KR20130059404A - 원핵생물 발현 구축물 - Google Patents

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아델버트 그로쓰만
프리데리케 헤쎄
에르하르드 코페츠키
윌마 라우
크리스찬 샨츠
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 원핵생물 세포에서 관심 폴리펩타이드의 발현에 유용한 프로-폴리펩타이드를 보고한다. 따라서, 상기 프로-폴리펩타이드를 상기 관심 폴리펩타이드의 N-말단에 융합시킨다. 본 발명에 보고된 바와 같은 상기 프로-폴리펩타이드는 개선된 발현 수율을 제공하고 상기 융합 폴리펩타이드의 취급(하류 가공과정, 정제)을 개선시킨다. 예를 들어, 상기 프로-폴리펩타이드를 포함하는 관심 단백질이 예를 들어 친화성 크로마토그래피 물질에 결합되어 있는 동안 효율적인 내독소 제거가 수행된다. 그 후에, 상기 프로-폴리펩타이드는 동족 프로테아제를 갖는 통합된 프로테아제 절단 부위에 의해 상기 관심 폴리펩타이드로부터 효율적으로 절단될 수 있다.

Description

원핵생물 발현 구축물{PROKARYOTIC EXPRESSION CONSTRUCT}
본 발명은 원핵생물 세포에서 폴리펩타이드의 생산을 위한 발현 구축물을 보고한다. 상기 발현 구축물은 N-에서 C-말단 방향으로 다이펩타이드 GS, 아미노산 태그, 다이펩타이드 GS 및 프로테아제 절단 부위를 포함하는 프로-폴리펩타이드를 포함한다.
재조합 폴리펩타이드의 생산을 위한 발현 시스템들은 현재의 발달 상태로 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Marino, M.H., Biopharm. 2 (1989) 18-33]; [Goeddel, D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7]; [Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159]에 개시되어 있다.
약학적 용도에 사용하기 위한 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 및 항체 융합물은 일반적으로 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, BHK 세포, PER.C6(등록상표) 세포 등과 같은 포유동물 세포에서 일반적으로 생산된다. 진핵생물 발현 플라스미드의 요소는 일반적으로, 에스케리키아 콜라이의 경우, 원핵생물 복제 기원 및 원핵생물 선택 마커, 진핵생물 선택 마커, 및 관심 구조 유전자(들)(각각의 유전자는 프로모터, 구조 유전자 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 전사 종결자를 포함한다)의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 원핵생물 플라스미드 번식 단위이다. 포유동물 세포에서 일시적인 발현을 위해서, 포유동물 복제 기원, 예를 들어 SV40 Ori 또는 OriP를 포함시킬 수 있다. 프로모터로서 구성 또는 유도성 프로모터가 선택될 수 있다. 최적화된 전사를 위해서 코작(Kozak) 서열을 5' 번역되지 않은 영역에 포함시킬 수도 있다. mRNA 가공과정, 특히 mRNA 스플라이싱 및 전사 종결의 경우, 구조 유전자의 조직(엑손/인트론 조직)에 따라, mRNA 스플라이싱 신호뿐만 아니라 폴리아데닐화 신호를 포함시킬 수도 있다.
약학적 용도에 사용하기 위한 다른 폴리펩타이드, 예를 들이 인슐린, 인터페론 알파-2, 소마토트로핀, 인터류킨-2, GM-CSF 및 레테플라제는 원핵생물 세포, 효모 및 주로 에스케리키아 콜라이에서 생산될 수 있다. 에스케리키아 콜라이 발현 플라스미드의 요소는 일반적으로 복제 기원, 선택 마커, 및 관심 구조 유전자(들)의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트이다. 발현 카세트는 일반적으로 프로모터, 구조 유전자, 및 전사 종결자를 포함한다. 프로모터로서 구성 또는 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 최적화된 전사를 위해서 mRNA의 개시 코돈에 선행하는 샤인-달가르노-서열(Shine-Dalgarno-Sequence) 또는 그의 변체를 5' 번역되지 않은 영역에 포함시킬 수도 있다.
본 발명은 원핵생물 세포에서 관심 폴리펩타이드의 발현에 유용한 프로-폴리펩타이드를 보고한다. 따라서, 상기 프로-폴리펩타이드를 상기 관심 폴리펩타이드의 N-말단에 융합시킨다. 본 발명에 보고된 바와 같은 상기 프로-폴리펩타이드는 개선된 발현 수율을 제공하고 상기 융합 폴리펩타이드의 취급(하류 가공과정, 정제)을 개선시킨다. 예를 들어, 상기 프로-폴리펩타이드를 포함하는 관심 단백질이 예를 들어 친화성 크로마토그래피 물질에 결합되어 있는 동안 효율적인 내독소 제거가 수행된다. 그 후에, 상기 프로-폴리펩타이드는 동족 프로테아제를 갖는 통합된 프로테아제 절단 부위에 의해 상기 관심 폴리펩타이드로부터 효율적으로 절단될 수 있다.
본 발명에서 하나의 태양으로서 N-에서 C-말단 방향으로
-아미노산 서열 GS를 갖는 제 1 다이펩타이드,
-아미노산 서열 태그,
-효소 절단 부위에 바로 인접하여 아미노산 서열 GS를 갖는 제 2 다이펩타이드,
-상기 효소 절단 부위
를 포함하는 프로-폴리펩타이드를 보고한다.
하나의 실시태양에서, 상기 프로-폴리펩타이드는 상기 아미노산 서열 GS를 갖는 제 1 다이펩타이드에 대해 N-말단에 선도 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 상기 선도 아미노산 서열은 2 개 이상 20 개 이하의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 추가의 실시태양에서 상기 선도 아미노산 서열은 2 개 이상 10 개 이하의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 또한 하나의 실시태양에서 상기 선도 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 8 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 추가의 실시태양에서 상기 선도 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 6 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다.
하나의 실시태양에서 상기 프로-폴리펩타이드는 N-에서 C-말단 방향으로
-선도 아미노산 서열,
-아미노산 서열 GS를 갖는 제 1 다이펩타이드,
-아미노산 서열 태그,
-효소 절단 부위에 바로 인접하여 아미노산 서열 GS를 갖는 제 2 다이펩타이드
-상기 효소 절단 부위
로 이루어진다.
본 발명에 보고된 바와 같은 추가의 태양은 N-에서 C-말단 방향으로
-임의로 선도 아미노산 서열,
-아미노산 서열 GS를 갖는 제 1 다이펩타이드,
-아미노산 서열 태그,
-효소 절단 부위에 바로 인접하여 아미노산 서열 GS를 갖는 제 2 다이펩타이드,
-상기 효소 절단 부위, 및
-관심 단백질
을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다.
앞서 보고된 바와 같은 모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 아미노산 서열 태그는 서열번호 9 내지 서열번호 27 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 실시태양에서 상기 아미노산 서열 태그는 서열번호 11 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시태양에서 상기 효소 절단 부위는 서열번호 28 내지 서열번호 42 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 추가의 실시태양에서 상기 관심 폴리펩타이드는 항체 중쇄 또는 경쇄, 항체 단편, 단쇄 항체, 아포지방단백질, 아포지방단백질 변체, 아포지방단백질 융합물, 인터페론, 인터류킨, 인슐린, 조직 유형 플라스미노겐 활성화제 변체, 콜로니-자극 인자, 성장 호르몬, 골 형태발생 단백질 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서 상기 관심 폴리펩타이드는 서열번호 43 또는 서열번호 44 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 실시태양에서 상기 관심 폴리펩타이드는 본 발명에 보고된 바와 같은 프로-폴리펩타이드와 상이한 폴리펩타이드이다, 즉 상기 관심 폴리펩타이드는 아미노산 서열 태그에 직접 융합된 아미노산 서열 GS를 갖는 다이펩타이드에 상응하는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 하나의 실시태양에서 상기 관심 폴리펩타이드의 N-말단의 아미노산은 하류 가공과정 후에 유리 알파-아미노 기를 갖는다. 하나의 실시태양에서 상기 프로-폴리펩타이드 및/또는 관심 폴리펩타이드는 글리코실화되지 않는다.
본 발명에서 또 다른 태양으로서 하기의 단계를 포함하는 관심 폴리펩타이드의 제조 방법을 보고한다
(a) N-에서 C-말단 방향으로
-임의로 선도 아미노산 서열,
-아미노산 서열 GS를 갖는 제 1 다이펩타이드,
-아미노산 서열 태그,
-효소 절단 부위에 바로 인접하여 아미노산 서열 GS를 갖는 제 2 다이펩타이드
-상기 효소 절단 부위, 및
-관심 단백질
을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계,
(b) 상기 세포를 배양하는 단계,
(c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 융합 폴리펩타이드를 회수하는 단계,
(d) 상기 융합 폴리펩타이드를 정제하는 단계,
(e) 상기 융합 폴리펩타이드를 효소에 의해 절단하는 단계에 의해 관심 폴리펩타이드를 생성시킨다.
