CN111378678A - 一种强化羟脯氨酸合成的质粒及其构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种质粒,其包括抗生素抗性基因、表达脯氨酸‑4‑羟化酶的基因(P4H蛋白基因)、表达谷氨酸‑5‑激酶的基因(GK基因)以及表达γ‑谷氨酰磷酸还原酶的基因(GPR基因)构成的四基因多顺反子结构,该顺反子质粒上的LacI基因和LacO基因被去掉,构建出不需要诱导剂诱导的组成型表达外源基因的质粒。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域,具体涉及将一种重组质粒,以及转入该重组质粒构建的基因工程菌,以及使用该基因工程菌强化生产L-羟脯氨酸的方法。
背景技术
L-羟脯氨酸(L-Hydroxyproline,L-Hyp)为亚氨基酸——羟脯氨酸的一种同分异构体,全名为反式-4-羟基-L-脯氨酸(或L-羟基脯氨酸、L-羟脯氨酸),是L-脯氨酸经羟基化之后的产物,其分子式为C5H9NO3。L-羟脯氨酸呈白色片状结晶或结晶性粉末,微甜,熔点为274℃,易溶于水,微溶于乙醇。
L-羟脯氨酸是胶原蛋白的主要组成部分,不属于20种常见氨基酸,近些年来,L-羟脯氨酸的研究和开发已经引起医药、生化、食品及美容等产业的广泛关注。它可以作为化妆品添加剂,具有抗氧化、抗辐射的作用;它具有减肥作用,可望成为比较理想的减肥药物;它具有多种生理功能与独特的生物活性,既可以作为各种软组织疾病的药物,如结蹄组织受损、风湿性关节炎等,又可以加快伤口愈合,以及治疗各种皮肤病;它可以作为氨基酸注射液的重要成分,它对急慢性肝病所导致的低蛋白血症有一定的疗效;它参与脂肪的乳化及红细胞血红素和球蛋白的形成,具有调节脂肪乳化等作用;它还是多种药物,如第三代抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等的合成原料。
目前,生产L-羟脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、酶转化法和微生物发酵法,其中蛋白水解提取法和化学合成法因环境污染等原因,已逐步被酶转化法和微生物发酵法取代。
酶转化法以L-脯氨酸和α-酮戊二酸为原料,利用高表达L-脯氨酸羟化酶的重组菌株作为酶源,经酶转化反应得到L-羟脯氨酸(Hyp)。
微生物发酵法利用谷氨酸激酶(GK)、谷氨酰磷酸还原酶(GPR)、脯氨酸4-羟化酶基因(P4H)共表达的重组菌株,以甘油或葡萄糖糖为原料产生Hyp,与以脯氨酸为底物的酶转化法相比,更具成本优势。
大肠杆菌因具有遗传背景清楚、载体受体系统完备、生长迅速、培养简单、重组子稳定等优点,特别适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达等方面,常常被用来作为外源基因表达的宿主菌。
然而,目前普遍采用的大肠杆菌重组菌,存在菌株不稳定、发酵水平低、需要使用诱导剂IPTG或乳糖诱导等问题。
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂不会被重组大肠杆菌代谢而十分稳定。IPTG存在的情况下,其可与阻遏物结合形成复合物,引起阻遏物变构,不能再Lac O基因结合,从而促进基因的表达。但是由于IPTG化合物本身具有一定的毒性,当利用IPTG诱导表达时,发酵液中残留的IPTG难以在最终的产品中完全去除。同时IPTG价格较为昂贵,在较大体积的发酵罐中进行诱导时,会造成发酵成本的增加。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足,本发明提供了一种强化表达三个基因以及适当的抗生素抗性基因的人工构建的质粒,该质粒上的LacI基因和LacO基因被去掉,构建出不需要诱导剂诱导的组成型表达外源基因的质粒;将该质粒转入大肠杆菌中形成基因工程菌;利用该基因工程菌在发酵中强化合成L-羟脯氨酸途径,以提高L-羟脯氨酸的产量。
本发明具体涉及如下内容:
1.一种质粒,其包括抗生素抗性基因、表达脯氨酸-4-羟化酶的基因(P4H蛋白基因)、表达谷氨酸-5-激酶的基因(GK基因)以及表达γ-谷氨酰磷酸还原酶的基因(GPR基因)。
2.根据项1所述的质粒,其中,与脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)和γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)相比,所述抗生素抗性基因设置在3’端。
3.根据项1或2所述的质粒,其为组成型质粒,还包括Trc启动子基因(Trc),与脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)和抗生素抗性基因相比,Trc启动子基因(Trc)设置在5’端,
其中,设置在抗生素抗性基因之前的基因的终止子被敲除,脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、抗生素抗性基因构成共同以Trc启动子启动的四基因多顺反子结构。
