 또는 qRT-PCR 등을 사용하여 발현 생성물의 양 또는 전사체의 양을 측정함으로써, 예를 들면, 재조합 세포에서 각각의 유전자 발현 생성물의 양을 측정함으로써 표준 수단으로 결정할 수 있다. 예시적 시험은 실시예 부분에 설명되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "목적 단백질(POI)"은 숙주 세포에서 재조합 기술에 의해 생산되는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 더욱 구체적으로는, 단백질은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리펩티드(즉, 이종성 단백질)일 수 있거나, 숙주 세포에 대해 천연적일 수 있지만(즉, 숙주 세포에 대해 상동성 단백질), 예를 들면, POI를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 자가 복제 벡터를 사용한 형질전환에 의해, 또는 숙주 세포의 게놈 내로 POI를 인코딩하는 핵산 서열의 하나 이상의 카피의 재조합 기술에 의한 통합으로, 또는, 예를 들면, 프로모터 서열의 POI를 인코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열의 재조합 변형에 의해 생산된다. 몇몇 경우, 본원에 사용된 용어 POI는 재조합에 의해 발현된 단백질에 의해 매개된 바와 같은 숙주 세포에 의한 임의의 대사 생성물을 지칭한다.
특정의 실시형태에 따라, 용어 POI는, 특히 본 발명의 프로모터가 이러한 CS1 단백질을 코딩하는 임의의 핵산 서열과 자연적으로 연관되는 경우, 예를 들면, 도 2의 임의의 아미노산 서열을 특징으로 하는 피키아 파스토리스의 CS1 단백질을 제외한다.
구체적으로, 본원에 기재된 POI는 진핵생물 단백질, 바람직하게는 포유동물 단백질, 구체적으로 숙주 세포와 이종성인 단백질이다.
본 발명에 따라 생산된 POI는 다량체성 단백질, 바람직하게는 이량체 또는 사량체일 수 있다.
본 발명의 한 가지 양상에 따라, POI는 바람직하게는 항체 또는 이의 단편, 효소 및 펩티드, 단백질 항생물질, 독소 융합 단백질, 탄수화물-단백질 접합체, 구조 단백질, 조절 단백질, 백신 및 백신 유사 단백질 또는 입자, 프로세스 효소, 성장 인자, 호르몬 및 사이토킨 또는 POI의 대사물질을 포함하는 치료 단백질로부터 선택되는 재조합 또는 이종성 단백질이다.
특정의 POI는 항체 또는 이의 단편 등의 항원 결합 분자이다. 특정의 POI 중에는 모노클로날 항체(mAb), 면역글로불린(Ig) 또는 면역글로불린 부류 G(IgG), 중쇄 항체(HcAb'), 또는 이의 단편, 예를 들면, 단편-항원 결합(Fab), Fd, 단일-쇄 가변 단편(scFv) 또는 이의 조작된 변이체, 예를 들면, Fv 이량체(디아바디), Fv 삼량체(트리아바디), Fv 사량체 또는 미니바디, 및 VH 또는 VHH 또는 V-NAR 등의 단일-도메인 항체 등의 항체가 있다.
특정 실시형태에 따라, 발효 생산물은 POI, 이의 대사물질 또는 유도체를 사용하여 제조된다.
POI는 구체적으로 순수한 형태, 예를 들면, 실질적으로 순수하게 세포 배양물로부터 회수될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "정제된"은 핵산 분자 또는 POI 등의 화합물의 적어도 50%(w/w), 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%를 포함하는 제제를 지칭한다. 순도는 화합물에 적절한 방법(예: 크로마토그래피 방법, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합"은 "유전자 조작에 의해 또는 유전자 조작의 결과로서 제조되는" 것을 의미한다. 따라서, "재조합 미생물"은 적어도 하나의 "재조합 핵산"을 포함한다. 재조합 미생물은 구체적으로 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 포함하거나, 재조합 핵산 서열을 함유하도록 유전자 조작되어 있다. "재조합 단백질"은 숙주에서 각각의 재조합 핵산을 발현시킴으로써 생산된다. "재조합 프로모터"는 본원에 기재된 바와 같은 기능적 활성 프로모터로서 사용하기에 적합한 유전자 조작된 비-코딩 뉴클레오티드 서열이다.
따라서, 신규한 프로모터는 특유의 기능적 특성으로 동정되었다. 예상치 않게, PAS_chrl-4(본원에서 CS1 유전자라 함, 서열번호 9)는 피. 파스토리스 중의 가장 강력한 전사된 유전자로서 생산 프로세스 조건에서 전사 강도의 분석에 의해 동정되었다. 코딩된 CS1 단백질(서열번호 10)은 당분해 효소 또는 단백질이 아니라, GPI-앵커를 통해 세포 표면 상에 위치하는 것으로 예상된다. 피. 파스토리스의 GS115 균주의 9.43Mbp 게놈 서열이 결정되고 제US20110021378A1호에 개시되어 있지만, 프로모터 서열 등의 개개 서열의 특성은 상세히 조사되어 있지 않다.
이러한 프로모터가 본 발명에 따르는 방법에서 효과적으로 사용될 수 있다는 것은 놀라운 일이다. 산업적 규모의 POI 생산에 사용된 바와 같은 종래 기술의 피키아 프로모터는 메탄올 대사 경로로부터 주로 유래하며, 종종 바람직하지 않은 POI 생산을 유도하기 위해 메탄올 첨가를 필요로 했다. 본 발명에 따르는 프로모터 및 방법은 증강된 발현에 의해 생산 증가를 제공하고, 특히 메탄올을 함유하지 않는 화학적으로 규정된 배지를 사용하는 경우, 특정 프로모터 조절에 기인하여 감소된 오염 위험을 갖는다는 이점을 갖는다.
본 발명에 따르는 프로모터는 적합한 탄소 기질 양 및 특정한 배양 배지와 주로 독립적으로 이의 개선된 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 피. 파스토리스는 산업적 생산 프로세스의 조건하에 성공적으로 배양될 수 있다. 먼저, 글리세롤 등의 기초 탄소원 상에서의 배치식 배양을 사용하고, 글루코즈 등의 보충 탄소원의 제한된 공급물을 사용한 유가식을 사용했다. 샘플은 1차 배치식 단계의 말기에 근접하여, 및 예를 들면, 보충 탄소원의 제한된 양을 사용하여 제한된 성장 조건에서 취했다. DNA 마이크로어레이를 사용한 전사체 분석은 보충 탄소원에 대해 및 과잉 탄소, 즉 과량의 기초 탄소원의 존재하에 강력하게 활성적인 특이적 유전자를 나타냈다. pCS1 프로모터 서열은 높은 및 낮은 성장 속도에서 놀랍게도 강력한 프로모터로서 동정되었다. 종래 기술의 필적하는 pGAP 프로모터는 현저히 약했다.
기초 탄소원 상에서 강력한 재조합 유전자 발현의 특징 및 제한된 보충 탄소원 상에서 강력한 발현은 발효 프로세스에서 확인될 수 있다.
개선된 재조합 단백질 생산을 제공할 수 있는 본 발명에 따르는 구성 프로모터 서열로 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열은 다양한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 본 발명에 따르는 프로모터의 기원은 바람직하게는 효모 세포, 가장 바람직하게는 피키아 속 또는 피. 파스토리스 종 등의 메틸로트로픽 효모의 것이고, 이어서 프로모터는 적합한 변이체, 예를 들면, 돌연변이체 또는 유사체를 생산하기 위한 모친 서열로서 사용될 수 있다.
일련의 효모 세포, 특히 일련의 피키아 균주는 각각의 프로모터 서열, 또는 상이한 종의 각각의 유사체를 수득하는데 적합할 수 있는 것으로 생각된다.
상동체 및 유사체 등의 기능적 활성 변이체를 포함하는 동정된 피. 파스토리스 프로모터의 변이체는 표준 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 프로모터는, 예를 들면, 변화된 발현 수준 및 조절 특성을 갖는 프로모터 변이체를 생성하기 위해 변형시킬 수 있다.
예를 들면, 프로모터 라이브러리는, 상이한 발효 전략하에서 이들의 발현을 위한 변이체를 분석하고 적합한 변이체를 선택함으로써, 예를 들면, 진핵 세포에서 유전자 발현을 미세 조정하기 위한 모친 분자로서 사용될 수 있는, 본 발명에 따르는 프로모터 서열의 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다. 변이체의 합성 라이브러리는, 예를 들면, 선택된 POI를 생산하기 위한 요건에 합치하는 프로모터를 선택하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 변이체는 진핵 숙주 세포에서 증가된 발현 효율 및 탄소원 농후 및 제한 조건하에 고도의 발현을 가질 수 있다.
상이한 발효 전략은 성장 단계와 생산 단계를 구별할 것이다.
성장 및/또는 생산은 적합하게는 배치식 방식, 유가식 방식 또는 연속식 방식으로 수행할 수 있다. 배치식, 유가식, 연속식, 교반 탱크 반응기 또는 에어리프트 반응기를 포함하는 임의의 적합한 생물반응기가 사용될 수 있다.
파일럿 또는 산업 규모로 발효 프로세스를 제공하는 것이 유리하다. 산업 프로세스 규모는 바람직하게는 적어도 10L, 특히 적어도 50L, 바람직하게는 적어도 1m3, 바람직하게는 적어도 10m3, 가장 바람직하게는 적어도 100m3의 용적을 사용할 것이다.
산업 규모의 생산 조건이 바람직한데, 이는 수일의 전형적 프로세스 시간을 사용하는 100L 내지 10m3의 반응기 용적으로 유가식 배양, 또는 대략 0.02 내지 0.15h-1의 희석 속도로 대략 50 내지 1000L 이상의 발효기 용적으로 연속식 프로세스를 지칭한다.
적절한 배양 기술은 배치식 단계로 개시하는 생물반응기에서의 배양, 이어서 높은 비성장 속도에서 짧은 지수 유가식 단계, 이어서 추가로 낮은 비성장 속도에서 유가식 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 적합한 배양 기술은 배치식 단계, 이어서 낮은 희석 속도에서 연속 배양 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태는 생물량을 제공하기 위한 배치식 배양, 이어서 고수율 POI 생산을 위한 유가식 배양을 포함한다.
적어도 1g/L 세포 건조 중량, 보다 바람직하게는 적어도 10g/L 세포 건조 중량, 바람직하게는 적어도 20g/L 세포 건조 중량의 세포 밀도를 수득하기 위해 성장 조건하에 생물반응기에서 본 발명에 따르는 숙주 세포주를 배양하는 것이 바람직하다. 파일롯 또는 산업적 규모로 생물량 생산의 이러한 수율을 제공하는 것이 유리하다.
생물량 축적을 가능하게 하는 성장 배지, 특히 기초 성장 배지는 통상적으로 탄소원, 질소원, 황 공급원 및 인산염 공급원을 포함한다. 일반적으로, 이러한 배지는 또한 미량 원소 및 비타민을 추가로 포함하고, 아미노산, 펩톤 또는 효모 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
바람직한 질소원은 NH4H2PO4 또는 NH3 또는 (NH4)2SO4를 포함한다.
바람직한 황 공급원을 MgSO4 또는 (NH4)2SO4 또는 K2SO4를 포함한다.
바람직한 인산염 공급원은 NH4H2PO4, 또는 H3PO4 또는 NaH2PO4, KH2PO4, Na2HPO4 또는 K2HPO4를 포함한다.
또한, 전형적 배지 성분은 KCl, CaCl2, 및 미량 원소, 예를 들면, Fe, Co, Cu, Ni, Zn, Mo, Mn, I, B를 포함한다.
바람직하게는, 배지는 비타민 B7가 보충된다.
피. 파스토리스를 위한 전형적 성장 배지는 글리세롤, 솔비톨, 또는 글루코즈, NH4H2PO4, MgSO4, KCl, CaCl2, 비오틴 및 미량 원소를 포함한다.
생산 단계에서, 생산 배지는 구체적으로 보충 탄소원의 제한된 양으로 사용된다.
바람직하게는, 숙주 세포주는 적합한 탄소원을 갖는 무기 배지에서 배양되고, 이에 의해 단리 공정을 현저히 단순화시킨다. 바람직한 무기 배지의 예는, 예를 들면, 영양요구성을 보충하기 위해, 사용가능한 탄소원(예를 들면, 글루코즈, 글리세롤, 솔비톨 또는 메탄올), 매크로 원소(칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 염화물, 황산염, 인산염) 및 미량 원소(구리, 요오드, 망간, 몰리브덴, 코발트, 아연 및 철 염, 붕산)를 함유하는 염 및 임의로 비타민 또는 아미노산을 함유하는 것이다.
세포는 목적하는 POI의 발현을 수행하기에 적합한 조건하에 배양되고, 이는 발현 시스템 및 발현된 단백질의 성질에 따라, 예를 들면, 당해 단백질이 신호 펩티드에 융합되는지의 여부 및 당해 단백질이 가용성 또는 막-결합되는지의 여부에 따라 세포 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 배양 조건은 숙주 세포의 종류 및 사용된 특정 발현 벡터를 포함하는 요인에 따라 달라질 것이다.
본 발명에 따르는 적합한 프로모터 서열을 임의로 추가로 바람직한 조절 서열과 함께 선택함으로써, 비교가능한 조건하에, 프로모터 활성 또는 전사 강도에 의해 표시되거나, 생산 세포와 상동성인 GAP 프로모터, 천연 pGAP와 비교하여 프로모터 강도에 의해 조절되거나, 피. 파스토리스로부터 단리되는, 적어도 동일한 또는 적어도 약 1.1배, 또는 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 또는 적어도 최대 약 15배의 활성을 제공할 수 있다.
전형적인 생산 배지는 보충 탄소원, 및 추가로 NH4H2PO4, MgSO4, KCl, CaCl2, 비오틴 및 미량 원소를 포함한다.
예를 들면, 발효에 첨가된 보충 탄소원의 공급물은 50중량% 이하의 이용가능한 당과 함께 탄소원을 포함할 수 있다. 보충 배지의 낮은 공급 속도는 세포 성장에 대한 생성물 또는 부산물 억제의 효과를 제한할 수 있고, 따라서 기질 제공에 기반한 높은 생산 수율이 가능해질 것이다.
발효는 바람직하게는 3 내지 7.5의 pH에서 수행된다.
전형적인 발효 시간은 20℃ 내지 35℃, 바람직하게는 22℃ 내지 30℃의 온도에서 약 24 내지 120시간이다.
일반적으로, 본원에서 지칭되는 재조합 핵산 또는 생물체는 당업자에게 공지된 재조합 기술에 의해 생산할 수 있다. 본 발명에 따르면, 당업자의 기술 범위 내의 통상의 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 문헌[참조: Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)]에 충분히 설명되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 재조합 작제물은 프로모터 및 관련 유전자를 벡터 또는 발현 작제물 내로 결찰시킴으로써 수득된다. 이들 유전자는 이러한 벡터 또는 발현 작제물을 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있다.
발현 벡터는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 클로닝 벡터, 변형된 클로닝 벡터, 및 구체적으로 설계된 플라스미드를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 바와 같은 바람직한 발현 벡터는 숙주 세포에서 재조합 유전자의 발현에 적합한 임의의 발현 벡터일 수 있고, 숙주 생물에 따라 선택된다. 재조합 발현 벡터는, 숙주 벡터로도 불리우는, 숙주 생물체의 게놈에서 복제가능하거나 게놈 내로 통합가능한 임의의 벡터일 수 있다.