하나의 실시태양에서 상기 세포는 원핵생물 세포이다. 또 다른 실시태양에서 상기 세포는 에스케리키아 콜라이 또는 바실러스 서브틸리스 세포이다. 하나의 실시태양에서 상기 아미노산 서열 태그는 서열번호 9 내지 서열번호 27 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 실시태양에서 상기 아미노산 서열 태그는 서열번호 11 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시태양에서 상기 효소 절단 부위는 서열번호 28 내지 서열번호 42 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 또한 하나의 실시태양에서 상기 추가의 폴리펩타이드는 항체 중쇄 또는 경쇄, 항체 단편, 단쇄 항체, 아포지방단백질, 아포지방단백질 변체, 아포지방단백질 융합물, 인터페론, 인터류킨, 인슐린, 조직 유형 플라스미노겐 활성화제 변체, 콜로니-자극 인자, 성장 호르몬, 골 형태발생 단백질 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서 상기 관심 폴리펩타이드는 서열번호 43 또는 서열번호 44 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 실시태양에서 상기 관심 폴리펩타이드는 본 발명에 보고된 바와 같은 프로-폴리펩타이드와 상이한 폴리펩타이드이다, 즉 상기 추가의 폴리펩타이드는 아미노산 서열 태그에 직접 융합된 아미노산 서열 GS를 갖는 다이펩타이드를 포함하지 않는다.
본 발명에서 추가의 태양으로서 5'-에서 3'-방향으로
-아미노산 서열 GS를 갖는 다이펩타이드를 암호화하는 핵산,
-아미노산 서열 태그를 암호화하는 핵산,
-효소 절단 부위를 암호화하는 핵산에 바로 인접하여 아미노산 서열 GS를 갖는 다이펩타이드를 암호화하는 핵산,
-상기 효소 절단 부위를 암호화하는 핵산
을 포함하는 핵산을 포함하는 부분들의 키트를 보고한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
-원핵생물 세포를 글루코스, 효모 추출물, L-류신, L-프롤린, L-메티오닌, 티아민-HCl, 소포제를 포함하는 배지에서 배양하고,
-상기 세포에 효모 추출물, 글리세롤, L-메티오닌, L-류신 및 L-프롤린을 포함하는 제 1 공급물 용액을 공급하고,
-상기 세포에 L-프롤린을 포함하는 제 2 공급물 용액을 공급하고,
-수산화 칼륨 용액 및 글루코스 용액을 pH 조절에 사용함
을 특징으로 하는, 상기 원핵생물 세포의 배양 방법이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
-폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 글루코스, 효모 추출물, L-류신, L-프롤린, L-메티오닌, 티아민-HCl, 소포제를 포함하는 배지에서 배양하고,
-상기 세포에 효모 추출물, 글리세롤, L-메티오닌, L-류신 및 L-프롤린을 포함하는 제 1 공급물 용액을 공급하고,
-상기 세포에 L-프롤린을 포함하는 제 2 공급물 용액을 공급하고,
-수산화 칼륨 용액 및 글루코스 용액을 pH 조절에 사용함
을 특징으로 하고, 상기 폴리펩타이드를 상기 세포 또는 상기 배양 배지로부터 회수하고 이에 의해 폴리펩타이드를 생성시키는, 상기 폴리펩타이드의 제조 방법이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 제 1 공급물의 첨가를 578 ㎚에서 측정된 약 15의 광학 밀도에서 출발하고, 상기 제 2 공급물의 첨가를 578 ㎚에서 측정된 약 50의 광학 밀도에서 출발하고, 상기 폴리펩타이드의 발현을 578 ㎚에서 측정된 약 90의 광학 밀도에서 IPTG로 유도한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 배지는 약 8.85 g/ℓ의 글루코스, 약 63.5 g/ℓ의 효모 추출물, 약 2.2 g/ℓ의 NH4Cl, 약 1.95 g/ℓ의 L-류신, 약 2.9 g/ℓ의 L-프롤린, 약 0.75 g/ℓ의 L-메티오닌, 약 17.3 g/ℓ의 KH2PO4*3H2O, 약 2 g/ℓ의 MgSO4*7H2O, 약 25.8 ㎎/ℓ의 티아민-HCl, 약 1.0 ㎖/ℓ의 10% 소포제를 포함한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 제 1 공급물 용액은 약 333 g/ℓ의 효모 추출물, 약 333 g/ℓ의 85% 글리세롤, 약 1.7 g/ℓ의 L-메티오닌, 및 약 5 g/ℓ의 L-류신 및 L-프롤린 각각을 포함한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 제 2 공급물 용액은 약 600 g/ℓ의 L-프롤린을 포함한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 pH 조절용 염기는 10%(w/v) KOH 용액이고 상기 산은 75% 글루코스 용액이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 배양은 약 25 ℃에서이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 배양은 약 pH 6.5 내지 약 pH 6.9의 pH에서이다.
하나의 실시태양에서 상기 배양은 약 10 ℓ의 부피에서이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 제 1 공급물을 70 g/h의 비율로 출발한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 제 2 공급물을 10 ㎖/h의 비율로 출발한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 용존 산소 값을 50% 이상으로 유지시킨다. 특정한 실시태양에서, 상기 용존 산소 값을, 교반기 속도, 통기율, 및 공기압을 동시에 증가시킴으로써 50% 이상으로 유지시킨다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 교반기 속도는 약 500 rpm 내지 약 1500 rpm이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 통기율은 약 10 ℓ/분 내지 약 20 ℓ/분이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 공기압은 약 300 mbar 내지 약 500 mbar이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 원핵생물 세포는 에스케리키아 콜라이 세포이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 폴리펩타이드는 아포지방단백질 A1이다. 구체적인 실시태양에서 상기 아포지방단백질 A1은 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약 8.85 g/ℓ의 글루코스, 약 63.5 g/ℓ의 효모 추출물, 약 2.2 g/ℓ의 NH4Cl, 약 1.95 g/ℓ의 L-류신, 약 2.9 g/ℓ의 L-프롤린, 약 0.75 g/ℓ의 L-메티오닌, 약 17.3 g/ℓ의 KH2PO4*3H2O, 약 2 g/ℓ의 MgSO4*7H2O, 약 25.8 ㎎/ℓ의 티아민-HCl, 약 1.0 ㎖/ℓ의 10% 소포제를 포함하는 원핵생물 세포용 배양 배지이다.
하나의 실시태양에서, 상기 배지는 약 333 g/ℓ의 효모 추출물, 약 333 g/ℓ의 85% 글리세롤, 약 1.7 g/ℓ의 L-메티오닌, 및 약 5 g/ℓ의 L-류신 및 L-프롤린 각각을 포함하는 제 1 공급물을 추가로 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 배지는 약 600 g/ℓ의 L-프롤린을 포함하는 제 2 공급물 용액을 추가로 포함한다.
본 발명에 보고된 프로-폴리펩타이드는 원핵생물 세포에서 관심 폴리펩타이드의 발현에 유용하다. 상기 프로-폴리펩타이드는 개선된 발현 수율을 제공하고 취급, 예를 들어 하류 가공과정 및 정제를 개선시킨다. 예를 들어, 상기 프로-폴리펩타이드를 포함하는 관심 단백질이 예를 들어 친화성 크로마토그래피 물질에 결합되어 있는 동안 효율적인 내독소 제거가 수행된다. 그 후에, 상기 프로-폴리펩타이드는 동족 프로테아제를 갖는 통합된 프로테아제 절단 부위에 의해 상기 관심 폴리펩타이드로부터 효율적으로 절단될 수 있다.
본 발명에서 N-에서 C-말단 방향으로
-임의로 선도 아미노산 서열,
-제 1 다이펩타이드 GS,
-아미노산 서열 태그,
-효소 절단 부위에 바로 인접한 제 2 다이펩타이드 GS
-상기 효소 절단 부위
를 포함하는 프로-폴리펩타이드를 보고한다.
본 출원 내에서 사용된 바와 같은 "아미노산" 또는 "아미노산 잔기"란 용어는 직접 또는 전구체의 형태로 핵산에 의해 암호화될 수 있는 카복시 α-아미노산의 기를 나타낸다. 개별적인 아미노산은 3 개의 뉴클레오타이드, 소위 코돈 또는 3 개 염기로 이루어지는 핵산에 의해 암호화된다. 각각의 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 암호화된다. 이는 "유전 암호의 축퇴"로서 공지되어 있다. 본 출원 내에서 사용된 바와 같은 "아미노산"이란 용어는 알라닌(3 글자 암호: ala, 1 글자 암호: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라진(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 아이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 쓰레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 타이로신(tyr, Y), 및 발린(val, L)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산을 나타낸다.