4.根据项3所述的质粒,其中,所述抗生素抗性基因是四环素抗性基因(TetR)、卡那霉素抗性基因(KanR)、氯霉素抗性基因(CmR)、庆大霉素抗性基因(GmR)、红霉素抗性基因(EmR)以及其它适合的抗生素抗性基因中的任一种,优选该抗生素抗性基因是四环素抗性基因(TetR)。
5.根据项4所述的质粒,其中,该质粒从5’端到3’端依次包括:
Trc启动子基因(Trc)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)以及抗生素抗性基因;或者
Trc启动子基因(Trc)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)以及抗生素抗性基因;或者
Trc启动子基因(Trc)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)以及抗生素抗性基因;或者
Trc启动子基因(Trc)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)以及抗生素抗性基因;或者
Trc启动子基因(Trc)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)以及抗生素抗性基因;或者
Trc启动子基因(Trc)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、以及抗生素抗性基因。
6.一种构建如项1~5中任一项所述的质粒的方法,其包括如下步骤:
构建分别表达脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)三个基因的原始质粒,所述三个基因位于Trc启动子之后;
对原始质粒进行抗性替换,使之在上述三个基因下游的位置携带抗生素抗性基因,所述下游为靠近质粒基因组3’的一端。
7.一种构建如项1~5中任一项所述的质粒的方法,其包括如下步骤:
构建分别表达脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)三个基因的原始质粒,所述三个基因位于Trc启动子之后;
对原始质粒进行抗性替换,使之在上述三个基因下游的位置携带抗生素抗性基因,所述下游为靠近质粒基因组3’的一端;
将抗生素抗性基因的启动子及其上游紧邻的基因的终止子敲除,形成表达稳定型质粒,所述上游为靠近质粒基因组5’的一端。
8、一种构建如项1~5中任一项所述的质粒的方法,其包括如下步骤:
构建分别表达脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H基因)、谷氨酸-5-激酶基因(GK基因)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR基因)三个基因的原始质粒,所述三个基因位于Trc启动子之后;
对原始质粒进行抗性替换,使之在上述三个基因下游的位置携带抗生素抗性基因,所述下游为靠近质粒基因组3’的一端;
将抗生素抗性基因的启动子及其上游紧邻的基因的终止子敲除,形成表达稳定型质粒,所述上游为靠近质粒基因组5’的一端;以及
将Trc启动子前后紧邻的LacI和LacO基因敲除,形成组成型质粒。
9.一种基因工程菌,其携带项1~5中任一项所述的质粒。
10.一种制造L-羟脯氨酸的方法,其包括:
使用如项9所述的基因工程菌进行需氧发酵的步骤。
11.根据项10所述的方法,其中在所述发酵中不使用诱导剂。
附图说明
图1天然条件下在大肠杆菌中由谷氨酸生产L-羟脯氨酸的途径;
图2天然条件下由脯氨酸-4-羟化酶催化的反应;
图3原始质粒构建示意图;
图4替换成四环素抗性质粒的过程图;
图5稳定表达型(抗性基因由Trc启动子启动)质粒的构建;
图6组成型(敲除LacI和LacO基因)高产羟脯氨酸质粒构建示意图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例,然而应当理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反,提供这些实施例是为了能更透彻地理解本发明,并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
需要说明的是,在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解,技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式,而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语,故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式,然所述描述乃以说明书的一般原则为目的,并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如无特殊说明,本文中所用术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同,但如有冲突,则以本文中的定义为准。本文中,所涉及的数值一般指重量或重量百分比,除非特殊说明。
本申请的第一方面提供了一种人工构建的质粒。
