TWI628281B - 胺基酸營養缺陷復原型原核株用於重組生產多肽之用途 - Google Patents

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Abstract

本文係報導在原核細胞中生產多肽之方法，該方法包含在化學性界定最低生長培養基中培養包含一或多種編碼該多肽之核酸之原核細胞並自該原核細胞或該原核細胞之周質或自該培養基回收該多肽之步驟，其中該原核細胞係胺基酸營養缺陷復原型原核細胞，其中該胺基酸營養缺陷復原型原核細胞與非復原型原核細胞相比，在相同培養條件下及在相同生長培養基中之生長需要向該生長培養基中補充較少的胺基酸，且其中該化學性界定最低生長培養基不含與該營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸。

Description

胺基酸營養缺陷復原型原核株用於重組生產多肽之用途
本發明係屬於重組多肽生產之領域。更準確地，本文報導使用營養缺陷復原型原核株於化學性界定最低生長培養基中重組生產非糖基化多肽之方法。
在最近幾年中，治療性多肽之生產穩定增加，且有可能治療性多肽將在不久的未來成為可用於治療各種疾病之最大治療劑群組。治療性多肽之影響源自其特異性，例如特異性標靶識別及/或結合功能。
在發酵過程中使用細胞培養物以生產物質且特定而言多肽。在其中細胞培養物未經基因修飾並形成其自身代謝產物之過程與其中生物體經基因修飾以使得其生產較大量之其自身物質(例如多肽)或生產外來物質之過程之間存在差異。向生產該等物質之生物體供應保證生物體存活並使能夠生產期望標靶化合物之營養培養基。已知許多培養基用於該等目的並使能夠最佳化具體宿主培養。
使用化學性界定最低生長培養基培養重組細胞以重組生產治療性多肽係有利的。其使能夠容易進行所生產治療性多肽之下游處理及純化，因原料差異經最小化而提供穩健生產過程，並減少商品成本。
化學性界定最低生長培養基不包含游離胺基酸，且要求使用具 有完整代謝路徑之原營養需求性細胞系以自化學性界定最低生長培養基之可用組份生產所需胺基酸。
例如，當使用大腸桿菌(E.coli)作為宿主細胞系時，通常採用野生型株，例如MG1655、W3110或BL21。該等株顯示良好生長特性但較低產物力價。
已藉由非定向誘變及選擇獲得之突變原核株當與野生型株相比時顯示其基因組DNA存在顯著差異。已基於可獲得之最大產物力價選擇突變株。由於突變株具有許多營養缺陷型，故其不能在化學性界定最低生長培養基中用於培養。突變株需要進給胺基酸以補足其營養缺陷型，從而導致培養成本增加。
US 5,932,439報導用於生產重組蛋白之大腸桿菌(Escherichia coli)K-12株。
藉由復原具有其一或多種營養缺陷型之營養缺陷原核株，營養缺陷復原型株可在化學性界定最低生長培養基上生長，不需要再向該培養基中添加任何與已復原之營養缺陷型相應之物質。在昂貴物質之情形下，可達成商品成本之降低且可更經濟地生產重組多肽。
除恢復在不存在與已復原之營養缺陷型相應之物質之情況下在化學性界定最低生長培養基上生長之能力以外，已發現可維持或甚至與非復原型株相比增加可獲得之產物力價。此外已發現，使用營養缺陷復原型原核株可獲得之產物力價高於利用相應原營養需求性野生型株可獲得之產物力價。
不希望受此理論影響，假設當與尚未實施此一缺失及復原之相應原營養需求性野生型株相比時，本文中所報導之胺基酸營養缺陷復原型原核株具有不同代謝及代謝通量。因此，原核株內之某些酶之不活化及再活化對該株之整個代謝具有可檢測/顯著影響，此可在(例如) 與相應原營養需求性野生型株相比此一株之生產率增加看出。
本文中所報導之一態樣係胺基酸營養缺陷復原型原核株，其特徵在於- 已復原必需胺基酸代謝路徑中之至少一種缺陷，且- 該株可在不含與營養缺陷復原型原核株中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸的化學性界定最低生長培養基中生長。
在一實施例中，營養缺陷復原型原核株係營養缺陷復原型大腸桿菌株。
本文中所報導之一態樣係胺基酸營養缺陷復原型原核細胞，其特徵在於- 已復原必需胺基酸代謝路徑中之至少一種缺陷，且- 該細胞可在不含與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸的化學性界定最低生長培養基中生長。
在一實施例中，營養缺陷復原型原核細胞係營養缺陷復原型大腸桿菌細胞。
本文中所報導之營養缺陷復原型原核株/細胞可用於重組生產治療性多肽之方法，其中與非營養缺陷復原型株/細胞相比不需要補充至少一種胺基酸殘基。
本文中所報導之態樣係在(重組)原核細胞中生產多肽之方法，該方法包含以下步驟：- 在化學性界定最低生長培養基中培養已藉由將復原親代原核細胞之胺基酸營養缺陷型之核酸引入親代原核細胞之基因組中獲得且包含一或多種編碼該多肽之核酸之(重組)原核細胞，並自原核細胞或原核細胞之周質或自培養基回收該多肽。
本文中所報導之態樣係在(重組)原核細胞中生產多肽之方法，該方法包含以下步驟： - 使為至少一種胺基酸營養缺陷型之原核細胞自至少一種胺基酸營養缺陷型復原，- 在化學性界定最低生長培養基中培養包含一或多種編碼該多肽之核酸之胺基酸營養缺陷復原型(重組)原核細胞，並自原核細胞或原核細胞之周質或自培養基回收該多肽。
本文中所報導之態樣係在(重組)原核細胞中生產多肽之方法，該方法包含以下步驟：- 在化學性界定最低生長培養基中培養包含一或多種編碼該多肽之核酸之(重組)原核細胞，並自原核細胞或原核細胞之周質或自培養基回收該多肽，其中該(重組)原核細胞係胺基酸營養缺陷復原型原核細胞。
在所有生產多肽之方法之一實施例中，該營養缺陷復原型原核細胞具有至少一種其他(非復原)胺基酸營養缺陷型。此營養缺陷型可用於在引入一或多種編碼所關注多肽(該多肽)之核酸後選擇重組體/轉型體。
在所有生產多肽之方法之一實施例中，胺基酸營養缺陷復原型原核細胞與非復原型原核細胞(親代細胞)相比在相同培養條件下且在相同生長培養基中之生長需要向生長培養基中補充較少胺基酸。
在所有生產多肽之方法之一實施例中，該化學性界定最低生長培養基不含與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸。
在所有生產多肽之方法之一實施例中，營養缺陷復原型原核細胞之培養需要向生長培養基中補充比培養非營養缺陷復原型原核細胞(親本/親代細胞)所需胺基酸少一種或兩種或三種或四種之胺基酸。
在所有生產多肽之方法之一實施例中，在培養期間不添加與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸。
在所有生產多肽之方法之一實施例中，該培養係在不存在與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸之情況下進行。
在所有生產多肽之方法之一實施例中，該原核細胞係大腸桿菌細胞。
在所有生產多肽之方法之一實施例中，該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
在所有生產多肽之方法之一實施例中，該多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
本文中所報導之態樣係胺基酸營養缺陷復原型原核株用於(重組)生產多肽之用途。
在一實施例中- 胺基酸營養缺陷復原型原核株中已復原必需胺基酸代謝路徑中之至少一種缺陷，且- 該胺基酸營養缺陷復原型株可在不含與營養缺陷復原型原核株中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸之化學性界定最低生長培養基中生長。
在一實施例中，該營養缺陷復原型原核株係營養缺陷復原型大腸桿菌株。
在一實施例中，該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
在一實施例中，該多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
在所有態樣之一實施例中，該營養缺陷復原型原核株係非溶源性株。溶源性株經溫和型(temporal)噬菌體感染，即非溶源性株不含噬菌體。
在所有態樣之一實施例中，該復原係僅靶向胺基酸營養缺陷型之定向復原。
在所有態樣之一實施例中，該復原係引入一或多種合成營養缺陷胺基酸所需酶。
在所有態樣之一實施例中，該原核株具有基因型thi-1、△ompT、△pyrF。
圖1 親代株CSPZ-2(菱形)與營養缺陷復原型株CSPZ-6(三角形)之生長比較。
圖2 親代株CSPZ-2(菱形)與營養缺陷復原型株CSPZ-6(三角形)之產物產量比較。
圖3 A：L-白胺酸濃度之趨勢圖(CSPZ-2：菱形；CSPZ-6：三角形)。
B：L-脯胺酸濃度之趨勢圖(CSPZ-2：菱形；CSPZ-6：三角形)。
圖4 營養缺陷復原型及野生型株在進行及不進行胺基酸補充之培養基上之生長比較(在補充有L-白胺酸及L-脯胺酸之CDM上之CSPZ-6：三角形；在CDM上之CSPZ-6：正方形；在CDM上之MG1655衍生株：「X」)。
圖5 營養缺陷復原型與野生型株在進行及不進行胺基酸補充之培養基上之產物產量比較(在補充有L-白胺酸及L-脯胺酸之CDM上之CSPZ-6：三角形；在CDM上之CSPZ-6：正方形；在CDM上之MG1655衍生株：「X」)。
圖6 營養缺陷復原型株CSPZ-6(菱形)與野生型株66C5(正方形)在不進行胺基酸補充之培養基上之生長比較。
圖7 營養缺陷復原型株CSPZ-6(菱形，常溫)、野生型株66C5(正方形，常溫)及野生型株66C5(在高溫下，三角形)在不進行胺基酸 補充之培養基上之生長比較。
圖8 營養缺陷復原型株CSPZ-6(菱形)及野生型株66C5(正方形)在不進行胺基酸補充之培養基上之產物產量比較。
圖9 營養缺陷復原型株CSPZ-6(菱形，常溫)、野生型株66C5(正方形，常溫)及野生型株66C5(在高溫下，三角形)在不進行胺基酸補充之培養基上之產物產量比較。
圖10營養缺陷復原型株CSPZ-6(菱形)及野生型株BL21在不進行胺基酸補充之培養基上之生長比較。
圖11營養缺陷復原型株CSPZ-6(菱形)及野生型株BL21(正方形)在不進行胺基酸補充之培養基上之產物產量比較。
圖12營養缺陷復原型株CSPZ-6(菱形)及野生型株MG1655衍生物(三角形)之生長比較。
圖13營養缺陷復原型株CSPZ-6(菱形)及野生型株MG1655衍生物(三角形)之產物產量比較。
研發大規模重組多肽生產製程之一目的係減少在培養期間培養基組份之所需量(即消耗)。尤其，鑒於商品成本，減少昂貴培養基組份(例如胺基酸)之消耗係有利的。
此目的已藉由以下來達成：使胺基酸營養缺陷株自至少一種、一些或所有其胺基酸營養缺陷型中復原，以避免進給昂貴胺基酸且其後減少重組生產所關注多肽之成本。另外可使用導致經改良製程穩定性並有助於下游處理(DSP)之化學性界定培養基。
因此，本文中報導在化學性界定最低生長培養基中使用營養缺陷復原型原核株重組生產非糖基化多肽之方法。
已發現，藉由復原具有一或多種其營養缺陷型之營養缺陷原核株，營養缺陷復原型株可在不需再添加與已復原之營養缺陷型相應之 物質之化學性界定最低生長培養基上生長。在昂貴物質(例如胺基酸)之情形下，可達成商品成本之降低且可更經濟地生產重組多肽。
除恢復在不存在與已復原之營養缺陷型相應之物質之情況下在化學性界定最低生長培養基上生長之能力以外，已發現可維持或甚至增加可獲得之產物力價。此外已發現，使用營養缺陷復原型原核株可獲得之產物力價高於利用相應原營養需求性野生型株可獲得之產物力價。
本文中所報導之態樣係在原核細胞生產多肽之方法，該方法包含以下步驟：- 在化學性界定最低生長培養基中培養已藉由將復原親代原核細胞之胺基酸營養缺陷型之核酸引入親代原核細胞之基因組中獲得且包含一或多種編碼該多肽之核酸之原核細胞，並自原核細胞或原核細胞之周質或自培養基回收該多肽。
本文中所報導之態樣係在原核細胞生產多肽之方法，該方法包含以下步驟：- 使為至少一種胺基酸營養缺陷型之原核細胞自至少一種胺基酸營養缺陷型復原，- 在化學性界定最低生長培養基中培養包含一或多種編碼該多肽之核酸之胺基酸營養缺陷復原型原核細胞，並自原核細胞或原核細胞之周質或自培養基回收該多肽。
本文中所報導之態樣係在(重組)原核細胞中生產多肽之方法，該方法包含以下步驟：- 在化學性界定最低生長培養基中培養包含一或多種編碼該多肽之核酸之(重組)原核細胞，並自原核細胞或原核細胞之周質或自培養基回收該多肽，其中該(重組)原核細胞係胺基酸營養缺陷復原型原核細胞， 其中胺基酸營養缺陷復原型原核細胞與非復原型原核細胞(親代細胞)相比在相同培養條件下且在相同生長培養基中之生長需要向生長培養基中補充較少胺基酸，且其中該化學性界定最低生長培養基不含與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸。