"폴리펩타이드"란 용어는 천연으로 생성되었든지 합성으로 생성되었든지 간에, 펩타이드 결합에 의해 결합된 아미노산들로 이루어지는 중합체를 나타낸다. 약 20 개 미만 아미노산 잔기의 폴리펩타이드를 "펩타이드"라 칭할 수 있는 반면, 2 개 이상의 폴리펩타이드로 이루어지거나 또는 100 개 초과 아미노산 잔기의 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 분자는 "단백질"이라 칭할 수 있다. "다이펩타이드"란 용어는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2 개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩타이드를 나타낸다. 폴리펩타이드는 또한 비-아미노산 성분, 예를 들어 탄수화물 그룹, 금속 이온, 또는 카복실산 에스터를 포함할 수도 있다. 상기 비-아미노산 성분은, 상기 폴리펩타이드가 발현되는 세포에 의해 첨가될 수도 있으며, 세포의 유형에 따라 변할 수 있다. 폴리펩타이드를 본 발명에서는 그의 아미노산 주쇄 구조 또는 이를 암호화하는 핵산에 의해 정의한다. 탄수화물 그룹과 같은 첨가는 일반적으로 자세히 명시하지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수도 있다. 하나의 실시태양에서 관심 폴리펩타이드는 아포지방단백질 또는 아포지방단백질 변체/융합물이다. 또 다른 실시태양에서 상기 아포지방단백질은 아포지방단백질 A1 또는 아포지방단백질 A1 변체/융합물이다. 추가의 실시태양에서 상기 아포지방단백질 A1은 테트라넥틴 삼량체화 도메인에 N-말단 융합되어 인공 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 융합 폴리펩타이드를 생성시킨다. 하나의 실시태양에서 상기 관심 폴리펩타이드는 서열번호 43 내지 서열번호 76 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시태양에서 상기 관심 폴리펩타이드는 서열번호 43 및 서열번호 44 및 서열번호 45 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
"선도 아미노산 서열"이란 용어는 펩타이드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산들 또는 아미노산 잔기들의 서열을 나타낸다. 하나의 실시태양에서 상기 선도 아미노산 서열은 1 내지 20 개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 또 다른 실시태양에서 상기 선도 아미노산 서열은 2 내지 15 개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 추가의 실시태양에서 상기 선도 아미노산 서열은 4 내지 10 개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 또한 하나의 실시태양에서 상기 선도 아미노산 서열은 MR, 또는 서열번호 1(KAKRFKKH), 또는 서열번호 2(AHFWQQA), 또는 서열번호 3(CDLPQTHSL), 또는 서열번호 4(IEPD), 또는 서열번호 5(IEPDSPGT), 또는 서열번호 6(MCDLPQTHSL), 또는 서열번호 7(AEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS), 또는 서열번호 8(TDPEFQQQQQLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDSLAPDWDNMTWQEWEKQVRYLEANISKSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDIRSVV)의 아미노산 서열을 갖는다. 추가의 실시태양에서 상기 선도 아미노산 서열은 MR, 및 서열번호 1(KAKRFKKH), 및 서열번호 2(AHFWQQA), 및 서열번호 3(CDLPQTHSL), 및 서열번호 4(IEPD), 및 서열번호 5(IEPDSPGT), 및 서열번호 6(MCDLPQTHSL) 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
"아미노산 서열 태그"란 용어는 특이적인 결합 성질을 갖는 펩타이드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기들의 서열을 나타낸다. 하나의 실시태양에서 상기 아미노산 서열 태그는 친화성 또는 정제 태그이다. 하나의 실시태양에서 상기 아미노산 서열 태그는 Arg-태그, His-태그, 플래그(Flag)-태그, 3x플래그-태그, 스트렙(Strep)-태그, 나노-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모듈린-결합-펩타이드, 셀룰로스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그, 및 MBP-태그 중에서 선택된다. 추가의 실시태양에서 상기 아미노산 서열 태그는 서열번호 9(RRRRR) 및 서열번호 10(RRRRRR), 및 서열번호 11(HHHHHH), 및 서열번호 12(KDHLIHNVHKEFHAHAHNK) 및 서열번호 13(DYKDDDDK) 및 서열번호 14(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK) 및 서열번호 15(AWRHPQFGG) 및 서열번호 16(WSHPQFEK) 및 서열번호 17(MDVEAWLGAR) 및 서열번호 18(MDVEAWLGARVPLVET) 및 서열번호 19(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP) 및 서열번호 20(EQKLISEEDL) 및 서열번호 21(KETAAAKFERQHMDS) 및 서열번호 22(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL) 및 서열번호 23(셀룰로스 결합 도메인) 및 서열번호 24(셀룰로스 결합 도메인) 및 서열번호 25(TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEP SNVPALWQLQ) 및 서열번호 26(GST-태그) 및 서열번호 27(MBP-태그) 중에서 선택된다.
"효소 절단 부위"란 용어는 프로테아제에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 펩타이드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기들의 서열을 나타낸다. 하나의 실시태양에서 상기 프로테아제는 IgA-프로테아제, 그랜자임(Granzyme) B, Tev프로테아제, 예비절단(Prescission) 프로테아제, 트롬빈, 인자 Xa, 또는 엔테로키나제이다.
"IgA-프로테아제"란 용어는 하기의 서열들 중 하나를 포함하는 인식 부위를 갖는 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터 유도된 프로테아제를 나타내며, 여기에서 "↓"는 절단된 결합의 위치를 나타낸다.
Pro-Ala-Pro ↓ Ser-Pro (서열번호 28),
Pro-Pro ↓ Ser-Pro (서열번호 29),
Pro-Pro ↓ Ala-Pro (서열번호 30),
Pro-Pro ↓ Thr-Pro (서열번호 31),
Pro-Pro ↓ Gly-Pro (서열번호 32),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Thr-Pro (서열번호 33),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Ala-Pro (서열번호 34),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Ser-Pro (서열번호 35),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Thr-Pro (서열번호 36),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Gly-Pro (서열번호 37),
Ala-Pro-Pro-Ala ↓ Ala-Pro (서열번호 39),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Ala-Pro (서열번호 40),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓Ser-Pro (서열번호 41),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓Gly-Pro (서열번호 42).
"작동적으로 결합된"이란 용어는 2 개 이상 성분들의 병치를 나타내며, 여기에서 상기와 같이 개시된 성분들은 상기 성분들이 그들이 의도하는 방식으로 작용하도록 하는 관계로 놓인다. 예를 들어, 분비 리더 및 폴리펩타이드와 같은 2 개의 폴리펩타이드 암호화 영역들을 결합시키는 관계로 놓인다.
핵산을 암호화하는 아미노산 서열의 결합은 당해 분야에 공지된 재조합 방법에 의해, 예를 들어 PCR 방법을 사용하고/하거나 편리한 제한 부위에서의 연결에 의해 수행된다. 편리한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
특히 원핵생물 세포에서 관심 폴리펩타이드의 재조합 생산을 위해 높은 발현 수율 및 실행 가능한 하류 처리과정이 고려된다.
본 발명에 보고된 바와 같이 N-에서 C-말단 방향으로
-제 1 다이펩타이드 GS,
-아미노산 서열 태그,
-제 2 다이펩타이드 GS, 및
-효소 절단 부위
를 포함하는 프로-폴리펩타이드는 작동적으로 결합된 관심 폴리펩타이드의 발현에 유용하다. 유리한 성질들은 본 발명에 보고된 바와 같은 프로-폴리펩타이드가, 원핵생물 세포에서 재조합 수단에 의해 발현되도록 되어 있는 관심 폴리펩타이드의 N-말단에 융합될 때 발휘될 수 있다. 따라서, 본 발명에 보고된 바와 같은 프로-폴리펩타이드를 발현 효율 및 하류 가공과정의 개선에 사용할 수 있다. 상기 관심 폴리펩타이드는 본 발명에 보고된 바와 같은 프로-폴리펩타이드 및 상기 관심 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드로서 원핵생물 세포에 의해 발현된다. 즉 상기 융합 폴리펩타이드는 N-에서 C-말단 방향으로 본 발명에 보고된 바와 같은 프로-폴리펩타이드 및 상기 관심 폴리펩타이드를 포함한다.
상이한 융합 폴리펩타이드들의 발현 수율. 각 세포에 제공된 첫 번째 수율 값을 실시예 3b에 따른 발효 방법에 의해 수득하였으며, 각 세포에서 두 번째 수율 값은 실시예 3a에 따른 발효 방법에 의해 수득하였다.
