KR20130070302A

KR20130070302A - 발린 생산능을 향상시키는 방법

Info

Publication number: KR20130070302A
Application number: KR1020110137548A
Authority: KR
Inventors: 이영주; 윤선준; 박세조; 김석수
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2013-06-27

Abstract

본 발명은 균주의 로이신/이소로이신/발린 전달 시스템(Leu/Ile/Val transporter system)을 불활성화 시킴으로써 발린(Valine) 생산능을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게 상기 불활성화는 서열번호 1과 같은 liv J 를 코딩하는 뉴클레오타이드를 결실시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명을 통해 박테리아에서 liv J 를 코딩하는 뉴클레오타이드를 불활성화시킴으로써 발린 생산능을 증가시킬 수 있는 유리한 효과를 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 균주를 이용하면 발린을 제조할 경우 원가 절감 효과를 기대할 수 있는바, 경제성 또한 인정된다고 할 것이다.

Description

발린 생산능을 향상시키는 방법{The method of improving production of Valine}

본 발명은 균주의 로이신/이소로이신/발린 전달 시스템(Leu/Ile/Val transporter system)을 불활성화 시킴으로써 발린(Valine) 생산능을 향상시키는 기술에 관한 것이다. 보다 상세하게는 상기 불활성화는 liv J 를 코딩하는 뉴클레오타이드를 결실시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 한다.

발린(Valine)은 2-amino valeric acid로 단백질을 구성하는 분자 아미노산으로서 알부민의 가수분해로 얻을 수 있으며, 필수 아미노산의 하나로 단백질에 들어 있는 양은 상대적으로 적다. 또한 발린은 로이신과 그 성질이 유사하기 때문에 단백질 가수분해물 중에서 순수하게 분리하기가 비교적 곤란한 아미노산에 속하며, D-발린과 L-발린이 존재한다.

L-발린에 대해서 구체적으로 살펴보면 근육 세포 보호 및 근육 분해를 방지하는 효과가 있는 천연 아미노산의 일종으로, 의약품, 식품, 기타 동물 사료 등에 널리 이용되고 있다. 그리고 L-발린은 의약용으로 수액제 및 종합아미노산 제제 등에 사용되고 있으며, 식품용으로는 건강 보조제 및 음료 첨가용 등으로 이용되고 있다. 상기 이유로 인하여 L-발린의 제조 방법을 향상시키는 것은 산업적인 의미로 보았을 때 중요하다.

L-발린 생산 균주를 개발하기 위한 방법은 종래 기술로부터 여러 가지가 있었다. 가장 일반적인 아미노산 생산 균주 개발법으로는 돌연변이법을 이용한 중간대사산물 또는 최종산물에 대한 내성주 선별법, 염색체 변이를 통한 목적 산물 생산 조절 유전자의 활성, 결실 또는 강화 등이 있다. 즉 돌연변이법 이용으로는 발린의 유사 구조체에 대한 내성을 가지는 변이주를 선별하는 방법이 적용될 수 있다. 또한 목적산물 이외의 분지점에 해당하는 생합성 경로의 활성을 감소시키거나 차단하는 방법, 또는 목적산물로의 생합성 경로를 강화하는 방법 등 생합성 경로를 조절하는 효소를 활성, 결실 또는 강화하는 방법이 있다.

그러나 상기 언급한 돌연변이법 등의 일반적인 아미노산 균주 개발 방법을 발린 생산 균주에 적용할 경우 발린 생산균주에 원하지 않는 돌연변이를 유발할 수 있다. 또한 생합성 경로 조절을 통해 과생산된 목적산물이 세포내에 축적되면서 세포생육이 저하되거나 목적산물 생산이 저조되는 등 feedback inhibition을 받게 된다.

본 발명에서 결손을 시킨 liv J 유전자는 로이신/이소로이신/발린 전달 시스템(Leu/Ile/Val transporter system)을 코딩하는 유전자로 세포 외부의 분지쇄 아미노산을 세포내로 유입시키는 단백질을 코딩한다. 세포 내부의 아미노산 함량이 일정 수준에 도달하면 균주는 더 이상 최종산물을 생산하지 않을 것이며, 발린 생산량 증가를 기대하기가 어려울 가능성이 존재한다. 따라서 원가를 절감하여 제조비용을 낮추기 위해서 높은 발린 생산능을 지닌 균주를 개발하는 새로운 균주 개발 방법이 요구된다.