적절한 발현 벡터는 일반적으로는 진핵 숙주 세포에서 POI를 인코딩하는 DNA의 발현에 적합한 추가의 조절 서열을 포함한다. 조절 서열의 예는 작동인자, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 및 전사 및 번역 개시 및 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 조절 서열은 발현되는 DNA 서열에 작동적으로 연결될 수 있다.
숙주 세포에서 재조합 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하기 위해, 발현 벡터는, 예를 들면, POI의 분비를 가능하게 하는 GOI 또는 신호 펩티드 유전자의 상류에 존재하는, 코딩 서열의 5' 말단에 인접한 본 발명에 따르는 프로모터를 제공할 수 있다. 따라서, 전사는 이러한 프로모터 서열에 의해 조절되고 개시된다.
신호 펩티드는 이종성 신호 펩티드 또는 천연 및 이종성 신호 펩티드의 하이브리드일 수 있고, 구체적으로는 단백질을 생산하는 숙주 생물체에 대해 이종성 또는 동종성일 수 있다. 신호 펩티드의 기능은 POI가 분비되어 세포질내 망상조직으로 도입하게 하는 것이다. 통상적으로, 이는 혈장 막 외부로 단백질의 수송을 유도하는 짧은(3 내지 60개 아미노산 길이) 펩티드 쇄이고, 이에 의해 이종성 단백질을 분리 및 정제하는 것이 용이해진다. 일부 신호 펩티드는, 단백질이 수송된 후, 신호 펩티다제 의해 단백질로부터 절단된다.
예시적 신호 펩티드는 에스. 세레비지애 알파-접합 인자 프레프로(prepro) 펩티드로부터의 신호 서열 및 피. 파스토리스 산 포스파타제 유전자(PHO1)으로부터의 신호 펩티드이다.
프로모터 서열은, 당해 프로모터가 코딩 서열의 전사를 조절하는 경우, 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있는 것으로 이해된다. 프로모터 서열이 코딩 서열에 자연적으로 연결되어 있지 않은 경우, 이의 전사는 천연(야생형) 세포 중의 프로모터에 의해 조절되지 않거나, 당해 서열은 상이한 연속 서열과 재결합된다.
관련 서열의 기능을 증명하기 위해, 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 발현 벡터는 POI의 발현을 유도하도록 작제될 수 있고, 발현된 수율은 통상의 조절 요소를 갖는 작제물과 비교된다. 실험 절차에 대한 상세한 설명은 하기 실시예에서 발견된다. 동정된 유전자는 특이적 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 피. 파스토리스로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 발현 벡터 내로 클로닝시키고, 예를 들면, 다양한 상이한 POI의 고수준 생산을 위해, 효모 벡터 및 피. 파스토리스 균주를 사용하여 진핵 세포주 내로 형질전환시킨다. 이와 같이 생산된 재조합 POI의 양에 대한 본 발명에 따르는 프로모터의 효과를 평가하기 위해, 진핵 세포주는, 통상의 구성, 예를 들면, 성장-의존성 프로모터, 예를 들면, 각각의 세포에서 표준 pGAP 프로모터를 포함하는 균주와 비교하여 진탕 플라스크 실험 및 유가식 또는 케모스타트 발효로 배양할 수 있다. 특히, 프로모터의 선택은 재조합 단백질 생산에 큰 영향을 미친다.
POI는 이와 같이 수득된 형질전환체를 적절한 배지에서 배양하고, 발현된 생성물 또는 대사물질을 배양물로부터 단리하고, 이를 적합한 방법으로 임의로 정제함으로써 재조합 숙주 세포주를 사용하여 생산할 수 있다.
본 발명에 따르는 형질전환체는 이러한 벡터 DNA, 예를 들면, 플라스미드 DNA를 숙주 내로 도입하고, POI 또는 숙주 세포 대사물질을 고수율로 발현시키는 형질전환체를 선택함으로써 수득할 수 있다. 숙주 세포는 전기 펄스법, 원형질체 방법, 리튬 아세테이트 방법 및 이의 변형 방법 등과 같이 진핵 세포의 형질전환에 통상 사용되는 방법으로 외래 DNA를 도입할 수 있도록 처리된다. 피. 파스토리스는 바람직하게는 전기천공에 의해 형질전환된다. 미생물에 의해 재조합 DNA 단편의 흡수를 위한 바람직한 형질전환 방법은 화학적 형질전환, 전기영동 또는 원형질체화에 의해 형질전환을 포함한다. 본 발명에 따르는 형질전환체는 이러한 벡터 DNA, 예를 들면, 플라스미드 DNA를 숙주 내로 도입하고, 관련 단백질 또는 숙주 세포 대사물질을 높은 수율로 발현시키는 형질전환체를 선택함으로써 수득할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 POI의 생산을 위한 몇몇 상이한 접근방식이 바람직하다. 물질은, 관련 단백질 및 상기한 바와 같은 조절 요소 중의 적어도 하나를 코딩하는 재조합 DNA를 함유하는 발현 벡터로 진핵 숙주 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포의 배양물을 제조하고, 전사 및 POI 생산을 유도하고, 발효 공정의 생성물을 회수함으로써 발현되고, 처리되고, 임의로 분비될 수 있다.
본 발명에 따르는 숙주 세포는 바람직하게는 하기 시험에 의해 이의 발현 능력 또는 수율에 대해 시험된다: ELISA, 활성 분석, HPLC 또는 기타 적합한 시험.
POI는 바람직하게는 적어도 1mg/L, 바람직하게는 적어도 10mg/L, 바람직하게는 적어도 100mg/L, 가장 바람직하게는 적어도 1g/L의 수율을 생성하는 조건을 사용하여 발현된다.
본원에 개시된 방법은 바람직하게는 분비된 형태로 또는 세포내 생성물로서 POI의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 재조합 숙주 세포를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이어서, 재조합에 의해 생산된 POI 또는 숙주 세포 대사물질은 세포 배양 배지로부터 단리될 수 있고, 당업자에게 공지된 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다.
본 발명에 따라 생산된 POI는 통상적으로 당해 기술분야의 기술 상태를 사용하여 단리되고 정제될 수 있고, 이는 목적하는 POI 농도의 증가 및/또는 적어도 하나의 불순물 농도의 감소를 포함한다.
POI가 세포로부터 분비되는 경우, 이는 당해 기술분야의 기술 상태를 사용하여 세포 배지로부터 단리 및 정제될 수 있다. 숙주 세포로부터 재조합 발현 생성물의 분비는, 효모 세포가 파쇄되어 세포내 단백질을 방출하는 경우에 발생하는 단백질의 복잡한 혼합물이 아닌 배양 상청액으로부터 회수되기 때문에, 정제 공정의 촉진을 포함하는 이유에서 일반적으로 유리하다.
또한, 배양된 형질전환체 세포는 초음파 또는 기계적, 효소적 또는 화학적으로 파쇄되어, POI가 분리 및 정제되는, 목적하는 POI를 함유하는 세포 추출물을 수득할 수 있다.
재조합 폴리펩티드 또는 단백질 생성물을 수득하는 분리 및 정제 방법으로서는, 용해도 차이를 이용하는 방법(예를 들면, 염석(salting out) 및 용매 침전), 분자량 차이를 이용하는 방법(예를 들면, 초음파 및 겔 전기영동), 전하 차이를 이용하는 방법(예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피), 특이적 친화성을 이용하는 방법(예를 들면, 친화성 크로마토그래피), 소수성 차이를 이용하는 방법(예를 들면, 역상 고성능 액체 크로마토그래피) 및 등전점 차이를 이용하는 방법(예를 들면, 등전점 전기영동) 등의 방법이 사용될 수 있다.
고도로 정제된 생성물은 오염 단백질을 본질적으로 함유하지 않고, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 또는 적어도 98%, 100% 이하의 순도를 갖는다. 정제된 생성물은 세포 파편으로부터 세포 배양 상청액 등의 정제에 의해 수득할 수 있다.
단리 및 정제 방법으로서는 하기 표준 방법이 바람직하다: 세포 파괴(POI가 세포내에서 수득되는 경우), 세포(파편) 분리 및 정밀여과 또는 접선 유동 필터(TFF)에 의한 세척 또는 원심분리, 침전 또는 열 처리에 의한 POI 정제, 효소적 소화에 의한 POI 활성화, 크로마토그래피, 예를 들면, 이온 교환(IEX), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 친화성 크로마토그래피, 크기 배제(SEC) 또는 HPLC 크로마토그래피에 의한 POI 정제, 농축의 POI 침전 및 한외여과 단계에 의한 세척.
분리 및 정제된 POI는 통상의 방법, 예를 들면, 웨스턴 블롯팅, HPLC, 활성 분석 또는 ELISA에 의해 동정될 수 있다.
POI는 임의의 진핵, 원핵 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 이는 분비된 단백질 또는 세포내 단백질일 수 있다. 본 발명은 또한 천연 발생 단백질의 기능적 상동체(homolog), 기능적 등가 변이체, 유도체 및 생물학적 활성 단편의 재조합 생산을 제공한다. 기능적 상동체는 바람직하게는 서열의 기능적 특성과 동일하거나 상응하고 이러한 특성을 갖는다.
본원에서 지칭되는 POI는 바람직하게는 치료적, 예방적, 진단적, 분석적 또는 산업적 사용을 위해 진핵 숙주 세포와 동종성이거나 이종성인 생성물일 수 있다.
POI는 바람직하게는 진핵 세포, 바람직하게는 효모 세포에서, 바람직하게는 분비된 단백질로서 생산되는 이종성 재조합 폴리펩티드 또는 단백질이다. 바람직하게 생산된 단백질의 예는 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 아프로티닌, 조직 인자 경로 억제제 또는 기타 프로테아제 억제제, 및 인슐린 또는 인슐린 전구체, 인슐린 유사체, 성장 호르몬, 인터류킨, 조직 플라스미노겐 활성화제, 형질전환 성장 인자 a 또는 b, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1), 글루카곤-유사 펩티드 2(GLP-2), GRPP, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 XIII, 혈소판 유래된 성장 인자 1, 혈청 알부민, 효소, 예를 들면, 리파제 또는 프로테아제, 또는 천연 단백질과 유사한 기능을 갖는 기능적 상동체, 기능적 등가 변이체, 유도체 및 생물학적 활성 단편이다. POI는 천연 단백질과 구조적으로 유사할 수 있고, C- 및 N-말단 중의 어느 하나 또는 둘 다에 또는 천연 단백질의 측쇄에 하나 이상의 아미노산의 부가, 천연 아미노산 서열 중의 하나 또는 다수의 상이한 부위에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 천연 단백질의 하나 또는 두 말단에서 또는 아미노산 서열 중의 하나 또는 몇몇 부위에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 또는 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의해 천연 단백질로부터 유래할 수 있다. 이러한 변형은 상기 언급한 몇몇 단백질에 대해 공지되어 있다.
또한, POI는, 상기 생화학적 반응의 생성물 또는 몇몇 반응의 캐스케이드를 수득할 목적, 예를 들면, 숙주 세포의 대사물질을 수득할 목적으로, 숙주 세포에서 생화학적 반응을 제공하는 기질, 효소, 억제제 또는 보조인자로부터 선택될 수 있다. 예시적 생성물은 비타민(예: 리보플라빈), 유기산 및 알콜일 수 있고, 이는 본 발명에 따르는 재조합 단백질 또는 POI의 발현 후에 증가된 수율로 수득될 수 있다.
일반적으로, 재조합 생성물을 발현하는 숙주 세포는 POI의 재조합 발현에 적합한 임의의 진핵 세포일 수 있다.
바람직한 포유동물 세포의 예는 BHK, CHO(CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHO-K1, CHOK1SV, CHO-S), HeLa, HEK293, MDCK, NIH3T3, NS0, PER.C6, SP2/0 및 VERO 세포이다.
본 발명에 따라 숙주 세포로서 사용된 바람직한 효모의 예는, 이로써 한정되지 않지만, 사카로마이세스 속(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애), 피키아 속(예를 들면, 피. 파스토리스 또는 피 메타노리카), 코마가타엘라 속(케이. 파스토리스, 케이. 슈도파스토리스 또는 케이. 파피이), 한세눌라 폴리모르파 또는 클루이베로마이세스 락티스를 포함한다.
보다 새로운 문헌은 피키아를 코마가타엘라 파스토리스, 코마가타엘라 파피이 및 코마가타엘라 슈도파스토리스로 분할하여 개명한다. 본원에서 피키아 파스토리스는 모든 코마가타엘라 파스토리스, 코마가타엘라 파피이 및 코마가타엘라 슈도파스토리스에 대해 동의어로 사용된다.
바람직한 효모 숙주 세포는 메틸로트로픽 효모, 예를 들면, 피키아 또는 코마가타엘라, 예를 들면, 피키아 파스토리스, 또는 코마가타엘라 파스토리스, 또는 케이. 파피이, 또는 케이. 슈도파스토리스로부터 유래된다. 숙주의 예는 효모, 예를 들면, 피. 파스토리스를 포함한다. 피. 파스토리스의 예는 균주 CBS 704(= NRRL Y-1603 = DSMZ 70382), CBS 2612(= NRRL Y-7556), CBS 7435(= NRRL Y-11430 ), CBS 9173-9189(CBS 균주: CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands), 및 DSMZ 70877(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)를 포함할 뿐만 아니라, 인비트로겐(Invitrogen)사의 균주, 예를 들면, X-33, GS115, KM71 및 SMD1168을 포함한다. 에스. 세레비지애 균주의 예는 W303, CEN.PK 및 BY-시리즈(EUROSCARF collection)을 포함한다. 상기한 모든 균주는 형질전환체를 생산하고 이종성 유전자를 발현시키기 위해 성공적으로 사용되었다.
본 발명에 따르는 바람직한 효모 숙주 세포, 예를 들면, 피. 파스토리스 또는 에스. 세레비지애 숙주 세포는 이종성 또는 재조합 프로모터 서열을 함유하고, 이는 생산 숙주와는 상이한, 피. 파스토리스 또는 에스. 세레비지애로부터 유래될 수 있다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명에 따르는 숙주 세포는 숙주 세포와 동일한 속, 종 또는 균주로부터 기원하는 프로모터를 포함하는 본 발명에 따르는 재조합 발현 작제물을 포함한다.
본 발명에 따르는 프로모터는 바람직하게는 숙주 세포와 상동성인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래된다.
예를 들면, 본 발명에 따르는 프로모터는 효모, 예를 들면, 에스. 세레비지애로부터 유래될 수 있고, 효모에서 POI의 발현에 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태는 피. 파스토리스 생산자 숙주 세포주에서 재조합 POI를 생산하는 방법에 사용하기 위해 피. 파스토리스로부터 기원하는 본 발명에 따르는 프로모터에 관한 것이다. 뉴클레오티드 서열의 상동성 기원은 동일한 속 또는 종의 숙주 세포 내로 이의 도입을 촉진시키고, 따라서 가능하게는 산업적 제조 공정에서 증가된 수율로 POI의 안정한 생산을 가능하게 한다. 또한, 기타 적합한 효모 또는 기타 진균 또는 기타 생물체, 예를 들면, 척추동물 또는 식물 유래의 프로모터의 기능적 활성 변이체를 사용할 수 있다.