융합 폴리펩타이드의 N-말단 프로- 폴리펩타이드의 요소들 융합 폴리펩타 이드의 분자량

[g/ mol ]
수율

[g/ℓ]
수율
[10 -3 mol /ℓ]
선도 아미노산 서열 다이펩타이드 아미노산 서열 태그 다이펩타이드 중재 아미노산 서열 효소 절단 부위
MR GS HHHHHH GS n.p. PRPPTP 34904.1 24.312.8 0.696
0.367
MCDLPQTHSL GS HHHHHH GS n.p. VVAPPAP 35472.7 20.310.5 0.572
0.296
MR GS HHHHHH GS AEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAAS VVAPPAP 48373.5 7.9
3.5
0.163
0.072
MR GS HHHHHH n.p. AHFWQQA PRPPTP 35372.5 9.0
2.4
0.254
0.068
MR GS HHHHHH n.p. TDPEFQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDSLAPDWDNMTWQEWEKQVRYLEANISKSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDIRSVV APPAAP 49653.5 10.27.0 0.205
0.141
M n.p. HHHHHH n.p. KAKRFKKH PRPPAP 35453.9 11.12.6 0.313
0.073
n.p. = 존재하지 않음
표 1로부터, N-말단에서 제 2 다이펩타이드 GS와 효소 절단 부위 사이에 추가의 아미노산 서열이 삽입되지 않은 본 발명에 보고된 바와 같은 프로-폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드는 중재 아미노산 서열을 포함하는 것들보다 더 높은 발현 수율을 제공하는 것을 알 수 있다. 2 개 이상의 아미노산 잔기의 선도 아미노산 서열이 상기 제 1 다이펩타이드 GS에 대해 N-말단에 존재할 수도 있다.
본 발명에 보고된 바와 같은 프로-폴리펩타이드는 그의 C-말단에 효소 절단 부위를 함유한다. 상기 효소 절단 부위는 프로테아제에 대한 인식 동기를 함유하는 아미노산 서열이다. 상기 인식 부위는 상기 프로테아제가 상기 인식 부위에서 특이적으로 절단하는 한, 즉 상기 서열이 상기 융합 폴리펩타이드의 전체 아미노산 서열 중 오직 한 번만 존재하는 한, 임의의 프로테아제에 대한 것일 수 있다.
상기 융합 폴리펩타이드가 친화성 크로마토그래피 물질에, 즉 상기 관심 폴리펩타이드에 대해서 특이적으로 설계된 것이 아니라 아미노산 서열 태그에 대해서 설계된 친화성 물질에 결합된 동안 내독소 제거가 가능한 것이 특히 유리하다. 이러한 결합 성질에 의해서 아미노산 서열 태그와 상응하는 친화성 물질의 임의의 상응하는 조합을 사용할 수 있다. 상기 내독소 제거 후에 상기 관심 폴리펩타이드를 프로테아제 절단 부위를 사용함으로써 상기 융합 폴리펩타이드로부터 효율적으로 제거할 수 있다.
하기의 실시예 및 서열 목록을 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공하고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 나타낸다. 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 나타낸 과정들에 변경을 수행할 수 있는 것으로 생각된다.
서열 목록에 대한 설명
서열번호 1 내지 8 아미노산 서열
서열번호 9 내지 27 아미노산 태그
서열번호 28 내지 42 프로테아제 절단 부위
서열번호 43 내지 76 아포지방단백질 아미노산 서열
서열번호 77 내지 78 변형 아포지방단백질 융합 아미노산 서열
서열번호 79 내지 84 프로-폴리펩타이드 아미노산 서열
실시예
물질 및 방법
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, New York, (December 1989)]에 개시된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학 시약들을 제조자의 설명에 따라 사용하였다.
유전자 합성
목적하는 유전자 구획을 화학 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오타이드로부터 제조하였다. 단일의 제한 엔도뉴클레아제 절단 효소가 측면에 인접한 상기 유전자 구획들을, PCR 증폭을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 및 연결에 의해 조립하고 후속으로 A-돌출부를 통해 pCR2.1-TOPO-TA 클로닝 벡터(인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp.), 미국 소재) 내로 클로닝하였다. 상기 서브클로닝된 유전자 단편들의 DNA 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다.
실시예 1
에스케리키아 콜라이 발현 플라스미드의 제조 및 설명
테트라넥틴-아포지방단백질 A1 융합 폴리펩타이드를 재조합 수단에 의해 제조하였다. 3 개의 상이한 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 하기에 제공한다(굵은 선, 테트라넥틴-삼량체화 도메인, 변체 A 및 B). 변체 A는 변체 B와, 상기 테트라넥틴 도메인의 N-말단에서 2 개의 아미노산 잔기의 첨가에 의해 상이하다. 변체 C는 변체 A와, 상기 테트라넥틴 도메인의 C-말단 단부에서 5 개의 아미노산 잔기의 첨가에 의해 상이하다.
변체 A의 아미노산 서열(서열번호 44):
1 IVNAKKDVVN TKMFEELKSR LDTLAQEVAL LKEQQALQTV DEPPQSPWDR
51 VKDLATVYVD VLKDSGRDYV SQFEGSALGK QLNLKLLDNW DSVTSTFSKL
101 REQLGPVTQE FWDNLEKETE GLRQEMSKDL EEVKAKVQPY LDDFQKKWQE
151 EMELYRQKVE PLRAELQEGA RQKLHELQEK LSPLGEEMRD RARAHVDALR
201 THLAPYSDEL RQRLAARLEA LKENGGARLA EYHAKATEHL STLSEKAKPA
251 LEDLRQGLLP VLESFKVSFL SALEEYTKKL NTQ
변체 B의 아미노산 서열(서열번호 77):
1 KKIVNAKKD VVNTKMFEEL KSRLDTLAQE VALLKEQQAL QTVDEPPQSP
51 WDRVKDLATV YVDVLKDSGR DYVSQFEGSA LGKQLNLKLL DNWDSVTSTF
101 SKLREQLGPV TQEFWDNLEK ETEGLRQEMS KDLEEVKAKV QPYLDDFQKK
151 WQEEMELYRQ KVEPLRAELQ EGARQKLHEL QEKLSPLGEE MRDRARAHVD
201 ALRTHLAPYS DELRQRLAAR LEALKENGGA RLAEYHAKAT EHLSTLSEKA
251 KPALEDLRQG LLPVLESFKV SFLSALEEYT KKLNTQ
변체 C의 아미노산 서열(서열번호 78):
1 IVNAKKDVVN TKMFEELKSR LDTLAQEVAL LKEQQALQTV SLKGTDEPPQ
51 SPWDRVKDLA TVYVDVLKDS GRDYVSQFEG SALGKQLNLK LLDNWDSVTS
101 TFSKLREQLG PVTQEFWDNL EKETEGLRQE MSKDLEEVKA KVQPYLDDFQ
151 KKWQEEMELY RQKVEPLRAE LQEGARQKLH ELQEKLSPLG EEMRDRARAH
201 VDALRTHLAP YSDELRQRLA ARLEALKENG GARLAEYHAK ATEHLSTLSE
251 KAKPALEDLR QGLLPVLESF KVSFLSALEE YTKKLNTQ
상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 융합 폴리펩타이드는 에스케리키아 콜라이에서 전구체 폴리펩타이드(더 큰 융합 폴리펩타이드)로서 발현되었다. 하기의 N-말단 프로-폴리펩타이드를 개선된 발현 수율 및 하류 가공과정에 대해 시험하였다:
1) 변체 B와 결합된 프로- 폴리펩타이드(플라스미드 5803)의 아미노산 서열:
MRGSHHHHHH GSPRPPTP (서열번호 79)
프로-폴리펩타이드 5803은 N-에서 C-말단 방향으로
-아미노산 서열 MR을 갖는 선도 아미노산 서열,
-제 1 다이펩타이드 GS,
-HHHHHH(서열번호 11)의 아미노산 서열을 갖는 헥사-히스티딘 태그,
-제 2 다이펩타이드 GS, 및
-PRPPTP(서열번호 33)의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위
를 포함하는 인공 폴리펩타이드이다.
2) 변체 A와 결합된 프로- 폴리펩타이드(플라스미드 5816)의 아미노산 서열:
MCDLPQTHSL GSHHHHHHGS VVAPPAP (서열번호 80)
프로-폴리펩타이드 5816은 N-에서 C-말단 방향으로
-MCDLPQTHSL(서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 인터페론 서열의 단편에 접합된 메티오닌을 암호화하는 선도 아미노산 서열,
-제 1 다이펩타이드 GS,
-HHHHHH(서열번호 11)의 아미노산 서열을 갖는 헥사-히스티딘 태그,
-제 2 다이펩타이드 GS, 및
-VVAPPAP(서열번호 32)의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위
를 포함하는 인공 폴리펩타이드이다.
