ES2688044T3 - Uso de una cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos para la producción recombinante de un polipéptido - Google Patents

Uso de una cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos para la producción recombinante de un polipéptido Download PDF

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ES2688044T3 ES14706005.7T ES14706005T ES2688044T3 ES 2688044 T3 ES2688044 T3 ES 2688044T3 ES 14706005 T ES14706005 T ES 14706005T ES 2688044 T3 ES2688044 T3 ES 2688044T3
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Abstract

Un procedimiento para producir un polipéptido en una célula procariota, que comprende las siguientes etapas: - suprimir en una célula procariota que es auxótrofa para al menos un aminoácido al menos una auxotrofia para un aminoácido introduciendo en el genoma de una célula procariota original un ácido nucleico que suprima una auxotrofia para aminoácidos de la célula procariota original, - cultivar la célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente y recuperar el polipéptido de la célula procariota o del periplasma de la célula procariota o del medio, en el que el valor de producto cuando se usa la cepa procariota con supresión de auxotrofias es más alto que el valor de producto que se puede obtener con una cepa protótrofa natural correspondiente.

Description

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DESCRIPCION
Uso de una cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos para la producción recombinante de un polipéptido
La presente invención se encuentra en el campo de la producción de polipéptidos recombinantes. Más precisamente, en el presente documento se informa de un procedimiento para la producción recombinante de un polipéptido no glucosilado que usa una cepa procariota con supresión de auxotrofias en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente.
Antecedentes de la invención
En los últimos años, la producción de polipéptidos terapéuticos se ha incrementado constantemente y es probable que los polipéptidos terapéuticos se conviertan en el grupo más grande de medicamentos disponibles para el tratamiento de diversas enfermedades en un futuro próximo. El impacto de los polipéptidos terapéuticos procede de su especificidad, tal como el reconocimiento de dianas y/o la función de unión específicos.
Los cultivos celulares se usan en procedimientos fermentativos para producir sustancias y, en particular, polipéptidos. Se hace una distinción entre los procedimientos en los que los cultivos celulares no se modifican genéticamente y forman sus productos metabólicos endógenos y los procedimientos en los que los organismos se modifican genéticamente de tal manera que produzcan una cantidad más grande de sus sustancias endógenas, tales como polipéptidos, o bien produzcan sustancias exógenas. A los organismos que producen las sustancias se les suministra un medio de nutrientes que garantiza la supervivencia de los organismos y posibilita la producción del compuesto diana deseado. Se conocen numerosos medios de cultivo para estos propósitos que posibilitan un cultivo óptimo del huésped específico.
El uso de un medio mínimo de crecimiento definido químicamente en el cultivo de una célula recombinante para la producción recombinante de polipéptidos terapéuticos es ventajoso. Posibilita un fácil desarrollo del procesamiento y purificación posteriores del polipéptido terapéutico producido, proporciona un sólido procedimiento de producción debido a las diferencias minimizadas en las materias primas y reduce los costes de los productos.
Un medio mínimo de crecimiento definido químicamente no comprende aminoácidos libres y se requiere que use líneas de células protótrofas que tengan vías metabólicas inalteradas para producir los aminoácidos requeridos a partir de los componentes disponibles del medio mínimo de crecimiento definido químicamente.
Por ejemplo, cuando se usa E. coli como línea de células huésped, en general, se emplean cepas naturales, tales como MG1655, W3110 o BL21. Estas cepas muestran buenas características de crecimiento, pero un valor de producto inferior.
Las cepas procariotas mutantes, que se han obtenido mediante selección y mutagénesis no dirigida, muestran profundas diferencias en su ADN genómico en comparación con las cepas naturales. Las cepas mutantes se han seleccionado basándose en el valor de producto máximo que se puede obtener. Como las cepas mutantes albergan una serie de auxotrofias, no se pueden usar para su cultivo en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente. Las cepas mutantes requerían la alimentación de aminoácidos para complementar sus auxotrofias, lo que daba como resultado costes de cultivo incrementados.
El documento US 5.932.439 informa de cepas de Escherichia coli K-12 para la producción de proteínas recombinantes.
El documento WO 2012/028526 informa de una proteína de fusión tetranectina-apolipoproteína A-I. El documento EP 0 972 383 informa de un sistema huésped/vector de E. coli que posibilita una selección de plásmidos libre de antibióticos mediante complementación de una auxotrofia en E. coli (pyrF).