在本申请的一个实施方式中,构建了一种质粒,其包括抗生素抗性基因、表达脯氨酸-4-羟化酶的基因(P4H蛋白基因)、表达谷氨酸5-激酶的基因(GK蛋白基因)、以及表达γ-谷氨酰磷酸还原酶(GPR蛋白基因)的基因。
在一个具体的实施方式中,所述质粒自5’端至3’端可以依次包括:脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)和抗生素抗性基因;也可以依次包括:P4H、GPR和GK;又可以依次包括:GK、P4H、GPR;还可以依次包括:GK、GPR、P4H;也可以依次包括:GPR、GK、P4H;还可以依次包括:GPR、P4H、GK;其中所述抗生素抗性基因排在以上三个基因之后,例如可以为四环素抗性基因,也可以为卡那霉素抗性基因(KanR)、氯霉素抗性基因(CmR)、庆大霉素抗性基因(GmR)、红霉素抗性基因(EmR)。
在一个具体的实施方式中,所述质粒为组成型质粒,包括例如:自5’端至3’端依次由下述构成的四基因多顺反子结构:Trc启动子基因(Trc)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、四环素抗性基因;其中,Trc启动子基因(Trc)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、四环素抗性基因共同以Trc启动子启动。
图6给出了pTrc-PGGT组成型质粒,该质粒长度为6070bp,其自trc启动子的位置起始,顺着箭头方向(图中的逆时针方向,亦即5’端至3’端方向)依次为:Trc启动子基因(Trc)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、四环素抗性基因(TetR)。
在天然条件下,在大肠杆菌中存在由谷氨酸生成Hyp的途径,该过程需由4个酶催化,即,谷氨酸激酶(GK),γ-谷氨酰磷酸还原酶(GPR),二氢吡咯羧酸还原酶(P5CR)以及脯氨酸羟化酶(P4H),它们分别由基因proB、proA、proC和p4h编码。其中,GK是整个途径的限速酶,它会受到产物L-Pro的反馈抑制。该途径如图1所示。
其中,脯氨酸-4-羟化酶(L-Proline-4-hydroxylase,P4H)是依赖α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+的双加氧酶成员之一,在反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydrooxy-L-proline,t-4Hyp)等重要手性化合物的生物合成中发挥关键作用。其所催化的反应如图2所示。
通过搜索NCBI数据库,可以发现注释为P4H的蛋白有一百余种,但是目前通过分子生物学方法仅实现了极少数P4H的活性表达,而多数P4H并未被挖掘利用。作为示例,在此可以使用来自大肠杆菌BL21的P4H。
在此,选择并结合使用P4H蛋白、GK蛋白、GPR蛋白三基因的优势在于:P4H单基因表达生产L-羟脯氨酸需要补加大量的L-脯氨酸,除了补充生成L-羟脯氨酸产物消耗的部分,还要保证菌体有一定量的L-脯氨酸供菌体本身生长使用;GK与P4H两基因表达方案与单基因表达相比,能够使得菌体自身产生超量的L-脯氨酸,供给生成产物和供菌体代谢使用,但是要进一步提高L-羟脯氨酸产量,需要进一步强化生成L-脯氨酸之前的代谢途径,三基因方案有进一步强化的效果,使得终产物L-羟脯氨酸生成量有了进一步提高。如下文表1所示:
表1不同基因表达方案产生产物L-羟脯氨酸的相对能力
将抗生素抗性基因构建成与GPR、GK与P4H三基因多顺反子结构,更重要的作用是稳定Trc启动子对GPR、GK与P4H三基因的转录和表达,如果GPR、GK与P4H三基因中的任何一个或两个或三个基因发生突变,以至于不能转录,在其后的抗生素抗性基因也无法转录,抗性能力消失,菌体在含抗生素的培养基中死亡,所以多顺反子表达抗生素抗性基因结构起到了筛选和稳定GPR、GK与P4H三基因表达的作用。
常用的几种抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因等,各有优劣,比如,氨苄青霉素抗性基因,会产生一种可分解氨苄青霉素的酶,其工作浓度较高,通常为100ug/ml,且其抗性质粒不稳定。本发明优选的四环素抗性基因,是阻断与抗生素结合的位点,不仅其工作浓度较低,通常为10-50ug/ml,其抗性质粒还更稳定,而且四环素价格低、可以用酒精溶液配制、不易染菌,从而具有特别的优势。
使用本发明优选的四环素进行了抗性替换的实施方式可以结合附图4清楚地看到。
在本说明书的上下文中,“质粒”是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。与天然质粒相比,人工构建的质粒通常至少带有一个或一个以上的选择性标记基因(如四环素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,有质粒能够在微生物中复制识别序列,对于表达质粒还要有一个或者多个启动子序列,并去掉了大部分非必需序列,使质粒分子量尽可能减少以便基因工程操作。