POI가 숙주 세포에 상동성인 단백질, 즉 숙주 세포에서 천연적으로 발생하는 단백질인 경우, 숙주 세포에서 POI의 발현은 이의 천연 프로모터 서열을 본 발명에 따르는 프로모터 서열과 교환함으로써 조절할 수 있다.
이러한 목적은, 예를 들면, 부위 특이적 재조합을 가능하게 하는 표적 유전자의 상동성 서열, 숙주 세포에 적합한 프로모터 서열 및 선택가능한 마커를 포함하는 재조합 DNA 분자를 사용한 숙주 세포의 형질전환에 의해 달성할 수 있다. 부위 특이적 재조합은 당해 프로모터 서열을 POI를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결하기 위해 수행한다. 이는 천연 프로모터 서열 대신에 본 발명에 따르는 프로모터 서열로부터 POI의 발현을 초래한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 프로모터 서열은 POI의 천연 프로모터 서열과 비교하여 증가된 프로모터 활성을 갖는다.
본 발명에 따라, POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 본 발명에 따르는 프로모터 서열을 포함하는 피. 파스토리스 세포주를 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따르는 프로모터를 포함하고 POI를 인코딩하는 목적 유전자를 도입할 수 있는, 본 발명에 따르는 와일드카드 벡터 또는 숙주 세포를 또한 제공할 수 있다. 따라서, 와일드카드 세포주는 이의 발현 능력을 특징으로 하는 예비형성된 숙주 세포주이다. 이는, 예를 들면, 부위-특이적 리콤비나제-매개된 카세트 교환을 사용하여, POI 생산을 위해, 생산자 세포주를 생성하는 혁신적 "와일드카드" 플랫폼 전략에 따른다. 이러한 신규 숙주 세포는, 예를 들면, 재현가능한 고효율적 생산 세포주를 수득하기 위해, 수일 내에 소정의 게놈 발현 핫 스팟 내로 목적 유전자(GOI)의 클로닝을 용이하게 한다.
바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따르는 방법은, 세포당 단일 카피 또는 복수 카피로, 숙주 세포의 게놈 내로의 통합에 적합한 플라스미드 상에 제공되는, POI를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 사용한다. POI를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열도 또한 세포당 단일 카피 또는 복수 카피로 자가 복제 플라스미드 상에 제공될 수 있다.
본 발명에 따르는 바람직한 방법은, 진핵 발현 벡터, 바람직하게는 효모 발현 벡터인 플라스미드를 사용한다. 발현 벡터는, 이로써 한정되지 않지만, 클로닝 벡터, 변형된 클로닝 벡터 및 특이적으로 설계된 플라스미드를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은 바람직한 발현 벡터는 숙주 세포에서 재조합 유전자의 발현에 적합한 임의의 발현 벡터일 수 있고, 숙주 생물체에 따라 선택된다. 재조합 발현 벡터는, 숙주 벡터로도 불리우는, 숙주 생물체의 게놈 내에서 복제가능하거나 게놈 내로 통합가능한 임의의 벡터, 예를 들면, 본 발명에 따르는 DNA 작제물을 함유하는 효모 벡터일 수 있다. 바람직한 효모 발현 벡터는 한세눌라, 피키아, 칸디다 및 토룰로프시스 속으로 나타내어지는 메틸로트로픽 효모로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효모에서 발현시키기 위한 것이다.
본 발명에 있어서, 벡터로서는 pPICZ, pGAPZ, pPIC9, pPICZalfa, pGAPZalfa, pPIC9K, pGAPHis 또는 pPUZZLE로부터 유래된 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 재조합 작제물은 관련 유전자를 벡터에 결찰시킴으로써 수득된다. 이들 유전자는 이러한 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있다. 당해 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드는, 이렇게 수득된 형질전환체를 적절한 배지에서 배양하고, 배양물로부터 발현된 POI를 단리하고, 발현된 생성물에 적절한 방법으로 이를 정제하여 특히 오염 단백질로부터 POI를 분리함으로써 재조합 숙주 세포주를 사용하여 생산될 수 있다.
발현 벡터는 하나 이상의 표현형 선택가능한 마커, 예를 들면, 항생물질 내성을 부여하거나 독립영양 요구를 공급하는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 효모 벡터는 효모 플라스미드로부터의 복제 기원, 자가 복제 서열(ARS), 또는 달리는, 숙주 게놈 내로의 통합에 사용된 서열, 프로모터 영역, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종결을 위한 서열 및 선택가능한 마커를 통상 함유한다.
예를 들면, 전구화 서열 및/또는 POI를 코딩하는 DNA 서열, 프로모터 및 터미네이터를 각각 결찰시키고, 통합 또는 숙주 복제에 필요한 정보를 함유하는 적합한 벡터 내로 이들을 삽입하는데 사용된 공정은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: J. Sambrook et al., (A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, 1989]에 기재되어 있다.
본 발명에 따르는 조절 요소 및/또는 POI를 통합 표적으로 사용하는 벡터는, 조절 요소 및/또는 POI를 코딩하는 전체 DNA 서열을 함유하는 DNA 작제물을 먼저 제조한 다음, 이어서 이러한 단편을 적합한 발현 벡터 내로 삽입하거나, 개개 요소에 대한 유전자 정보를 함유하는 DNA 단편을 삽입한 다음, 결찰시킴으로써 작제할 수 있다.
또한, 다중클로닝 부위를 갖는 벡터인 다중클로닝 벡터는 본 발명에 따라 사용될 수 있고, 여기서 목적하는 이종성 유전자는 발현 벡터를 제공하기 위해 다중클로낭 부위에 도입될 수 있다. 발현 벡터에서, 프로모터는 POI 유전자의 상류에 배치되고, 당해 유전자의 발현을 조절한다. 다중클로닝 벡터의 경우, POI 유전자는 다중클로닝 부위에 도입되기 때문에, 당해 프로모터는 다중클로닝 부위의 상류에 배치된다.
본 발명에 따르는 재조합 숙주 세포를 수득하기 위해 제공된 DNA 작제물은 확립된 표준 방법, 예를 들면, 포스포르아미다이트 방법에 의해 합성에 의해 제조할 수 있다. 또한, DNA 작제물은, 예를 들면, 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 제조하고 표준 기술[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor, 1989]에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 하이브리드화에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열을 스크리닝함으로써 수득된, 게놈 또는 cDNA 기원의 것일 수 있다. 마지막으로, DNA 작제물은, 합성, 게놈성 또는 cDNA 기원의 단편, 필요에 따라, 전체 DNA 작제물의 다양한 부분에 상응하는 단편을 표준 기술에 따라 어닐링함으로써 제조한, 혼합된 합성 및 게놈성, 혼합된 합성 및 cDNA 또는 혼합된 게놈성 및 cDNA 기원의 것일 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 효모 발현 벡터는, 예를 들면, 상동성 재조합에 의해 효모 게놈에 안정하게 통합할 수 있다.
세포를 본 발명에 따르는 조절 요소 및/또는 POI 유전자로 형질전환시킴으로써 수득된 본 발명에 따르는 형질전환체 숙주 세포는 바람직하게는 거대 세포 수로 효율적으로 성장하는 조건하에 먼저 배양할 수 있다. 세포주가 POI 발현을 위해 제조되는 경우, 배양 기술은 발현 생성물을 생산하기 위해 선택된다.
특정 예는, 글리세롤 배치 배지 및 글루코즈 유가식 배지를 사용하여, 리포터 단백질을 생산하는 재조합 생산 피. 파스토리스의 유가식 발효에 관한 것이다. 비교 프로모터 활성은 본 발명에 따르는 프로모터가 재조합 단백질 생산을 위해 성공적으로 사용될 수 있는 것을 증명한다.
추가의 예에 따라, 인간 혈청 알부민(HSA)은 글루코즈-제한 조건하에 POI로서 생산되고, HSA 수율 및 유전자 카피수가 측정된다.
또 다른 예에 따라, 본 발명에 따르는 프로모터의 조절하에 HSA를 발현하는 피. 파스토리스 균주의 유가식 배양이 수행되었다.
추가의 예는 pCS1 프로모터의 전사 조절하에 모델 단백질로서 돼지 카복시펩티다제 B의 발현을 참조한다.
또한, 상기 예는 pCS1의 전사 조절 하에 항체 단편의 발현을 지칭한다.
추가의 예는 본 발명에 따르는 프로모터의 크기 또는 길이 변이체, 예를 들면, pCS1 서열 및 5' 말단에서의 신장을 포함하는 신장된 pCS1 서열 pCS1a(서열번호 2), 또는 80 내지 800bp 범위의 길이를 갖는 pCS1의 단편을 지칭한다.
상술한 기재는 하기 실시예를 참조로 하여 보다 완전히 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 본 발명의 하나 이상의 실시형태를 실시하는 단순한 대표적 방법이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
다음의 실시예는 신규한 프로모터를 동정하고 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 이의 발현 특성을 분석하는데 사용된 물질 및 방법을 설명한다.
실시예 1: 피. 파스토리스에서 강력하게 발현된 유전자의 동정
피. 파스토리스의 강력한 유전자 및 이의 각각의 프로모터를 동정하기 위해, 유전자 발현 패턴의 분석은 DNA 마이크로어레이를 사용하여 수행했다. 글리세롤 배치 및 글루코즈 제한(케모스타트)에서 성장시킨 피. 파스토리스를 분석했다.
a) 균주
보충물 부재하에 최소 배지에서 성장시킬 수 있는 야생형 피. 파스토리스 균주(CBS2612, CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands)를 사용했다.
b) 피. 파스토리스의 배양
발효는 최종 작업 용적 2.5L로 미니포스(Minifors) 반응기(Infors-HT, Switzerland)로 수행하였다.
다음 배지를 사용했다:
리터당 함유된 PTM1 미량 염 보존액
6.0g CuSO4·5H2O, 0.08g NaI, 3.36g MnSO4·H2O, 0.2g Na2MoO4·2H2O, 0.02g H3BO3, 0.82g CoCl2, 20.0g ZnCl2, 65.0g FeSO4·7H2O, 0.2g 비오틴 및 5.0ml H2SO4 (95%-98%).
리터당 함유된 글리세롤 배치 배지
2g 시트르산 1수화물(C6H8O7·H2O), 39.2g 글리세롤, 20.8g의 NH4H2PO4, 0.5g MgSO4·7H2O, 1.6g KCl, 0.022g CaCl2·2H2O, 0.8mg 비오틴 및 4.6ml PTM1 미량 염 보존액. HCl을 첨가하여 pH를 5로 설정하였다.
리터당 함유된 글리세롤 유가식 배지
632g 글리세롤, 8g MgSO4·7H2O, 22g KCl 및 0.058g CaCl2·2H2O.
리터당 함유된 케모스타트 배지
2g 시트르산 1수화물(C6H8O7·H2O), 99.42g 글루코즈 1수화물, 22g NH4H2PO4, 1.3g MgSO4·7H2O, 3.4g KCl, 0.02g CaCl2·2H2O, 0.4mg 비오틴 및 3.2ml PTM1 미량 염 보존액. HCl을 첨가하여 pH를 5로 설정하였다.
용해된 산소를 교반기 속도(500 내지 1250rpm)으로 DO = 20%에서 조절했다. 통기 속도는 60Lh- 1 공기였고, 온도는 25℃로 조절하고, pH 설정값 5는 NH4OH(25%)를 첨가하여 조절했다.
발효를 개시하기 위해, 1.5L 배치 배지를 발효조로 멸균 여과시키고, 피. 파스토리스는 출발 광학 밀도(OD 600) 1로 접종했다(YPG에서 밤새 예비배양으로부터, 180rpm, 28℃). 대략 25시간의 배치 단계는 약 20g/L의 무수 생물량 농도에 도달하고, 글루코즈 배지와 함께 10시간 지수 유가식을 계속한 후, 무수 생물량 농도 약 50g/L를 유도한다. 이어서, 용적은 1.5L로 감소되고, 케모스타트 배양을 0.15Lh-1의 공급/수거 속도로 개시하여 μ= 0.1의 일정한 성장률을 유도했다. 발효는 케모스타트 개시 후 50시간에 종료했다.
이러한 발효는 신뢰가능한 마이크로어레이 분석에 필요한 생물학적 복제물을 수득하기 위해 3회 수행했다.
케모스타트 동안 탄소 제한된 조건(검출가능한 잔류 글루코즈 없음)은 배양 상청액의 HPLC 분석에 의해 확인하였다.
c) 샘플링
샘플을 글리세롤 배치 단계의 말기 및 글루코즈 케모스타트의 정상 상태 조건에서 채취했다. 광학 밀도 또는 효모 건조 질량의 측정, 정성적 현미경 검사 및 세포 생존률 분석으로서 통상적 샘플링은 각 발효 동안 함께 수행했다. 마이크로어레이 분석을 위해, 샘플을 채취하여 다음과 같이 처리했다: 최적의 급냉을 위해, 9mL 세포 배양액을 즉시 4.5mL 빙냉 5% 페놀(Sigma) 용액(무수 에탄올 중)과 혼합하고, 등분했다. 각 2mL를 예비냉각된 채혈관(GE Healthcare, NJ)에서 원심분리하고(1분간 13200rpm), 상청액을 완전히 제거하고, 튜브를 RNA 정제까지 -80℃에서 저장했다.
d) RNA 정제 및 마이크로어레이 하이브리드화를 위한 샘플 제조
RNA는 공급자의 지시(Ambion, US)에 따라 TRI 시약을 사용하여 단리했다. 세포 펠릿을 TRI 시약 중에 재현탁시키고, 40초 동안 5ms-1에서 패스트프렙(FastPrep) 24(M.P. Biomedicals, CA)를 이용하여 유리 비드로 균질화시켰다. 클로로포름의 첨가 후, 샘플을 원심분리하고, 모든 RNA는 이소프로판올을 첨가하여 수상으로부터 침전시켰다. 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고, 건조시키고, RNAse 비함유 물에 재현탁시켰다. RNA 농도는 나노드롭 1000 분광광도계(NonaDrop products, DE)를 사용하여 OD260를 측정하여 결정했다. 샘플로부터 잔류 DNA는 DNA 비함유 키트(Ambion, CA)를 이용하여 제거하였다. 10㎍ RNA와 등가의 샘플 용적을 RNAse 비함유 물에서 50μL로 희석시킨 다음, DNAse 완충제 I 및 rDNAse I를 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양했다. DNAse 불활성화 시약의 첨가 후, 샘플을 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. RNA 농도를 상술한 바와 같이 다시 측정했다. 추가로, RNA의 통합성은 RNA 나노 칩(Agilent)을 사용하여 분석했다. 샘플의 하이브리드화에 대한 증폭 및 표지화로부터 마이크로어레이의 유동을 모니터링하기 위해, 키트 중 스파이크(Agilent, 제품 번호: 5188-5279)를 양성 대조군으로 사용했다. 이는 자체의 RNA 샘플과 함께 증폭되고, 표지되고 공하이브리드화된 아데노바이러스로부터의 10개의 상이한 폴리아데닐화 전사물을 함유한다. 샘플은 퀴크 앰프 라벨링 키트(Agilent, 제품 번호: 5190-0444)를 사용하여 Cy 3 및 Cy 5로 표지했다. 따라서, 정제된 샘플 RNA 500ng을 8.3μL RNAse 비함유 물에서 희석하고, 2μL 스파이크 A 또는 B, 및 1.2μL T7 프로모터 프라이머를 첨가했다. 혼합물을 65℃에서 10분 동안 변성시키고, 아이스에서 5분 동안 유지시켰다. 이어서, 8.5μL cDNA 마스터믹스(샘플당: 4μL 5× 제1 스트랜드 완충액, 2μL 0.1M DTT, 1μL 10mM의 dNTP 믹스, 1μL MMLV-RT, 0.5μL RNase out)를 첨가하고, 40℃에서 2시간 동안 배양한 후, 15분 동안 65℃로 옮기고, 아이스에 5분 동안 정치시킨다. 전사 마스터믹스(샘플당: 15.3μL 뉴클레아제 비함유 물, 20μL 전사 완충액, 6μL 0.1M DTT, 6.4μL 50% PEG, 0.5μL RNase 억제제, 0.6μL 무기 포스파타제, 0.8μL T7 RNA 폴리머라제, 2.4μL 시아닌 3 또는 시아닌 5)를 제조하고, 각 튜브에 첨가하고, 2시간 동안 40℃에서 배양했다. 수득된 표지된 cRNA를 정제하기 위해, RNeasy 미니 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 74104)를 사용했다. 샘플은 -80℃에서 저장했다. cRNA 농도 및 표지 효율의 정량화는 나노드롭 분광광도계로 수행했다.