Vidal et al. informaron del desarrollo de un sistema de selección de plásmidos libre de antibióticos basado en la auxotrofia para glicina para la sobreproducción recombinante de proteínas en Escherichia coli (J. Biotechnol. 134 (2008) 127-136).
Schmidt, M., et al. informaron sobre la superación de la auxotrofia para isoleucina de BLR(DE3) de Escherichia coli para producir de manera recombinante proteínas de seda de araña en medios mínimos (Biotechnol. Lett. 29 (2007) 1741-1744).
Huang, C., et al. informaron de la producción industrial de medicamentos recombinantes en Escherichia coli y sus avances recientes (J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (2012) 383-399).
Sumario
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La invención se define por las reivindicaciones.
Suprimiendo en una cepa procariota auxótrofa una o más de sus auxotrofias, la cepa con supresión de auxotrofias puede crecer en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente al que ya no se necesita añadir la sustancia correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido. En el caso de sustancias costosas, se puede lograr una reducción de los costes de los productos y se puede producir de manera más económica un polipéptido recombinante.
Además del restablecimiento de la capacidad de crecer en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente en ausencia de la sustancia correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido, se ha descubierto que el valor de producto obtenible se puede mantener o incluso incrementar en comparación con la cepa sin supresión. Además, se ha descubierto que el valor de producto obtenible usando una cepa procariota con supresión de auxotrofias es más alto que el valor de producto que se puede obtener con una cepa protótrofa natural correspondiente.
Sin comprometerse con esta teoría, se supone que una cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos como se informa en el presente documento tiene un metabolismo y flujos metabólicos diferentes en comparación con una cepa protótrofa natural correspondiente en la que no se han realizado dichas deleción y supresión. Por tanto, la inactivación y reactivación de determinadas enzimas en una cepa procariota tiene un efecto detectable/pronunciado sobre todo el metabolismo de la cepa, lo que se puede ver, por ejemplo, en la productividad incrementada de dicha cepa en comparación con una cepa protótrofa natural correspondiente.
En el presente documento se divulga una cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos, caracterizada por que
- se ha suprimido al menos una insuficiencia en la vía metabólica de un aminoácido esencial, y
- la cepa puede crecer en medio mínimo de crecimiento definido químicamente que está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la cepa procariota con supresión de auxotrofias.
En un modo de realización, la cepa procariota con supresión de auxotrofias es una cepa de E. coli con supresión de auxotrofias.
En el presente documento se divulga una célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos, caracterizada por que
- se ha suprimido al menos una insuficiencia en la vía metabólica de un aminoácido esencial, y
- la célula puede crecer en medio mínimo de crecimiento definido químicamente que está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
En un modo de realización, la célula procariota con supresión de auxotrofias es una célula de E. coli con supresión de auxotrofias.
Se puede usar la cepa/célula procariota con supresión de auxotrofias como se informa en el presente documento en un procedimiento para la producción recombinante de un polipéptido terapéutico, en el que, en comparación con la cepa/célula sin supresión de auxotrofias, no se requiere el enriquecimiento con al menos un residuo de aminoácido.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para producir un polipéptido en una célula procariota (recombinante), que comprende las siguientes etapas:
- suprimir en una célula procariota que es auxótrofa para al menos un aminoácido al menos una auxotrofia para un aminoácido introduciendo en el genoma de una célula procariota original un ácido nucleico que suprima una auxotrofia para aminoácidos de la célula procariota original,
- cultivar la célula procariota (recombinante) con supresión de auxotrofias para aminoácidos que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente y recuperar el polipéptido de la célula procariota o del periplasma de la célula procariota o del medio
en el que el valor de producto cuando se usa la cepa procariota con supresión de auxotrofias es más alto que el valor de producto que se puede obtener con una cepa protótrofa natural correspondiente.
En un modo de realización de todos los procedimientos para producir un polipéptido, la célula procariota con supresión de auxotrofias tiene al menos una auxotrofia para aminoácidos (sin supresión) adicional. Esta auxotrofia se puede usar para la selección de recombinantes/transformantes después de la introducción de uno o más ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de interés (el polipéptido).
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En un modo de realización de todos los procedimientos para producir un polipéptido, el procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos en comparación con la célula (célula original) en las mismas condiciones de cultivo y en el mismo medio de enriquecimiento con menos aminoácidos en el medio de crecimiento.