「胺基酸營養缺陷原核細胞」係因(例如)包含編碼相應生物合成路徑之蛋白質之結構基因之基因座內的突變或缺失而不能合成必需胺基酸之原核細胞。在不向培養基中添加各別胺基酸之情況下，該細胞不能增殖。營養缺陷可係關於任何胺基酸。原核細胞亦可係一種以上胺基酸營養缺陷型的。因此，在一實施例中，胺基酸營養缺陷原核細胞係至少兩種胺基酸營養缺陷型的。在另一實施例中，胺基酸營養缺陷原核細胞係至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種胺基酸營養缺陷型的。在再一實施例中，胺基酸營養缺陷原核細胞係至少2種且最多5種或最多10種或最多15種胺基酸營養缺陷型的。在另一實施例中，胺基酸營養缺陷原核細胞係兩種至五種胺基酸或兩種至三種胺基酸或兩種胺基酸或三種胺基酸或四種胺基酸營養缺陷型的。在一實施例中，(胺基酸)營養缺陷復原型細胞具有至少一種胺基酸營養缺陷型或至少兩種胺基酸營養缺陷型或至少三種胺基酸營養缺陷型或一種至三種胺基酸營養缺陷或兩種胺基酸營養缺陷型。
在一實施例中，胺基酸營養缺陷原核細胞係細菌細胞。
在一實施例中，該細胞係艾氏菌屬(Escherichia)細胞或芽胞桿菌屬(Bacillus)細胞或乳酸桿菌屬(Lactobacillus)細胞或棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細胞或酵母菌細胞(酵母屬(Saccharomyces)、假絲酵母菌屬(Candida)或畢赤酵母屬(Pichia))。在再一實施例中，該細胞係大腸桿菌細胞或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細胞或嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)細胞或麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)細胞或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)酵母菌細胞。
可用於本文所報導之方法之原核細胞可包含一或多種胺基酸營養缺陷型。例如，白胺酸生物合成路徑存在缺陷之大腸桿菌細胞可選自LeuB6缺陷細胞13-6、χ148、χ156、χ2224、χ462、χ463、χ474、χ478、χ515、χ65、χ697、χ760、2000k MSE248、342-167、342MG、679-680、A586、A592、A593、AA100、AA7852、AA787、AB1102、AB1111、AB1115、AB1122、AB1129、AB113、AB1132、AB1133、AB114、AB1157、AB1157-D、AB1314、AB1330、AB1331、AB1881、AB1884、AB1885、AB188、CP78、CP79、CR34 Thy-、CR34 Thy-SR、CR34/308、CR34/313、CR34/399、CR34/43、CR34/454、CR34/500、CR34/7a、CS130、CS312、CS419、CS425、CS426、CS460、CS471、CS472、CS50、CS81、CS85、CSR06、CSR603、CSR603/pDR1996、CT28-3b、DA10、DA11、DB1161、DB1257、DE1878、DE1882、DE2345、DF225、DF41、JRG94、JS10C600r-m-、T6R、P678SSR pro-、PA20SR、PA200 SR、PA201 SR、PA214SRT6R、PA265 SR、PA309、PDE70、PA340、PA340/T6、PA360、PA414、PAM161、PAM162、PAM163、PAM164、PAM660、PAT84、PB349、PB69、PC1、PC2、PC3、PC5、PC6、PC8、PJ1、PJ2、PJ3、PJ4、PJ5、PJ C600(=CRSR)、W208 SR AzR、W2660、LAM-、W945his、WA2127、WA2379、WA2548、WA2552、WA2574、WA2899、WA921、WA946、WA960、Y10、Y46、Y53、Y70、YYC100。
在一實施例中，該原核細胞係大腸桿菌K12細胞或大腸桿菌B細胞。
術語「生長」係指培養中活細胞密度之變化。此變化可係隨時間之變化。可藉由測定在578nm下之光密度來測定活細胞密度。
在一實施例中，生長係在一段時期期間活細胞密度之增加。在一實施例中，該時期係接種後0小時至30小時之培養時期。
術語「相同」表示第二值係在第一值之+/- 20%內。關於培養條件，術語「相同」係指培養時間、培養體積、培養溫度、接種細胞密度、通氣速率、pH值、攪拌器速度、進給速率(若適用)等。關於培養基，術語「相同」表示第二培養基與第一培養基相比有最多5種組份不同(不同=存在或不存在)。
在一實施例中，相同培養條件係一致培養條件。在一實施例中，相同培養基係一致培養基。
用於培養原核細胞以及用於培養胺基酸營養缺陷原核細胞之方法為熟習此項技術者所已知(例如參見Riesenberg,D.等人，Curr.Opin.Biotechnol.2(1991)380-384)。
該培養可係利用任何方法進行。在一實施例中，該培養係分批培養、進料分批培養、灌注培養、半連續性培養或具有完全或部分細胞滯留之培養。
在一實施例中，該培養係高細胞密度培養。術語「高細胞密度培養」表示培養方法其中所培養原核細胞之細胞乾重在培養中之某一點處為至少10g/L。在一實施例中，細胞乾重在培養中之某一點處為至少20g/L或至少50g/L或至少100g/L或100g/L以上。為達到此一高細胞密度狀態，在培養期間所添加之進料及/或調整溶液之體積必須儘可能小。測定細胞乾重之方法係報導(例如)於Riesenberg,D.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.34(1990)77-82中。
所提供培養基中之營養素將在培養期間經代謝，並必須進行補充以避免提供限制。
自1號實驗與2號實驗之比較，可看出在相同培養條件下利用營養缺陷復原型株CSPZ-6可達成比利用其親代株CSPZ-2所達成力價更高之力價，即營養缺陷復原型株具有增加之生產率(體積生產率，時空產量)。
自2號實驗與5號實驗之比較，可看出營養缺陷復原型株CSPZ-6不需要添加胺基酸脯胺酸及白胺酸用於重組生產。可在不存在脯胺酸及白胺酸之情況下達成相當或甚至稍有增加之產物力價。
自5號實驗與6號實驗之比較，可看出在相同培養條件下利用營養缺陷復原型株CSPZ-6可達成比利用相應野生型株(MG1655(△pyrF))所達成力價更高之力價。
亦已將利用營養缺陷復原型株CSPZ-6可獲得之產物力價與利用另一相應野生型株W3110(66C5=W3110 △pyrF)可獲得之產物力價相比較。
自7號實驗與8號實驗之比較，可看出在相同培養條件下利用營養缺陷復原型株CSPZ-6可達成比利用相應野生型株(W3110)所達成力 價更高之力價。
自7號實驗與9號實驗之比較，可看出即使使用經改良培養條件(高溫)用於野生型株但不用於營養缺陷復原型株，利用營養缺陷復原型株CSPZ-6仍可達成比利用相應野生型株(W3110)所達成力價更高之力價。
亦已將利用營養缺陷復原型株CSPZ-6可獲得之產物力價與另一相應野生型株BL-21(CSPZ-14=BL21 △pyrF)可獲得之產物力價相比較。
自10號實驗與11號實驗之比較，可看出在相同培養條件下利用營養缺陷復原型株CSPZ-6可達成比利用相應野生型株(BL-21)所達成力價更高之力價。
本文中所報導之一態樣係胺基酸營養缺陷復原型原核株，其特徵在於- 已復原必需胺基酸代謝路徑中之至少一種缺陷，- 該株可在不含與營養缺陷復原型原核株中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸之化學性界定最低生長培養基中生長，且- 與親代非營養缺陷復原型株之生產率相比以及與相應野生型株(相應基因型)相比，營養缺陷復原型株之生產率得到改良。
在一實施例中，該營養缺陷復原型原核株係營養缺陷復原型大腸桿菌株。
本文中所報導之一態樣係胺基酸營養缺陷復原型原核細胞，其特徵在於 - 已復原必需胺基酸代謝路徑中之至少一種缺陷，且- 該細胞可在不含與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸的化學性界定最低生長培養基中生長。
在一實施例中，營養缺陷復原型原核細胞係營養缺陷復原型大腸桿菌細胞。
本文中所報導之營養缺陷復原型原核株/細胞可用於重組生產治療性多肽之方法，其中與非營養缺陷復原型株/細胞相比不需要補充至少一種胺基酸殘基。
本文中所報導之態樣係在(重組)原核細胞中生產多肽之方法，該方法包含以下步驟：- 在化學性界定最低生長培養基中培養包含一或多種編碼該多肽之核酸之(重組)原核細胞，並自原核細胞或原核細胞之周質或自培養基回收該多肽，其中該(重組)原核細胞係胺基酸營養缺陷復原型原核細胞。
在一實施例中，胺基酸營養缺陷復原型原核細胞與非復原型原核細胞(親代細胞)相比在相同培養條件下且在相同生長培養基中之生長需要向生長培養基中補充較少胺基酸。
在一實施例中，該化學性界定最低生長培養基不含與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸。
在一實施例中，營養缺陷復原型原核細胞之培養需要向生長培養基中補充比培養非營養缺陷復原型原核細胞(親代細胞)所需胺基酸少一種或兩種或三種或四種之胺基酸。
在一實施例中，該營養缺陷復原型原核細胞具有至少一種其他(非復原)胺基酸營養缺陷型。
在一實施例中，在培養期間不添加與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸。
在一實施例中，該培養係在不存在與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸之情況下進行。
在一實施例中，該原核細胞係大腸桿菌細胞。
在一實施例中，該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
在一實施例中，多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
在一實施例中，在接種後30小時處培養之活細胞密度在營養缺陷復原型株之培養中比非在復原型原核細胞之培養中更高。
本文中所報導之態樣係胺基酸營養缺陷復原型原核株用於(重組)生產多肽之用途。
在一實施例中- 胺基酸營養缺陷復原型原核株中已復原必需胺基酸代謝路徑中之至少一種缺陷，且- 該胺基酸營養缺陷復原型株可在不含與營養缺陷復原型原核株中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸之化學性界定最低生長培養基中生長。
在一實施例中，該營養缺陷復原型原核株係營養缺陷復原型大腸桿菌株。
在一實施例中，該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
在一實施例中，該多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
在一實施例中，在原核細胞中生產多肽之方法包含以下步驟：- 在化學性界定最低生長培養基中培養包含一或多種編碼該多肽之核酸之原核細胞，並自原核細胞或原核細胞之周質或自培養基回收該多肽，其中該原核細胞係胺基酸營養缺陷復原型原核細胞， 其中胺基酸營養缺陷復原型原核細胞與非復原型原核細胞相比在相同培養條件下且在相同生長培養基中之生長需要向生長培養基中補充較少胺基酸，且其中該化學性界定最低生長培養基不含與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸。
具體實施例
1.一種胺基酸營養缺陷復原型原核株，其特徵在於- 已復原必需胺基酸代謝路徑中之至少一種缺陷，且- 該株可在不含與營養缺陷復原型原核株中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸之化學性界定最低生長培養基中生長。
2.如第1項之株，其特徵在於該營養缺陷復原型原核株係營養缺陷復原型大腸桿菌株。
3.一種胺基酸營養缺陷復原型原核細胞，其特徵在於- 已復原必需胺基酸代謝路徑中之至少一種缺陷，且- 該細胞可在不含與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸的化學性界定最低生長培養基中生長。
4.如第3項之株，其特徵在於營養缺陷復原型原核細胞係營養缺陷復原型大腸桿菌細胞。
5.一種在(重組)原核細胞中生產多肽之方法，該方法包含以下步驟：- 在化學性界定最低生長培養基中培養已藉由將復原親代原核細胞之胺基酸營養缺陷型之核酸引入親代原核細胞之基因組中獲得且包含一或多種編碼該多肽之核酸之(重組)原核細胞，並自原核細胞或原核細胞之周質或自培養基回收該多肽。