e) 마이크로어레이 분석
유전자 발현 하이브리드화 키트(Agilent, 카탈로그 번호 5188-5242)를 표지된 샘플 cRNA의 하이브리드화용으로 사용했다. 하이브리드화 샘플을 제조하기 위해, 각 300ng cRNA(Cy3 및 Cy5) 및 6μL 10배 차단제는 뉴클레아제 비함유 물을 사용하여 최종 용적 24μL로 희석했다. 1μL 25배 단편화 완충액을 첨가한 후, 혼합물을 30분 동안 60℃에서 배양했다. 이어서, 25μL GEX 하이브리드화 완충액 HI-RPM을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 13,200rpm으로 1분 동안 원심분리한 후, 샘플을 아이스 위에서 냉각시키고, 즉시 하이브리드화용으로 사용했다. 내부에(in-house) 설계된 피. 파스토리스 특이적 올리고뉴클레오티드 어레이(AMAD-ID: 026594, 8x15K 커스텀 어레이, Agilent)를 사용했다. 마이크로어레이 하이브리드화는 마이크로어레이 하이브리드화 챔버 사용자 가이드(Agilent, G2534A)에 따라 수행했다. 첫째, 가스켓 슬라이드는 덮지 않고 챔버 베이스 위에 두고 아질런트 라벨이 위로 직면하게 했다. 샘플(어레이당 40μL)을 8개의 정사각형 각각의 중앙에 부하했다. 이어서, 마이크로어레이 슬라이드를 조심스럽게 가스켓 슬라이드(아래를 향하는 Agilent 라벨) 위에 조심스럽게 놓고, 챔버 커버를 위에 배치하고, 클램프로 고정했다. 하이브리드화는 65℃에서 17시간 동안 하이브리드화 오븐에서 수행했다. 스캐닝 전에, 마이크로어레이 칩을 세척했다. 따라서, 챔버는 분해되었고, 샌드위치 슬라이드는 세척 완충액 1에 침지시키면서 서로 분리시켰다. 마이크로어레이는 세척 완충액 1과 함께 다른 접시로 직접 옮기고, 1분 동안 세척하고, 세척 완충액 2(온도 적어도 30℃)로 옮기고, 다시 1분 동안 세척했다. 슬라이드 가장자리를 조직과 접촉시켜 마이크로어레이 슬라이드를 건조시킨 후, 이를 슬라이드 홀더(위를 향하는 Agilent 라벨)에 넣었다. 슬라이드 홀더는 캐러셀(carousel)에 넣고, 스캐닝을 개시했다.
f) 데이터 수집 및 마이크로어레이 데이터의 통계학적 평가
이미지는 G2565AA 마이크로어레이 스캐너(Agilent)로 50nm의 해상도로 스캐닝하고, 아질런트의 특징 추출 9.5 소프트웨어에 개입시켰다. 아질런트의 특징 추출 9.5는 스팟 강도의 정량화용으로 사용되었다. 이어서, 원래의 평균 스팟 강도 데이터는 추가의 표준화 및 데이터 분석을 위한 오픈 공급원 소프트웨어 R에 개입시켰다.
데이터 전처리 및 표준화를 위해, R 패키지 림마(limma), vsn 및 마레이(marray)를 사용했다. 강도 데이터는 배경 보정되지 않았고, VSN으로 표준화되었다.
마이크로어레이 데이터는, 강력하게 발현되고 구성 유전자를 동정하기 위해, 두 상태에서 높은 신호 강도를 갖는 항목을 검색했다. 가장 강력하게 전사된 유전자는 양 상태에서 신호 강도와 함께 표 1에 제시되어 있다. pGAP 및 pTEF의 데이터는 참조로 추가한다. 평균에서, 양 조건(글리세롤 배치 및 글루코즈-제한된 케모스타트 배양)에서 pCS1는 pGAP를 약 30% 발현시킨 반면, pTEF는 pGAP보다 약 12% 약했다.
| 프로모터 | 유전자 식별자 | 강도1 | pGAP 강도/전사 강도의 % | 강도2 | pGAP 강도/전사 강도의 % | |
| pGAP | PAS_chr2-1_0437 | 56235.2 | 100.0 | 44411.4 | 100.0 | |
| pTEF | PAS_FragB_0052 | 47046.3 | 83.4 | 39956.2 | 89.9 | |
| pCS1 | PAS_chr1-4_0586 | 83570.4 | 148.6 | 54723.2 | 122.7 | |
1. 글리세롤 배치 단계에서(양 채널의 평균)
2. 글루코즈-제한된 케모스타트에서(양 채널의 평균)
실시예 2: 세포내 발현된 리포터 유전자로서 eGFP를 사용하여 피. 파스토리스에서 신규 동정된 프로모터 pCS1의 비교 프로모터 활성 연구
신규 동정된 프로모터의 특성을 분석하기 위해, 진탕 플라스크 스크리닝을 다음과 같이 수행했다: 24시간 동안 예비배양은 프로세스의 배치 단계를 시뮬레이팅하는 - 탄소원으로 글리세롤을 함유하는 농후(rich) 배지로 수행하였고, 프로세스의 글루코즈 제한 유가식 단계를 시뮬레이팅하는 - 최소 배지 및 글로코즈 공급물 비드에 의한 주배양을 수행했다. 녹색 형광 단백질(eGFP)은 프로모터 활성을 위한 세포내 리포터 단백질로서 사용되었다.
a) 균주 & 발현 벡터
피. 파스토리스 야생형 균주(CBS2612, CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands)를 숙주 균주로서 사용했다. 균주의 형질전환은 이. 콜라이(E. coli)(pUC19)를 위한 복제 기원, 이. 콜라이 및 효모에서 선택을 위한 항생물질 내성 카세트(제오신에 대해 내성을 부여하는 Sh ble 유전자), 다중 클로닝 부위 및 에스. 세레비지애 CYC1 전사 터미네이터로 이루어진 목적 유전자(GOI)를 위한 발현 카세트, 및 피. 파스토리스 게놈(3' AOX1 영역)으로 통합하기 위한 유전자좌를 포함하는, pPUZZLE로 명명된 내부 벡터를 사용하여 수행되었다[참조: Stadlmayr et al. J. Biotechnol 2010 Dec;150(4):519-29].
b) GOI로서 eGFP를 함유하는 pPUZZLE 발현 벡터 내로 신규 동정된 프로모터 pCS1의 증폭 및 클로닝
pCS1 프로모터(서열번호)는 개시 코돈 ATG까지 CS1 유전자의 5'-비 코딩 영역의 985bp를 포함하고(실시예 1 참조), 표 2에 제시된 프라이머를 사용하여 피. 파스토리스 게놈 DNA로부터 PCR(Phusion Polymerase, New England Biolabs)에 의해 증폭시켰다. 당해 서열은 pPUZZLE 발현 벡터 pPM1aZ10_eGFP에 클로닝하고, ApaI 및 SbfI로 절단하여 pPM1aZ10_pCS1_eGFP를 생성했다. 또한, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제 프로모터의 통상 사용된 프로모터(피. 파스토리스의 pGAP, 본원에서 서열번호 13)를 함유하는 벡터 pPM1aZ10_pGAP_eGFP를 참조로서 사용했다. 프로모터는 ApaI 및 SbfI 제한 부위(표 2 및 3 참조)를 사용하는 eGFP 유전자의 개시 코돈의 상류에 삽입했다. 프로모터 서열의 정확성은 생거(Sanger) 서열분석에 의해 확인했다.
| 명칭 | 표적 | 서열 | TM | 제한 부위 |
| pCS1 fw | pCS1 | 서열번호 14 GATAGGGCCCCAGGGCATCATTGAGGTTTCCAC |
69.6 | ApaI |
| pCS1 back | pCS1 | 서열번호 15 GATACCTGCAGGTTTTGTTGTTGAGTGAAGCGAGTG |
69.3 | SbfI |
| 클로닝 효소 | |||||
| 프로모터 | 5' 프라이머 | 3' 프라이머 | 5' | 3' | 길이 |
| pCS1 | pCS1_fw | pCS1_back | ApaI | SbfI | 985 |
c) 프로모터 활성을 분석하기 위한 피. 파스토리스에서 eGFP의 발현
모든 플라스미드는 전기천공 적격 피. 파스토리스에서 전기천공(2kV, 4ms, GenePulser, BioRad) 전에 3' AOX 게놈 통합 영역 내에서 AscI로 선형화했다.
양성 형질전환체는 25㎍/mL 제오신(Invivogen, CA)을 함유하는 YPD 플레이트(1리터당: 10g 효모 추출물, 20g 펩톤, 20g 글루코즈, 20g 한천-한천) 상에서 선택했다. 콜로니 PCR은 형질전환된 플라스미드의 존재를 보장하기 위해 사용되었다. 따라서, 게놈 DNA는 피. 파스토리스 콜로니를 5분 동안 각각 쿠킹 및 동결시켜 수득하고, 적합한 프라이머와 함께 PCR에 직접 적용했다. 발현 스크리닝을 위해, 단일 콜로니를 예비배양물로서 액체 YPG-Zeo 배지(1리터당: 20g 펩톤, 10g 효모 추출물, 12.6g 글리세롤 및 25mg 제오신)로 접종했다. 약 24시간 후, 예비배양물을 사용하여, 2ml 합성 스크리닝 배지(1리터당: 22g 글루코즈 1수화물, 22g 시트르산, 3.15g (NH4)2HPO4, 0.027g CaCl2ㆍ2H2O, 0.9g KCl, 0.5g MgSO4ㆍ7H2O, 2mL 500×비오틴 및 1.47mL 미량 염 보존액[1리터당: 6g CuSO4ㆍ5H2O, 0.08g NaI, 3g MnSO4ㆍH2O, 0.2g Na2MoO4ㆍ2H2O, 0.02g H3BO3, 0.5g CoCl2, 20g ZnCl2, 5g FeSO4ㆍ7H2O 및 5mL H2SO4]; 5M KOH를 사용하여 pH를 5로 설정; 여과에 의해 멸균) 및 2 글루코즈 공급물(24시간 후에 첨가된 2차 공급물 비드; Kuhner, CH)에서 OD600 0.1을 갖는 주배양물을 접종했다. 글로코즈 제한 성장 조건은 다음 식: (글루코즈) = 1.63 * t0.74[㎎/Disc]에 의해 기재되는 이러한 공급물 비드의 느린 글로코즈 방출 동역학에 기인하여 달성되었다. 샘플은 예비배양 말기 및 주배양물의 접종후 24시간 및 48시간에 취했다. 세포 밀도는 OD600을 측정함으로써 결정되었고, eGFP 발현은 문헌[참조: Stadlmayr et al.; J. Biotechnology 2010 Dec;150(4):519-29]에 기재된 유동 세포계수법으로 분석했다. 각 샘플에 대해, 10,000개의 세포를 분석했다. 피. 파스토리스의 자가 형광성은 비형질전환된 피. 파스토리스 야생형 세포를 사용하여 측정하고, 신호로부터 감산했다. 상대적 eGFP 발현 수준(세포 크기와 관련된 형광 강도)는 구성 pGAP 프로모터의 조절하에 eGFP를 발현하는 클론의 eGFP 발현 수준의 백분율로 제시된다.
결과는 표 4에 제시되어 있다. pCS1 프로모터의 조절하에 클론 발현은 예비-배양(배치) 말기에서 pGAP를 38% 초과했고, 주배양(유가식) 말기에 4배 높은 GFP 발현 수준을 가졌다.
| 예비-배양 | 주배양 | |||
| 배치 말기 | stdev | 48시간 | stdev | |
| pCS1 | 138.2 | 26.6 | 400.7 | 104.87 |
| pGAP | 100.0 | 100.0 | ||
d) 실시예 2c의 피. 파스토리스 클론의 eGFP 유전자 카피 수(GCN)의 결정
GCN은 피. 파스토리스 게놈 내로 통합된 리포터 단백질 발현 카세트의 수를 나타낸다. pCS1 또는 pGAP의 조절하에 eGFP를 발현하는 클론의 GCN 결정은 하기 실시예 5에 추가로 기재된 바와 같이 수행했다. eGFP 발현 수준은 실시예 2c와 같이 분석했다. 예시적으로, 각 프로모터의 하나의 클론의 결과는 표 5에 제시되어 있다. 신규한 pCS1 프로모터의 조절하에 eGFP를 발현하는 클론은 스크리닝 배양물에서 동일한 GCN으로 pGAP 프로모터하에 발현하는 클론과 비교하여 2배 양의 eGFP를 생산했다.
| 클론 | FL/세포 크기 | GCN | 형광/ 세포 크기/GCN |
| pGAP_eGFP#2 | 6.0 | 1 | 6.0 |
| pCS1_eGFP#4 | 13.0 | 1 | 13.0 |
e) 유가식 발효에서 pCS1 프로모터 강도의 분석
생산 프로세스-유사 조건에서 pCS1 프로모터 활성을 평가하기 위해, 각각 1개 카피의 eGFP 발현 카세트(실시예 2d 참조)를 포함하는 하나의 pCS1 클론(pCS1_eGFP#4) 및 하나의 pGAP 클론(pGAP_eGFP#2)의 유가식 배양을 수행했다.
유가식 발효는 최종 작업 용적 1.0 L로 DASGIP 반응기로 수행했다.
다음 배지를 사용했다:
리터당 함유된 PTM1 미량 염 보존액
6.0g CuSO4·5H2O, 0.08g NaI, 3.36g MnSO4·H2O, 0.2g Na2MoO4·2H2O, 0.02g H3BO3, 0.82g CoCl2, 20.0g ZnCl2, 65.0g FeSO4·7H2O, 0.2g 비오틴 및 5.0ml H2SO4 (95%-98%).