En un modo de realización de todos los procedimientos para producir un polipéptido, el medio mínimo de crecimiento definido químicamente está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
En un modo de realización de todos los procedimientos para producir un polipéptido, el cultivo de la célula procariota con supresión de auxotrofias requiere el enriquecimiento con uno o dos o tres o cuatro aminoácidos menos en el medio de crecimiento que el requerido para el cultivo de la célula procariota sin supresión de auxotrofias (original/célula original).
En un modo de realización de todos los procedimientos para producir un polipéptido, el aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias no se añade durante el cultivo.
En un modo de realización de todos los procedimientos para producir un polipéptido, el cultivo es en ausencia del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
En un modo de realización de todos los procedimientos para producir un polipéptido, la célula procariota es una célula de E. coli.
En un modo de realización de todos los procedimientos para producir un polipéptido, el polipéptido es una cadena de anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio único, un scFv, un scFab, o un conjugado de uno de los anteriores con un polipéptido que no sea un anticuerpo.
En un modo de realización de todos los procedimientos para producir un polipéptido, el polipéptido es un conjugado de un scFv o scFab con un agente citotóxico.
En el presente documento se divulga el uso de una cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos para la producción (recombinante) de un polipéptido.
En un modo de realización,
- en la cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos se ha suprimido al menos una insuficiencia en la vía metabólica de un aminoácido esencial, y
- la cepa con supresión de auxotrofias para aminoácidos puede crecer en medio mínimo de crecimiento definido químicamente que está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la cepa procariota con supresión de auxotrofias.
En un modo de realización, la cepa procariota con supresión de auxotrofias es una cepa de E. coli con supresión de auxotrofias.
En un modo de realización, el polipéptido es una cadena de anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio único, un scFv, un scFab, o un conjugado de uno de los anteriores con un polipéptido que no sea un anticuerpo.
En un modo de realización, el polipéptido es un conjugado de un scFv o scFab con un agente citotóxico.
En un modo de realización de todos los aspectos, la cepa procariota con supresión de auxotrofias es una cepa no lisógena. Una cepa lisógena está infectada con un bacteriófago temporal, es decir, una cepa no lisógena está libre de bacteriófagos.
En un modo de realización de todos los aspectos, la supresión es una supresión dirigida que selecciona como diana solo la auxotrofia para aminoácidos.
En un modo de realización de todos los aspectos, la supresión es la introducción de una o más enzimas requeridas para la síntesis del aminoácido auxótrofo.
En un modo de realización de todos los aspectos, la cepa procariota tiene el genotipo thi-1, AompT, ApyrF. Descripción detallada
crecimiento de la célula procariota sin supresión crecimiento requiere el
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Un objeto en el desarrollo de los procedimientos de producción de polipéptidos recombinantes a gran escala es la reducción de la cantidad requerida, es decir, el consumo, de componentes del medio durante el cultivo. Especialmente la reducción del consumo de componentes del medio costosos, tales como los aminoácidos, es ventajosa en vista de los costes de los productos.
Este objeto se ha logrado suprimiendo en una cepa auxótrofa para aminoácidos al menos una, algunas o todas sus auxotrofias para aminoácidos a fin de evitar la alimentación de aminoácidos costosos y, con ello, reducir los costes de la producción recombinante de un polipéptido de interés. Adicionalmente, se puede usar un medio definido químicamente que dé como resultado una estabilidad del procedimiento mejorada y facilite el procesamiento posterior (DSP).
Por tanto, en el presente documento se informa de un procedimiento para la producción recombinante de un polipéptido no glucosilado que usa una cepa procariota con supresión de auxotrofias en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente.
Se ha descubierto que suprimiendo en una cepa procariota auxótrofa una o más de sus auxotrofias, la cepa con supresión de auxotrofias puede crecer en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente al que ya no se necesita añadir la sustancia correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido. En el caso de sustancias costosas, tales como, por ejemplo, los aminoácidos, se puede lograr una reducción de los costes de los productos y se puede producir de manera más económica un polipéptido recombinante.
Además del restablecimiento de la capacidad de crecer en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente en ausencia de la sustancia correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido, se ha descubierto que el valor de producto obtenible se puede mantener o incluso incrementar. Además, se ha descubierto que el valor de producto obtenible usando una cepa procariota con supresión de auxotrofias es más alto que el valor de producto que se puede obtener con una cepa protótrofa natural correspondiente.