3) 변체 A와 결합된 프로- 폴리펩타이드(플라스미드 5820)의 아미노산 서열:
1 MRGSHHHHHH GSAEAGITGT WYNQLGSTFI VTAGADGALT GTYESAVGNA
51 ESRYVLTGRY DSAPATDGSG TALGWTVAWK NNYRNAHSAT TWSGQYVGGA
101 EARINTQWLL TSGTTEANAW KSTLVGHDTF TKVKPSAASV VAPPAP
(서열번호 81)
프로-폴리펩타이드 5820은 N-에서 C-말단 방향으로
-아미노산 서열 MR을 갖는 선도 아미노산 서열,
-제 1 다이펩타이드 GS,
-HHHHHH(서열번호 11)의 아미노산 서열을 갖는 헥사-히스티딘 태그,
-제 2 다이펩타이드 GS,
-스트렙트아비딘으로부터 유도된 중재 아미노산 서열, 및
-VVAPPAP(서열번호 34)의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위
를 포함하는 인공 폴리펩타이드이다.
4) 변체 A와 결합된 프로- 폴리펩타이드(플라스미드 5805)의 아미노산 서열:
MRGSHHHHHH AHFWQQAPRP PTP (서열번호 82)
프로-폴리펩타이드 5805는 N-에서 C-말단 방향으로
-아미노산 서열 MR을 갖는 선도 아미노산 서열,
-제 1 다이펩타이드 GS,
-HHHHHH(서열번호 11)의 아미노산 서열을 갖는 헥사-히스티딘 태그,
-아미노산 서열 AHFWQQA(서열번호 2)를 갖는 중재 아미노산 서열, 및
-PRPPTP(서열번호 38)의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위
를 포함하는 인공 폴리펩타이드이다.
5) 변체 C와 결합된 프로- 폴리펩타이드(플라스미드 5819)의 아미노산 서열:
1 MRGSHHHHHH TDPEFQQQQQ LLDVVKRQQE LLRLTVWGTK NLQARVTAIE
51 KYLQDQARLN SWGCAFRQVC HTTVPWVNDS LAPDWDNMTW QEWEKQVRYL
101 EANISKSLEQ AQIQQEKNMY ELQKLNSWDI RSVVAPPAP
(서열번호 83)
프로-폴리펩타이드 5819는 N-에서 C-말단 방향으로
-아미노산 서열 MR을 갖는 선도 아미노산 서열,
-제 1 다이펩타이드 GS,
-HHHHHH(서열번호 11)의 아미노산 서열을 갖는 헥사-히스티딘 태그,
-인간 HIV2 gp32 단백질로부터 유도된 중재 아미노산 서열, 및
-VVAPPAP(서열번호 34)의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위
를 포함하는 인공 폴리펩타이드이다.
6) 변체 B와 결합된 프로- 폴리펩타이드(플라스미드 5806)의 아미노산 서열:
MHHHHHHKAK RFKKHPRPPAP (서열번호 84)
프로-폴리펩타이드 5806은 N-에서 C-말단 방향으로
-선도 아미노산 서열(M, 개시 코돈),
-HHHHHH(서열번호 11)의 아미노산 서열을 갖는 헥사-히스티딘 태그,
-KAKRFKKH(서열번호 1)의 아미노산 서열을 갖는 중재 아미노산 서열, 및
-PRPPAP(서열번호 40)의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위
를 포함하는 인공 폴리펩타이드이다.
상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 변체 폴리펩타이드를 IgA 프로테아제를 사용하여 시험관 내에서 효소 절단에 의해 상기 융합 전구체 단백질로부터 회수하였다.
5803, 5816, 5820, 5805, 5819 및 5806으로 표시된, 상이한 프로-폴리펩타이드 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 암호화 융합 유전자를 적합한 핵산 구획의 연결에 의해 공지된 재조합 방법 및 기법으로 조립하였다. 핵산 서열을 화학 합성에 의해 제조하였으며 DNA 서열화에 의해 확인하였다.
기본/개시 에스케리키아 콜라이 발현 플라스미드 4980의 제조 및 설명
플라스미드 4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)은 에스케리키아 콜라이에서 코어-스트렙트아비딘의 발현을 위한 발현 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 435 bp 길이의 코어-스트렙트아비딘 암호화 EcoRI/CelII-단편을 갖는 플라스미드 1966(1966-pBRori-URA3-LACI-T-반복부; EP-B 1 422 237에 보고되어 있다)으로부터 유도된 3142 bp 길이의 EcoRI/CelII-단편의 연결에 의해 생성되었다.
상기 코어-스트렙트아비딘 에스케리키아 콜라이 발현 플라스미드는 하기의 요소들을 포함한다:
-에스케리키아 콜라이에서 복제를 위한 벡터 pBR322로부터의 복제 기원(문헌[Sutcliffe, J.G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90]에 따른 bp 위치 2517-3160에 상응함),
-에스케리키아 콜라이 pyrF 돌연변이체 균주(유라실 영양요구성)의 상보성에 의한 플라스미드 선택을 허용하는 오로티딘 5'-포스페이트 데카복실라제를 암호화하는 사카로마이세스 세레비지아에의 URA3 유전자(문헌[Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124]),
-하기로 형성된 코어-스트렙트아비딘 발현 카세트
문헌[Stuber, D. et al.](이전 참조)에 따른 합성 리보솜 결합 부위를 포함하는 T5 하이브리드 프로모터(문헌[Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433] 및 [Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152]에 따른 T5-PN25/03/04 하이브리드 프로모터),
코어-스트렙트아비딘 유전자, 및
2 개의 박테리오파지-유도된 전사 종결자, λ-T0 종결자(문헌[Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414]), 및 fd-종결자(문헌[Beck, E., and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58]), 및
-에스케리키아 콜라이로부터의 lacI 억제 유전자(문헌[Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769]).
프로- 폴리펩타이드를 포함하는 최종 발현 플라스미드(플라스미드 5803, 5816, 5820, 5805, 5819 및 5806)의 제조
플라스미드 5803(5803-His6-IgA-TP7-TripB-ApoAI)은 프로-폴리펩타이드 5803을 함유하는 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질의 발현을 위한 플라스미드이다. 상기 플라스미드는, 단일의 측면 인접 EcoRI 및 CelII 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 사용하여 벡터 4980으로부터 코어-스트렙트아비딘 구조 유전자를 절제하고 958 bp 길이의 EcoRII/CelII 5803 프로-폴리펩타이드 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질 암호화 유전자 구획을 3142 bp 길이의 EcoRI/CelII-4980 벡터 단편에 삽입하여 제조되었다.
플라스미드
5816 (5816-IFN-His6-IgA-API10-TripB-ApoAI),
5820 (5820-His6-coreSA-IgA-API10-TripB-ApoA1),
5805 (5805-His6-IgA-Pro-TPI10-TripB-ApoAI),
5819 (5819-gp32-His6-IgA-API10-TriB-SLKGT-ApoA1), 및
5806 (5806-His6-IgA-Opt-AP7-TripB-ApoAI)
를 이전에 플라스미드 5803에 대해 개시한 바와 같이 생성시켰다.
실시예 2
에스케리키아 콜라이에서 플라스미드 5803, 5816, 5820, 5805, 5819 및 5806으로부터 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질의 발현
테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질 5803, 5816, 5820, 5805, 5819 및 5806의 발현을 위해서, 에스케리키아 콜라이 영양요구성(PyrF)의 상보성에 의한 무-항생제 플라스미드를 선택할 수 있게 하는 에스케리키아 콜라이 숙주/벡터 시스템을 사용하였다(예를 들어 EP-B 0 972 838 및 미국 특허 제 6,291,245 호를 참조하시오).
상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질을 에스케리키아 콜라이 균주 CSPZ-2(leuB, proC, trpE, thi-1, ΔpyrF)에서 발현시켰다.
선택성 배지에서 pyrF 영양요구성의 상보성에 의한 형질전환 및 세포 배양
에스케리키아 콜라이 K12 균주 CSPZ-2(leuB, proC, trpE, thi-1, ΔpyrF)를 선행 단계에서 수득한 발현 플라스미드들(각각 5803, 5816, 5820, 5805, 5819 및 5806)로 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 CSPZ-2 세포를 먼저 37 ℃에서 아가 플레이트 상에서 증식시키고 후속으로 0.5% 카사미노산(디프코(Difco))을 함유하는 M9 최소 배지에서 진탕 배양물 중에서 550 ㎚에서 0.6 내지 0.9의 광학 밀도까지 증식시키고 후속으로 IPTG(1 내지 5 mmol/ℓ 최종 농도)로 유도하였다.