리터당 함유된 글리세롤 배치 배지
2g 시트르산 1수화물(C6H8O7·H2O), 39.2g 글리세롤, 12.6g NH4H2PO4, 0.5g MgSO4·7H2O, 0.9g KCl, 0.022g CaCl2·2H2O, 0.4mg 비오틴 및 4.6ml PTM1 미량 염 보존액. HCl을 첨가하여 pH를 5로 설정하였다.
리터당 함유된 글리세롤 유가식 배지
464g 글루코즈 1수화물, 5.2g MgSO4·7H2O, 8.4g KCl 및 0.28g CaCl2·2H2O, 0.34mg 비오틴 및 10.1ml PTM1 미량 염 보존액.
용해된 산소를 교반기 속도(400 내지 1200rpm)으로 DO = 20%에서 조절했다. 통기 속도는 24Lh- 1 공기였고, 온도는 25℃에서 조절하고, pH 설정값 5는 NH4OH(25%)를 첨가하여 조절했다.
발효를 개시하기 위해, 400mL 배치 배지를 발효조에서 멸균 여과시키고, 피. 파스토리스 클론 pCS1_eGFP#1을 출발 광학 밀도(OD 600) 1로 접종했다(예비배양으로부터). (약 20g/L의 무수 생물량 농도에 도달하는) 약 25시간의 배치 단계에는 7시간 동안 지수 공급 및 13시간 동안 일정한 공급 속도 15g/L로 개시하는 글로코즈 제한 유가식을 수행하여 최종 무수 생물량 농도 약 110g/L를 유도한다. 샘플은 배치 및 유가식 단계 동안 취했고, 플레이트 판독기(Infinite 200, Tecan, CH)를 사용하여 eGFP 발현에 대해 분석했다. 발효는 이중으로 수행한다. 따라서, 샘플을 광학 밀도(OD600) 5로 희석시켰다. 결과는 생물반응기당 상대적 형광(FL/r)으로서 표 6에 나타낸다. pCS1 프로모터의 조절하에 클론 발현은 전체 발효 프로세스 동안 pGAP와 비교하여 평균 4.2배 더 높은 eGFP 발현을 가졌다.
| pGAP_eGFP#2 | pCS1_eGFP#1 | 비교 FL/r | |||
| t [h] | FL/r | STDEV | FL/r | STDEV | pCS1/pGAP |
| -4.5 | 2.1 | 0.1 | 9.3 | 0.6 | 4.4 |
| 0.8 | 4.7 | 0.1 | 16.8 | 0.9 | 3.6 |
| 2.3 | 5.9 | 1.0 | 20.2 | 1.5 | 3.4 |
| 4.3 | 9.2 | 0.1 | 35.3 | 1.4 | 3.8 |
| 6.8 | 14.2 | 0.6 | 57.6 | 4.0 | 4.1 |
| 17.9 | 57.6 | 4.2 | 288.2 | 15.6 | 5.0 |
| 19.9 | 86.0 | 16.6 | 337.3 | 26.5 | 3.9 |
| 21.6 | 73.9 | 9.7 | 379.9 | 41.7 | 5.1 |
f) 상이한 성장 조건 및 기질에서 pCS1의 프로모터 활성
상이한 배지 조성 및 성장 조건에 대한 pCS1의 프로모터 활성에 대한 보다 많은 정보를 수득하기 위해, 균주 pCS1_eGFP#4는 상이한 탄소원을 함유하는 YP 배지, 상이한 PH 값 및 합성 최소 배지에서 배양했다. 샘플은 주배양의 접종 후 24시간 및 48시간에서 채취하고, 실시예 2c에 기재된 바와 같이 유동 세포계수법으로 분석했다.
참조로서 pCS1-eGFP#4 또는 pGAP-eGFP#2의 단일 콜로니를 예비-배양으로서 액체 YPG-Zeo 배지(1리터당: 20g 펩톤, 10g 효모 추출물, 12.6g 글리세롤 및 25mg 제오신)에 접종했다. 대략 24시간 후, 예비-배양물을 사용하여, 주배양물을 2mL 주배양 배지에서 0.1의 OD600으로 접종시켰다. 주배양 배지는 다음과 같다: 1리터당 YP: 20g 펩톤; 10g 효모 추출물, pH 7.0-7.5; YPD: YP + 2% 글루코즈, YPG: YP + 2% 글레세롤; YPM: YP + 1%메탄올; YPE: YP + 1% 에탄올; YP 공급물 비드: YP + 1 글루코즈 공급물 비드(kuhner, CH, 직경 6mm); YPD ph4.5: HCL로 pH 4.5로 설정된 YPD: 합성 스크리닝 배지(1리터당: 22g 글루코즈 1수화물, 22g 시트르산, 3.15g (NH4)2HPO4ㆍH2O, 0.027g CaCl2·2H2O, 0.9g KCl, 0.5g MgSO4·7H2O, 2mL 500 X 비오틴 및 1.47ml 미량 염 스톡 용액 [리터당: 6g CuSO4ㆍ5H2O, 0.08g NaI, 3g MnSO4ㆍH2O, 0.2g Na2MoO4ㆍ7H2O, 0.02g H3BO3, 0.5g CoCl2, 20g ZnCl2, 5g FeSO4ㆍ7H2O 및 5mL H2SO4]; 5M KOH를 사용하여 5로 설정된 pH; 여과에 의해 멸균). 공급물 비드를 갖는 하나를 제외한 모든 배양물에는 19시간 및 43시간 후에 0.5%의 각 탄소원이 공급되었다. 세포 크기당 eGFP 형광의 결과는 표 7에 제시되어 있다.
YPD에 대해, pCS1 발현 수준은 24시간 및 48시간 후에 pGAP 발현 수준을 2배 초과한 반면, YPG에 대해 pCS1 발현 수준은 24시간 및 48시간 후에 3.9배 더 높았다. 신규 pCS1 프로모터의 조절하의 발현 수준은, 메탄올 또는 에탄올을 탄소원으로 사용하거나 pH 4.5에서 배양하는 경우(표 7)에도 더 높았다.
| 클론 | 주배양 배지 | 24시간 | 48시간 |
| pGAP_eGFP#2 | YPD | 291.0 | 392.9 |
| pGAP_eGFP#2 | YPG | 194.8 | 393.0 |
| pCS1_eGFP#4 | YPD | 598.7 ± 6.4 | 890.2 ± 52.2 |
| pCS1_eGFP#4 | YPG | 770.8 ± 17.5 | 1521.4 ± 77.2 |
| pCS1_eGFP#4 | YP+글루코즈 공급 비드 |
724.3 ± 4.6 | 1559.3 ± 28.3 |
| pCS1_eGFP#4 | YPM | 844.0 ± 25.4 | 1526.4 ± 65.3 |
| pCS1_eGFP#4 | YPE | 873.1 ± 16.0 | 1658.0 ± 344.4 |
| pCS1_eGFP#4 | YPD, pH 4.5 | 742.1 ± 62.8 | 1938.8 ± 62.9 |
| pCS1_eGFP#4 | SCD, pH 5.0 | 382.4 ± 11.5 | 1072.2 ± 167.1 |
실시예 3: 세포외 발현된 리포터 유전자로서 인간 혈청 알부민(HSA)을 사용하는 피. 파스토리스에서 신규 동정된 프로모터 pCS1의 비교 프로모터 활성 연구
분비된 리포터 단백질 HSA의 발현을 위한 신규 동정된 프로모터의 특성을 분석하기 위해, 진탕 플라스크 스크리닝을 다음과 같이 수행했다: 24시간 동안 예비배양은 프로세스의 배치 단계를 시뮬레이팅하는 - 탄소원으로 글리세롤을 함유하는 농후 배지로 수행하고, 이어서 완충된 농후 배지(2% 글루코즈)에서 주배양을 수행했다. 주배양물에는 12시간마다 0.5% 글루코즈가 공급되었다.
a) 균주 & 발현 벡터
피. 파스토리스 야생형 균주(CBS2612, CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands)를 숙주 균주로서 사용했다. 균주의 형질전환은 pPUZZLE라 명명되는 내부 벡터를 사용하여 수행되었고[참조: Stadlmayr et al. J. Biotechnol 2010 Dec;150(4):519-29], 양성 형질전환체의 선택은 제오신 내성을 기초로 했다. 인간 혈청 알부민(HSA)의 분비 발현을 위해, 이의 천연 분비 리더를 사용했다.
b) 내부 발현 벡터에서 신규 동정된 프로모터 pCS1의 증폭 및 클로닝
실시예 2b에서 증폭된 프로모터를 pPUZZLE 발현 벡터 pPM1aZ10_HSA에 클로닝하여 pPM1aZ10_pCS1_HSA를 생성했다. 또한, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제 프로모터의 통상 사용된 프로모터(pGAP)를 함유하는 벡터 pPM1aZ10_pGAP_HSA를 참조로 사용했다. 프로모터는 ApaI 및 SbfI 제한 부위(표 3 참조)를 사용하여 HSA 유전자의 개시 코돈의 상류에 삽입했다. 프로모터 서열의 정확성은 생거 서열분석에 의해 확인했다.
c) 신규 동정된 프로모터 pCS1의 조절하에 피. 파스토리스에서 HSA의 발현
모든 플라스미드는 피. 파스토리스 내로 (피. 파스토리스를 위한 표준 형질전환 프로토콜을 사용하여) 전기천공 전에 Ascl 제한 효소를 사용하여 선형화했다. 양성 형질전환체의 선택은 25㎍/mL 제오신을 함유하는 YPD 플레이트(1리터당: 10g 효모 추출물, 20g 펩톤, 20g 글루코즈, 20g 한천-한천) 플레이트 상에서 수행했다. 콜로니 PCR은 실시예 2c에 기재된 바와 같이 형질전환된 플라스미드의 존재를 보장하기 위해 사용되었다.
HSA 발현 스크리닝을 위해, 단일 콜로니를 예비배양물로서 액체 YPG-Zeo 배지(1리터당: 20g 펩톤, 10g 효모 추출물, 12.6g 글리세롤 및 25mg 제오신)에서 접종했다. 약 24시간 후, 예비배양물을 사용하여 BM 배지(1리터당: 20g 펩톤, 10g 효모 추출물, 20g 글루코즈, 황산암모늄과의 13.4g 효모 질소 염기, 0.4mg 비오틴 및 100mM 인산칼륨 완충제 pH 6.0)에서 OD600 0.1로 주배양물을 접종했다. 주배양물에는 12시간마다 0.5% 글루코즈를 공급한다. 샘플은 주배양의 말기에 취했다. 생물량 농도는 OD600 또는 습윤 세포 중량을 측정하여 결정했다. 배양물 상청액 중의 HSA 농도는 공급자의 지침 메뉴얼에 따라 인간 알부민 ELISA 정량화 세트(카탈로그 번호 E80-129, 베틸 라보라토리즈, 텍사스, 미국)에 의해 정량화했다. HSA 표준은 40ng mL-1의 개시 농도로 사용했다. 샘플은 따라서 샘플 희석액(50mM 트리스-HCl, 140mM NaCl, 1%(w/v)의 BSA, 0.05%(v/v)의 트윈20, pH8.0)으로 희석시켰다. pGAP(1개 HSA 유전자 카피)의 조절하에 HSA를 발현하는 클론 및 pCS1의 조절하에 eGFP를 발현하는 9개 클론의 스크리닝으로부터의 HSA 역가는 표 8에 나타낸다. 모든 pCS1-조절된 클론은 1개의 유전자 카피를 갖는 pGAP-조절된 클론과 비교하여 HSA의 양을 2배 분비했다. HSA의 GCN은 실시예 5에 기재된 바와 같이 결정했다. pCS1의 조절하에 모든 분석된 클론은 발현 카세트의 1개 카피를 함유했다(1GCN). 따라서, 신규 pCS1 프로모터의 조절하에 모든 클론은 스크리닝 배양물에서 동일한 GCN을 갖는 pGAP 클론보다 2배 높은 HSA 분비 수율(분비된 HSA mg/생물량 g)을 가졌다.
| 클론 | HSA [mg/L] 48h 주배양 |
| pGAP_HSA #3 (1GCN) | 32.8 |
| pCS1_HSA | 76.5 +/- 5.0 |
실시예 4: pCS1 프로모터의 조절하에 HSA를 발현하는 피. 파스토리스 균주의 유가식 배양
생산 프로세스-유사 조건에서 HSA의 발현을 유도하는 pCS1의 능력을 분석하기 위해, HSA 발현 카세트의 1개 카피를 함유하는 하나의 pCS1 클론(pCS1_HSA#1)의 유가식 배양(실시예 3)을 수행했다.
발효는 1.0L의 최종 작업 용적을 갖는 DASGIP 생물반응기에서 수행했다. pGAP의 조절하에 HSA를 발현시키는 2개의 상이한 피. 파스토리스 균주(문헌[참조: Prielhofer et al. 2013. Microb. Cell. Fact. 12:5]에 기재된, 하나의 HSA 유전자 카피를 갖는 pGAP_HSA#3, 및 2개의 HSA 유전자 카피를 갖는 pGAP_HSA#4)를 참조로서 배양했다.
다음 배지를 사용했다:
리터당 함유된 PTM1 미량 염 보존액
6.0g CuSO4·5H2O, 0.08g NaI, 3.36g MnSO4·H2O, 0.2g Na2MoO4·2H2O, 0.02g H3BO3, 0.82g CoCl2, 20.0g ZnCl2, 65.0g FeSO4·7H2O, 0.2g 비오틴 및 5.0ml H2SO4 (95%-98%).
리터당 함유된 글리세롤 배치 배지
39.2g 글리세롤, 27.9g H3PO4(85%), 7.8g MgSO4·7H2O, 2.6g KOH, 9.5g K2SO4, 0.6g CaSO4·2H2O, 0.4mg 비오틴 및 4.6ml PTM1 미량 염 보존액. 발효조에서 멸균 여과 후 pH를 5.85로 조정하였다.
리터당 함유된 글루코즈 유가식 배지
550g 글루코즈 1수화물, 6.5g MgSO4·7H2O, 10g KCl, 0.35g CaCl2·2H2O, 0.4mg 비오틴 및 12ml PTM1 미량 염 보존액.
용해된 산소를 교반기 속도(400 내지 1200rpm)로 DO = 20%에서 조절했다. 통기 속도는 24Lh- 1 공기였고, 온도는 25℃에서 조절하고, pH 설정값 5.85는 NH4OH(25%)를 첨가하여 조절했다.
발효를 개시하기 위해, 400mL 배치 배지를 발효조에서 멸균 여과시키고, 피. 파스토리스를 출발 광학 밀도(OD 600) 1로 접종했다(예비배양으로부터). 약 25시간의 배치 단계는 약 20g/L의 무수 생물량 농도에 도달하고, 이어서 글로코즈 배지의 일정 공급에 의한 유가식을 100시간 동안 수행하여 무수 생물량 농도 약 100g/L를 유도한다. 배치 동안 pH는 5.8이었고, 발효 내내 5.85로 유지하였다. 샘플은 배치 및 유가식 단계 동안 취했다. HSA 농도는 실시예 3c에 기재된 바와 같이 인간 알부민 ELISA 정량화 세트(Bethyl, 카탈로그 번호 E80-129)를 사용하여 정량화했다.