6.一種在(重組)原核細胞中生產多肽之方法，該方法包含以下步驟： - 使為至少一種胺基酸營養缺陷型之原核細胞自至少一種胺基酸營養缺陷型復原，- 在化學性界定最低生長培養基中培養包含一或多種編碼該多肽之核酸之胺基酸營養缺陷復原型(重組)原核細胞，並自原核細胞或原核細胞之周質或自培養基回收該多肽。
7.一種在(重組)原核細胞中生產多肽之方法，該方法包含以下步驟：- 在化學性界定最低生長培養基中培養包含一或多種編碼該多肽之核酸之(重組)原核細胞，並自原核細胞或原核細胞之周質或自培養基回收該多肽，其中該(重組)原核細胞係胺基酸營養缺陷復原型原核細胞。
8.如第5項至第7項中任一項之方法，其特徵在於該營養缺陷復原型原核細胞具有至少一種其他(非復原)胺基酸營養缺陷型。
9.如第5項至第8項中任一項之方法，其特徵在於胺基酸營養缺陷復原型原核細胞與非復原型原核細胞(親代細胞)相比在相同培養條件下且在相同生長培養基中之生長需要向生長培養基中補充較少胺基酸。
10.如第5項至第9項中任一項之方法，其特徵在於該化學性界定最低生長培養基不含與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸。
11.如第5項至第10項中任一項之方法，其特徵在於營養缺陷復原型原核細胞之培養需要向生長培養基中補充比培養非營養缺陷復原型原核細胞(親本/親代細胞)所需胺基酸少一種或兩種或三種或四種之胺基酸。
12.如第5項至第11項中任一項之方法，其特徵在於在培養期間不添加與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基 酸。
13.如第5項至第12項中任一項之方法，其特徵在於該培養係在不存在與營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸之情況下進行。
14.如第5項至第13項中任一項之方法，其特徵在於該原核細胞係大腸桿菌細胞。
15.如第5項至第14項中任一項之方法，其特徵在於該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
16.如第5項至第15項中任一項之方法，其特徵在於該多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
17.一種胺基酸營養缺陷復原型原核株之用途，其用於(重組)生產多肽。
18.如第17項之用途，其特徵在於- 胺基酸營養缺陷復原型原核株中已復原必需胺基酸代謝路徑中之至少一種缺陷，且- 該胺基酸營養缺陷復原型株可在不含與營養缺陷復原型原核株中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸之化學性界定最低生長培養基中生長。
19.如第1項至第18項中任一項之株或方法，其特徵在於該營養缺陷復原型原核株係營養缺陷復原型大腸桿菌株。
20.如第1項至第19項中任一項之株或方法，其特徵在於該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
21.如第1項至第20項中任一項之株或方法，其特徵在於該多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
22.如第1項至第21項中任一項之株或方法，其特徵在於該營養缺陷復原型原核株係非溶源性株。
23.如第1項至第22項中任一項之株或方法，其特徵在於該復原係僅靶向胺基酸營養缺陷型之定向復原。
24.如第1項至第23項中任一項之株或方法，其特徵在於該復原係引入一或多種合成營養缺陷胺基酸所需之酶。
25.如第1項至第24項中任一項之株或方法，其特徵在於該原核株具有基因型thi-1、△ompT、△pyrF。
提供以下實例、序列及圖以幫助理解本發明，本發明之實際範圍係闡述於隨附申請專利範圍中。應瞭解，可對所述程序作出多種修改而不偏離本發明之精神。
序列列表
SEQ ID NO：01 人類干擾素源序列。
SEQ ID NO：02 六組胺酸親和力標籤。
SEQ ID NO：03 IgA蛋白酶裂解位點。
SEQ ID NO：04 四聯蛋白脂蛋白元A-I融合多肽胺基酸序列。
SEQ ID NO：05 在IgA蛋白酶裂解後獲得之N端延伸之四聯蛋白脂蛋白元A-I融合多肽胺基酸序列。
SEQ ID NO：06 無親和力標籤IgA蛋白酶裂解之四聯蛋白脂蛋白元A-I融合多肽胺基酸序列(N端縮短之融合多肽)。
實例 材料及方法 重組DNA技術：
如以下文獻中所闡述使用標準方法來操作DNA：Sambrook,J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989。根據製造商之 說明書使用分子生物學試劑。
實例1 營養缺陷型之復原
使大腸桿菌K12株CSPZ-2(leuB、proC、trpE、thi-1、△pyrF)自其在基因leuB、proC、proBA及trpE中之遺傳缺陷復原。此係藉由使用定向遺傳改造大腸桿菌染色體基因之方法進行(Gene Bridges,Heidelberg,Germany；http：//www.genebridges.com；例如參見WO 99/29837、WO 01/04288、US 6,355,412)。詳細地進行以下逐步改變：
leuB基因座之修復：
大腸桿菌CSPZ-2在基因座leuB中具有TCG至TTG點突變，該點突變導致在相應3-異丙基蘋果酸鹽去氫酶中之286位絲胺酸至白胺酸之胺基酸交換，從而使此酶存在缺陷。因此，該株不能在未補充有L-白胺酸之培養基上生長。用具有側翼序列之編碼野生型Ser286之寡核苷酸，交換株CSPZ-2中之基因組突變，以生成復原型株CSPZ-3(CSPZ-2 leuB+)，其可在補充有L-脯胺酸之M9培養基板上生長但不需要L-白胺酸。
proC(b0386)及proBA(b0242及b0243)基因座之修復：
株CSPZ-3仍需要補充脯胺酸以在M9最低營養素培養基上生長。proC基因座之PCR擴增產生大約2.4kb片段。對於大腸桿菌K12(野生型株)，預期1,024bp片段(Blattner,F.R.等人，Science 277(1997)1453-1474)。PCR產物之測序揭露proC基因座因IS186(1,335bp)換位至基因組中受到破壞。藉由PCR表徵proBA基因座，但擴增失敗，此指示不存在proBA操縱子。
使用自大腸桿菌株MG1655基因組DNA擴增之PCR產物用於Red/ET重組，以復原proC基因座中之缺陷。
在連續步驟中，經由Red/ET重組將proBA操縱子插入基因組之infA-serW基因間區域中以恢復CSPZ-4中之原營養需求性表現型。藉由整合位點之PCR擴增及測序並藉由平鋪於M9最低營養素培養基瓊脂板上來驗證該整合。脯胺酸原營養需求性營養缺陷復原型株係稱為CSPZ-5。
trpE(b1264)基因座之修復：
親代株CSPZ-2之trpE基因座之DNA測序揭露9個核苷酸之缺失導致損失Glu139、Glu 140及Arg141。此突變並不導致色胺酸營養缺陷表現型，但可影響酶活性並使得減少生長。因此，經由Red/ET重組用野生型基因座交換經突變trpE基因座。藉由測序證實trpE基因之成功恢復，且所得株係稱為CSPZ-6。
實例2 表現質粒之製備 四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合多肽
藉由重組方法製備四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合多肽。所表現融合多肽在N端至C端方向上之胺基酸序列係如下：- 胺基酸甲硫胺酸(M)，- 具有CDLPQTHSL(SEQ ID NO：01)之胺基酸序列之干擾素順序之片段，- GS連接體，- 具有HHHHHH(SEQ ID NO：02)之胺基酸序列之六組胺酸標籤，- GS連接體，- 具有VVAPPAP(SEQ ID NO：03)之胺基酸序列之IgA蛋白酶裂解位點，及- 具有SEQ ID NO：04之胺基酸序列之四聯蛋白-脂蛋白元A-I。
上文所闡述之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合多肽係藉由在活體外使用IgA蛋白酶之酶促裂解釋放四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合多肽的前體多肽。
利用已知重組方法及技術藉由聯結適當核酸區段來組裝編碼融合基因之前體多肽。藉由DNA測序來驗證藉由化學合成製得之核酸序列。用於生產四聯蛋白-脂蛋白元A-I之表現質粒係如下製備。
大腸桿菌表現質粒之製備 a)質粒5816
質粒4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)係用於在大腸桿菌中表現核-鏈黴抗生物素之表現質粒。其係藉由連結3142bp長之EcoRI/CelII-載體片段來生成，該EcoRI/CelII-載體片段源自具有435bp長之核-鏈黴抗生物素編碼EcoRI/CelII片段之質粒1966(1966-pBRori-URA3-LACI-T-重複序列；報導於EP-B 1 422 237中)。
核-鏈黴抗生物素大腸桿菌表現質粒包含以下元件：- 載體pBR322之用於在大腸桿菌中複製之複製起點(與Sutcliffe,G.等人，Quant.Biol.43(1979)77-90之bp位點2517至3160相對應)，- 啤酒酵母菌中編碼血苷5’-磷酸去羧酶之URA3基因(Rose,M.等人，Gene 29(1984)113-124)，其允許藉由大腸桿菌pyrF突變株(尿嘧啶營養缺陷型)之互補進行質粒選擇，- 核-鏈黴抗生物素表現盒，其包含- T5雜合啟動子(根據Bujard,H.等人，Methods Enzymol.155(1987)416-433及Stueber,D.等人，Immunol.Methods IV(1990)121-152之T5-PN25/03/04雜合啟動子)，其包括根據Stueber,D.等人(參見上文)之合成核糖體結合位點，- 核-鏈黴抗生物素基因，- 兩個噬菌體源轉錄終止子，即λ-T0終止子(Schwarz,E.等人， Nature 272(1978)410-414)及fd-終止子(Beck,E.及Zink,B.,Gene 1-3(1981)35-58)，- 來自大腸桿菌之lacI抑制子基因(Farabaugh,P.J.,Nature 274(1978)765-769)。
用於表現四聯蛋白-脂蛋白元A-I前體多肽之最終表現質粒5816可藉由以下方式來製備：使用單一側翼EcoRI及CelII限制性核酸內切酶裂解位點自質粒4980切除核-鏈黴抗生物素結構基因，並將編碼前體多肽之EcoRI/CelII限制位點側翼核酸插入3142bp長之EcoRI/CelII-4980載體片段中。
b)質粒5830
質粒5830與質粒5816一致，惟編碼三肽QKK之密碼子自caa aaa aag(質粒5816)變為cag aag aag(質粒5830)。
c)質粒5836
利用已知重組方法及技術藉由聯結適當核酸區段組裝用於表現縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之編碼融合基因。藉由DNA測序來驗證藉由化學合成製得之核酸序列。用於生產具有SEQ ID NO：06之融合蛋白之表現質粒可如下製得：質粒4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)係用於在大腸桿菌中表現核-鏈黴抗生物素之表現質粒。其係藉由連結3142bp長之EcoRI/CelII-載體片段來生成，該EcoRI/CelII-載體片段源自具有435bp長之核-鏈黴抗生物素編碼EcoRI/CelII片段之質粒1966(1966-pBRori-URA3-LACI-T-重複序列；報導於EP-B 1 422 237中)。
核-鏈黴抗生物素大腸桿菌表現質粒包含以下元件：- 載體pBR322之用於在大腸桿菌中複製之複製起點(與Sutcliffe,G.等人，Quant.Biol.43(1979)77-90之bp位點2517至3160相對應)，- 啤酒酵母菌中編碼血苷5’-磷酸去羧酶之URA3基因(Rose,M.等 人，Gene 29(1984)113-124)，其允許藉由大腸桿菌pyrF突變體株(尿嘧啶營養缺陷型)之互補進行質粒選擇，- 核-鏈黴抗生物素表現盒，其包含- T5雜合啟動子(根據Bujard,H.等人，Methods.Enzymol.155(1987)416-433及Stueber,D.等人，Immunol.Methods IV(1990)121-152之T5-PN25/03/04雜合啟動子)，其包括根據Stueber,D.等人(參見上文)之合成核糖體結合位點，- 核-鏈黴抗生物素基因，- 兩個噬菌體源轉錄終止子，即λ-T0終止子(Schwarz,E.等人，Nature 272(1978)410-414)及fd-終止子(Beck,E.及Zink,B.,Gene 1-3(1981)35-58)，- 來自大腸桿菌之lacI抑制子基因(Farabaugh,P.J.,Nature 274(1978)765-769)。