이하 본 발명과 관련된 특허문헌에 대해 개시하면 다음과 같다. 첫째, KR 2004-0089155이 존재하나, 이 발명은 liv J 유전자를 사용하지 않고, 생산 균주가 다르다는 점에서 본 발명과 차이가 있다. 둘째, KR 2007-0005268이 존재하나, 이 발명 또한 liv J 유전자를 사용하지 않는다는 점에서 본 발명과 다르다.

본 발명은 분지쇄 아미노산을 세포 내로 유입시키는 유전자인 liv J를 결손시켜 세포 외부에 존재하는 목적 산물이 세포 내로 유입 되는 것을 막아 발린 생산능을 향상시키고자 함을 목적으로 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 본 발명에서는 균주의 로이신/이소로이신/발린 전달 시스템(Leu/Ile/Val transporter system)을 불활성화 시킴으로써 발린(Valine) 생산능을 향상시키는 방법을 제공한다.

상세하게는, 상기 불활성화는 서열번호 1과 같은 liv J 를 코딩하는 뉴클레오타이드를 결실시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

바람직하게는, 상기 균주는 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균주인 것을 특징으로 할 수 있다.

한편 상기 에스케리치아 속 균주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헐마니(Escherichia hermannii) 및 에스케리치아 불네리스 (Escherichia vulnera) 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

본 발명을 통해 박테리아에서 liv J 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 불활성화시킴으로써 발린 생산능을 증가시킬 수 있는 유리한 효과를 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 균주를 이용하면 발린을 제조할 경우 원가 절감 효과를 기대할 수 있는바, 경제성 또한 인정된다고 할 것이다.

도 1은 liv J 유전자의 결실여부를 확인한 PCR 분석 결과를 보여주는 전기영동 겔 사진이다.

본 발명은 균주의 로이신/이소로이신/발린 전달 시스템(Leu/Ile/Val transporter system)을 불활성화 시킴으로써 발린(Valine) 생산능을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

상세하게는, 상기 불활성화는 서열번호 1과 같은 liv J 를 코딩하는 뉴클레오타이드를 결실시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 한편 본 발명의 다른 일면으로 liv J 를 코딩하는 뉴클레오타이드의 치환, 삽입이 수행될 수도 있다.

바람직하게는, 상기 균주는 에스케리치아(Escherichia sp.) 속 균주인 것을 특징으로 할 수 있다. 그러나 상기 균주가 에스케리치아 속 균주에 한정되는 것은 아니며, 코리네박테리움(Corynebacterium sp.) 속 균주에도 적용 가능하다.

더 바람직하게는 (i) 상기 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균주는 에스케리치아 속 균주인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 에스케리치아 속 균주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헐마니(Escherichia hermannii) 및 에스케리치아 불네리스 (Escherichia vulnera) 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 그리고 (ii) 상기 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis), 코리네박테리움 릴리움 (Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토필룸 (Corynebacterium acetophilum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 후지오켄세 (Corynebacterium fujiokense) 및 코리네박테리움 니트릴로필루스(Corynebacterium nitrilophilus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하에서 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의거하여 구체적으로 설명한다.

[실시예 1] liv J 유전자가 결실된 변이주 제조

liv J 유전자를 원스텝 불활성화 방법(one step inactivation; Warner et al., PNAS, 6:6650-6645(2000))에 의해 결손시키고, 항생제 내성 부여 표식 유전자를 제거하였다. 결손하고자 하는 liv J 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1과 같다.

로이신/이소로이신/발린 전달시스템(Leu/Ile/Val transporter system)을 코딩하는 유전자인 liv J 결실 균주를 제작하기 위해서 하기 표 1에서의 프라이머 쌍과 pKD13 플라스미드(GenBank 접근번호 AY048744)를 이용하여 PCR 반응(총 반응 부피는 50 ㎕, 94℃에서 1분 1사이클 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분 30초 총 30 사이클, 그 후 72℃에서 2분 및 10℃에서 5분)을 수행하였고, 그 결과 획득한 DNA 단편을 pKD46(GenBank No.AY048746)을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이 BSG25 세포에 일렉트로포레이션하였다(one step inactivation; Warner et al., PNAS, 6:6640(2000)).