이전에 나타낸 바와 같이, 2HSA 카피를 갖는 pGAP 클론은 하나의 카피를 갖는 pGAP 클론보다 2배 많이 분배했다[참조: Prielhofer et al. 2013. Microb. Cell. Fact. 12:5]. pCS1의 제어하에 HSA를 분비하는 두 클론은 단일 복사 pGAP클론에 비해 배치 및 유가식의 말기에 4배 더 높은 HSA 역가에 도달한다 (결과는 표 9에 제시됨). 생물량 및 GCN에 상관시키면, pCS1 클론은 동일한 유전자 카피 수를 갖는 pGAP 클론의 390% 분비된 HSA를 생산했다.
| 배치식 말기 | 유가식 말기 | |||||||
| 프로모터 | GCN | HSA [mg L-1] |
YDM [g L-1] |
HSA [mg L-1] |
YDM [g L-1] |
PGAP의 HSA/YDM % |
||
| PCS1#1 | 1 | 38.1 | 22.2 | 377.7 | 119.9 | 390.7 | ||
| PGAP#3 | 1 | 8.4 | 22.1 | 78.6 | 97.7 | 100.0 | ||
| PGAP#4 | 2 | 17.4 | 24.4 | 167.7 | 121.0 | 172.0 | ||
실시예 5: 선택된 클론의 유전자 카피 수(GCN)의 결정
발현 강도는 종종 피. 파스토리스 게놈 내로 통합된 발현 카세트의 수와 상관한다. 따라서, 선택된 클론의 유전자 카피 수를 결정했다. 게놈 DNA는 DNeasy 혈액 및 조직 키트를 사용하여 단리했다(Qqiagen, Cat. No. 69504). 유전자 카피 수는 정량적 PCR을 사용하여 결정했다. 따라서, 센시믹스(SensiMix) SYBR 키트(Bioline, QT605-05)를 사용했다. 센시믹스 SYBR을 각각의 프라이머[참조: Prielhofer et al. 2013. Microb. Cell. Fact. 12:5에 제공됨] 및 샘플과 혼합하고, 실시간 PCR 사이클러(Roter Gene, Qiagen)에서 실시간 분석을 위해 적용했다. 모든 샘플은 삼중 또는 사중으로 분석했다. 로터 유전자 소프트웨어는 데이터 분석용으로 사용했다.
실시예 6: 세포외 발현된 리포터 유전자로서 돼지 카복시펩티다제 B(CpB)를사용하여 피. 파스토리스에서 신규 동정된 프로모터 pCS1의 비교 프로모터 활성 연구
신규 동정된 프로모터의 특성을 분석하기 위해, 진탕 플라스크 스크리닝을 다음과 같이 수행했다: 24시간 동안 예비배양은 탄소원으로 글리세롤을 함유하는 농후 배지로 수행하였고, 농후 배지로 주배양을 수행했다.
a) 균주 & 발현 벡터
피. 파스토리스 야생형 균주(CBS2612, CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands)를 숙주 균주로서 사용한다. 균주의 형질전환은 pPUZZLE라 명명되는 내부 벡터를 사용하여 수행하고[참조: Stadlmayr et al. J. Biotechnol 2010 Dec;150(4):519-29], 양성 형질전환체의 선택은 제오신 내성을 기초로 했다. 돼지 카복시펩티다제 B(CpB)의 분비 발현을 위해, 효모 알파 접합 인자 리더를 사용한다.
b) 내부 발현 벡터에서 신규 동정된 프로모터 pCS1의 증폭 및 클로닝
실시예 2b에서 증폭된 프로모터는 pPUZZLE 발현 벡터 pPM1aZ30_aMF_CpB에서 클로닝하여 pPM1aZ30_pCS1_aMF_CpB를 제공했다. 또한, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제 프로모터의 통상 사용된 프로모터(pGAP)를 함유하는 벡터 pPM1aZ30_pGAP_CpB를 참조로 사용했다. 프로모터는 ApaI 및 SbfI 제한 부위를 사용하여 CpB 유전자의 개시 코돈의 상류에 삽입했다. 프로모터 서열의 정확성은 생거 서열분석에 의해 확인했다.
c) 신규 동정된 글루코즈 제한 유도 프로모터의 조절하에 피. 파스토리스에서 CpB의 발현
플라스미드는 피. 파스토리스 내로 (피. 파스토리스를 위한 표준 형질전환 프로토콜을 사용하여) 전기천공 전에 AscI 제한 효소를 사용하여 선형화했다. 양성 형질전환체의 선택은 25㎍/mL의 제오신을 함유하는 YPD 플레이트(1리터당: 10g 효모 추출물, 20g 펩톤, 20g 글루코즈, 20g 한천-한천) 플레이트 상에서 수행한다. 콜로니 PCR은 실시예 2c에 기재된 바와 같이 형질전환된 플라스미드의 존재를 보장하기 위해 사용된다.
CpB 발현 스크리닝을 위해, 단일 콜로니를 예비배양물로서 액체 YPG-Zeo 배지(1리터당: 20g 펩톤, 10g 효모 추출물, 12.6g 글리세롤 및 25mg 제오신)에서 접종했다. 약 24시간 후, 예비배양물을 사용하여 YPD 배지(1리터당: 20g 펩톤, 10g 효모 추출물, 20g 글루코즈)에서 OD600 1로 주배양물을 접종했다. 주배양물에는 12시간마다 0.5% 글루코즈를 공급한다. 샘플은 예비배양 말기 및 주배양물의 접종 후 24시간 및 48시간에 취했다. 생물량 농도는 OD600 또는 습윤 세포 중량을 측정하여 결정했다. 배양물 상청액 중의 CpB 농도는, CpB에 의한 힙푸릴-L-아르기닌의 힙푸르산으로의 전환에 기초하여, 효소 검정으로 정량화한다. 반응 동력학은 반응이 개시될 때 히타치 U-2910 분광광도계를 사용하여 25℃에서 254㎚에서의 흡수를 모니터링하여 측정한다. 샘플 및 표준을 검정 완충액(25mM 트리스, 100mM HCl, pH 7.65)으로 완충시키고, 활성화 완충액(0.01mgL-1 트립신, 300mM 트리스, 1μM ZnCl2, pH 7.65)을 사용하여 활성화시킨다. 트립신 부재하의 활성화 완충액은 음성 대조군으로서 샘플 대신 사용한다. 반응은 기질 용액(검정 완충액 중의 1mM 힙푸릴-L-아르기닌)을 첨가하여 개시한다.
d) pCS1 프로모터의 조절하에 CpB를 발현하는 피. 파스토리스의 유가식 배양
유가식 발효는 실시예 2d에 기재된 배지를 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행한다.
실시예 7: 세포외 발현된 리포터 유전자로서 인간 혈청 알부민(HSA)을 사용하여 피. 파스토리스 다중카피 클론에서 신규 동정된 프로모터 pCS1의 비교 프로모터 활성 연구
HSA 생산이 보다 높은 GCN에 의해 추가로 증강될 수 있는지를 조사하기 위해, HSA를 발현하는 pCS1 클론을 문헌[참조: Marx et al., (2009]에 기재된 바와 같이 형질전환후 벡터 증폭 방법에 의해 증폭시켰다. 상동성 재조합에 의해 rDNA 유전자좌 내로 통합되는 벡터가 생성되었다. 증폭은 항생물질의 농도를 증가시키는 단계식으로 선택에 의해 수행했다.
a) 균주 및 발현 벡터
피. 파스토리스 야생형 균주(CBS2612, CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands)를 숙주 균주로서 사용했다. 균주의 형질전환은 통합 부위로서 리보솜 DNA 유전자좌의 NTS 영역을 함유하는 벡터 pPUZZLE의 변이체로 수행하고[참조: Marx et al. 2009. FEMS Yeast Res. 9(8): 1260-70.], 양성 형질전환체의 선택은 제오신 내성을 기초로 했다. 인간 알부민(HSA)의 분비 발현을 위해, 이의 천연 분비 리더를 사용했다.
실시예 2b에서 증폭된 pCS1 프로모터는 pPUZZLE 발현 벡터 pPM1nZ30_HSA 내로 클로닝하여 pPM1nZ30_pCS1_HSA을 제공한다.
프로모터는 ApaI 및 SbfI 제한 부위를 사용하여 HSA 유전자의 개시 코돈의 상류에 삽입한다. 프로모터 서열의 정확성은 생거 서열분석에 의해 확인했다.
b) 신규 동정된 프로모터 pCS1의 조절하에 피. 파스토리스에서 HSA의 형질전환후 벡터 증폭 및 발현
플라스미드는 피. 파스토리스에서 (피. 파스토리스를 위한 표준 형질전환 프로토콜을 사용하여) 전기천공 전에 Spel 제한 효소를 사용하여 선형화했다. 양성 형질전환체의 초기 선택은 25㎍/mL의 제오신을 함유하는 YPD 플레이트(1리터당: 10g 효모 추출물, 20g 펩톤, 20g 글루코즈, 20g 한천-한천) 플레이트 상에서 수행한다. 콜로니 PCR은 실시예 2c에 기재된 바와 같이 형질전환된 플라스미드의 존재를 보장하기 위해 사용된다. 유전자 카피 수 증폭은 보다 높은 제오신 농도(50, 100 및 500㎍/mL 제오신)을 함유하는 YPD 한천 플레이트 상에서 클론의 반복된 스트리킹에 의해 문헌[참조: Marx et al., FEMS Yeast Res. 2009 Dec; 9(8): 1260-70]에 기재된 바와 같이 수행했다.
HSA ELISA에 의한 HSA 발현 스크리닝 및 생성물 정량화는 실시예 3c에 기재된 바와 같이 수행했다. GCN은 실시예 5에 기재된 바와 같이 최고 HSA 분비 수준을 갖는 일부 클론의 것으로 결정되었다. 대조군으로 공지된 GCN(1 또는 2)를 갖는 GCN-증폭된 Pcs1 클론 및 PGAP 및 PCS1 클론은 48시간 동안 BM 배지에서 배양했다.
HSA GCN을 증가시킴으로써, HSA 분비 수준은 또한 증가할 수 있다(표 10에 제시됨). 3HSA 유전자 카피를 갖는 pCS1의 조절하에 HSA를 발현하는 다중카피 클론은 단일 카피 클론과 비교하여 WCW당 2 또는 3배 높은 양의 HSA를 생산했다. 다중카피 pCS1 클론의 생산성에서 유사한 증가는 실시예 4에서 제시된 유가식 생물반응기 배양에서 예상될 수 있다.
| 클론 | ㎍ HSA/g WCW | GCN | ㎍ HSA/g WCW/GCN |
| pGAP_HSA#3 | 291.0 | 1 | 291.0 |
| pGAP_HSA#4 | 476.2 | 2 | 238.1 |
| pCS1_HSA#1 | 540.7 | 1 | 540.7 |
| pCS1_HSA#1_25-100#7 | 1464.1 | 3 | 488.0 |
| pCS1_HSA#1_50-100#5 | 1178.3 | 4 | 294.6 |
| pCS1_HSA#1_50-100#9 | 1580.7 | 3 | 526.9 |
실시예 8: 세포외 발현된 리포터 유전자로서 항체 단편(Fab)를 사용하여 피. 파스토리스에서 신규 동정된 프로모터 pCS1의 비교 프로모터 활성 연구
신규 동정된 프로모터의 특성을 분석하기 위해, 진탕 플라스크 스크리닝을 다음과 같이 수행했다: 24시간 동안 예비배양은 탄소원으로 글리세롤을 함유하는 농후 배지로 수행하였고, 이어서 농후 배지로 주배양을 수행했다.
a) 균주 & 발현 벡터
피. 파스토리스 야생형 균주(CBS2612, CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands)를 숙주 균주로서 사용한다. 실시예 2b에서 증폭된 pCS1은 GOI로서 HyHEL의 LC 또는 Fab-HC를 함유하는 pPUZZLE 발현 벡터로 클로닝시켰다. 프로모터는 ApaI 및 SbfI 제한 부위를 사용하여 Fab 유전자의 개시 코돈의 상류에 삽입했다. 서열 입증 후, 양 쇄에 대한 발현 카세트는 호환성 제한 효소 MreI 및 AgeI를 사용하여 하나의 벡터에 합했다.
b) 신규 동정된 프로모터의 조절하에 피. 파스토리스에서 Fab의 발현
플라스미드는 피. 파스토리스 내로 (피. 파스토리스를 위한 표준 형질전환 프로토콜을 사용하여) 전기천공 전에 AscI 제한 효소를 사용하여 선형화했다. 양성 형질전환체의 선택은 25㎍/mL의 제오신을 함유하는 YPD 플레이트(1리터당: 10g 효모 추출물, 20g 펩톤, 20g 글루코즈, 20g 한천-한천) 플레이트 상에서 수행한다. 콜로니 PCR은 실시예 2c에 기재된 바와 같이 형질전환된 플라스미드의 존재를 보장하기 위해 사용된다.
Fab 발현 스크리닝은 실시예 3c에 기재된 HSA 발현 스크리닝과 유사하게 수행했다. 순수한 Fab의 정량화는 코팅 항체(1:1,000)로서 항-인간 IgG 항체(Abcam ab7497), 및 검출 항체(1:1,000)로서 염소 항-인간 카파 경쇄(Bound and Free) - 알칼리 포스파타제 접합된 항체(Sigma A3813)을 사용하여 ELISA에 의해 수행했다. 인간 Fab/카파, IgG 단편(Bethyl P80-115)은 50ng/mL의 개시 농도로 표준으로 사용했다. 상청액 샘플을 따라서 희석했다. 검출은 pNPP 기질(Sigma S0942)로 수행했다. 코팅, 희석 및 세척 완충제는 PBS(2mM KH2PO4, 10mM Na2HPO4ㆍ2H2O, 2.7mM g KCl, 8mM NaCl, pH 7.4)에 기초하고, 따라서 BSA(1%(w/v)) 및/또는 트윈20(0.1%(v/v))로 완료했다.
선택된 클론으로부터의 게놈 DNA를 단리하고, 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)로부터의 GCN은 실시예 5에 기재된 바와 같이 결정했다. GCN은 클론 PCS1#5와 관련되고, 이를 위한 HC 및 LC GCN은 1로 설정했다. Fab 발현 수율(㎍ Fab/g WCW), 상대 GCN, 및 GCN당 Fab 수율은 표 11에 제시되어 있다. 다른 모델 단백질에 대해, GCN당 대략 2배 높은 Fab 수율(평균 35.4㎍ Fab/gWCW)은 pGAP의 조절하에 발현하는 클론과 비교하여 pCS1의 조절하에 발현하는 클론에 대해 수득되었다.
| 클론 | [㎍ Fab g-1 WCW] | pCS1_Fab#5와 관련된 상대 GCN |
GCN당 Fab 수율 [㎍ Fab g-1 WCW] |
||
| 중쇄 | 경쇄 | 중쇄 | 경쇄 | ||
| pGAP_Fab#34 | 73.3 | 4 | 3 | 18 | 24 |
| pCS1_Fab#2 | 35.9 | 1 | 1 | 36 | 36 |
| pCS1_Fab#4 | 66.8 | 2 | 2 | 33 | 33 |
| pCS1_Fab#5 | 34.7 | 1 | 1 | 34.7 | 34.7 |
| pCS1_Fab#7 | 37.5 | 1 | 1 | 38 | 37.5 |
c) pCS1 프로모터의 조절하에 Fab를 발현하는 피. 파스토리스 균주의 유가식 배양
유가식 배양은 실시예 2d에 기재된 배지를 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 유사하게 수행했다.