用於表現縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之最終表現質粒5836可藉由以下方式來製備：使用單一側翼EcoRI及CelII限制性核酸內切酶裂解位點自質粒4980切除核-鏈黴抗生物素結構基因，並將編碼融合蛋白之EcoRI/CelII限制位點側翼核酸插入3142bp長之EcoRI/CelII-1質粒片段中。
d)質粒3036
用於重組生產IgA-蛋白酶之表現質粒3036係基於載體OripBR-URA3-EK-IFN(例如參見US 6,291,245)。質粒3036與OripBR-URA3-EK-IFN之不同在於lacI抑制子基因及編碼IgA蛋白酶蛋白質之標靶基因之存在。lacI抑制子基因係源自質粒pUHA1(Stueber,D.等人，在：Immunological Methods IV(1990)121-152)。其係根據Mullis,K.B.及Faloona,F.A.(Methods Enzymology 155(1987)335-350)所闡述之方法藉由聚合酶鏈反應(PCR)來擴增，並選殖至質粒3036前體中。編碼來 自淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)之IgA-蛋白酶蛋白之標靶基因係藉由PCR生成，並選殖至表現載體中。
IgA-蛋白酶表現質粒3036包含以下元件：- 載體pBR322之用於在大腸桿菌中複製之複製起點(與Sutcliffe,G.等人，Quant.Biol.43(1979)77-90之bp位點2517至3160相對應)，- 啤酒酵母菌中編碼血苷5’-磷酸去羧酶之URA3基因(Rose,M.等人，Gene 29(1984)113-124)，其允許藉由大腸桿菌pyrF突變體株(尿嘧啶營養缺陷型)之互補進行質粒選擇，- IgA-蛋白酶表現盒，其包含- T5雜合啟動子(根據Bujard,H.等人，Methods.Enzymol.155(1987)416-433及Stueber,D.等人，Immunol.Methods IV(1990)121-152之T5-PN25/03/04雜合啟動子)，其包括根據Stueber,D.等人(參見上文)之合成核糖體結合位點，- IgA蛋白酶之開放閱讀框(淋病奈瑟球菌，GenBank登錄號P09790)，- 兩個噬菌體源轉錄終止子，即λ-T0終止子(Schwarz,E.等人，Nature 272(1978)410-414)及fd-終止子(Beck,E.及Zink,B.,Gene 1-3(1981)35-58)，- 來自大腸桿菌之lacI抑制子基因(Farabaugh,P.J.,Nature 274(1978)765-769)。
實例3
藉由在已補充有營養缺陷互補胺基酸白胺酸及脯胺酸之化學性界定最低生長培養基上培養來表現融合多肽
為表現WO 2012/028526中所報導之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白，採用使能夠藉由大腸桿菌營養缺陷型(pyrF)之互補來進行無抗生素質粒選擇之大腸桿菌宿主/載體系統(參見EP 0 972 838及US 6,291,245)。
藉由電穿孔利用表現質粒5816使大腸桿菌K12株CSPZ-2(leuB、proC、trpE、thi-1、△pyrF)及CSPZ-6(thi-1、△pyrF)轉型(參見實例2)。首先使經轉型大腸桿菌細胞在37℃下於瓊脂板上生長。將自此板挑選之菌落轉移至3mL旋轉培養物中，並在37℃下生長至1至2之光密度(在578nm下量測)。然後，將1000μL培養物與1000μL無菌86%甘油混合，並立即在-80℃下冷凍用於長時間儲存。
此純系之正確產物表現首先在小規模搖瓶實驗中驗證，並利用SDS-Page分析，然後轉移至10L發酵槽中。
預培養：
對於預培養，使用化學性界定培養基(CDM)：NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、檸檬酸鹽1.6g/L、甘胺酸0.78g/L、L-丙胺酸0.29g/L、L-精胺酸0.41g/L、L-天冬醯胺*H2O 0.37g/L、L-天冬胺酸鹽0.05g/L、L-半胱胺酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-組胺酸0.05g/L、L-異白胺酸0.31g/L、L-白胺酸0.38g/L、L-離胺酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫胺酸0.27g/L、L-苯基丙胺酸0.43g/L、L-脯胺酸0.36g/L、L-絲胺酸0.15g/L、L-蘇胺酸0.40g/L、L-色胺酸0.07g/L、L-纈胺酸0.33g/L、L-酪胺酸0.51g/L、L-麩醯胺酸0.12g/L、Na-L-麩胺酸鹽*H2O 0.82g/L、葡萄糖*H2O 5.0g/L、痕量元素溶液5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、噻胺*HCL 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有MnSO4*H2O 1.28g/l、ZnSO4*7H2O 1.70g/L、H3BO3 0.30g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.18g/L、CoCl2*6H2O 0.25g/L、CuSO4*5H2O 0.22g/L、EDTA 0.75g/L。
對於預培養，用原始種子庫安瓿中之0.9mL接種具有四個擋板之1000mL錐形燒瓶中之300mL CDM。在37℃及170rpm下在旋轉振盪器上實施培養9小時，直至獲得7至13之光學密度(578nm)為止。然後 將100g之此預培養轉移至10L生物反應器中，以接種分批培養基。
存在胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸之發酵(1號實驗及2號實驗)：
對於10L Biostat C DCU3發酵槽(Sartorius,Melsungen,Germany)中之發酵，使用以下分批培養基：KH2PO4 4.73g/L、(NH4)2HPO4 7.47g/L、K2HPO4*3H2O 14.94g/L、檸檬酸鹽2.07g/l、L-甲硫胺酸1.22g/L、L-脯胺酸4.08g/L、L-白胺酸2.57g/L、檸檬酸鐵銨0.08g/L、NaHCO3 0.82g/L、痕量元素溶液7.3mL/L、MgSO4*7H2O 1.42g/L、噻胺*HCl 20.9mg/L、葡萄糖*H2O 29.3g/L、生物素0.2mg/L、1.2mL/L Synperonic 10%消泡劑。
痕量元素溶液含有溶解於1N HCl溶液中之FeSO4*7H2O 10g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、H3BO3 0.50g/L、噻胺-HCL 2.0g/L。
進料1溶液含有700g/L葡萄糖*H2O、KH2PO4 8.43g/L及K2HPO4*3H2O 22.38g/L。
進料2包含585g/L L-脯胺酸及150.3g/L MgSO4*7H2O。
將所有組份溶解於去離子水中。
用於pH調節之鹼性溶液係補充有11.25g/L L-甲硫胺酸、51.5g/L L-脯胺酸及56.25g/L L-白胺酸之12.5%(w/v)NH3水溶液(參見WO 2012/028522)。
以4.2L無菌分批培養基加上來自預培養之100mL接種物開始，在37℃、pH 6.9±0.2、800毫巴背壓及10L/min之初始通氣速率下實施分批發酵。在整個發酵期間，藉由將攪拌器速度增加至高達1500rpm將溶氧之相對值(pO2)保持在50%下。在耗盡初始補充之葡萄糖(藉由溶氧值之陡然增加指示)後，溫度轉變為25℃，且在發酵後15分鐘進入進料分批模式並利用兩種進料開始(分別50g/h及13g/h)。將進 料2之速率保持恆定，而在8.5小時內利用預定義進給曲線使進料1之速率自50g/h逐步增加至最終160g/h。當二氧化碳廢氣濃度位準高於2%時，在5小時內將通氣速率自10L/min不斷增加至20L/min。藉由在150之光密度時添加2.4g IPTG來誘導重組四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之表現。
在發酵結束時，在收穫之前利用加熱步驟將細胞質可溶性之經表現四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白轉移至不可溶蛋白質聚集體(所謂包涵體)中，在該加熱步驟中，將發酵槽中之整個培養液加熱至50℃並持續1小時(例如參見EP-B 1 486 571)。其後，利用並流離心機(13,000rpm,13L/h)對發酵槽之內容物進行離心，且在進一步處理之前，將所收穫之生物量儲存在-20℃下。合成之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白排他性地出現在呈不可溶蛋白質聚集體(所謂包涵體(IB))之形式之不可溶細胞碎片部分中。
產物形成之分析：
利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析自發酵槽抽取之樣品(一個樣品在誘導之前抽取且其他樣品在誘導蛋白質表現之後於指定時間點抽取)。自每一樣品，將相同量之細胞(OD標靶=5)懸浮於5mL PBS緩衝液中並經由在冰上進行超音波處理加以破壞。然後，對100μL之每一懸浮液進行離心(15,000rpm，5分鐘)，且將每一上清液取出並轉移至單獨小瓶中。此係用於區分所表現之可溶與不可溶標靶蛋白質。向每一上清液(=可溶)部分中添加300μL之SDS樣品緩衝液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)，並向每一沈澱(=不可溶)部分中添加400μL之SDS樣品緩衝液。在95℃下在強烈混合下將樣品加熱15分鐘，以溶解並還原樣品中之所有蛋白質。冷卻至室溫後，將5μL之每一樣品轉移至4%至20% TGX Criterion Stain游離聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad)中。另外，將5μL分子量標準物(Precision Plus蛋白質標準物，Bio- Rad)及3個數量(0.3μL、0.6μL及0.9μL)之具有已知產物蛋白質濃度(0.1μg/μL)之量化標準物置於凝膠上。
在200V下將電泳運行60分鐘，且其後將凝膠轉移至GelDOC EZ成像儀(Bio-Rad)上並用UV輻射處理5分鐘。使用Image Lab分析軟體(Bio-Rad)分析凝膠影像。利用該三種標準物，利用>0.99之係數計算線性回歸曲線且由此計算原始樣品中標靶蛋白質之濃度。
在八天放射性流出物分析中量測經純化且經脂化之TN-ApoA1之活性。細胞(THP-1)係藉由PMA(佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯)與巨噬細胞區分。向該等細胞加載乙醯化之LDL及3H標記之膽固醇。丟棄上清液，且利用平衡培養基將細胞培育5小時，以去除非特異性結合之膽固醇。添加脂化之TN-ApoA1，其使能夠在隨後的18小時期間自細胞輸出3H標記之膽固醇。在上清液及細胞溶解產物中量測放射性。
結果：
使用上文所提及發酵過程在為L-白胺酸及L-脯胺酸營養缺陷型之親代株CSPZ-2中及營養缺陷復原型株CSPZ-6中表現四聯蛋白-脂蛋白元A-I。儘管後一種株不需再進給任何胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸，但利用經補充發酵培養基測試此營養缺陷復原型株之性能用於與株CSPZ-2之直接性能比較。
儘管使用相同培養基及發酵過程，但營養缺陷復原型株生長得比親代株快(參見圖1)。
儘管使用相同培養基及發酵過程，但營養缺陷復原型株比親代株更快表現更多產物(參見圖2)。
如自胺基酸白胺酸及脯胺酸之濃度趨勢(參見圖3 A及B)可看出，營養缺陷復原型株由於代謝路徑完整現可代謝L-白胺酸及L-脯胺酸。因此，在所施加之進料分批過程之葡萄糖限制性培養條件下營養缺陷復原型株生長得更快。
出人意料地，營養缺陷復原型株在補充有胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸之相同化學性界定發酵培養基上具有比親代株顯著更好之性能。由於可能代謝所含胺基酸而促進生長，且此亦可改良產物形成。自此得出之結論係使用原營養需求型大腸桿菌生產株。
實例4