En el presente documento se informa de un procedimiento para producir un polipéptido en una célula procariota, que comprende la siguiente etapa:
- cultivar una célula procariota, que se ha obtenido introduciendo en el genoma de una célula procariota original un ácido nucleico que suprime una auxotrofia para aminoácidos en la célula procariota original, que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente y recuperar el polipéptido de la célula procariota o del periplasma de la célula procariota o del medio.
En el presente documento se informa de un procedimiento para producir un polipéptido en una célula procariota, que comprende las siguientes etapas:
- suprimir en una célula procariota que es auxótrofa para al menos un aminoácido al menos una auxotrofia para un aminoácido,
- cultivar la célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente y recuperar el polipéptido de la célula procariota o del periplasma de la célula procariota o del medio.
En el presente documento se informa de un procedimiento para producir un polipéptido en una célula procariota (recombinante), que comprende la siguiente etapa:
- cultivar una célula procariota (recombinante) que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente y recuperar el polipéptido de la célula procariota o del periplasma de la célula procariota o del medio,
en el que la célula procariota (recombinante) es una célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos,
en el que el crecimiento de la célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos en comparación con la célula procariota sin supresión (célula original) en las mismas condiciones de cultivo y en el mismo medio de crecimiento requiere el enriquecimiento con menos aminoácidos en el medio de crecimiento, y
en el que el medio mínimo de crecimiento definido químicamente está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
Una “célula procariota auxótrofa para aminoácidos” es una célula procariota que no puede sintetizar un aminoácido esencial, por ejemplo, debido a una mutación o deleción en un locus génico que comprende el gen estructural que
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codifica las proteínas de la vía de biosíntesis correspondiente. Sin la adición del aminoácido respectivo al medio de cultivo, la célula no puede proliferar. La auxotrofia puede ser para cualquier aminoácido. La célula procariota también puede ser auxótrofa para más de un aminoácido. Por tanto, en un modo de realización, la célula procariota auxótrofa para aminoácidos es auxótrofa para al menos dos aminoácidos. En otro modo de realización, la célula procariota auxótrofa para aminoácidos es auxótrofa para al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco aminoácidos. En un modo de realización adicional, la célula procariota auxótrofa para aminoácidos es auxótrofa para al menos 2 y hasta 5, o hasta 10, o hasta 15 aminoácidos. En otro modo de realización, la célula procariota auxótrofa para aminoácidos es auxótrofa para de dos a cinco aminoácidos, o de dos a tres aminoácidos, o para dos aminoácidos, o para tres aminoácidos, o para cuatro aminoácidos. En un modo de realización, la célula con supresión de auxotrofias (para aminoácidos) tiene al menos una auxotrofia para un aminoácido, o al menos auxotrofias para dos aminoácidos, o al menos auxotrofias para tres aminoácidos, o auxotrofias para desde uno a tres aminoácidos o auxotrofias para dos aminoácidos.
En un modo de realización, la célula procariota auxótrofa para aminoácidos es una célula bacteriana.
En un modo de realización, la célula es una célula de Escherichia, o una célula de Bacillus, o una célula de Lactobacillus, o una célula de Corynebacterium o una célula de levadura (Saccharomyces, Candida o Pichia). En un modo de realización adicional, la célula es una célula de Escherichia coli, o una célula de Bacillus subtilis, o una célula de Lactobacillus acidophilus, o una célula de Corynebacterium glutamicum o una célula de levadura de Pichia pastoris.