在本说明书的上下文中,术语“组成型质粒”特别地指代根据本实施方案的、去除了LacI基因和位于Trc启动子后面的LacO基因的质粒。
在本说明书的上下文中,“多顺反子结构”见于原核生物,意指一个mRNA分子编码多个多肽链。这些多肽链对应的DNA片段则位于同一转录单位内,各自拥有独立的核糖体结合位点RBS、起点(起始密码子)和终点(终止密码子)。
使用“组成型质粒”的原因在于,不用添加诱导剂,可以简化工艺步骤和降低由于添加诱导剂产生的成本。本专利的组成型质粒的构建方法,示例说明如下,由本申请质粒中的原有启动子(诱导型启动子)出发,其具有LacI基因和位于Trc启动子后面的LacO基因,这两个基因构成了诱导表达系统,必须通过加入IPTG或者乳糖才能使得Trc启动子更强的启动转录P4H蛋白基因、GK蛋白基因、GPR蛋白基因和抗生素抗性基因如四环素抗性基因(TetR),IPTG诱导剂价格昂贵,又对宿主有毒性,这个毒性物质很可能会带入到后续产品中。为了解决该质粒需要诱导的问题,使得Trc启动子变成组成型启动子,即可将质粒上的LacI基因和LacO基因去掉,构建出组成型表达外源基因的质粒。但是,为了构建组成型质粒,在本领域任何构建组成型质粒可采用的方法都可以使用,上文所述的方法并不构成对构建方法的限制。
在此构建组成型表达质粒时涉及到一个Lac表达系统和Lac启动子,“Lac启动子”是来自大肠杆菌的乳糖操纵子,是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列,由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(LacP)、操纵基因(LacO)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolitegene activation protein)因子和cAMP来激活启动子,促使转录进行;负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白,该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物,使其构型改变,不能与LacO基因结合,从而解除这种阻遏,诱导转录发生。
在本发明的进一步具体的实施方案中,实现了上文所述的组成型质粒,额外地,其中所述GPR基因是没有终止子的GPR基因,而所述抗生素抗性基因是没有启动子的抗生素抗性基因。该实施方案可以结合附图5清楚地看到。在本说明书的上下文中,术语“稳定表达型质粒”特别指代,抗生素抗性基因被敲除了启动子,而其上游基因被敲除了终止子的人工构建的质粒。
在此,这样的做法(形成稳定表达型质粒)的原因在于,脯氨酸-4-羟化酶(proline-4-hydroxylase,P4H)基因的过量表达,会过多的消耗L-脯氨酸,使得宿主不能正常生长。为获得更稳定的三基因表达质粒,对上文所述的组成型质粒进行改进,将GPR蛋白的基因后面的终止子和抗生素抗性基因启动子去掉,使得抗生素抗性基因与P4H蛋白基因、GK蛋白基因和GPR蛋白基因形成一个以Trc启动子启动的四基因多顺反子结构,这样的结构有稳定表达四个基因的特点,如果不能正确地表达多顺反子基因,其抗性基因也不能表达,在抗生素的筛选压力下不能正确表达多顺反子蛋白的宿主将不能生长。这样的结构使得多顺反子的蛋白表达量越高,宿主的抗性越强,因此在含有抗生素的培养环境下,可以增强抗性基因前面三个基因的表达,从而增强产羟脯氨酸途径,提高产羟脯氨酸能力。
在图6中可见最终组成型、高产羟脯氨酸的质粒示例,该质粒带有四环素抗性基因,其该抗性基因由Trc启动子启动,并且敲除了LacI和LacO基因。
本申请的第二方面涉及一种构建前述质粒的方法,其包括如下步骤:
进行步骤一:构建分别表达脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)三个基因的原始质粒,此三个基因位于Trc启动子之后依次排列;原始质粒的结构对应图3,由图3可以看到该表达三个基因的原始质粒(命名为pTrc99a-PGG),其中,依箭头方向(逆时针方向)依次排列:Trc基因、P4H基因、GK基因、GPR基因。
进行步骤二:对原始质粒进行抗性替换,使之在GPR之后的位置携带抗生素抗性基因(例如四环素抗性基因,也可以为卡那霉素抗性基因(KanR)、氯霉素抗性基因(CmR)、庆大霉素抗性基因(GmR)、红霉素抗性基因(EmR)或其它适合的抗生素抗性基因;在原始质粒基础上进行了抗性替换的质粒(命名为pTrc99t-PGG)的结构对应图4,由图4可以看到,与原始质粒相比,位于GPR基因下游的氨苄抗性基因被替换为了四环素基因。
任选进行步骤三:将GPR蛋白的基因的终止子和四环素抗性基因的启动子敲除,形成表达稳定型质粒;在抗性替换质粒基础上构建出表达稳定型基因(pTrc99t-PGGT),其结构如图5所示,由图5可以看出,将处于上游的GPR蛋白的基因终止子和处于下游的四环素抗性基因启动子被敲除(箭头的指向即从上游至下游的方向)。
任选进行步骤四:将Trc前后紧邻的LacI和LacO基因敲除,形成组成型质粒。在表达稳定型基因的基础上,进一步敲除LacI和LacO基因,得到组成型质粒(pTrc-PGGT),这在图6的起始点处(Trc前后)可以看出。