藉由在已補充有營養缺陷互補胺基酸白胺酸及脯胺酸之化學性界定最低生長培養基上培養來表現IgA蛋白酶
為表現IgA蛋白酶(106kDa)，採用使能夠藉由大腸桿菌營養缺陷型(PyrF)之互補來進行無抗生素質粒選擇之大腸桿菌宿主/載體系統(EP 0 972 838及US 6,291,245)。
藉由電穿孔利用表現質粒3036使大腸桿菌K12株CSPZ-2(leuB、proC、trpE、thi-1、△pyrF)及CSPZ-6(thi-1、△pyrF)轉型。首先使經轉型大腸桿菌細胞在37℃下於瓊脂板上生長。將自此板挑選之菌落轉移至3mL旋轉培養物中，並在37℃下生長至1至2之光密度(在578nm下量測)。然後，將1000μL培養物與1000μL無菌86%甘油混合，並立即在-80℃下冷凍用於長時間儲存。此純系之正確產物表現首先在小規模搖瓶實驗中驗證，並利用SDS-Page分析，然後轉移至10L發酵槽中。
預培養：
對於預培養，使用化學性界定培養基(CDM)：NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、檸檬酸鹽1.6g/L、甘胺酸0.78g/L、L-丙胺酸0.29g/L、L-精胺酸0.41g/L、L-天冬醯胺*H2O 0.37g/L、L-天冬胺酸鹽0.05g/L、L-半胱胺酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-組胺酸0.05g/L、L-異白胺酸0.31g/L、L-白胺酸0.38g/L、L-離胺酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫胺酸0.27g/L、L-苯基丙胺酸0.43g/L、L-脯胺酸0.36g/L、L-絲胺酸0.15g/L、L-蘇胺酸0.40g/L、L-色胺酸0.07 g/L、L-纈胺酸0.33g/L、L-酪胺酸0.51g/L、L-麩醯胺酸0.12g/L、Na-L-麩胺酸鹽*H2O 0.82g/L、葡萄糖*H2O 6.0g/L、痕量元素溶液0.5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、噻胺*HCl 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有溶解於0.5M HCl中之FeSO4*7H2O 10.0g/L、ZnSO4 * 7H2O 2.25g/L、MnSO4 * H2O 2.13g/L、H3BO3 0.50g/L、(NH4)6Mo7O24 * 4H2O 0.3g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、CuSO4 * 5H2O 1.0g/L。
對於預培養，用原始種子庫安瓿中之1.0mL接種具有四個擋板之1000mL錐形燒瓶中之220mL CDM。在37℃及170rpm下在旋轉振盪器上實施培養9小時，直至獲得11至13之光學密度(578nm)為止。利用vinoc.=100mL * 5/ODPC計算接種物體積，且其取決於利用等量細胞接種10L生物反應器之分批培養基之預培養之光密度。
存在胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸之發酵(3號實驗及4號實驗)：
對於在10L Biostat C DCU3發酵槽(Sartorius,Melsungen,Germany)中發酵，實施與實例3中所闡述相同之製程，惟在發酵結束時不實施任何加熱步驟。
產物形成之分析：
利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析自發酵槽抽取之樣品(一個樣品在誘導之前抽取且其他樣品在誘導蛋白質表現之後於指定時間點抽取)。自每一樣品，將相同量之細胞(OD標靶=10)懸浮於5mL PBS緩衝液中並經由在冰上進行超音波處理來破壞。然後，對100μL之每一懸浮液進行離心(15,000rpm，5分鐘)，且將每一上清液取出並轉移至單獨小瓶中。此係用於區分所表現之可溶與不可溶標靶蛋白質。向每一上清液(=可溶)部分中添加100μL之SDS樣品緩衝液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)，並向每一沈澱(=不可溶)部分中添加200μL之SDS樣品緩衝液。在95℃下在強烈混合下將樣品加熱15min，以 溶解並還原樣品中之所有蛋白質。冷卻至室溫後，將5μL之每一樣品轉移至4%至20% TGX Criterion Stain游離聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad)中。另外，將5μL分子量標準物(Precision Plus蛋白質標準物，Bio-Rad)及3個數量(0.3μL、0.6μL及0.9μL)之具有已知產物蛋白質濃度(0.1μg/μL)之量化標準物置於凝膠上。
在200V下將電泳運行60min，且其後將凝膠轉移至GelDOC EZ成像儀(Bio-Rad)並用UV輻射處理5min。使用Image Lab分析軟體(Bio-Rad)分析凝膠影像。利用該三種標準物，利用>0.99之係數計算線性回歸曲線且由此計算原始樣品中標靶蛋白質之濃度。
結果：
使用上文所提及發酵過程在為L-白胺酸及L-脯胺酸營養缺陷型之親代株CSPZ-2中及營養缺陷復原型株CSPZ-6中表現IgA蛋白酶。儘管後一種株不需再進給任何胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸，但測試此營養缺陷復原型株在補充發酵培養基上之性能用於與親代株CSPZ-2之直接性能比較。
與親代株相比，營養缺陷復原型株在胺基酸補充分批培養基上之生長顯著較快。
實例5 營養缺陷復原型大腸桿菌株及野生型株MG1655在化學性界定最低生長培養基上之培養
營養缺陷復原型株之一明顯益處在於，由於原營養需求性表現型，在化學性界定培養基上培養期間不再需要進給任何昂貴胺基酸。此將大幅減少該製程之商品成本。為了測試，利用營養缺陷復原型株CSPZ-6進行一致發酵，其中培養基及進料中僅不包括胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸。為證明營養缺陷復原型株具有優於亦係原營養需求性之野生型大腸桿菌株之顯著優勢，探究K12株MG1655(其中缺失pyrF 基因以適應無抗生素選擇系統)在相同發酵過程內之生長及產物形成。
藉由電穿孔利用表現質粒5816使大腸桿菌K12株CSPZ-6(thi-1、△pyrF)及MG1655衍生物(△pyrF、△ompT)轉型(參見實例2)。首先使經轉型大腸桿菌細胞在37℃下於瓊脂板上生長。將自此板挑選之菌落轉移至3mL旋轉培養物中，並在37℃下生長至1至2之光密度(在578nm下量測)。然後，將1000μL培養物與1000μL無菌86%甘油混合，並立即在-80℃下冷凍用於長時間儲存。
此純系之正確產物表現首先在小規模搖瓶實驗中驗證，並利用SDS-Page分析，然後轉移至10L發酵槽中。
預培養：對於預培養，使用化學性界定培養基(CDM)：
NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、檸檬酸鹽1.6g/L、甘胺酸0.78g/L、L-丙胺酸0.29g/L、L-精胺酸0.41g/L、L-天冬醯胺*H2O 0.37g/L、L-天冬胺酸鹽0.05g/L、L-半胱胺酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-組胺酸0.05g/L、L-異白胺酸0.31g/L、L-白胺酸0.38g/L、L-離胺酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫胺酸0.27g/L、L-苯基丙胺酸0.43g/L、L-脯胺酸0.36g/L、L-絲胺酸0.15g/L、L-蘇胺酸0.40g/L、L-色胺酸0.07g/L、L-纈胺酸0.33g/L、L-酪胺酸0.51g/L、L-麩醯胺酸0.12g/L、Na-L-麩胺酸鹽*H2O 0.82g/L、葡萄糖*H2O 5.0g/L、痕量元素溶液5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、噻胺*HCl 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有MnSO4*H2O 1.28g/L、ZnSO4*7H2O 1.70g/L、H3BO3 0.30g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.18g/L、CoCl2*6H2O 0.25g/L、CuSO4*5H2O 0.22g/L、EDTA 0.75g/L。
對於預培養，用原始種子庫安瓿中之0.9mL接種具有四個擋板之1000mL錐形燒瓶中之300mL CDM培養基。在37℃及170rpm下在旋 轉振盪器上實施培養9小時，直至獲得6至13之光學密度(578nm)為止。然後將100g之此預培養轉移至10L生物反應器中，以接種分批培養基。
不存在胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸之發酵(5號實驗及6號實驗)：
對於在10L Biostat C DCU3發酵槽(Sartorius,Melsungen,Germany)中之發酵，使用以下分批培養基：KH2PO4 4.73g/L、(NH4)2HPO4 7.47g/L、K2HPO4*3H2O 14.94g/L、檸檬酸鹽2.07g/L、L-甲硫胺酸1.22g/L、檸檬酸鐵銨0.08g/L、NaHCO3 0.82g/L、痕量元素溶液7.3mL/L、MgSO4*7H2O 1.42g/L、噻胺*HCl 20.9mg/L、葡萄糖*H2O 29.3g/L、生物素0.2mg/L、1.2mL/L Synperonic 10%消泡劑。
痕量元素溶液含有溶解於1N HCl溶液中之FeSO4*7H2O 10g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、H3BO3 0.50g/L、噻胺-HCl 2.0g/L。
進料1溶液含有700g/L葡萄糖*H2O、KH2PO4 8.43g/L及K2HPO4*3H2O 22.38g/L。
進料2僅包含150.3g/L MgSO4*7H2O。
將所有組份溶解於去離子水中。
用於pH調節之鹼性溶液係補充有11.25g/L L-甲硫胺酸之12.5%(w/v)NH3水溶液。
以4.2L無菌分批培養基加來自預培養之100mL接種物開始，在37℃、pH 6.9±0.2、800毫巴背壓及10L/min之初始通氣速率下實施分批發酵。在整個發酵期間藉由將攪拌器速度增加至高達1500rpm將溶氧之相對值(pO2)保持在50%下。在耗盡初始補充之葡萄糖(藉由溶氧值之陡然增加指示)後，溫度轉變為25℃，且在發酵後15分鐘進入 進料分批模式並利用兩種進料開始(分別50g/h及13g/h)。將進料2之速率保持恆定，而在8.5小時內利用預定義進給曲線使進料1之速率自50g/h逐步增加至最終160g/h。當二氧化碳廢氣濃度位準高於2%時，在5小時內將通氣速率自10L/min不斷增加至20L/min。藉由在150之光密度時添加2.4g IPTG來誘導重組四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之表現。在發酵結束時，在收穫之前利用加熱步驟將細胞質可溶性之經表現四聯蛋白-脂蛋白元A-I轉移至不可溶蛋白質聚集體(所謂包涵體)中，在該加熱步驟中，將發酵槽中之整個培養液加熱至50℃並持續1小時(例如參見EP-B 1 486 571)。其後，利用並流離心機(13,000rpm,13l/h)對發酵槽之內容物進行離心，且在進一步處理之前，將所收穫之生物量儲存在-20℃下。合成之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白排他性地出現在呈不可溶蛋白質聚集體(所謂包涵體(IB))之形式之不可溶細胞碎片部分中。
產物形成之分析：
利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析自發酵槽抽取之樣品(一個樣品在誘導之前抽取且其他樣品在誘導蛋白質表現之後於指定時間點抽取)。自每一樣品，將相同量之細胞(OD標靶=5)懸浮於5mL PBS緩衝液中並經由在冰上進行超音波處理來破壞。然後，對100μL之每一懸浮液進行離心(15,000rpm，5分鐘)，且將每一上清液取出並轉移至單獨小瓶中。此係用於區分所表現之可溶與不可溶標靶蛋白質。向每一上清液(=可溶)部分中添加300μL之SDS樣品緩衝液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)，並向每一沈澱(=不可溶)部分中添加400μL之SDS樣品緩衝液。在95℃下在強烈混合下將樣品加熱15分鐘，以溶解並還原樣品中之所有蛋白質。冷卻至室溫後，將5μL之每一樣品轉移至4%至20% TGX Criterion Stain游離聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad)中。另外，將5μL分子量標準物(Precision Plus蛋白質標準物，Bio- Rad)及3個數量(0.3μL、0.6μL及0.9μL)之具有已知產物蛋白質濃度(0.1μg/μL)之量化標準物置於凝膠上。