Las células procariotas que se pueden usar en el procedimiento como se informa en el presente documento pueden comprender una o más auxotrofias para aminoácidos. Por ejemplo, las células de E. coli deficitarias en la vía de biosíntesis de leucina se pueden seleccionar de las células deficitarias en LeuB6 13-6, x148, x156, x2224, x462, X463, x474, x478, x515, x65, x697, x760, 2000k MSE248, 342-167, 342MG, 679-680, A586, A592, A593, AA100, AA7852, AA787, AB1102, AB1111, AB1115, AB1122, AB1129, AB113, AB1132, AB1133, AB114, AB1157, AB1157- D, AB1314, AB1330, AB1331, AB1881, AB1884, AB1885, AB188, CP78, CP79, CR34 Thy-, CR34 Thy- SR, CR34/308, CR34/313, CR34/399, CR34/43, CR34/454, CR34/500, CR34/7a, CS130, CS312, CS419, CS425, CS426, CS460, CS471, CS472, CS50, CS81, CS85, CSR06, CSR603, CSR603/pDR1996, CT28-3b, DA10, DA11, DB1161, DB1257, DE1878, DE1882, DE2345, DF225, DF41, JRG94, JS10 C600r-m-, T6R, P678SSR pro-, PA20SR, PA200 SR, PA201 SR, PA214SRT6R, PA265 SR, PA309, PDE70, PA340, PA340/T6, PA360, PA414, PAM161, PAM162, PAM163, PAM164, PAM660, PAT84, PB349, PB69, PCI, PC2, PC3, PC5, PC6, PC8, PJ1, PJ2, PJ3, PJ4, PJ5, PJ C600 (= CRSR), W208 SR AzR, W2660, LAM-, W945his, WA2127, WA2379, WA2548, WA2552, WA2574, WA2899, WA921, WA946, WA960, Y10, Y46, Y53, Y70, YYC100.
En un modo de realización, la célula procariota es una célula de E. coli K12 o una célula de E. coli B.
El término “crecimiento” se refiere al cambio de la densidad de células viables en un cultivo. Este cambio puede ser un cambio con el tiempo. La densidad de células viables se puede determinar determinando la densidad óptica a 578 nm.
En un modo de realización, el crecimiento es el incremento de la densidad de células viables durante un periodo de tiempo. En un modo de realización, el periodo de tiempo es el periodo de tiempo de 0 a 30 horas de cultivo después de la inoculación.
El término “mismo” indica que un segundo valor está dentro de +/- 20 % de un primer valor. Con respecto a las condiciones de cultivo, el término “mismo” se refiere al tiempo de cultivo, volumen de cultivo, temperatura de cultivo, densidad de células de siembra, tasa de oxigenación, valor de pH, velocidad del agitador, tasa de alimentación (si es aplicable), etc. Con respecto al medio de cultivo, el término “mismo” indica que un segundo medio en comparación con un primer medio difiere en 5 componentes como máximo (difiere = presencia o ausencia).
En un modo de realización, las mismas condiciones de cultivo son las condiciones de cultivo idénticas. En un modo de realización, el mismo medio de cultivo es el medio de cultivo idéntico.
Los procedimientos para cultivar una célula procariota y también para cultivar una célula procariota auxótrofa para aminoácidos se conocen por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Riesenberg, D., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991) 380-384).
El cultivo puede ser con cualquier procedimiento. En un modo de realización, el cultivo es un cultivo por lotes, un cultivo por lote alimentado, un cultivo con perfusión, un cultivo semicontinuo o un cultivo con retención celular completa o parcial.
En un modo de realización, el cultivo es un cultivo de alta densidad de células. El término “cultivo de alta densidad de células” indica un procedimiento de cultivo en el que el peso seco de células de la célula procariota cultivada en un punto del cultivo es de al menos 10 g/l. En un modo de realización, el peso seco de células en un punto del cultivo es de al menos 20 g/l, o al menos 50 g/l, o al menos 100 g/l o más de 100 g/l. A fin de alcanzar dicho estado
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de alta densidad de células, el volumen de las soluciones de alimentación y/o ajuste añadido durante el cultivo ha de ser lo más pequeño posible. Se informa de los procedimientos para la determinación del peso seco de células, por ejemplo, en Riesenberg, D., et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 34 (1990) 77-82.
Los nutrientes en el medio proporcionado se metabolizarán durante el cultivo y se han de reponer a fin de evitar una limitación.
experimento n.°
cepa procariota/plásmido de expresión medio mínimo definido químicamente + valor de producto véase el ejemplo
1
CSPZ-2/5816 Leu, Pro 16,1 g/l 3
2
CSPZ-6/5816 Leu, Pro 19,2 g/l 3
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CSPZ-6/5816 - 20,8 g/l
5
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MG1655 (ApyrF)/5816 - 10,9 g/l 5
A partir de la comparación del experimento n.° 1 con el experimento n.° 2, se puede ver que con la cepa CSPZ-6 con supresión de auxotrofias se puede lograr un valor más alto que con su cepa CSPZ-2 original en las mismas condiciones de cultivo, es decir, la cepa con supresión de auxotrofias tiene una productividad incrementada (productividad volumétrica, tiempo-espacio-rendimiento).