생물반응기 배양에서, pCS1의 조절하에 Fab 발현은 pGAP와 비교하여 GCN당 3.0배 높은 특정한 생산성을 제공했다(표 12 참조).
| 클론 | Fab 수율 [mg Fab g-1 DCW] |
qP [㎍ Fab g-1 DCW h-1] | pCS1_Fab#5와 관련된 상대 GCN |
GCN당 qP | ||
| 중쇄 | 경쇄 | 중쇄 | 경쇄 | |||
| pGAP_Fab#34 | 0.220 | 2.18 | 4 | 3 | 0.55 | 0.73 |
| pCS1_Fab#4 | 0.262 ± 0.000 | 3.51 ± 0.14 | 2 | 2 | 1.76 | 1.76 |
| pCS1_Fab#5 | 0.178 | 2.54 | 1 | 1 | 2.54 | 2.54 |
실시예 9: pCS1의 변이체의 비교
pCS1 프로모터의 긴 변이체는 실시예 2a에 기재된 바와 같이 클로닝하고, 실시예 2c에 기재된 바와 유사하게 스크리닝했다. pCS1(표준 길이) 및 pGAP의 조절하에 발현하는 클론은 대조군으로 사용했다. pCS1 및 이의 변이체의 전방 프라이머 및 길이는 표 13에 수록되어 있다.
| 변이체 | 전방 프라이머 | 길이(bp) |
| pCS1 (표준) 서열번호 1 |
GATAGGGCCCCAGGGCATCATTGAGGTTTCCAC 서열번호 16 |
985 |
| pCS1-1488 서열번호 2 |
GATAGGGCCCGATAGTTCTAGAAGACCTGGCGTCG 서열번호 17 |
1488 |
| pCS1-767F 서열번호 3 |
GATAGGGCCCAGCCAACCATCTTTTGTTTCG 서열번호 18 |
767 |
| pCS1-500F 서열번호 4 |
GATAGGGCCCGTGGTTTCCAGGACAACACCC 서열번호 19 |
500 |
| pCS1-344F 서열번호 5 |
GATAGGGCCCGACCGCAATTCACCATGATGC 서열번호 20 |
344 |
| pCS1-234F 서열번호 6 |
GATAGGGCCCAGCCTGCTTCATTCCTGCC 서열번호 21 |
234 |
| pCS1-138F 서열번호 7 |
GATAGGGCCCCCGCGAAAAAGGTTTGTTTATAG 서열번호 22 |
138 |
| pCS1-85F 서열번호 8 |
GATAGGGCCCCATACTCTCCTCCCCCCCCTG 서열번호 23 |
85 |
pGAP, pCS1 또는 pCS1 변이체의 조절하에 eGFP를 발현하는 클론의 스크리닝은 pCS1이 최적 활성을 위해 대략 500bp의 최소 길이를 필요로 하는 것을 나타냈다. 보다 짧은 pCS1 변이체는 길이 감소에 따라 활성이 완만해진다(표 14 참조).
| 클론 | FL/세포 크기, 24 h |
FL/세포 크기, 48 h |
| pGAP_eGFP#2 | 15.39 | 17.59 |
| pCS1_eGFP#4 | 25.30 | 37.77 |
| pCS1_85pool | -0.15 | 0.04 |
| pCS1_138pool | 7.70 | 6.30 |
| pCS1_234pool | 18.57 | 19.71 |
| pCS1_344pool | 25.19 | 27.63 |
| pCS1_500pool | 28.50 | 38.82 |
| pCS1_767pool | 26.88 | 36.47 |
| pCS1_1488pool | 30.59 | 44.40 |
실시예 10: 높은 및 낮은 성장 속도에서 성장-제한된 조건하에 상기 프로모터의 조절하에 eGFP를 발현하는 클론에서 프로모터의 발현 강도의 검증
a) 균주
"목적 프로모터"의 조절하에 eGFP를 발현하는 숙주 균주(예: 피키아 파스토리스) 및 pGAP의 조절하에 eGFP를 발현하는 균주를 사용하여 발현 수준을 비교한다.
b) 프로모터 비교를 위한 eGFP 발현 균주의 배양
이들 균주는 1.0L의 최종 작업 용적을 갖는 DASGIP 생물반응기를 사용하여 2개의 고정된 특정 성장 속도(희석 속도를 설정하여 하나의 낮은 특정 성장 속도 및 하나의 높은 특정 성장 속도)로 케모스타트에서 배양한다.
하기 배지를 사용한다:
리터당 함유된 PTM1 미량 염 보존액
6.0g CuSO4ㆍ5H2O, 0.08g NaI, 3.36g MnSO4ㆍH2O, 0.2g Na2MoO4ㆍ2H2O, 0.02g H3BO3, 0.82g CoCl2, 20.0g ZnCl2, 65.0g FeSO4ㆍ7H2O, 0.2g 비오틴 및 5.0ml H2SO4(95%-98%).
리터당 함유된 글리세롤 배치식 배지
2g 시트르산 1수화물(C6H8O7ㆍH2O), 39.2g 글리세롤, 12.6g NH4H2PO4, 0.5g MgSO4ㆍH2O, 0.9g KCl, 0.022g CaCl2ㆍH2O, 0.4mg 비오틴 및 4.6ml PTM1 미량 염 보존액. HCl을 첨가하여 pH를 5로 설정한다.
리터당 함유된 케모스타트 배지
2.5g 시트르산 1수화물(C6H8O7ㆍH2O), 55.0g 글루코즈 1수화물, 21.75g (NH4)2HPO4, 1.0g MgSO4ㆍH2O, 2.5g KCl, 0.04g CaCl2ㆍH2O, 0.4mg 비오틴 및 2.43mL PTM1 미량 염 보존액. HCl을 첨가하여 pH를 5로 설정한다.
용해된 산소를 교반기 속도(400 내지 1200rpm)으로 DO = 20%에서 조절했다. 통기 속도는 24Lh- 1 공기였고, 온도는 25℃에서 조절하고, pH 설정값 5는 NH4OH(25%)를 첨가하여 조절했다. 발효를 개시하기 위해, 400mL 배치 배지를 발효조에서 멸균 여과시키고, 피. 파스토리스 클론을 출발 광학 밀도(OD 600) 1로 접종했다(예비배양으로부터). (약 20g/L의 무수 생물량 농도에 도달하는) 약 25시간의 배치 단계 후에 글로코즈 제한 케모스타트 배양(glucose-limited chemostat cultivation)을 수행했다. 케모스타트 배지의 공급 속도 및 수거 속도는 목적하는 일정한 특정 성장 속도를 유지하기 위해 사용했다. 배양 동안, 배양 브로쓰 용적을 일정하게 유지하고, 세포 건조 중량은 일정한 성장 속도를 보장하기 위해 결정한다. 세포는 각각 0.15 및 0.015h-1의 높은 및 낮은 성장 속도에서 배양한다. 따라서, 공급/수거 속도는 각각 150mLh-1 L-1(배양 브로쓰 L 및 시간당 케모스타트 배지 L) 및 15mLh-1 5L-1로 조절한다.
c) 샘플링
샘플은 정지상 조건(적어도 5용적 교환 후)에 취하고, 플레이트 판독기(Infinite 200, Tecan, CH)를 사용하여 eGFP 발현에 대해 분석한다. 따라서, 샘플은 5의 광학 밀도(OD600)으로 희석한다. 발효는 이중으로 수행한다. 발현 데이터는 실시예 2d)에 기재된 바와 같이 생물반응기당 상대 형광을 계산하여 비교한다.
실시예 11: 높은 및 낮은 비성장 속도에서 높은 전사를 가능하게 하는 피. 파스토리스 프로모터의 동정
높은 및 낮은 성장 속도에서 높은 전사를 가능하게 하는 프로모터를 동정하기 위해, 유전자 발현 패턴의 분석은 DNA 마이크로어레이를 사용하여 수행했다. 높은 및 낮은 성장 속도에서 높은 전사 강도를 나타내는 유전자는 전사체 데이터로부터 선택했다. 따라서, 피. 파스토리스는 각각 0.15 및 0.015h-1의 높은 및 낮은 비성장 속도에서 실시예 10b에 기재된 바와 같이 케모스타트 배양으로 성장시켰다. 샘플링, RNA 정제, 마이크로어레이 하이브리드화를 위한 샘플 제조, 마이크로어레이 분석, 데이터 수집 및 통계학적 평가는 실시예 1c), 1d), 1e) 및 1f)에 기재된 바와 같이 수행한다. 높은 및 낮은 성장 속도에서 높은 전사 강도를 갖는 유전자 및 각각의 프로모터는 높은 및 낮은 성장 속도 조건 둘 다에서 높은 신호 강도를 갖는 유전자에 대해 마이크로어레이 데이터를 검색함으로써 동정했다. 제2 기준으로서, 신호 강도는 양 조건에서 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAP, 동의어 GAPDH 및 TDH3) 유전자의 것들보다 높아야 한다. 프로모터를 단리하기 위해, 각 유전자의 개시 코돈 ATG의 상류에 있는 대략 1000bp의 핵산 단편을 증폭시켰다.
SEQUENCE LISTING
<110> Lonza Ltd.
<120> CONSTITUTIVE PROMOTER
<130> LO003P
<150> EP13159527.4
<151> 2013-03-15
<150> US13/835,589
<151> 2013-03-15
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 985
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 1
agggcatcat tgaggtttcc acaaaaggaa gaaacatgga tccagagaca tcaacagaga 60
ggaaagcggg tagtgaagcc gaagccacaa cacagcccga tttggaaggg agttcacaat 120
caaggtgagt ccagccattt tttttctttt tttttttttt attcaggtga acccacctaa 180
ctatttttaa ctgggatcca gtgagctcgc tgggtgaaag ccaaccatct tttgtttcgg 240
ggaaccgtgc tcgccccgta aagttaattt ttttttcccg cgcagcttta atctttcggc 300
agagaaggcg ttttcatcgt agcgtgggaa cagaataatc agttcatgtg ctatacaggc 360
acatggcagc agtcactatt ttgcttttta accttaaagt cgttcatcaa tcattaactg 420
accaatcaga ttttttgcat ttgccactta tctaaaaata cttttgtatc tcgcagatac 480
gttcagtggt ttccaggaca acacccaaaa aaaggtatca atgccactag gcagtcggtt 540
ttatttttgg tcacccacgc aaagaagcac ccacctcttt taggttttaa gttgtgggaa 600
cagtaacacc gcctagagct tcaggaaaaa ccagtacctg tgaccgcaat tcaccatgat 660
gcagaatgtt aatttaaacg agtgccaaat caagatttca acagacaaat caatcgatcc 720
atagttaccc attccagcct tttcgtcgtc gagcctgctt cattcctgcc tcaggtgcat 780
aactttgcat gaaaagtcca gattagggca gattttgagt ttaaaatagg aaatataaac 840
aaatataccg cgaaaaaggt ttgtttatag cttttcgcct ggtgccgtac ggtataaata 900
catactctcc tcccccccct ggttctcttt ttcttttgtt acttacattt taccgttccg 960
tcactcgctt cactcaacaa caaaa 985
<210> 2
<211> 1488
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 2
gatagttcta gaagacctgg cgtcgctggt caactactcg tttcacaagt tgacaaagac 60
ttttaccaag agaagagcag ttgtcaccga ccacaataac aacctggaag ccgagaaaaa 120
acttggaatc tccaaggtga gactgcctag aaatccgtac tctgcggccg atcgaagact 180
gcatttcctc caagaattga tgctcatggt ctcatcttac aatcgcacac acaacagtgt 240
cagtcttctt tgcggtccct tgaacacaac caaccgaaag gtggggaagt ctaatgtcac 300
gcaaacgata ttgcaaccaa tgttgggctc tactggcgtc tggctgcatc aaatagctga 360
tcggttcgta atcttcaaag attggtgtag gacgaacgag tctgctgggc tacaagtttt 420
gccccatatc gctgttcaag ccaacccgcg gaatcccaaa acaccccatc cgacaaaagt 480
tgttgttttc agcagatcta gggagggcat cattgaggtt tccacaaaag gaagaaacat 540
ggatccagag acatcaacag agaggaaagc gggtagtgaa gccgaagcca caacacagcc 600
cgatttggaa gggagttcac aatcaaggtg agtccagcca ttttttttct tttttttttt 660
tttattcagg tgaacccacc taactatttt taactgggat ccagtgagct cgctgggtga 720
aagccaacca tcttttgttt cggggaaccg tgctcgcccc gtaaagttaa tttttttttc 780
ccgcgcagct ttaatctttc ggcagagaag gcgttttcat cgtagcgtgg gaacagaata 840
atcagttcat gtgctataca ggcacatggc agcagtcact attttgcttt ttaaccttaa 900
agtcgttcat caatcattaa ctgaccaatc agattttttg catttgccac ttatctaaaa 960
atacttttgt atctcgcaga tacgttcagt ggtttccagg acaacaccca aaaaaaggta 1020
tcaatgccac taggcagtcg gttttatttt tggtcaccca cgcaaagaag cacccacctc 1080
ttttaggttt taagttgtgg gaacagtaac accgcctaga gcttcaggaa aaaccagtac 1140
ctgtgaccgc aattcaccat gatgcagaat gttaatttaa acgagtgcca aatcaagatt 1200
tcaacagaca aatcaatcga tccatagtta cccattccag ccttttcgtc gtcgagcctg 1260
cttcattcct gcctcaggtg cataactttg catgaaaagt ccagattagg gcagattttg 1320
agtttaaaat aggaaatata aacaaatata ccgcgaaaaa ggtttgttta tagcttttcg 1380
cctggtgccg tacggtataa atacatactc tcctcccccc cctggttctc tttttctttt 1440
gttacttaca ttttaccgtt ccgtcactcg cttcactcaa caacaaaa 1488
<210> 3
<211> 767
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 3
agccaaccat cttttgtttc ggggaaccgt gctcgccccg taaagttaat ttttttttcc 60
cgcgcagctt taatctttcg gcagagaagg cgttttcatc gtagcgtggg aacagaataa 120
tcagttcatg tgctatacag gcacatggca gcagtcacta ttttgctttt taaccttaaa 180
gtcgttcatc aatcattaac tgaccaatca gattttttgc atttgccact tatctaaaaa 240
tacttttgta tctcgcagat acgttcagtg gtttccagga caacacccaa aaaaaggtat 300
caatgccact aggcagtcgg ttttattttt ggtcacccac gcaaagaagc acccacctct 360
tttaggtttt aagttgtggg aacagtaaca ccgcctagag cttcaggaaa aaccagtacc 420
tgtgaccgca attcaccatg atgcagaatg ttaatttaaa cgagtgccaa atcaagattt 480
caacagacaa atcaatcgat ccatagttac ccattccagc cttttcgtcg tcgagcctgc 540
ttcattcctg cctcaggtgc ataactttgc atgaaaagtc cagattaggg cagattttga 600
gtttaaaata ggaaatataa acaaatatac cgcgaaaaag gtttgtttat agcttttcgc 660
ctggtgccgt acggtataaa tacatactct cctccccccc ctggttctct ttttcttttg 720
ttacttacat tttaccgttc cgtcactcgc ttcactcaac aacaaaa 767
<210> 4
<211> 500
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 4
gtggtttcca ggacaacacc caaaaaaagg tatcaatgcc actaggcagt cggttttatt 60
tttggtcacc cacgcaaaga agcacccacc tcttttaggt tttaagttgt gggaacagta 120
acaccgccta gagcttcagg aaaaaccagt acctgtgacc gcaattcacc atgatgcaga 180
atgttaattt aaacgagtgc caaatcaaga tttcaacaga caaatcaatc gatccatagt 240
tacccattcc agccttttcg tcgtcgagcc tgcttcattc ctgcctcagg tgcataactt 300
tgcatgaaaa gtccagatta gggcagattt tgagtttaaa ataggaaata taaacaaata 360
taccgcgaaa aaggtttgtt tatagctttt cgcctggtgc cgtacggtat aaatacatac 420
tctcctcccc cccctggttc tctttttctt ttgttactta cattttaccg ttccgtcact 480
cgcttcactc aacaacaaaa 500
<210> 5
<211> 344
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 5
gaccgcaatt caccatgatg cagaatgtta atttaaacga gtgccaaatc aagatttcaa 60
cagacaaatc aatcgatcca tagttaccca ttccagcctt ttcgtcgtcg agcctgcttc 120
attcctgcct caggtgcata actttgcatg aaaagtccag attagggcag attttgagtt 180
taaaatagga aatataaaca aatataccgc gaaaaaggtt tgtttatagc ttttcgcctg 240
gtgccgtacg gtataaatac atactctcct cccccccctg gttctctttt tcttttgtta 300
cttacatttt accgttccgt cactcgcttc actcaacaac aaaa 344
<210> 6
<211> 234
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 6
agcctgcttc attcctgcct caggtgcata actttgcatg aaaagtccag attagggcag 60
attttgagtt taaaatagga aatataaaca aatataccgc gaaaaaggtt tgtttatagc 120
ttttcgcctg gtgccgtacg gtataaatac atactctcct cccccccctg gttctctttt 180
tcttttgtta cttacatttt accgttccgt cactcgcttc actcaacaac aaaa 234