在200V下將電泳運行60min，且其後將凝膠轉移至GelDOC EZ成像儀(Bio-Rad)並用UV輻射處理5min。使用Image Lab分析軟體(Bio-Rad)分析凝膠影像。利用該三種標準物，利用>0.99之係數計算線性回歸曲線且由此計算原始樣品中標靶蛋白質之濃度。
在八天放射性流出物分析中量測經純化且經脂化之TN-ApoA1之活性。細胞(THP-1)係藉由PMA(佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯)與巨噬細胞區分。向該等細胞加載乙醯化之LDL及3H標記之膽固醇。丟棄上清液，且利用平衡培養基將細胞培育5小時，以去除非特異性結合之膽固醇。添加脂化之TN-ApoA1，其使能夠在隨後的18小時期間自細胞輸出3H標記之膽固醇。在上清液及細胞溶解產物中量測放射性。
結果：
使用上文所提及發酵過程在營養缺陷復原型株CSPZ-6及代表K12野生型株MG1655之原營養需求性MG1655衍生株中表現四聯蛋白-脂蛋白元A-I。兩種株均不需進給胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸，因此培養基及進料中不包括該等胺基酸。此明顯減少該製程之商品成本。
由於缺乏較高濃度之L-白胺酸之生長抑制效應，營養缺陷復原型及野生型株二者在不含胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸之培養基上均生長得較快(參見實例3)。營養缺陷復原型株之最終光密度在缺乏該等胺基酸之此培養基中得以充分改良，而野生型株之生長在誘導產物形成後且在發酵後期顯著減少(參見圖4)。
儘管營養缺陷復原型株在誘導物添加後前幾小時中之產物形成在補充有胺基酸之發酵培養基中較快，但最終產量與不添加胺基酸之發酵相比幾乎相同(參見圖5)。因此，該等胺基酸自培養基離開節省大量成本，但不減少產物產量。原營養需求型野生型大腸桿菌 MG1655衍生株在生長產量及產物方面具有明顯缺陷。
總結：
即使未補充胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸，營養缺陷復原型株在相同化學性界定發酵培養基上仍顯示比原營養需求型野生型大腸桿菌株更好之性能。因此，有利地使高產大腸桿菌株在其胺基酸營養缺陷型復原，以允許在化學性界定最低生長培養基上培養並自使用此一化學性界定最低生長培養基而非使用原營養需求性野生型大腸桿菌株(如MG1655或緊密相關之W3110)之優勢獲益(Vijayendran,C.等人，J.Biotechnol.128(2007)747-761)，如可進一步自實例6看出。
實例6 營養缺陷復原型大腸桿菌株及野生型株W3110在化學性界定最低生長培養基上之培養
為證明營養缺陷復原型株CSPZ-6具有優於原營養需求性野生型大腸桿菌株W3110(其中缺失pyrF基因以適應無抗生素選擇系統)之顯著優勢，探究在相同發酵過程內之生長及產物形成。
藉由電穿孔利用表現質粒5830(參見實例2)使大腸桿菌K12株CSPZ-6(thi-1、△pyrF)及66C5(=W3110 △pyrF衍生物)轉型。首先使經轉型大腸桿菌細胞在37℃下於瓊脂板上生長。將自此板挑選之菌落轉移至3mL旋轉培養物中，並在37℃下生長至1至2之光密度(在578nm下量測)。然後，將1000μL培養物與1000mL無菌86%甘油混合，並立即在-80℃下冷凍用於長時間儲存。
此純系之正確產物表現首先在小規模搖瓶實驗中驗證，並利用SDS-Page分析，然後轉移至10L發酵槽中。
預培養：
對於預培養，使用化學性界定培養基(CDM)：NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、檸檬酸鹽1.6g/L、甘胺 酸0.78g/L、L-丙胺酸0.29g/L、L-精胺酸0.41g/L、L-天冬醯胺*H2O 0.37g/L、L-天冬胺酸鹽0.05g/L、L-半胱胺酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-組胺酸0.05g/L、L-異白胺酸0.31g/L、L-白胺酸0.38g/L、L-離胺酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫胺酸0.27g/L、L-苯基丙胺酸0.43g/L、L-脯胺酸0.36g/L、L-絲胺酸0.15g/L、L-蘇胺酸0.40g/L、L-色胺酸0.07g/L、L-纈胺酸0.33g/L、L-酪胺酸0.51g/L、L-麩醯胺酸0.12g/L、Na-L-麩胺酸鹽*H2O 0.82g/L、葡萄糖*H2O 5.0g/L、痕量元素溶液5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、噻胺*HCl 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有溶解於0.5M HCl中之FeSO4*7H2O 10.0g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、H3BO3 0.50g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L。
對於預發酵，用原始種子庫安瓿中之0.9ml接種具有四個擋板之1000ml錐形燒瓶中之300ml CDM-介質。在32℃及170rpm下在旋轉振盪器上實施培養8小時，直至獲得4至9之光學密度(578nm)為止。利用Vinoc.=100ml * 5/ODPC計算接種物體積，且其取決於利用等量細胞接種10L生物反應器之分批培養基之預培養之光密度。
不存在胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸之發酵(7號實驗及8號實驗)：
對於在10L Biostat C DCU3發酵槽(Sartorius,Melsungen,Germany)中之發酵，使用以下分批培養基：KH2PO4 1.58g/L、(NH4)2HPO4 7.47g/L、K2HPO4*3H2O 13.32g/L、檸檬酸鹽2.07g/L、L-甲硫胺酸1.22g/L、NaHCO3 0.82g/L、痕量元素溶液7.3mL/L、MgSO4*7H2O 0.99g/L、噻胺*HCl 20.9mg/L、葡萄糖*H2O 29.3g/L、生物素0.2mg/L、1.2mL/L Synperonic 10%消泡劑。
痕量元素溶液含有溶解於0.5M HCl溶液中之FeSO4*7H2O 10g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、CuSO4*5H2O 1.0 g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、(NH4)6Mo7O24 * 4H2O 0.3g/L、H3BO3 0.50g/L。
進料1溶液含有700g/L葡萄糖*H2O、12.3g/L MgSO4*7H2O及0.1g/L FeSO4*7H2O。
進料2包含KH2PO4 52.7g/L、K2HPO4*3H2O 139.9g/L及(NH4)2HPO4 132.1g/L。
將所有組份溶解於去離子水中。
用於pH調節之鹼性溶液係補充有11.25g/L L-甲硫胺酸之12.5%(w/v)NH3水溶液。
以4.2L無菌分批培養基加來自預培養之100mL接種物開始，在31℃、pH 6.9±0.2、800毫巴背壓及10L/min之初始通氣速率下實施分批發酵。在整個發酵期間藉由將攪拌器速度增加至高達1500rpm將溶氧之相對值(pO2)保持在50%下。在耗盡初始補充之葡萄糖(藉由溶氧值之陡然增加指示)後，溫度轉變為25℃，且在發酵後15分鐘進入進料分批模式並利用兩種進料開始(分別60g/h及14g/h)。將進料2之速率保持恆定，而在7小時內利用預定義進給曲線使進料1之速率自60g/h逐步增加至最終160g/h。當二氧化碳廢氣濃度位準高於2%時，在5小時內將通氣速率自10L/min不斷增加至20L/min。藉由在120之光密度時添加2.4g IPTG來誘導重組四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之表現。在發酵結束時，在收穫之前利用加熱步驟將細胞質可溶性之經表現四聯蛋白-脂蛋白元A-I轉移至不可溶蛋白質聚集體(所謂包涵體)中，在該加熱步驟中，將發酵槽中之整個培養液加熱至50℃並持續1小時(例如參見EP-B 1 486 571)。其後，利用並流離心機(13,000rpm,13L/h)對發酵槽之內容物進行離心，且在進一步處理之前，將所收穫之生物量儲存在-20℃下。合成之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白排他性地出現在呈不可溶蛋白質聚集體(所謂包涵體(IB))之形式之不可溶 細胞碎片部分中。
產物形成之分析：
利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析自發酵槽抽取之樣品(一個樣品在誘導之前抽取且其他樣品在誘導蛋白質表現之後於指定時間點抽取)。自每一樣品，將相同量之細胞(OD標靶=5)懸浮於5mL PBS緩衝液中並經由在冰上進行超音波處理來破壞。然後，對100μL之每一懸浮液進行離心(15,000rpm，5分鐘)，且將每一上清液取出並轉移至單獨小瓶中。此係用於區分所表現之可溶與不可溶標靶蛋白質。向每一上清液(=可溶)部分中添加300μL之SDS樣品緩衝液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)，並向每一沈澱(=不可溶)部分中添加400μL之SDS樣品緩衝液。在95℃下在強烈混合下將樣品加熱15分鐘，以溶解並還原樣品中之所有蛋白質。冷卻至室溫後，將5μL之每一樣品轉移至4%至20% TGX Criterion Stain游離聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad)中。另外，將5μL分子量標準物(Precision Plus蛋白質標準物，Bio-Rad)及3個數量(0.3μL、0.6μL及0.9μL)之具有已知產物蛋白質濃度(0.1μg/μL)之量化標準物置於凝膠上。
在200V下將電泳運行60min，且其後將凝膠轉移至GelDOC EZ成像儀(Bio-Rad)並用UV輻射處理5min。使用Image Lab分析軟體(Bio-Rad)分析凝膠影像。利用該三種標準物，利用>0.99之係數計算線性回歸曲線且由此計算原始樣品中標靶蛋白質之濃度。
在八天放射性流出物分析中量測經純化且經脂化之TN-ApoA1之活性。細胞(THP-1)係藉由PMA(佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯)與巨噬細胞區分。向該等細胞加載乙醯化之LDL及3H標記之膽固醇。丟棄上清液，且利用平衡培養基將細胞培育5小時，以去除非特異性結合之膽固醇。添加脂化之TN-ApoA1，其使能夠在隨後的18小時期間自細胞輸出3H標記之膽固醇。在上清液及細胞溶解產物中量測放射性。
結果：
使用上文所提及發酵過程在營養缺陷復原型株CSPZ-6及代表K12野生型株W3110之原營養需求性株66C5中表現四聯蛋白-脂蛋白元A-I。兩種株均不需進給胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸，因此培養基及進料中不包括該等胺基酸。此減少該製程之商品成本。
出人意料地，野生型株66C5除了為原營養需求性並利用等量細胞接種以外，當與在相同化學性界定培養基上且在相同培養條件下之營養缺陷復原型株CSPZ-6相比時亦自一開始即生長得極緩慢(參見圖6)。因此，葡萄糖進給速率必須經調適以避免過度進給及培養基中之葡萄糖累積。而且，兩種株之間之最終光密度極為不同。雖然營養缺陷復原型株達到300以上，但野生型株僅獲得143且由於生長停滯而終止發酵。對於分批階段(37℃)及進料分批階段(30℃)利用高溫(9號實驗)重複利用株66C5之發酵，但生長產量可未得到極大改良(參見圖7)。