A partir de la comparación del experimento n.° 2 con el experimento n.° 5, se puede ver que la cepa CSPZ-6 con supresión de auxotrofias no requiere la adición de los aminoácidos prolina y leucina para la producción recombinante. Se puede lograr un valor de producto comparable o incluso ligeramente incrementado en ausencia de prolina y leucina.
A partir de la comparación del experimento n.° 5 con el experimento n.° 6, se puede ver que con la cepa CSPZ-6 con supresión de auxotrofias se puede lograr un valor más alto que con una cepa natural correspondiente (MG 1655 (ApyrF)) en las mismas condiciones de cultivo.
experimento n.°
cepa procariota/plásmido de expresión medio mínimo definido químicamente + valor de producto véase el ejemplo
7
CSPZ-6/5830 - 22,6 g/l 6
8
66C5/5830 - 2,3 g/l 6
9
66C5/5830 - 6,9 g/l 6 (temperatura elevada)
El valor de producto obtenible con la cepa CSPZ-6 con supresión de auxotrofias también se ha comparado con el valor de producto obtenible con otra cepa W3110 natural correspondiente (66C5 = ApyrF de W3110).
A partir de la comparación del experimento n.° 7 con el experimento n.° 8, se puede ver que con la cepa CSPZ-6 con supresión de auxotrofias se puede lograr un valor más alto que con una cepa natural correspondiente (W3110) en las mismas condiciones de cultivo.
A partir de la comparación del experimento n.° 7 con el experimento n.° 9, se puede ver que con la cepa CSPZ-6 con supresión de auxotrofias se puede lograr un valor más alto que con una cepa natural correspondiente (W3110) incluso si se usan condiciones de cultivo mejoradas (temperatura elevada) para la cepa natural, pero no para la cepa con supresión de auxotrofias.
experimento n.°
cepa procariota/plásmido de expresión medio mínimo definido químicamente + valor de producto véase el ejemplo
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CSPZ-6/5836 - 33,8 g/l 7
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CSPZ-14/5836 - 9,6 g/l 7
El valor de producto obtenible con la cepa CSPZ-6 con supresión de auxotrofias también se ha comparado con el valor de producto obtenible con otra cepa BL-21 natural correspondiente (CSPZ-14 = ApyrF de BL21).
A partir de la comparación del experimento n.° 10 con el experimento n.° 11, se puede ver que con la cepa CSPZ-6 con supresión de auxotrofias se puede lograr un valor más alto que con una cepa natural correspondiente (BL-21) en las mismas condiciones de cultivo.
En el presente documento se divulga una cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos, caracterizada por que
- se ha suprimido al menos una insuficiencia en la vía metabólica de un aminoácido esencial,
- la cepa puede crecer en medio mínimo de crecimiento definido químicamente que está libre del aminoácido
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correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la cepa procariota con supresión de auxotrofias, y
- la productividad de la cepa con supresión de auxotrofias se mejora en comparación con la productividad de la cepa original sin supresión de auxotrofias, así como en comparación con las cepas naturales correspondientes (genotipo correspondiente).
En un modo de realización, la cepa procariota con supresión de auxotrofias es una cepa de E. coli con supresión de auxotrofias.
En el presente documento se divulga una célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos, caracterizada por que
- se ha suprimido al menos una insuficiencia en la vía metabólica de un aminoácido esencial, y
- la célula puede crecer en medio mínimo de crecimiento definido químicamente que está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
En un modo de realización, la célula procariota con supresión de auxotrofias es una célula de E. coli con supresión de auxotrofias.
Se puede usar la cepa/célula procariota con supresión de auxotrofias como se informa en el presente documento en un procedimiento para la producción recombinante de un polipéptido terapéutico, en el que, en comparación con la cepa/célula sin supresión de auxotrofias, no se requiere el enriquecimiento con al menos un residuo de aminoácido.
En el presente documento se informa de un procedimiento para producir un polipéptido en una célula procariota (recombinante), que comprende la siguiente etapa:
- cultivar una célula procariota (recombinante) que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente y recuperar el polipéptido de la célula procariota o del periplasma de la célula procariota o del medio,
en el que la célula procariota (recombinante) es una célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos.
En un modo de realización, el crecimiento de la célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos en comparación con la célula procariota sin supresión (célula original) en las mismas condiciones de cultivo y en el mismo medio de crecimiento requiere el enriquecimiento con menos aminoácidos en el medio de crecimiento.