37 ℃에서 4 내지 16 시간의 유도 기간 후에, 상기 세포질 및 용해성의 발현된 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질은, 삼각 플라스크 중의 전체 배양물 브로쓰를 수확 전에 1 내지 2 시간 동안 50 ℃로 가열하는 가열 단계에 의해, 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체로 전이되었다. 그 후에, 상기 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 50 mmol/ℓ의 칼륨 포스페이트 완충제, pH 6.5로 세척하고, 추가의 가공과정까지 -20 ℃에서 보관하였다.
발현 분석
발현 분석을 위해서 원심분리된 배양 배지의 3 개의 OD550 ㎚ 단위(1 OD550 ㎚ = 550 ㎚에서 1의 OD를 갖는 1 ㎖의 세포 현탁액)로부터 세포 펠릿을 0.25 ㎖의 10 mmol/ℓ 칼륨 포스페이트 완충제, pH 6.5에 재현탁하고, 상기 세포를 초음파 처리(50% 강도에서 30 초의 2 회 펄스)에 의해 용해시켰다. 상기 불용성 세포 성분들이 침전되었으며(원심분리 14,000 rpm, 5 분) 상등액을 그의 1/5 부피의 5xSDS 샘플 완충제(1xSDS 샘플 완충제: 50 mmol/ℓ 트리스-HCl, pH6.8, 1% SDS, 50 mmol/ℓ DTT, 10% 글리세롤, 0.001% 브로모페놀 블루)와 혼합하였다. 상기 불용성 세포 찌꺼기 분획(펠릿)을 0.3 ㎖의 1xSDS 샘플 완충제에 재현탁하고, 상기 샘플을 95 ℃에서 5 분간 배양하고 다시 원심분리시켰다. 후속으로, 상기 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(PAGE)(문헌[Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685])에 의해 분리시키고 쿠마씨 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R 염료로 염색하였다.
상기 합성된 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질은 균질하였으며 불용성 단백질 응집체(IB)의 형태로 불용성 세포 찌꺼기 분획 중에서 발견되었다. 상기 발현 수율은 모든 클론들에서 측정 정확도의 범위 내에서 필적할만하였으며 전체 에스케리키아 콜라이 단백질에 대해 30 내지 60%였다.
실시예 3
테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질의 재조합 생산을 위한 에스케리키아 콜라이의 10 ℓ 고 세포 밀도 발효
실시예 3a
예비-배양
예비-배양을 위해서 약 1 g/ℓ의 L-류신, 약 1 g/ℓ의 L-프롤린 및 약 1 ㎎/ℓ의 티아민-HCl이 보충된 문헌[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition, New York, (December 1989)]에 따른 M9 배지를 사용하였다.
예비-배양을 위해서 배플을 갖는 1000 ㎖ 삼각-플라스크 중의 M9-배지 300 ㎖에 1차 시드 뱅크 앰풀 2 ㎖을 접종하였다. 상기 배양을 1 내지 3의 광학 밀도(578 ㎚)가 획득될 때까지 37 ℃에서 13 시간 동안 회전 진탕기 상에서 수행하였다.
10 ℓ 유가( fed - batch ) 주 발효
발효를 위해서 문헌[Riesenberg, et al.]에 따른 배치 배지를 사용하였다(문헌[Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27]: 27.6 g/ℓ 글루코스*H2O, 13.3 g/ℓ KH2PO4, 4.0 g/ℓ (NH4)2HPO4, 1.7 g/ℓ 시트레이트, 1.2 g/ℓ MgSO4*7 H2O, 60 mg/ℓ 철(III) 시트레이트, 2.5 mg/ℓ CoCl2*6 H2O, 15 mg/ℓ MnCl2*4 H2O, 1.5 mg/ℓ CuCl2*2 H2O, 3 mg/ℓ H3BO3, 2.5 mg/ℓ Na2MoO4*2 H2O, 8 mg/ℓ Zn(CH3COO)2*2 H2O, 8.4 mg/ℓ 티트리플렉스(Titriplex) III, 1.3 ml/ℓ 신페로닉(Synperonic) 10% 소포제). 상기 배치 배지에 5.4 ㎎/ℓ 티아민-HCl 및 1.2 g/ℓ L-류신 및 L-프롤린 각각을 보충하였다. 공급물 1 용액은 19.7 g/ℓ MgSO4*7H2O가 보충된 700 g/ℓ 글루코스를 함유하였다. pH 조절용 알칼리 용액은 50 g/ℓ L-류신 및 50 g/ℓ L-프롤린이 각각 보충된 수성 12.5%(w/v) NH3 용액이었다.
상기 발효를 10 ℓ 바이오스탯(Biostat) C DCU3 발효기(자르토리우스(Sartorius) 독일 멜슝겐 소재)에서 수행하였다. 6.4 ℓ 멸균 발효 배치 배지 + 상기 예비-배양으로부터의 300 ㎖의 접종물로 출발하여, 배치 발효를 37 ℃, pH 6.9±0.2, 500 mbar에서 10 ℓ/분의 통기율로 수행하였다. 처음에 보충된 글루코스가 고갈된 후에, 온도를 28 ℃로 이동시켰으며 상기 발효가 유가 방식에 돌입하였다. 여기에서 용존 산소(pO2)의 상대적인 값을, 공급물 1을 일정하게 증가하는 교반기 속도(10 시간 이내에 550 rpm으로부터 1000 rpm까지 및 16 시간 이내에 1000 rpm으로부터 1400 rpm까지) 및 통기율(10 시간 동안 10 ℓ/분으로부터 16 ℓ/분까지 및 5 시간 동안 16 ℓ/분으로부터 20 ℓ/분까지)와 함께 첨가함으로써 50%로 유지시켰다(DO-염, 예를 들어 문헌[Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. (1987) 79-85]을 참조하시오). 상기 추가적인 아미노산과의 공급은 상기 알칼리 용액의 첨가로부터 생성되었으며, 이때 pH는 대략 8 시간의 배양 후에 조절 하한(6.70)에 도달하였다. 상기 재조합 치료 단백질의 발현은 70의 광학 밀도에서 1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었다.
바이오매스 수확
상기 발효의 끝에서 세포질성 및 용해성의 발현된 테트라넥틴-아포지방단백질 A1은, 상기 발효기 중의 전체 배양물 브로쓰를 수확 전에 1 내지 2 시간 동안 50 ℃로 가열하는 가열 단계에 의해, 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체로 전이된다(예를 들어 EP-B 1 486 571을 참조하시오). 그 후에, 상기 발효기의 내용물을 병류 원심분리기로 원심분리시키고(13,000 rpm, 13 ℓ/h), 수확된 바이오매스를 추가의 가공과정까지 -20 ℃에서 보관하였다. 상기 합성된 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질은 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체(IB)의 형태로 오직 불용성 세포 찌꺼기 분획에서만 독점적으로 발견되었다.
생성물 정량분석
상기 발효기로부터 취한 샘플들(하나는 유도 전의 것이고 다른 것들은 단백질 발현 유도 후 전용 시점에서의 것들)을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한다. 모든 샘플로부터 동일한 양의 세포(OD표적 = 5)를 5 ㎖의 PBS 완충제에 현탁하고 얼음 상에서 초음파 처리를 통해 분쇄시켰다. 이어서 100 ㎕의 각 현탁액을 원심분리하고(15,000 rpm, 5 분), 각 상등액을 회수하고 별도의 바이알로 옮긴다. 이는 용해성과 불용성의 발현된 표적 단백질을 구별하기 위한 것이다. 각 상등액(=용해성) 분획에 300 ㎕, 및 각 펠릿(=불용성) 분획에 400 ㎕의 SDS 샘플 완충제(문헌[Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685])를 가한다. 샘플들을 진탕 하에 95 ℃에서 15 분간 가열하여 상기 샘플들 중의 모든 단백질들을 용해시키고 환원시켰다. 실온으로 냉각시킨 후에 5 ㎕의 각 샘플을 4 내지 20% TGX 기준 염색 부재 폴리아크릴아미드 젤(바이오-래드(Bio-Rad))로 옮긴다. 추가로 5 ㎕의 분자량 표준(프리시즌 플러스 프로테인 스탠다드(Precision Plus Protein Standard, 바이오-래드) 및 기지의 생성물 단백질 농도(0.1 ㎍/㎕)를 갖는 3 개 량(0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9 ㎕)의 정량분석 기준을 상기 젤 상에 위치시킨다.
상기 전기영동을 200 V에서 60 분간 실행시켰으며 그 후에 상기 젤을 GelDOC EZ 이미저(바이오-래드)로 옮기고 UV 조사 하에 5 분간 처리하였다. 젤 상들을 이미지 랩(Image Lab) 분석 소프트웨어(바이오-래드)를 사용하여 분석하였다. 상기 3 개 표준을 사용하여 >0.99의 계수로 선형 회귀 곡선을 계산하고 이로부터 원래 샘플 중의 표적 단백질의 농도를 계산하였다.