由於當在相同化學性界定培養基上且在相同條件下培養時野生型株66C5之生長遠遠落後於營養缺陷復原型株CSPZ-6之生長，故產物形成亦低得多(參見圖8)。雖然在表現31小時後營養缺陷復原型株最終獲得22.6g/L，但在培養38小時後由於生長停滯而終止野生型株66C5發酵且因此產物產量經量化為僅2.3g/L。比生產率亦較低(21.9mg/OD相對於71.1mg/OD)。對於分批階段(37℃)及進料分批階段(30℃)利用高溫重複利用野生型株66C5之發酵，但產物產量可僅改良至6.9g/L(參見圖9)。原營養需求型野生型大腸桿菌株在與營養缺陷復原型株之直接比較中具有明顯缺陷。
總結：
營養缺陷復原型株CSPZ-6在未補充除甲硫胺酸以外之其他胺基酸之相同化學性界定發酵培養基上具有比原營養需求型野生型大腸桿 菌株W3110衍生物好得多之性能。因此，有利地使大腸桿菌株自其胺基酸營養缺陷型復原，以使用化學性界定最低營養素培養基用於培養並自使用此一培養基而非使用原營養需求性野生型大腸桿菌株(例如MG1655或W3110)之優勢獲益。
實例7 營養缺陷復原型株CSPZ-6及原營養需求性野生型株BL21 △pyrF衍生物在化學性界定培養基上之培養
為證明營養缺陷復原型株CSPZ-6具有優於原營養需求性野生型大腸桿菌B株BL21(其中缺失pyrF基因以適應無抗生素選擇系統，稱為CSPZ-14)之顯著優勢，探究在相同發酵過程內之生長及產物形成。
藉由電穿孔利用質粒第5836號使大腸桿菌K12株CSPZ-6(thi-1、△pyrF)及大腸桿菌B株CSPZ-14(=BL21 △pyrF衍生物)轉型(參見實例2)，以表現縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白衍生物。首先使經轉型大腸桿菌細胞在37℃下於瓊脂板上生長。將自此板挑選之菌落轉移至3mL旋轉培養物中，並在37℃下生長至1至2之光密度(在578nm下量測)。然後，將1000μL培養物與1000μL無菌86%甘油混合，並立即在-80℃下冷凍用於長時間儲存。此純系之正確產物表現首先在小規模搖瓶實驗中驗證，並利用SDS-Page分析，然後轉移至10L發酵槽中。
預培養：
對於預培養，使用化學性界定培養基(CDM)：NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、檸檬酸鹽1.6g/L、甘胺酸0.78g/L、L-丙胺酸0.29g/L、L-精胺酸0.41g/L、L-天冬醯胺*H2O 0.37g/L、L-天冬胺酸鹽0.05g/L、L-半胱胺酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-組胺酸0.05g/L、L-異白胺酸0.31g/L、L-白胺酸0.38g/L、L-離胺酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫胺酸0.27g/L、L-苯基丙胺酸0.43g/L、L-脯胺 酸0.36g/L、L-絲胺酸0.15g/L、L-蘇胺酸0.40g/L、L-色胺酸0.07g/L、L-纈胺酸0.33g/L、L-酪胺酸0.51g/L、L-麩醯胺酸0.12g/L、Na-L-麩胺酸鹽*H2O 0.82g/L、葡萄糖*H2O 6.0g/L、痕量元素溶液0.5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、噻胺*HCl 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有溶解於0.5M HCl中之FeSO4*7H2O 10.0g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4 * H2O 2.13g/L、H3BO3 0.50g/L、(NH4)6Mo7O24 * 4H2O 0.3g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、CuSO4 * 5H2O 1.0g/L。
對於預培養，用原始種子庫安瓿中之0.9mL接種具有四個擋板之1000mL錐形燒瓶中之300mL CDM。在32℃及170rpm下在旋轉振盪器上實施培養8小時，直至獲得4至9之光學密度(578nm)為止。然後將100g之此預培養轉移至10L生物反應器中，以接種分批培養基。
不存在胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸之發酵(10號實驗及11號實驗)：
對於在10L Biostat C DCU3發酵槽(Sartorius,Melsungen,Germany)中之發酵，使用以下分批培養基：KH2PO4 1.58g/L、(NH4)2HPO4 7.47g/L、K2HPO4*3H2O 13.32g/L、檸檬酸鹽2.07g/L、L-甲硫胺酸1.22g/L、NaHCO3 0.82g/L、痕量元素溶液7.3mL/L、MgSO4*7H2O 0.99g/L、噻胺*HCl 20.9mg/L、葡萄糖*H2O 29.3g/L、生物素0.2mg/L、1.2mL/L Synperonic 10%消泡劑。
痕量元素溶液含有溶解於0.5M HCl溶液中之FeSO4*7H2O 10g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、H3BO3 0.50g/L。
進料1溶液含有700g/L葡萄糖*H2O、7.4g/L MgSO4*7H2O及0.1g/L FeSO4*7H2O。
進料2包含KH2PO4 52.7g/L、K2HPO4*3H2O 139.9g/L及(NH4)2HPO4 66.0g/L。
將所有組份溶解於去離子水中。
用於pH調節之鹼性溶液係補充有11.25g/L L-甲硫胺酸之12.5%(w/v)NH3水溶液。
以4.2L無菌分批培養基加來自預培養之100mL接種物開始，在31℃、pH 6.9±0.2、800毫巴背壓及10L/min之初始通氣速率下實施分批發酵。在整個發酵期間藉由將攪拌器速度增加至高達1500rpm將溶氧之相對值(pO2)保持在50%下。在耗盡初始補充之葡萄糖(藉由溶氧值之陡然增加指示)後，溫度轉變為25℃，且在發酵後15分鐘進入進料分批模式並利用兩種進料開始(分別60g/h及14g/h)。將進料2之速率保持恆定，而在7小時內利用預定義進給曲線使進料1之速率自60g/h逐步增加至最終160g/h。當二氧化碳廢氣濃度位準高於2%時，在5小時內將通氣速率自10L/min不斷增加至20L/min。藉由在大約150之光密度時添加2.4g IPTG來誘導重組四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白之表現。在發酵結束時，在收穫之前利用加熱步驟將細胞質可溶性之經表現四聯蛋白-脂蛋白元A-I轉移至不可溶蛋白質聚集體(所謂包涵體)中，在該加熱步驟中，將發酵槽中之整個培養液加熱至50℃並持續1小時(例如參見EP-B 1 486 571)。其後，利用並流離心機(13,000rpm,13L/h)對發酵槽之內容物進行離心，且在進一步處理之前，將所收穫之生物量儲存在-20℃下。合成之四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白排他性地出現在呈不可溶蛋白質聚集體(所謂包涵體(IB))之形式之不可溶細胞碎片部分中。
產物形成之分析：
利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析自發酵槽抽取之樣品(一個樣品在誘導之前抽取且其他樣品在誘導蛋白質表現之後於指定時間點抽 取)。自每一樣品，將相同量之細胞(OD標靶=5)懸浮於5mL PBS緩衝液中並經由在冰上進行超音波處理來破壞。然後，對100μL之每一懸浮液進行離心(15,000rpm，5分鐘)，且將每一上清液取出並轉移至單獨小瓶中。此係用於區分所表現之可溶與不可溶標靶蛋白質。向每一上清液(=可溶)部分中添加300μL之SDS樣品緩衝液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)，並向每一沈澱(=不可溶)部分中添加400μL之SDS樣品緩衝液。在95℃下在強烈混合下將樣品加熱15分鐘，以溶解並還原樣品中之所有蛋白質。冷卻至室溫後，將5μL之每一樣品轉移至4%至20% TGX Criterion Stain游離聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad)中。另外，將5μL分子量標準物(Precision Plus蛋白質標準物，Bio-Rad)及3個數量(0.3μL、0.6μL及0.9μL)之具有已知產物蛋白質濃度(0.1μg/μL)之量化標準物置於凝膠上。
在200V下將電泳運行60min，且其後將凝膠轉移至GelDOC EZ成像儀(Bio-Rad)並用UV輻射處理5min。使用Image Lab分析軟體(Bio-Rad)分析凝膠影像。利用該三種標準物，利用>0.99之係數計算線性回歸曲線且由此計算原始樣品中標靶蛋白質之濃度。
在八天放射性流出物分析中量測經純化且經脂化之縮短TN-ApoA1之活性。細胞(THP-1)係藉由PMA(佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯)與巨噬細胞區分。向該等細胞加載乙醯化之LDL及3H標記之膽固醇。丟棄上清液，且利用平衡培養基將細胞培育5小時，以去除非特異性結合之膽固醇。添加脂化之縮短TN-ApoA1，其能夠在隨後的18小時期間自細胞輸出3H標記之膽固醇。在上清液及細胞溶解產物中量測放射性。
結果：
使用上文所提及發酵過程在營養缺陷復原型株CSPZ-6及代表大腸桿菌B野生型株BL21之原營養需求性株CSPZ-14中表現縮短之四聯 蛋白-脂蛋白元A-I融合蛋白。兩種株均不需進給胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸，因此培養基及進料中不包括該等胺基酸。此減少該製程之商品成本。
出人意料地，野生型株及BL21衍生物CSPZ-14除了為原營養需求性並利用等量細胞接種發酵外，當與在相同化學性界定培養基上且在相同培養條件下之營養缺陷復原型株CSPZ-6相比時亦自一開始即生長得顯著較慢(參見圖10)。因此，1.2小時後開始葡萄糖進給，但進給速率之增加遵循與在相當發酵中相同之曲線。兩種株之間之最終光密度極為不同。雖然營養缺陷復原型株在最後加熱步驟之前達到266之光密度，但野生型株之光密度自第33小時處之最大值降低至發酵結束時(第47小時)之僅143。
在兩種培養中，藉由在大約150之光密度時添加2.4g IPTG來誘導產物形成。由於株CSPZ-14之生長減少，故當在相同化學性界定培養基上且在相同條件下培養時，與利用株CSPZ-6之第19.5小時相比，在第22.2小時達到此OD。儘管如此，CSPZ-14之產物形成速率顯著較低，且因此在表現23小時後最終產量僅達到9.6g/L(參見圖11)。相比之下，在24小時之誘導表現後營養缺陷復原型株產生33.8g/L融合蛋白。而且，比生產率較低(67.1mg/OD相對於135.7mg/OD)。原營養需求型野生型大腸桿菌株在與營養缺陷復原型株之直接比較中具有明顯缺陷。
總結：
營養缺陷復原型株CSPZ-6在未補充除甲硫胺酸以外之其他胺基酸之相同化學性界定發酵培養基上具有比原營養需求型野生型大腸桿菌株CSPZ-14(BL21 △pyrF衍生物)好得多之性能。因此，有利地使大腸桿菌株自其胺基酸營養缺陷型復原，以在化學性界定最低營養素培養基上培養其並自使用此一培養基而非使用原營養需求性野生型大腸 桿菌株(例如MG1655、W3110或BL21)之優勢獲益。
實例8 營養缺陷復原型株CSPZ-6及原營養需求性野生型株MG1655在化學性界定培養基上之培養
為證明營養缺陷復原型株CSPZ-6具有優於原營養需求性野生型大腸桿菌K12株MG1655(其中缺失pyrF基因以適應無抗生素選擇系統，稱為CSPZ-9)之顯著優勢，已探究兩種株之間在相同發酵過程內之生長及IgA-蛋白酶產物形成。
藉由電穿孔利用質粒3036使大腸桿菌K12株CSPZ-6(thi-1、△pyrF)及CSPZ-9(=MG1655 △pyrF衍生物)轉型，以表現IgA-蛋白酶。首先使經轉型大腸桿菌細胞在37℃下於瓊脂板上生長。將自此板挑選之菌落轉移至3mL旋轉培養物中，並在37℃下生長至1至2之光密度(在578nm下量測)。然後，將1000μL培養物與1000μL無菌86%甘油混合，並立即在-80℃下冷凍用於長時間儲存。此純系之正確產物表現首先在小規模搖瓶實驗中驗證，並利用SDS-Page分析，然後轉移至10L發酵槽中。
預培養：