En un modo de realización, el medio mínimo de crecimiento definido químicamente está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
En un modo de realización, el cultivo de la célula procariota con supresión de auxotrofias requiere el enriquecimiento con uno o dos o tres o cuatro aminoácidos menos en el medio de crecimiento que el requerido para el cultivo de la célula procariota sin supresión de auxotrofias (célula original).
En un modo de realización, la célula procariota con supresión de auxotrofias tiene al menos una auxotrofia para aminoácidos (sin supresión) adicional.
En un modo de realización, el aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias no se añade durante el cultivo.
En un modo de realización, el cultivo es en ausencia del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
En un modo de realización, la célula procariota es una célula de E. coli.
En un modo de realización, el polipéptido es una cadena de anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio único, un scFv, un scFab, o un conjugado de uno de los anteriores con un polipéptido que no sea un anticuerpo.
En un modo de realización, el polipéptido es un conjugado de un scFv o scFab con un agente citotóxico.
En un modo de realización, la densidad de células viables a las 30 horas después de la inoculación del cultivo es más alta en el cultivo de la cepa con supresión de auxotrofias que en el cultivo de la célula procariota sin supresión.
En el presente documento se divulga el uso de una cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos
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para la producción (recombinante) de un polipéptido.
En un modo de realización,
- en la cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos se ha suprimido al menos una insuficiencia en la vía metabólica de un aminoácido esencial, y
- la cepa con supresión de auxotrofias para aminoácidos puede crecer en medio mínimo de crecimiento definido químicamente que está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la cepa procariota con supresión de auxotrofias.
En un modo de realización, la cepa procariota con supresión de auxotrofias es una cepa de E. coli con supresión de auxotrofias.
En un modo de realización, el polipéptido es una cadena de anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio único, un scFv, un scFab, o un conjugado de uno de los anteriores con un polipéptido que no sea un anticuerpo.
En un modo de realización, el polipéptido es un conjugado de un scFv o scFab con un agente citotóxico.
En un modo de realización, el procedimiento para producir un polipéptido en una célula procariota comprende la siguiente etapa:
- cultivar una célula procariota que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente y recuperar el polipéptido de la célula procariota o del periplasma de la célula procariota o del medio,
en el que la célula procariota es una célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos,
en el que el crecimiento de la célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos en comparación con la célula procariota sin supresión en las mismas condiciones de cultivo y en el mismo medio de crecimiento requiere el enriquecimiento con menos aminoácidos en el medio de crecimiento, y
en el que el medio mínimo de crecimiento definido químicamente está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
Modos de realización ejemplares
Se divulgan los siguientes modos de realización ejemplares.
1. Una cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos, caracterizada por que
- se ha suprimido al menos una insuficiencia en la vía metabólica de un aminoácido esencial, y
- la cepa puede crecer en medio mínimo de crecimiento definido químicamente que está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la cepa procariota con supresión de auxotrofias.
2. La cepa de acuerdo con el punto 1, caracterizada por que la cepa procariota con supresión de auxotrofias es una cepa de E. coli con supresión de auxotrofias.
3. Una célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos, caracterizada por que
- se ha suprimido al menos una insuficiencia en la vía metabólica de un aminoácido esencial, y
- la célula puede crecer en medio mínimo de crecimiento definido químicamente que está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
4. La cepa de acuerdo con el punto 3, caracterizada por que la célula procariota con supresión de auxotrofias es una célula de E. coli con supresión de auxotrofias.
5. Un procedimiento para producir un polipéptido en una célula procariota (recombinante), que comprende la siguiente etapa:
- cultivar una célula procariota (recombinante), que se ha obtenido introduciendo en el genoma de una
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célula procariota original un ácido nucleico que suprime una auxotrofia para aminoácidos en la célula procariota original, que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente y recuperar el polipéptido de la célula procariota o del periplasma de la célula procariota o del medio.
6. Un procedimiento para producir un polipéptido en una célula procariota (recombinante), que comprende las siguientes etapas:
- suprimir en una célula procariota que es auxótrofa para al menos un aminoácido al menos una auxotrofia para un aminoácido,
- cultivar la célula procariota (recombinante) con supresión de auxotrofias para aminoácidos que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente y recuperar el polipéptido de la célula procariota o del periplasma de la célula procariota o del medio.