综上,本申请的构建质粒的方法的构成可以为:步骤一、二;步骤一、二、三;或者步骤一、二、三、四。
质粒的构建可以遵循一般的生物技术方法,在此特别是指酶切和酶连接方法,以及连接的各个基因具有一定长度的同源片段的GIBSON无缝连接方法。其中,P4H基因来自于大肠杆菌BL21基因组,而GK和GPR基因来自DH5α基因组。用PCR反应进行基因组扩增,用EcoRI和XbaI酶双酶切,而后纯化片段进行酶连接。抗性替换、去除终止子和启动子、敲除LacI和LacO也与上述类似地通过酶切和酶连接方法进行。本领域任何使用的技术手段都可以适用,只要可以构建出所需质粒,而不受限于上文所述的方法。
本申请的第三方面涉及一种基因工程菌,其可以基于大肠杆菌、并由前述质粒转化得到。具体做法是将前述人工构建的质粒导入大肠杆菌。
作为将人工构建的质粒导入宿主微生物的方法,可以采用利用感受态细胞法[Journal of Molecular Biology,Vol.53,p.159(1970)]、乙酸锂法[Ito,H.等人,J.Bacteriol.,Vol.153,p.163(1983)]、原生质球法[Hinnen,A.,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.75,p.1929(1978)]、电脉冲法[J.Indust.Microbiol.,Vol.5,p.159(1990)]等的转化法、使用噬菌体的转化法[E.Ohtsubo,Genetics,Vol.64,p.189(1970)]、接合转移法[J.G.C.Ottow,Ann.Rev.Microbiol.,Vol.29,p.80(1975)]、细胞融合法[M.H.Gabor,J.Bacteriol.,Vol.137,p.1346(1979)]等。从这些方法中可以适宜选择适合宿主微生物的方法。
常用的基因工程受体有:大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞。在此的实例采用大肠杆菌,这样选择的好处是,大肠杆菌具有遗传背景清楚、载体受体系统完备、生长迅速、培养简单、重组子稳定等优点;因此特别适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达等方面。本发明对于宿主细胞没有限定,只要可以同时表达本发明希望表达的基因即可。
在一个具体的实施方式中,本发明的宿主微生物为大肠杆菌。
在一个具体的实施方式中,本发明的宿主微生物为任何可以用来接受质粒的大肠杆菌菌株,例如DH5α、TOP10、TOP10F’、C600、W3110、HB101、JM83、JM105、JM109、BL21类、JM101(Aps、Tcs、Cms)等,特别地,该宿主微生物为大肠杆菌DH5α。
本申请的第四方面涉及使用前述基因工程菌制造L-羟脯氨酸的方法。
具体做法是,将前面得到的基因工程菌接种入培养基中培养。
在此培养方式可以是摇瓶培养,也可以是发酵罐(生物反应器)培养。
在使用发酵罐培养时,可以适时地采用批次培养、连续培养、流加式培养等培养模式。
作为使用的培养基,在此可以列举:含有碳源、氮源、硫源、无机离子以及需要的其他有机成分的通常的培养基。
作为碳源,可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、糖蜜、淀粉水解物等糖类、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。作为氮源,可以使用硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐、大豆水解物等有机氮、氨气、氨水等。作为硫源,可以列举出硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、连二亚硫酸盐、硫代硫酸盐等无机硫化物。作为有机微量营养源,优选适量含有维生素B1等必需物质或者酵母提取物等。除此之外,根据需要可以少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。培养在需氧的条件下进行30~90小时较好,培养温度为25℃~37℃,且优选将培养中的pH控制在5~8的范围内。此外,可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质,以及氨气等来调节pH值。
就培养结束后从培养基溶液中采集L-Hyp而言,在本发明中不需要特别的方法。本发明中采集出的L-Hyp除了含有作为目标的L-Hyp之外,还可以含有微生物菌体、培养基成分、水分以及微生物的代谢副产物等。
作为提取产物的下游工艺,可以通过组合已经公知的离子交换树脂法、膜分离法、晶析法、以及其他的方法采集L-Hyp。
在一个更具体的实施方式中,上述培养基中不包括诱导剂;在此,所述诱导剂特别是IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropylβ-D-Thiogalactoside)它是一种常用诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定;在此,所述培养基分别指在培养各阶段所采用的斜面培养基、种子培养基或发酵培养基;在一个具体的实施方式中,在上述培养基中添加有四环素,以对菌体进行筛选。