對於預培養，使用化學性界定培養基(CDM)：NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、檸檬酸鹽1.6g/L、甘胺酸0.78g/L、L-丙胺酸0.29g/L、L-精胺酸0.41g/L、L-天冬醯胺*H2O 0.37g/L、L-天冬胺酸鹽0.05g/L、L-半胱胺酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-組胺酸0.05g/L、L-異白胺酸0.31g/L、L-白胺酸0.38g/L、L-離胺酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫胺酸0.27g/L、L-苯基丙胺酸0.43g/L、L-脯胺酸0.36g/L、L-絲胺酸0.15g/L、L-蘇胺酸0.40g/L、L-色胺酸0.07g/L、L-纈胺酸0.33g/L、L-酪胺酸0.51g/L、L-麩醯胺酸0.12g/L、Na-L-麩胺酸鹽*H2O 0.82g/L、葡萄糖*H2O 6.0g/L、痕量元素溶液 0.5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、噻胺*HCl 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有溶解於0.5M HCl中之FeSO4*7H2O 10.0g/L、ZnSO4 * 7H2O 2.25g/L、MnSO4 * H2O 2.13g/L、H3BO3 0.50g/L、(NH4)6Mo7O24 * 4H2O 0.3g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、CuSO4 * 5H2O 1.0g/L。
對於預培養，用原始種子庫安瓿中之0.9mL接種具有四個擋板之1000mL錐形燒瓶中之220mL CDM。在37℃及170rpm下在旋轉振盪器上實施培養8小時，直至獲得10至12之光學密度(578nm)為止。為利用等量細胞接種10L生物反應器之分批培養基，利用Vinoc.=100mL * 5/ODPC計算接種物體積，且因此其取決於之預培養光密度。
不存在胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸之發酵(12號實驗及13號實驗)：
對於在10L Biostat C DCU3發酵槽(Sartorius,Melsungen,Germany)中之發酵，使用以下分批培養基：KH2PO4 1.58g/L、(NH4)2HPO4 7.47g/L、K2HPO4*3H2O 13.32g/L、檸檬酸鹽2.07g/L、L-甲硫胺酸1.22g/L、NaHCO3 0.82g/L、痕量元素溶液7.3mL/L、MgSO4*7H2O 0.99g/L、噻胺*HCl 20.9mg/L、葡萄糖*H2O 29.3g/L、生物素0.2mg/L、1.2mL/L Synperonic 10%消泡劑。
痕量元素溶液含有溶解於0.5M HCl溶液中之FeSO4*7H2O 10g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、H3BO3 0.50g/L。
進料1溶液含有700g/L葡萄糖*H2O、7.4g/L MgSO4*7H2O及0.1g/L FeSO4*7H2O。
進料2包含KH2PO4 52.7g/L、K2HPO4*3H2O 139.9g/L及(NH4)2HPO4 66.0g/L。
將所有組份溶解於去離子水中。
用於pH調節之鹼性溶液係補充有11.25g/L L-甲硫胺酸之12.5%(w/v)NH3水溶液。
以4.2L無菌分批培養基加各別接種物體積開始，在31℃、pH 6.9±0.2、800毫巴背壓及10L/min之初始通氣速率下實施分批發酵。在整個發酵期間藉由將攪拌器速度增加至高達1500rpm將溶氧之相對值(pO2)保持在50%下。在耗盡初始補充之葡萄糖(藉由溶氧值之陡然增加指示)後，溫度轉變為25℃，且在發酵後15分鐘進入進料分批模式並利用兩種進料開始(分別60g/h及14g/h)。將進料2之速率保持恆定，而在7小時內利用預定義進給曲線使進料1之速率自60g/h逐步增加至最終160g/h。當二氧化碳廢氣濃度位準高於2%時，在5小時內將通氣速率自10L/min不斷增加至20L/min。藉由在大約150之光密度時添加2.4g IPTG來誘導重組IgA-蛋白酶之表現。實施發酵長達48小時，但光密度無顯著降低。最後，將培養液冷卻至4℃至8℃，並在發酵槽容器中儲存過夜。第二天，利用並流離心機(13,000rpm,13L/h)對發酵槽之內容物進行離心，且在進一步處理之前，將所收穫之生物量儲存在-20℃下。合成之IgA-蛋白酶排他性地出現在呈不可溶蛋白質聚集體(所謂包涵體(IB))之形式之不可溶細胞碎片部分中。
產物形成之分析：
利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析自發酵槽抽取之樣品(一個樣品在誘導之前抽取且其他樣品在誘導蛋白質表現之後於指定時間點抽取)。自每一樣品，將相同量之細胞(OD標靶=10)懸浮於5mL PBS緩衝液中並經由在冰上進行超音波處理來破壞。然後，對100μL之每一懸浮液進行離心(15,000rpm，5分鐘)，且將每一上清液取出並轉移至單獨小瓶中。此係用於區分所表現之可溶與不可溶標靶蛋白質。向每一上清液(=可溶)部分中添加100μL之SDS樣品緩衝液(Laemmli,U.K., Nature 227(1970)680-685)，並向每一沈澱(=不可溶)部分中添加200μL之SDS樣品緩衝液。在95℃下在強烈混合下將樣品加熱15分鐘，以溶解並還原樣品中之所有蛋白質。冷卻至室溫後，將5μL之每一樣品轉移至4%至20% TGX Criterion Stain游離聚丙烯醯胺凝膠(Bio-Rad)中。另外，將5μL分子量標準物(Precision Plus蛋白質標準物，Bio-Rad)及3數量(0.3μL、0.6μL及0.9μL)之具有已知產物蛋白質濃度(0.15μg/μL)之量化標準物置於凝膠上。
在200V下將電泳運行60min，且其後將凝膠轉移至GelDOC EZ成像儀(Bio-Rad)並用UV輻射處理5min。使用Image Lab分析軟體(Bio-Rad)分析凝膠影像。利用該三種標準物，利用>0.99之係數計算線性回歸曲線且由此計算原始樣品中標靶蛋白質之濃度。
利用上文所闡述之分子四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合多肽測試經再摺疊且經純化之IgA-蛋白酶之活性，該分子係藉由在活體外使用此IgA蛋白酶之酶促裂解釋放四聯蛋白-脂蛋白元A-I融合多肽之前體多肽。裂解活性係在預期範圍內。
結果：
使用上文所提及發酵過程在營養缺陷復原型株CSPZ-6及代表大腸桿菌K12野生型株MG1655之原營養需求性株CSPZ-9中表現IgA-蛋白酶蛋白質。兩種株均不需進給胺基酸L-白胺酸及L-脯胺酸，因此培養基及進料中不包括該等胺基酸。此明顯減少該製程之商品成本。
當與在相同化學性界定培養基上且在相同培養條件下之營養缺陷復原型株CSPZ-6相比時，野生型株及MG1655衍生物CSPZ-9顯示在發酵開始時生長較快。接種後24小時，光密度幾乎相同。但其後出人意料地，兩種株之光密度不同。株CSPZ-9之生長在30小時培養後已顯著減緩，且由於連續進給進料1，培養基中之葡萄糖濃度增加至16g/L。因此，在37小時培養後終止發酵。代謝物分析揭露，由於生長 速率顯著降低，培養基中之氨水、麩胺酸鹽、鐵、鎂及乙酸鹽之濃度顯著增加。兩種株之間之最終光密度極為不同。雖然復原型株達到362，但野生型株之光密度自第24小時之最大值256降低至發酵結束時(第37小時)之僅177(參見圖12)。
在利用在大約150之光密度時添加2.4g IPTG來誘導蛋白質表現後，當與野生型株CSPZ-9相比時，利用株CSPZ-6生產顯著更多之IgA-蛋白酶(參見圖13)。
總結：
營養缺陷復原型株CSPZ-6在未補充其他胺基酸之相同化學性界定發酵培養基上顯示與原營養需求型野生型大腸桿菌株CSPZ-9(MG1655 △pyrF衍生物)相比經改良之生長特性。因此，有用的是使高產大腸桿菌株自其胺基酸營養缺陷型復原，以能夠在化學性界定最低營養素培養基上培養其並自使用此一培養基而非使用來自MG1655、W3110或BL21之原營養需求性野生型大腸桿菌株衍生物之優勢獲益。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
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<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 六組胺酸標籤
<400> 2
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
<210> 4
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四聯蛋白-脂蛋白元A1融合蛋白
<400> 4
<210> 5
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四聯蛋白-脂蛋白元A-I(1)
<400> 5
<210> 6
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 縮短之四聯蛋白-脂蛋白元A1融合蛋白
<400> 6

Claims (19)

  1. 一種在原核細胞中生產多肽之方法，該方法包含以下步驟：藉由將可復原親代原核細胞之胺基酸營養缺陷型之核酸引入至該親代原核細胞之基因組中而將對至少一種胺基酸為營養缺陷型之原核細胞自至少一種胺基酸營養缺陷型復原，在化學性界定最低生長培養基中培養包含一或多種編碼該多肽之核酸之胺基酸營養缺陷型復原之原核細胞，及自該原核細胞或該原核細胞之周質或自該培養基回收該多肽，其中該原核細胞係大腸桿菌(E.coli)細胞。
  2. 如請求項1之方法，其中營養缺陷復原型原核細胞之該培養需要向該生長培養基中補充比培養親代非營養缺陷復原型原核細胞所需胺基酸少一種或兩種或三種或四種之胺基酸。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該營養缺陷復原型原核細胞具有至少一種其他胺基酸營養缺陷型。
  4. 如請求項1或2之方法，其中在該培養期間不添加與該營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸。
  5. 如請求項3之方法，其中在該培養期間不添加與該營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷型相應之胺基酸。
  6. 如請求項1或2之方法，其中該培養係在不存在與該營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷相應之胺基酸之情況下進行。
  7. 如請求項3之方法，其中該培養係在不存在與該營養缺陷復原型原核細胞中已復原之營養缺陷相應之胺基酸之情況下進行。
  8. 如請求項1或2之方法，其中該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
  9. 如請求項3之方法，其中該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
  10. 如請求項4之方法，其中該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
  11. 如請求項5之方法，其中該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
  12. 如請求項6之方法，其中該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
  13. 如請求項7之方法，其中該多肽係全長抗體鏈、單鏈抗體、單一結構域抗體、scFv、scFab或前述中之一者與非抗體多肽之偶聯物。
  14. 如請求項8之方法，其中該多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
  15. 如請求項9之方法，其中該多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
  16. 如請求項10之方法，其中該多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
  17. 如請求項11之方法，其中該多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
  18. 如請求項12之方法，其中該多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
  19. 如請求項13之方法，其中該多肽係scFv或scFab與細胞毒性劑之偶聯物。
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