이후 카나마이신 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 liv J 유전자의 결실여부를 확인하였다. PCR 반응 시 표 1의 liv J_CF 및 K 프라이머를 이용하여 앞서 기술한 PCR 반응 조건과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하였다. K 프라이머가 염색체내 삽입된 파쇄용 DNA에 작용하는 것이므로, 파쇄용 DNA가 삽입된 BSG25△liv J는 예상대로 1.1 kb 정도의 산물이 형성되었고, BSG25의 경우 파쇄용 DNA가 없으므로 PCR 반응이 일어나지 않아 산물이 형성되지 않았다(도 1 참조). liv J 유전자 결실이 확인된 균주를 이용하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하는 과정을 수행하였다. 그 과정으로는 liv J 유전자결실균주에 pCP20 플라스미드를 도입하여 FLP 재조합을 유도하였다. 이후 항생제 첨가 혹은 무첨가된 LB 평판에서 liv J 유전자 결실 균주를 배양하여 항생제 내성 표식 유전자가 제거된 것을 확인하였다.

프라이머	염기서열 (5’→3’)
livJ-F	ACAACATCACAACACACGTAATAACCAGAAGAATGGGGATTCTCAGGATGATTCCGGGGATCCGTCGACC
livJ-R	GGCGGCAACCCAAAGTTGCCGATTAATGATTACTTCGCATCGGTCGCCGTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
livJ-CF	CTGGCGTATCGTCAAAGT
K	CAGTCATAGCCGAATAGCCT

[실시예 2] 에스케리치아 콜라이 BSG25 균주와 liv J 유전자 결실 균주의 발린 생산량 평가

상기 실시예 1에서 얻어진 liv J 유전자 결실 균주의 발린 생산량을 확인하기 위하여 모균주인 에스케리치아 콜라이 BSG25와 liv J 유전자가 결실된 균주인 BSG25△livJ의 발린 생산량을 비교하였다. 상기 두 균주를 표 2의 배지 조성으로 구성된 5L 발효조에서 발린 생산량을 비교하였다.

성분	사입 배지 농도	추가 배지 농도
포도당	8 %	6.27 %
유안	0.2 %	0.875 %
제1인산 이수소칼륨	0.2 %	-
황산마그네슘	0.1 %	-
효모 페이스트	0.1 %	-
푸마르산	0.05 %	-
구연산 나트륨	0.025 %	-
티아민-HCl	10 ppm	-
황산철	10 ppm	-
황산망간	10 ppm	-
니코틴산	5 ppm	-
인산 75%	-	0.228 %
수산화나트륨	-	0.175 %

상기 배지 조건으로 사입 액량 2.0 L와 추가 액량 570 mL으로 수행하였고, 물리적인 배양 조건은 BSG25는 온도 35℃, 교반속도 500 rpm 및 통기량 1.0 vvm의 조건으로 배양하였다. 본 발명에서 얻어진 BSG25△livJ는 모균주와 같은 조건으로 배양하였다. 하기 표 3은 모균주 및 liv J 결실 균주의 발린 생성량 비교(5L J/F)에 관한 것이다.

균주명	배양시간 (hr)	발린 (%)	수율 (Yp/s)
BSG25	33	3.21	19.2
BSG25△livJ-43	30	5.21	28.3

표 3의 결과와 같이 BSG25△livJ 균주는 모균주에 비해 배양시간이 감소하였고 발린 생산이 증가하여 수율이 높아진 것으로 나타났다. BSG25와 BSG25△liv J 배양 결과의 발린 생산량을 비교하면 모균주 대비 BSG25△liv J 의 생산량이 3.21%에서 5.21%로, 본 발명에 의해 발린 생산량 3.21% 기준시 발린 생산량이 62.3% 증가한 것을 확인 할 수 있었다.

[실시예 3] 에스케리치아 콜라이 BSG25△liv J -43 유래 ygaZH 유전자 과발현 균주의 발린 생산량 평가

상기 실시예 2에서 얻어진 liv J 유전자 결실 균주에 발린 배출유전자인 ygaZH를 과발현 시켜 발린 생산량을 확인하기 위하여 에스케리치아 콜라이 BSG25△liv J -43와 ygaZH 유전자가 과발현된 균주인 BSG25△liv J /Ex의 발린 생산량을 비교하였다. 상기 두 균주를 상기 표 2의 배지 조성으로 구성된 5L 발효조에서 발린 생산량을 비교하였으며 상기 실시예 2와 같은 조건으로 배양하였다. 하기 표 4는 liv J 결실 균주 및 ygaZH 과발현 균주의 발린 생산량 비교 (5L J/F)에 관한 것이다.