从四环素的抗生素原理可知,对于大肠杆菌其杀菌浓度低,5ug/ml就可以起到杀无抗性菌的作用,而且直接用乙醇配制,免去了抗生素过滤除菌的麻烦,在杀菌过程中四环素本身基本不消耗,可以保持持续杀菌(丢失了质粒的大肠杆菌)的效能;采用组成型表达质粒可以从一开始就持续表达目的基因,使得菌体一直处于产L-羟脯氨酸状态,不用添加诱导剂,简化了工艺,节省了原料(诱导剂);诱导表达方式在加入诱导剂后会大量表达目标蛋白,造成表达质粒相关基因发生突变,影响体系稳定性和产生L-羟脯氨酸,而本专利采用多顺反子结构同时表达抗性基因,可以避免表达系统转录突变问题的发生。“四环素抗性基因”在此仅起示例作用而非限制作用,作为替选,也可以使用卡那霉素抗性基因(KanR)、氯霉素抗性基因(CmR)、庆大霉素抗性基因(GmR)、红霉素抗性基因(EmR)以及其他任意适宜的抗生素抗性基因。
实施例部分
实施例1表达三个基因原始质粒的构建
根据NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找来源于大肠杆菌BL21的脯氨酸-4-羟化酶(proline-4-hydroxylase,P4H)基因(GenBank:KT943377.1)、来源于大肠杆菌DH5α基因组的谷氨酸5-激酶(glutamate 5-kinase,GK)基因(GenBank CP025520.1,Range 1:3760135to 3761238)以及γ-谷氨酰磷酸还原酶(γ-glutamyl-phosphatereductase,GPR)基因(GenBank CP025520.1,Range 1:3761250..3762503),设计引物扩增相应的基因,引物如表2所示:
表2构建原始质粒用引物
用引物1和引物2从基因组中扩增P4H基因,用引物3和引物4扩增GK和GPR基因,然后用引物1和引物4以上述两个扩增的样品为模板,扩增出P4H酶的基因、Gk酶的基因以及GPR酶的基因串联的多顺反子结构,然后用EcoRI和XbaI酶双酶切,与经过EcoRI和XbaI酶双酶切的质粒pTrc99a(GenBank:M22744.1)纯化片段连接构建成用于后续质粒改造的原始质粒,质粒构建图如图3所示,质粒命名为pTrc99a-PGG。
实施例2经过抗性替换的质粒的构建
氨苄青霉素容易分解,其工作浓度为100微克/ml,其抗性质粒不稳定,且氨苄青霉素用量大,而四环素抗性质粒,其工作浓度只有5-10微克/ml,而且四环素价格低,添加使用不易分解,可以用75%的酒精配制,因此不易染菌。为了稳定培养工艺,降低成本,将氨苄青霉素抗性替换成四环素抗性,替换过程采用GIBSON连接方式,首先设计合适的引物,引物序列如表3所示。
表3构建原始质粒用引物
用引物5和引物6以质粒pJBTrc(GenBank:LT727449.1)为模板扩增四环素抗性基因,用引物7和引物8以pTrc99a-PGG质粒为模板扩增除去氨苄青霉素抗性以外大片段,将上述扩增片段纯化后,用GIBSON试剂将两个片段连接起来制备成四环素抗性的质粒,命名为pTrc99t-PGG。质粒构建流程如图4所示。
实施例3表达稳定型质粒的构建
脯氨酸-4-羟化酶(proline-4-hydroxylase,P4H)基因的过量表达,会过多的消耗L-脯氨酸,使得宿主不能正常生长,为获得更稳定的三基因表达质粒,对pTrc99t-PGG进行改进,将GPR蛋白的基因后面的终止子和四环素抗性基因启动子去掉,使得四环素抗性基因与P4H蛋白基因、GK蛋白基因和GPR蛋白基因形成一个以Trc启动子启动的四基因顺反子结构的结构,这样的结构有稳定表达四个基因的特点,如果不能正确地表达多顺反子基因,其抗性基因也不能表达,在四环素的筛选压力下不能正确表达多顺反子蛋白的宿主将不能生长。这样的结构使得多顺反子的蛋白表达量越高,宿主的抗性越强,因此在较高的抗生素环境下,可以增强抗性基因前面三个基因的表达,从而增强产羟脯氨酸途径,提高产羟脯氨酸能力。构建过程如下,pTrc99t-PGG质粒的抗性基因与Trc启动子启动的三个基因方向一致,采用将质粒反向扩增,末端磷酸化再连接的方法,去掉终止子和抗性基因启动子部分,形成四基因同时被Trc启动子启动的结构。反向扩增的引物分别为引物9(5-TTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATG)和引物10(5-TTACGCACGAATGGTGTAATCACCAATGC),构建过程如图5所示(圆圈部分为去掉的基因部分)。构建成功的质粒名为pTrc99t-PGGT。
实施例4组成型质粒的构建