7. Un procedimiento para producir un polipéptido en una célula procariota (recombinante), que comprende la siguiente etapa:
- cultivar una célula procariota (recombinante) que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente y recuperar el polipéptido de la célula procariota o del periplasma de la célula procariota o del medio,
en el que la célula procariota (recombinante) es una célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos.
8. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5 a 7, caracterizado por que la célula procariota con supresión de auxotrofias tiene al menos una auxotrofia para aminoácidos (sin supresión) adicional.
9. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5 a 8, caracterizado por que el crecimiento de la célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos en comparación con la célula procariota sin supresión (célula original) en las mismas condiciones de cultivo y en el mismo medio de crecimiento requiere el enriquecimiento con menos aminoácidos en el medio de crecimiento.
10. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5 a 9, caracterizado por que el medio mínimo de crecimiento definido químicamente está libre del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
11. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5 a 10, caracterizado por que el cultivo de la célula procariota con supresión de auxotrofias requiere el enriquecimiento con uno o dos o tres o cuatro aminoácidos menos en el medio de crecimiento que el requerido para el cultivo de la célula procariota sin supresión de auxotrofias (original/célula original).
12. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5 a 11, caracterizado por que el aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias no se añade durante el cultivo.
13. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5 a 12, caracterizado por que el cultivo es en ausencia del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
14. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5 a 13, caracterizado por que la célula procariota es una célula de E. coli.
15. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5 a 14, caracterizado por que el polipéptido es una cadena de anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio único, un scFv, un scFab, o un conjugado de uno de los anteriores con un polipéptido que no sea un anticuerpo.
16. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5 a 15, caracterizado por que el polipéptido es un conjugado de un scFv o scFab con un agente citotóxico.
17. Uso de una cepa procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos para la producción (recombinante) de un polipéptido.

Claims (8)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para producir un polipéptido en una célula procariota, que comprende las siguientes etapas:
    - suprimir en una célula procariota que es auxótrofa para al menos un aminoácido al menos una auxotrofia para un aminoácido introduciendo en el genoma de una célula procariota original un ácido nucleico que suprima una auxotrofia para aminoácidos de la célula procariota original,
    - cultivar la célula procariota con supresión de auxotrofias para aminoácidos que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un medio mínimo de crecimiento definido químicamente y recuperar el polipéptido de la célula procariota o del periplasma de la célula procariota o del medio,
    en el que el valor de producto cuando se usa la cepa procariota con supresión de auxotrofias es más alto que el valor de producto que se puede obtener con una cepa protótrofa natural correspondiente.
  2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el cultivo de la célula procariota con supresión de auxotrofias requiere el enriquecimiento con uno o dos o tres o cuatro aminoácidos menos en el medio de crecimiento que el requerido para el cultivo de la célula procariota original sin supresión de auxotrofias.
  3. 3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que la célula procariota con supresión de auxotrofias tiene al menos una auxotrofia para aminoácidos adicional.
  4. 4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias no se añade durante el cultivo.
  5. 5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el cultivo es en ausencia del aminoácido correspondiente a la auxotrofia que se ha suprimido en la célula procariota con supresión de auxotrofias.
  6. 6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la célula procariota es una célula de E. coli.
  7. 7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que el polipéptido es una cadena de anticuerpo de longitud completa, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo de dominio único, un scFv, un scFab, o un conjugado de uno de los anteriores con un polipéptido que no sea un anticuerpo.
  8. 8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que el polipéptido es un conjugado de un scFv o scFab con un agente citotóxico.
    densidad óptica [578 nm]
    imagen1
    Rendimiento de producto [mg/l]
    imagen2
    concentración [mg/l]
    A
    co
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    imagen3
    tiempo de cultivo [h]
    B
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    c
    :2
    o
    (V
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    c
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    imagen4
    densidad óptica [578 nm]
    :
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    O
    O
    30
    Rendimiento de producto [mg/l]
    imagen5
    densidad óptica [578 nm]
    imagen6
    densidad óptica [578 nm]
    Q
    imagen7
    Rendimiento de producto [mg/l]
    imagen8
    Rendimiento de producto [mg/l]
    imagen9
    Tiempo de cultivo después de la inducción de formación de producto [h]
    densidad óptica [578 nm]
    imagen10
    Rendimiento de producto [mg/l]
    imagen11
    Tiempo de cultivo después de la inducción de formación de producto [h]
    densidad óptica [578 nm]
    2€
    11
    imagen12
    rendimiento volumétrico de producto [g/l]
    imagen13
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