균주명	배양시간 (hr)	발린 (%)	수율 (Yp/s)
BSG25△liv J -43	30	5.21	28.3
BSG25△liv J /Ex	32	5.40	29.3

상기 표 4의 결과와 같이 BSG25△liv J /Ex 균주는 BSG25△liv J -43에 비해 발린 생산이 증가하여 수율이 높아진 것으로 나타났다. BSG25△liv J -43와 BSG25△liv J /Ex 배양 결과의 발린 생산량을 비교하면 BSG25△liv J -43 대비 BSG25△liv J /Ex 의 생산량이 5.21%에서 5.40%로, 본 발명에 의해 발린 생산량 5.21% 기준시 발린 생산량이 3.6%, 모균주 대비 3.21%에서 5.40%로 68.2% 증가한 것을 확인 할 수 있었다.

이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.

<110> Daesang co. <120> The method of improving production of Valine by inactivating Leu/Ile/Val transporter system <130> 20111129 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1104 <212> DNA <213> liv J coding nucleotide <400> 1 atgaacataa agggtaaagc gttactggca ggatgtatcg cgctggcatt cagcaatatg 60 gctctggcag aagatattaa agtcgcggtc gtgggcgcaa tgtccggtcc ggttgcgcag 120 tacggtgacc aggagtttac cggcgcagag caggcggttg cggatatcaa cgctaaaggc 180 ggcattaaag gcaacaaact gcaaatcgta aaatatgacg atgcctgtga cccgaaacag 240 gcggttgcgg tggcgaacaa agtcgttaac gacggcatta aatatgtgat tggtcacctc 300 tgttcttcat caacgcagcc tgcgtctgac atctacgaag acgaaggcat tttaatgatc 360 accccagcgg caaccgcgcc ggagctgacc gcccgtggct atcagctgat cctgcgcacc 420 accggcctgg actccgacca ggggccgacg gcggcgaaat atattcttga gaaagtgaaa 480 ccgcagcgta ttgctatcgt tcacgacaaa cagcaatacg gcgaaggtct ggcgcgagcg 540 gtgcaggacg gcctgaagaa aggcaatgca aacgtggtgt tctttgatgg catcaccgcc 600 ggggaaaaag atttctcaac gctggtggcg cgtctgaaaa aagagaatat cgacttcgtt 660 tactacggcg gttatcaccc ggaaatgggg caaatcctgc gtcaggcacg cgcggcaggg 720 ctgaaaactc agtttatggg gccggaaggt gtggctaacg tttcgctgtc taacattgcg 780 ggcgaatcag cggaagggct gctggtgacc aagccgaaga actacgatca ggttccggcg 840 aacaaaccca ttgttgacgc gatcaaagcg aaaaaacagg acccaagtgg cgcattcgtt 900 tggaccacct acgccgcgct gcaatctttg caggcgggcc tgaatcagtc tgacgatccg 960 gctgaaatcg ccaaatacct gaaagcgaac tccgtggata ccgtaatggg accgctgacc 1020 tgggatgaga aaggcgatct gaaaggcttt gagttcggcg tatttgactg gcacgccaac 1080 ggcacggcga ccgatgcgaa gtaa 1104

Claims

균주의 로이신/이소로이신/발린 전달 시스템(Leu/Ile/Val transporter system)을 불활성화 시킴으로써 발린(Valine) 생산능을 향상시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 불활성화는 서열번호 1과 같은 liv J 를 코딩하는 뉴클레오타이드를 결실시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 발린 생산능을 향상시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 균주는 에스케리치아 속 균주인 것을 특징으로 하는 발린 생산능을 향상시키는 방법.
제3항에 있어서, 상기 에스케리치아 속 균주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헐마니(Escherichia hermannii) 및 에스케리치아 불네리스 (Escherichia vulnera) 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 발린 생산능을 향상시키는 방법.