실시예 3b
예비-배양
예비-배양을 위해서 약 1 g/ℓ의 L-류신, 약 1 g/ℓ의 L-프롤린 및 약 1 ㎎/ℓ의 티아민-HCl이 보충된 문헌[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition, New York, (December 1989)]에 따른 M9 배지를 사용하였다.
예비-배양을 위해서 배플을 갖는 1000 ㎖ 삼각-플라스크 중의 변형된 M9-배지 300 ㎖에 아가 플레이트로부터, 또는 1차 시드 뱅크 앰풀 1 내지 2 ㎖을 접종하였다. 상기 배양을 1 내지 3의 광학 밀도(578 ㎚)가 획득될 때까지 37 ℃에서 13 시간 동안 회전 진탕기 상에서 수행하였다.
10 ℓ 유가 주 발효
발효 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A1의 고 수율 발현을 위해서 하기의 배치 배지 및 공급물들을 사용하였다:
8.85 g/ℓ 글루코스, 63.5 g/ℓ 효모 추출물, 2.2 g/ℓ NH4Cl, 1.94 g/ℓ L-류신, 2.91 g/ℓ L-프롤린, 0.74 g/ℓ L-메티오닌, 17.3 g/ℓ KH2PO4*H2O, 2.02 g/ℓ MgSO4*7H2O, 25.8 mg/ℓ 티아민-HCl, 1.0 ml/ℓ 신페로닉 10% 소포제. 상기 공급물 1 용액은 1.67 g/ℓ L-메티오닌 및 5 g/ℓ L-류신 및 L-프롤린 각각이 보충된 333 g/ℓ 효모 추출물 및 333 g/ℓ 85% 글리세롤을 함유하였다. 상기 공급물 2는 600 g/ℓ L-프롤린의 용액이었다. 상기 pH 조절용 알칼리 용액은 10%(w/v) KOH 용액이었으며 산으로서 75% 글루코스 용액을 사용하였다. 모든 성분들은 탈이온수에 용해되었다.
상기 발효를 10 ℓ 바이오스탯 C DCU3 발효기(자르토리우스, 독일 멜슝겐 소재)에서 수행하였다. 5.15 ℓ 멸균 발효 배치 배지 + 상기 예비-배양으로부터의 300 ㎖의 접종물로 출발하여, 유가 발효를 25 ℃, pH 6.7±0.2, 300 mbar에서 10 ℓ/분의 통기율로 수행하였다. 처음에 보충된 글루코스가 고갈되기 전에, 상기 배양물은 15의 광학 밀도(578 ㎚)에 도달하였으며 상기 발효가 유가 방식에 돌입하였고 이때 공급물 1을 70 g/h로 출발하였다. 상기 배양물 중의 글루코스 농도를 모니터하면서 공급물 1을, 글루코스 축적을 피하고 pH를 6.9의 조절 상한 부근으로 유지시키면서 최대 150 g/ℓ로 증가시켰다. 50의 광학 밀도(578 ㎚)에서, 공급물 2는 10 ㎖/h의 일정한 공급률로 시작하였다. 용존 산소(pO2)의 상대적인 값을, 교반기 속도(500 rpm에서 1500 rpm), 통기율(10 ℓ/분으로부터 20 ℓ/분까지) 및 압력(300 mbar로부터 500 mbar까지)을 동시에 증가시킴으로써 50% 이상으로 유지시켰다. 상기 재조합 치료 단백질의 발현은 90의 광학 밀도에서 1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었다.
생성물 정량분석
상기 발효기로부터 취한 7 개의 샘플들(하나는 유도 전의 것이고 다른 것들은 단백질 발현 유도 후 전용 시점에서의 것들)을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한다. 모든 샘플로부터 동일한 양의 세포(OD표적 = 5)를 5 ㎖의 PBS 완충제에 현탁하고 얼음 상에서 초음파 처리를 통해 분쇄시켰다. 이어서 100 ㎕의 각 현탁액을 원심분리하고(15,000 rpm, 5 분), 각 상등액을 회수하고 별도의 바이알로 옮긴다. 이는 용해성과 불용성의 발현된 표적 단백질을 구별하기 위한 것이다. 각 상등액(=용해성) 분획에 300 ㎕, 및 각 펠릿(=불용성) 분획에 200 ㎕의 SDS 샘플 완충제(문헌[Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685])를 가한다. 샘플들을 진탕 하에 95 ℃에서 15 분간 가열하여 상기 샘플들 중의 모든 단백질들을 용해시키고 환원시켰다. 실온으로 냉각시킨 후에 5 ㎕의 각 샘플을 10% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 젤(노바겐(Novagen))로 옮긴다. 추가로 5 ㎕의 분자량 표준(프리시즌 플러스 프로테인 스탠다드, 바이오-래드) 및 기지의 생성물 단백질 농도(0.1 ㎍/㎕)를 갖는 3 개 량(0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9 ㎕)의 정량분석 기준을 상기 젤 상에 위치시킨다.
상기 전기영동을 200 V에서 35 분간 실행시켰으며 이어서 상기 젤을 쿠마씨 브릴리언트 블루 R 염료로 염색하고, 가열된 물로 탈염시키고, 디지털화를 위해서 광학 농도계(GS710, 바이오-래드)로 옮겼다. 젤 상들을 콴터티 원(Quantity One) 1-D 분석 소프트웨어(바이오-래드)를 사용하여 분석하였다. 상기 3 개 표준을 사용하여 >0.98의 계수로 선형 회귀 곡선을 계산하고 이로부터 원래 샘플 중의 표적 단백질의 농도를 계산하였다.
바이오매스 수확
상기 발효의 끝에서 세포질성 및 용해성의 발현된 테트라넥틴-아포지방단백질 A1은, 상기 발효기 중의 전체 배양물 브로쓰를 수확 전에 1 내지 2 시간 동안 50 ℃로 가열하는 가열 단계에 의해, 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체(IB)로 전이되었다(예를 들어 EP-B 1 486 571 참조하시오). 상기 가열 단계 후에, 상기 합성된 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질은 IB의 형태로 오직 불용성 세포 찌꺼기 분획에서만 독점적으로 발견되었다.
상기 발효기의 내용물을 4 내지 8 ℃로 냉각시키고, 병류 원심분리기로 원심분리시키고(13,000 rpm, 13 ℓ/h), 수확된 바이오매스를 추가의 가공과정까지 -20 ℃에서 보관한다. 상기 수확된 총 바이오매스 수율은 상기 발현된 구축물에 따라 건조 물질 39 g/ℓ 내지 90 g/ℓ의 범위였다.
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Hoffmann-La Roche AG <120> Prokaryotic expression construct <130> 26973 <140> PCT/EP2011/064599 <141> 2011-08-25 <150> EP10008996.0 <151> 2010-08-30 <150> EP10187663.9 <151> 2010-10-15 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> short amino acid sequence <400> 1 Lys Ala Lys Arg Phe Lys Lys His 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> short amino acid sequence <400> 2 Ala His Phe Trp Gln Gln Ala 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> short amino acid sequence <400> 3 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> short amino acid sequence <400> 4 Ile Glu Pro Asp 1 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> short amino acid sequence <400> 5 Ile Glu Pro Asp Ser Pro Gly Thr 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> short amino acid sequence <400> 6 Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr 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125 Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro 130 135 140 Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr 145 150 155 160 Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg 165 170 175 Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu 180 185 190 Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu 195 200 205 Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu 210 215 220 Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys 225 230 235 240 Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu 245 250 255 Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val 260 265 270 Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 285 <210> 79 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pro-polypeptide 5803 <400> 79 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Pro Arg Pro Pro 1 5 10 15 Thr Pro <210> 80 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid 5816 <400> 80 Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser His His His His 1 5 10 15 His His Gly Ser Val Val Ala Pro Pro Ala Pro 20 25 <210> 81 <211> 146 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid 5820 <400> 81 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Glu Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr 20 25 30 Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly 35 40 45 Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro 50 55 60 Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr 85 90 95 Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser 100 105 110 Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp 115 120 125 Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Val Val Ala Pro Pro 130 135 140 Ala Pro 145 <210> 82 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid 5805 <400> 82 Met Arg Gly Ser His His His His His His Ala His Phe Trp Gln Gln 1 5 10 15 Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 20 <210> 83 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid 5819 <400> 83 Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gln Gln Gln Gln Leu Leu Asp Val Val Lys Arg Gln Gln Glu Leu Leu 20 25 30 Arg Leu Thr Val Trp Gly Thr Lys Asn Leu Gln Ala Arg Val Thr Ala 35 40 45 Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys 50 55 60 Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser 65 70 75 80 Leu Ala Pro Asp Trp Asp Asn Met Thr Trp Gln Glu Trp Glu Lys Gln 85 90 95 Val Arg Tyr Leu Glu Ala Asn Ile Ser Lys Ser Leu Glu Gln Ala Gln 100 105 110 Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp 115 120 125 Asp Ile Arg Ser Val Val Ala Pro Pro Ala Pro 130 135 <210> 84 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid 5806 <400> 84 Met His His His His His His Lys Ala Lys Arg Phe Lys Lys His Pro 1 5 10 15 Arg Pro Pro Ala Pro 20

Claims (40)

  1. N-에서 C-말단 방향으로
    제 1 다이펩타이드 GS,
    아미노산 서열 태그,
    효소 절단 부위에 바로 인접한 제 2 다이펩타이드 GS, 및
    상기 효소 절단 부위
    를 포함하는 프로-폴리펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제 1 다이펩타이드 GS에 대해 N-말단에 2 개 이상의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 선도 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로-폴리펩타이드.