pTrc99t-PGGT质粒及前面构建的pTrc99t-PGG和pTrc99a-PGG质粒,因为质粒上均具有LacI基因和Trc启动子后面的LacO基因,这两个基因构成了诱导表达系统,必须通过加入IPTG或者乳糖才能使得Trc启动子更强的启动P4H蛋白基因、GK蛋白基因、GPR蛋白基因和四环素抗性基因,IPTG诱导剂价格昂贵,又对宿主有毒性,这个毒性物质很可能会带入到后续产品中。为了解决该质粒需要诱导的问题,使得Trc启动子变成组成型启动子,可将质粒上的LacI基因和LacO基因去掉,构建出组成型表达外源基因的质粒。去掉LacI基因和LacO基因的方法与实施例3相似,也是进行反向扩增,然后将扩增序列末端磷酸化再连接,去掉LacI基因所用的引物为引物11(5-GCGCAACGCAATTAATGTAAGTTAGCG)和引物12(5-GTGATGACGGTGAAAACCTCTGACAC),去掉了LacI基因的质粒(命名为:pTrc99t-PGGT-I),再用引物13(5-CATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAA)和引物14(5-TGTGGAATTTCACACAGGAAACAG)进行反向扩增去掉LacO基因,最后构建出了不需要诱导剂,稳定的表达P4H蛋白、GK蛋白、GPR蛋白,使得产羟脯氨酸能力显著提高的稳定的质粒pTrc-PGGT。构建的质粒过程如图6所示。
以上构建质粒扩增的过程均为pfu酶扩增,退火温度均取两条引物中Tm较低的Tm再减去4℃值,扩增延伸时间均以每分钟延伸500bp的速度计算延伸时间。
实施例5质粒性能的测试
将上述原始质粒pTrc99a-PGG、替换了抗性的质粒pTrc99t-PGG、抗性基因多顺反子结构质粒pTrc99t-PGGT和最终组成型表达P4H蛋白基因、GK蛋白基因、GPR蛋白基因和四环素抗性基因(TetR)的pTrc-PGGT质粒分别转入大肠杆菌DH5α中,对产羟脯氨酸的性能进行测试。
菌株摇瓶发酵实验:
斜面培养:取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面,37℃培养12h。
摇瓶种子培养:用接种环刮取一环斜面种子接种于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中,通气型封口膜封口,37℃,200rpm培养10-16h;
摇瓶发酵培养:按10-15%接种量接种到装有500mL三角瓶中(终体积为50mL),通气型封口膜封口,37℃,200r/min振荡培养,发酵周期24-48h;
斜面培养基组成为:酵母粉5g/L,NaCl 10-20g/L,蛋白胨10-20g/L,氨苄青霉素100ug/ml或四环素50ug/ml,琼脂15-20g/L,其余为水,pH7.0-7.2;
种子培养基组成为:酵母粉5g/L,NaCl 10-20g/L,蛋白胨10-20g/L,氨苄青霉素100ug/ml或四环素50ug/ml,其余为水,pH 7.0-7.2;
发酵培养基组成为:甘油10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10-20g/L,蛋白胨10-20g/L,氨苄青霉素100ug/ml或四环素50ug/ml,其余为水,pH 7.0-7.2;
摇瓶发酵24h羟脯氨酸浓度如表4所示。
表4各种质粒在大肠杆菌DH5α中产羟脯氨酸结果
已公开的现有生产L-羟脯氨酸的菌种中,不同基因工程菌摇瓶发酵产羟脯氨酸结果如表5所示。
表5.不同基因工程菌发酵产L-羟脯氨酸结果
作为对比:Yulan Yi等(BMC Biotechnology,14:44.)将来源不同物种的P4H基因分别在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中实现了活性表达,摇瓶发酵结果表明,在不添加脯氨酸的情况下,重组菌E.coli BL21/pET-28a-p4hD的产量最高,OD600nm为6.5左右时,L-羟脯氨酸的产量为0.470g/L。
发明专利申请CN103509813A公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-羟脯氨酸的方法,构建表达脯氨酸-4-羟化酶的质粒(pAMP-P2trp-Hyp质粒)导入大肠杆菌,在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸,培养24h后L-羟脯氨酸的产量达到0.31g/L。
发明专利申请CN107805621A公开了一种高效生物合成L-羟脯氨酸的方法,将pTrcHisB-P4H和pBbA5C-CABG质粒共转化至敲除了putA基因的大肠杆菌中,该基因工程菌菌株在改良的MCG培养基中摇瓶发酵24h、48h、72h,L-羟脯氨酸产量分别达到270mg/L、580mg/L、596mg/L。
发明专利申请CN105567720A公开了一株直接利用葡萄糖发酵生产L-羟脯氨酸的重组菌的构建方法,将谷氨酸激酶基因(proB2A)与连有色氨酸串联启动子的L-羟脯氨酸的脯氨酸羟化酶基因(hyp)构建成共表达体系,转入大肠杆菌宿主菌中。实现proB2A、hyp在大肠杆菌中的共表达,该重组菌能够利用葡萄糖发酵生产L-羟脯氨酸,发酵24h测定的L-羟脯氨酸产量为0.9g/L。
本发明所提供的方法,构建成功的重组菌E.coli DH5α/pTrc-PGGT,通过摇瓶发酵培养,L-羟脯氨酸的产量可达到1.08g/L,具有良好的工业开发前景。
尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述,但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域,上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的,而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下,还可以做出很多种的形式,这些均属于本发明保护之列。
Claims (11)
1.一种质粒,其包括抗生素抗性基因、表达脯氨酸-4-羟化酶的基因(P4H蛋白基因)、表达谷氨酸-5-激酶的基因(GK基因)以及表达γ-谷氨酰磷酸还原酶的基因(GPR基因)。
2.根据权利要求1所述的质粒,其中,与脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)和γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)相比,所述抗生素抗性基因设置在3’端。
3.根据权利要求1或2所述的质粒,其为组成型质粒,还包括Trc启动子基因(Trc),与脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)和抗生素抗性基因相比,Trc启动子基因(Trc)设置在5’端,
其中,设置在抗生素抗性基因之前的基因的终止子被敲除,脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、抗生素抗性基因构成共同以Trc启动子启动的四基因多顺反子结构。
4.根据权利要求3所述的质粒,其中,所述抗生素抗性基因是四环素抗性基因(TetR)、卡那霉素抗性基因(KanR)、氯霉素抗性基因(CmR)、庆大霉素抗性基因(GmR)或红霉素抗性基因(EmR)中的任一种,优选该抗生素抗性基因是四环素抗性基因(TetR)。
5.根据权利要求4所述的质粒,其中,该质粒从5’端到3’端依次包括:
Trc启动子基因(Trc)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)以及抗生素抗性基因;或者
Trc启动子基因(Trc)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)以及抗生素抗性基因;或者
Trc启动子基因(Trc)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)以及抗生素抗性基因;或者
Trc启动子基因(Trc)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)以及抗生素抗性基因;或者
Trc启动子基因(Trc)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)以及抗生素抗性基因;或者
Trc启动子基因(Trc)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、以及抗生素抗性基因。
6.一种构建如权利要求1~5中任一项所述的质粒的方法,其包括如下步骤:
构建分别表达脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)三个基因的原始质粒,所述三个基因位于Trc启动子之后;
对原始质粒进行抗性替换,使之在上述三个基因下游的位置携带抗生素抗性基因,所述下游为靠近质粒基因组3’的一端。
7.一种构建如权利要求1~5中任一项所述的质粒的方法,其包括如下步骤:
构建分别表达脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H)、谷氨酸-5-激酶基因(GK)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR)三个基因的原始质粒,所述三个基因位于Trc启动子之后;
对原始质粒进行抗性替换,使之在上述三个基因下游的位置携带抗生素抗性基因,所述下游为靠近质粒基因组3’的一端;
将抗生素抗性基因的启动子及其上游紧邻的基因的终止子敲除,形成表达稳定型质粒,所述上游为靠近质粒基因组5’的一端。
8.一种构建如权利要求1~5中任一项所述的质粒的方法,其包括如下步骤:
构建分别表达脯氨酸-4-羟化酶基因(P4H基因)、谷氨酸-5-激酶基因(GK基因)、γ-谷氨酰磷酸还原酶基因(GPR基因)三个基因的原始质粒,所述三个基因位于Trc启动子之后;
对原始质粒进行抗性替换,使之在上述三个基因下游的位置携带抗生素抗性基因,所述下游为靠近质粒基因组3’的一端;
将抗生素抗性基因的启动子及其上游紧邻的基因的终止子敲除,形成表达稳定型质粒,所述上游为靠近质粒基因组5’的一端;以及
将Trc启动子前后紧邻的LacI和LacO基因敲除,形成组成型质粒。
9.一种基因工程菌,其携带权利要求1~5中任一项所述的质粒。
10.一种制造L-羟脯氨酸的方法,其包括:
使用如权利要求9所述的基因工程菌进行需氧发酵的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法,其中在所述发酵中不使用诱导剂。
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