<210> 7
<211> 138
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 7
ccgcgaaaaa ggtttgttta tagcttttcg cctggtgccg tacggtataa atacatactc 60
tcctcccccc cctggttctc tttttctttt gttacttaca ttttaccgtt ccgtcactcg 120
cttcactcaa caacaaaa 138
<210> 8
<211> 85
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 8
catactctcc tcccccccct ggttctcttt ttcttttgtt acttacattt taccgttccg 60
tcactcgctt cactcaacaa caaaa 85
<210> 9
<211> 408
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 9
atgcaattct ctatcgtcgc tactttggct cttgctggtt ccgctctggc tgcttactct 60
aacgtaactt acacttacga gactaccatc accgatgttg tcaccgagct caccacttac 120
tgcccagagc caaccacctt cgttcacaag aacaagacca tcactgtgac cgccccaacc 180
actttgacca tcactgactg tccttgcacc atctccaaga ccaccaagat caccactgat 240
gttccaccaa ccacccactc caccccacac accaccacca ctcacgtgcc atctacctct 300
accccagctc caacccactc tgtttctacc atctctcacg gtggtgctgc taaggctggt 360
gttgctggtt tggccggtgt tgctgctgcc gctgcttact tcttgtaa 408
<210> 10
<211> 135
<212> PRT
<213> Pichia pastoris
<400> 10
Met Gln Phe Ser Ile Val Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Ser Asn Val Thr Tyr Thr Tyr Glu Thr Thr Ile Thr Asp
20 25 30
Val Val Thr Glu Leu Thr Thr Tyr Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe Val
35 40 45
His Lys Asn Lys Thr Ile Thr Val Thr Ala Pro Thr Thr Leu Thr Ile
50 55 60
Thr Asp Cys Pro Cys Thr Ile Ser Lys Thr Thr Lys Ile Thr Thr Asp
65 70 75 80
Val Pro Pro Thr Thr His Ser Thr Pro His Thr Thr Thr Thr His Val
85 90 95
Pro Ser Thr Ser Thr Pro Ala Pro Thr His Ser Val Ser Thr Ile Ser
100 105 110
His Gly Gly Ala Ala Lys Ala Gly Val Ala Gly Leu Ala Gly Val Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Tyr Phe Leu
130 135
<210> 11
<211> 402
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 11
atgcaattct ctatcgtcgc tactttggct cttgctggtt ccgctctggc tgcttactct 60
aacgtaactt acacttacga gactaccatc accgatgttg tcactgagtt gaccacttac 120
tgcccagagc caaccacctt tgtttacaag aacaagacca tcaccgtgac tgagccaacc 180
actttgacca tcactgactg cccatgcacc atctcaaaga ccaccaagat caccactgat 240
gttccaccaa ccacccacgt caccccatcc accactcacg tgccatctac ctctacccca 300
gctccaaccc actctgtttc taccatctct cacggtggtg ctgctaaggc tggtgttgct 360
ggtttggccg gtgttgctgc tgccgctgct tacttcttgt aa 402
<210> 12
<211> 133
<212> PRT
<213> Pichia pastoris
<400> 12
Met Gln Phe Ser Ile Val Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Ser Asn Val Thr Tyr Thr Tyr Glu Thr Thr Ile Thr Asp
20 25 30
Val Val Thr Glu Leu Thr Thr Tyr Cys Pro Glu Pro Thr Thr Phe Val
35 40 45
Tyr Lys Asn Lys Thr Ile Thr Val Thr Glu Pro Thr Thr Leu Thr Ile
50 55 60
Thr Asp Cys Pro Cys Thr Ile Ser Lys Thr Thr Lys Ile Thr Thr Asp
65 70 75 80
Val Pro Pro Thr Thr His Val Thr Pro Ser Thr Thr His Val Pro Ser
85 90 95
Thr Ser Thr Pro Ala Pro Thr His Ser Val Ser Thr Ile Ser His Gly
100 105 110
Gly Ala Ala Lys Ala Gly Val Ala Gly Leu Ala Gly Val Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Ala Tyr Phe Leu
130
<210> 13
<211> 491
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 13
cttttttgta gaaatgtctt ggtgtcctcg tccaatcagg tagccatctc tgaaatatct 60
ggctccgttg caactccgaa cgacctgctg gcaacgtaaa attctccggg gtaaaactta 120
aatgtggagt aatggaacca gaaacgtctc ttcccttctc tctccttcca ccgcccgtta 180
ccgtccctag gaaattttac tctgctggag agcttcttct acggccccct tgcagcaatg 240
ctcttcccag cattacgttg cgggtaaaac ggaggtcgtg tacccgacct agcagcccag 300
ggatggaaaa gtcccggccg tcgctggcaa taatagcggg cggacgcatg tcatgagatt 360
attggaaacc accagaatcg aatataaaag gcgaacacct ttcccaattt tggtttctcc 420
tgacccaaag actttaaatt taatttattt gtccctattt caatcaattg aacaactatc 480
acctgcaggc c 491
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 14
gatagggccc cagggcatca ttgaggtttc cac 33
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 15
gatacctgca ggttttgttg ttgagtgaag cgagtg 36
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 16
gatagggccc cagggcatca ttgaggtttc cac 33
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 17
gatagggccc gatagttcta gaagacctgg cgtcg 35
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 18
gatagggccc agccaaccat cttttgtttc g 31
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 19
gatagggccc gtggtttcca ggacaacacc c 31
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 20
gatagggccc gaccgcaatt caccatgatg c 31
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 21
gatagggccc agcctgcttc attcctgcc 29
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 22
gatagggccc ccgcgaaaaa ggtttgttta tag 33
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Primer
<400> 23
gatagggccc catactctcc tcccccccct g 31
<210> 24
<211> 345
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> translational fusion partner
<400> 24
ggccattacg gccgggggac ttacatttta ccgttccgtc actcgcttca ctcaacaaca 60
aaaatgcaat tctctatcgt cgctactttg gctcttgctg gttccgctct ggctgcttac 120
tctaacgtaa cttacactta cgagactacc atcaccgatg ttgtcaccga gctcaccact 180
tactgcccag agccaaccac cttcgttcac aagaacaaga ccatcactgt gaccgcccca 240
accactttga ccatcactga ctgtccttgc accatctcca agaccaccaa gatcaccact 300
gatgttccac caaccaccca ctccacccca ctggccgcct cggcc 345
Claims (22)
- pCS1 핵산 서열(서열번호 1)을 포함하는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 천연 서열, 또는 200 내지 1500 bp의 길이를 갖고 서열번호 1의 서열과 적어도 60% 서열 상동성을 갖는, 서열번호 1의 크기 변이체, 돌연변이체 또는 하이브리드, 또는 이들의 조합물인 이의 기능적 활성 변이체인, 단리된 pCS1 프로모터 핵산 서열.
- 제1항에 있어서, pCS1 핵산 서열(서열번호 1)로 이루어지는, 핵산 서열.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기능적 활성 변이체가 pCS1 핵산 서열(서열번호 1)과 실질적으로 동일한 활성을 나타내는, 핵산.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기능적 활성 변이체가
a) 서열번호 1의 크기 변이체, 바람직하게는 서열번호 2, 3, 4, 5, 및 6로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열, 가장 바람직하게는 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6으로 이루어진 핵산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 서열번호 1의 크기 변이체;
b) 서열번호 1의 돌연변이체 또는 상기 a)의 크기 변이체의 돌연변이체로서, 서열번호 1 또는 크기 변이체와 적어도 60% 상동성을 갖는 돌연변이체;
c) - 서열번호 1, 상기 a)의 크기 변이체 및 상기 b)의 돌연변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열, 및
- 서열번호 1, 상기 a)의 크기 변이체, 상기 b)의 돌연변이체 및 이종성(heterologous) 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 서열을 포함하는 하이브리드; 또는
d) 상기 a) 또는 b)의 크기 변이체 또는 돌연변이체 핵산 서열 중의 어느 하나와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 서열인, 핵산 서열. - 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적 활성 변이체가
i) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 크기 변이체를 상기 서열 내에서 또는 상기 서열의 원위 말단(distal end)의 어느 하나 또는 둘 다에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형시킴으로써 수득할 수 있는 상동체(homolog); 및
ii) 피키아 파스토리스 이외의 다른 종으로부터 유래하는 유사체(analog)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 핵산 서열. - 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 핵산이 목적 단백질(protein of interest: POI)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 자연적으로 연관되지 않는, 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되는, 핵산 서열.
- 제6항에 있어서, POI의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 POI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 인접하여 배치되어 있는, 핵산 서열.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산 서열, 바람직하게는 자가 복제 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 발현 작제물, 또는 숙주 세포의 염색체 DNA 내로 통합되는 벡터.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산 서열 또는 제8항에 따르는 발현 작제물을 포함하는, 재조합 숙주 세포, 바람직하게는 진핵 세포, 보다 바람직하게는 효모 또는 사상균 세포, 보다 바람직하게는 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 피키아(pichia) 속의 효모 세포.
- 제9항에 있어서, 핵산 서열의 복수 카피 및/또는 발현 작제물의 복수 카피를 포함하는, 재조합 숙주 세포.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 포유동물, 곤충, 효모, 사상균 및 식물 세포, 바람직하게는 효모, 바람직하게는 피키아 파스토리스 균주 CBS 704, CBS 2621, CBS 7435, CBS 9173-9189, DSMZ 70877, X-33, GS115, KM71 및 SMD1168로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 재조합 숙주 세포.
- 제9항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 복수 세포의 안정한 배양물.
- a) 세포주를 POI를 발현시키는 조건하에 배양하는 단계, 및
b) POI를 회수하는 단계를 포함하는,
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 프로모터 또는 제8항에 따르는 발현 작제물, 및 상기 프로모터의 전사 조절하에 POI를 코딩하는 핵산, 또는 제9항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 재조합 숙주 세포를 배양하여 POI를 생산하는 방법. - 제13항에 있어서, 상기 POI가 성장-제한 조건하에 발현되는, 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 세포주가 배치식, 유가식 또는 연속 배양 조건, 및/또는 제한된 탄소 기질을 함유하는 배지에서 배양되는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 배양이 배치식 단계, 이어서 유가식 단계 또는 연속 배양 단계로 개시하는 생물반응기에서 수행되는, 방법.
- 제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 POI가, 바람직하게는 항체 또는 이의 단편을 포함한 치료학적 단백질, 효소 및 펩티드, 단백질 항생제, 독소 융합 단백질, 탄수화물-단백질 접합체, 구조 단백질, 조절 단백질, 백신 및 백신 유사 단백질 또는 입자, 프로세스 효소, 성장 인자, 호르몬 및 사이토카인 또는 POI의 대사물질로부터 선택된 이종성 단백질인, 방법.
- a) 진핵 세포를 높은 성장 속도로 배양하는 단계;
b) 상기 세포를 낮은 성장 속도로 추가로 배양하는 단계;
c) 단계 a) 및 b)의 세포 배양물의 샘플을 제공하는 단계;
d) 상기 샘플에서 전사 분석을 수행하고, 전사 수준을 상기 세포의 pGAP 프로모터의 전사 수준과 비교하는 단계; 및
f) 천연 pGAP 프로모터와 비교하여 적어도 1.1배 높은 동정된 구성 프로모터(constitutive promtoter)를 바람직하게는 측정함으로써 높거나 낮은 성장 속도에서 천연 pGAP 프로모터와 비교하여 높은 전사 강도를 갖는 구성 프로모터를 선택하는 단계를 포함하는, 구성 프로모터를 진핵 세포로부터 동정하는 방법. - 목적 단백질(POI)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연결되는 경우, 바람직하게는 핵산 서열로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 POI를 생산하는 방법에 있어서 높거나 낮은 성장 속도에서 천연 pGAP 프로모터의 조절하보다 높은 발현 수준으로 숙주 세포에서 이의 발현을 유도하는, 프로모터를 포함하는 단리된 핵산 서열의 용도로서,
상기 배양은 배치식 단계, 이어서 유가식 단계 또는 연속 배양 단계로 개시하는 생물반응기에서 수행되는, 용도. - 제19항에 있어서, 상기 발현 수준이 0.015 내지 0.15 h-1의 범위 내의 높은 성장 속도 및 낮은 성장 속도에서 결정되는, 용도.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 발현 수준이 pGAP 프로모터와 비교하여 적어도 1.1배 높은, 용도.
- 핵산 서열 및/또는 발현 작제물로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 POI를 생산하는 방법에 있어서 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항의 단리된 핵산 서열 또는 제8항의 발현 작제물의 용도로서,
바람직하게는 상기 배양은 배치식 단계, 이어서 유가식 단계 또는 연속 배양 단계로 개시하는 생물반응기에서 수행되는, 용도.
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