  3. N-에서 C-말단 방향으로
    제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프로-폴리펩타이드, 및
    관심 폴리펩타이드
    를 포함하는 융합 폴리펩타이드.
  4. 제 3 항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 프로-폴리펩타이드의 N-말단의 아미노산이 유리 알파-아미노 기를 가짐을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산 서열 태그가 서열번호 11 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소 절단 부위가 서열번호 33 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 다이펩타이드 GS에 대한 N-말단 선도 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 8 중에서 선택된 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  8. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    관심 폴리펩타이드가 항체 중쇄 또는 경쇄, 항체 단편, 단쇄 항체, 아포지방단백질, 아포지방단백질 변체, 아포지방단백질 융합물, 인터페론, 인터류킨, 인슐린, 조직 유형 플라스미노겐 활성화제 변체, 콜로니-자극 인자, 성장 호르몬, 및 골 형태발생 단백질 중에서 선택됨을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드.
  9. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    관심 폴리펩타이드가 서열번호 43 또는 서열번호 44 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드.
  10. 관심 폴리펩타이드의 제조 방법으로서,
    (a) N-에서 C-말단 방향으로
    제 1 다이펩타이드 GS,
    아미노산 서열 태그,
    효소 절단 부위에 바로 인접한 제 2 다이펩타이드 GS,
    상기 효소 절단 부위, 및
    상기 관심 폴리펩타이드
    를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계,
    (b) 상기 세포를 배양하는 단계,
    (c) 상기 세포 또는 배양 배지로부터 상기 융합 폴리펩타이드를 회수하는 단계,
    (d) 상기 융합 폴리펩타이드를 정제하는 단계,
    (e) 상기 융합 폴리펩타이드를 효소에 의해 절단하고 이에 의해 상기 관심 폴리펩타이드를 생성시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    융합 폴리펩타이드가 제 1 다이펩타이드 GS에 대해 N-말단에 2 개 이상의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 선도 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    제 1 다이펩타이드 GS에 대한 N-말단 선도 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 8 중에서 선택된 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 원핵생물 세포임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노산 서열 태그가 서열번호 11 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소 절단 부위가 서열번호 33 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    관심 폴리펩타이드가 항체 중쇄 또는 경쇄, 항체 단편, 단쇄 항체, 아포지방단백질, 아포지방단백질 변체, 아포지방단백질 융합물, 인터페론, 인터류킨, 인슐린, 조직 유형 플라스미노겐 활성화제 변체, 콜로니-자극 인자, 성장 호르몬, 및 골 형태발생 단백질 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩타이드가 서열번호 43 또는 서열번호 44 또는 서열번호 45의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  18. 5'-에서 3'-방향으로
    다이펩타이드 GS를 암호화하는 핵산,
    아미노산 서열 태그를 암호화하는 핵산,
    효소 절단 부위를 암호화하는 핵산에 바로 인접한 다이펩타이드 GS를 암호화하는 핵산, 및
    상기 효소 절단 부위를 암호화하는 핵산
    을 포함하는 핵산을 포함하는 키트.
  19. 원핵생물 세포의 배양 방법으로서,
    상기 원핵생물 세포를 글루코스, 효모 추출물, L-류신, L-프롤린, L-메티오닌, 티아민-HCl, 소포제를 포함하는 배지에서 배양하고,
    상기 세포에 효모 추출물, 글리세롤, L-메티오닌, L-류신 및 L-프롤린을 포함하는 제 1 공급물 용액을 공급하고,
    상기 세포에 L-프롤린을 포함하는 제 2 공급물 용액을 공급하고,
    수산화 칼륨 용액 및 글루코스 용액을 pH 조절에 사용함
    을 특징으로 하는 방법.
  20. 폴리펩타이드의 제조 방법으로서,
    상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 글루코스, 효모 추출물, L-류신, L-프롤린, L-메티오닌, 티아민-HCl, 소포제를 포함하는 배지에서 배양하고,
    상기 세포에 효모 추출물, 글리세롤, L-메티오닌, L-류신 및 L-프롤린을 포함하는 제 1 공급물 용액을 공급하고,
    상기 세포에 L-프롤린을 포함하는 제 2 공급물 용액을 공급하고,
    수산화 칼륨 용액 및 글루코스 용액을 pH 조절에 사용함
    을 특징으로 하고, 상기 폴리펩타이드를 상기 세포 또는 상기 배양 배지로부터 회수하고 이에 의해 폴리펩타이드를 생성시키는 방법.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    제 1 공급물의 첨가를 578 ㎚에서 측정된 약 15의 광학 밀도에서 출발하고, 제 2 공급물의 첨가를 578 ㎚에서 측정된 약 50의 광학 밀도에서 출발하고, 폴리펩타이드의 발현을 578 ㎚에서 측정된 약 90의 광학 밀도에서 IPTG로 유도함을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19 항 또는 제 21 항에 있어서,
    배지가 약 8.85 g/ℓ의 글루코스, 약 63.5 g/ℓ의 효모 추출물, 약 2.2 g/ℓ의 NH4Cl, 약 1.95 g/ℓ의 L-류신, 약 2.9 g/ℓ의 L-프롤린, 약 0.75 g/ℓ의 L-메티오닌, 약 17.3 g/ℓ의 KH2PO4*3H2O, 약 2 g/ℓ의 MgSO4*7H2O, 약 25.8 ㎎/ℓ의 티아민-HCl, 약 1.0 ㎖/ℓ의 10% 소포제를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 공급물 용액이 약 333 g/ℓ의 효모 추출물, 약 333 g/ℓ의 85% 글리세롤, 약 1.7 g/ℓ의 L-메티오닌, 및 약 5 g/ℓ의 L-류신 및 L-프롤린 각각을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 공급물 용액이 약 600 g/ℓ의 L-프롤린을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    pH 조절용 염기가 10%(w/v) KOH 용액이고 산이 75% 글루코스 용액임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배양이 약 25 ℃에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배양이 약 pH 6.5 내지 약 pH 6.9의 pH에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 19 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 공급물이 70 g/h의 비율로 출발함을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 공급물이 10 ㎖/h의 비율로 출발함을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 19 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    용존 산소 값을 50% 이상으로 유지시킴을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    용존 산소 값을, 교반기 속도, 통기율, 및 공기압을 동시에 증가시킴으로써 50% 이상으로 유지시킴을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 19 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    교반기 속도가 약 500 rpm 내지 약 1500 rpm임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 19 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    통기율이 약 10 ℓ/분 내지 약 20 ℓ/분임을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 19 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공기압이 약 300 mbar 내지 약 500 mbar임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 19 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    원핵생물 세포가 에스케리키아 콜라이 세포임을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 19 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩타이드가 아포지방단백질 A1임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    아포지방단백질 A1이 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  38. 약 8.85 g/ℓ의 글루코스, 약 63.5 g/ℓ의 효모 추출물, 약 2.2 g/ℓ의 NH4Cl, 약 1.95 g/ℓ의 L-류신, 약 2.9 g/ℓ의 L-프롤린, 약 0.75 g/ℓ의 L-메티오닌, 약 17.3 g/ℓ의 KH2PO4*3H2O, 약 2 g/ℓ의 MgSO4*7H2O, 약 25.8 ㎎/ℓ의 티아민-HCl, 약 1.0 ㎖/ℓ의 10% 소포제를 포함하는 원핵생물 세포용 배양 배지.
  39. 제 38 항에 있어서,
    약 333 g/ℓ의 효모 추출물, 약 333 g/ℓ의 85% 글리세롤, 약 1.7 g/ℓ의 L-메티오닌, 및 약 5 g/ℓ의 L-류신 및 L-프롤린 각각을 포함하는 제 1 공급물을 또한 포함함을 특징으로 하는 배양 배지.
  40. 제 39 항에 있어서,
    약 600 g/ℓ의 L-프롤린을 포함하는 제 2 공급물 용액을 또한 포함함을 특징으로 하는 배양 배지.
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