KR101751968B1

KR101751968B1 - 박테리아 변이 균주의 발린 생산능의 증가 방법

Info

Publication number: KR101751968B1
Application number: KR1020140168946A
Authority: KR
Inventors: 김승엽; 박진완; 이선희; 오재영; 박동철
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2017-06-30
Also published as: KR20160065364A

Abstract

본 발명은 박테리아 균주의 발린(valine) 생산능의 증가 방법 및 발린 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주를 제공한다. 본 발명은 발린 생산능을 갖는 박테리아에서 alaE 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 불활성화시킴으로써 발린의 생산능은 증가시킴과 동시에 알라닌의 생산은 효과적으로 감소시킬 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 부산물인 알라닌의 배출유전자를 불활성화 시킴으로 인해서, 세포 내 축적되는 알라닌이 증가함으로 인해 알라닌의 생합성 경로가 약화되게 되고, 전구체인 피루브산(pyruvate)의 이용을 감소시켜 피루브산으로부터 시작되는 L-발린의 생합성 경로를 강화 시켜 박테리아 변이 균주의 발린 생산능이 증가된다. 또한, 본 발명은 박테리아에서의 부산물인 알라닌의 생산능을 감소시킴으로써 발린을 높은 순도로 정제할 수 있다.

Description

박테리아 변이 균주의 발린 생산능의 증가 방법{Method for Increasing of Valin Production Potential of Mutant Bacteria}

본 발명은 알라닌 배출 시스템(alanine exporter system)을 불활성화시키는 단계를 포함하는 박테리아 변이 균주의 발린(valine) 생산능의 증가 방법에 관한 것이다.

발린(Valine, 2-amino valeric acid)은 단백질을 구성하는 분자 아미노산으로 D-발린과, L-발린이 존재하며, 이소로이신(Isoleucine), 로이신(Leucine)과 함께 분지쇄 아미노산(BCAA, Branched Chain Amino Acid)으로 불리는 아미노산군의 일종으로 이들 이소로이신 및 로이신과의 순수한 분리가 어렵기 때문에 발효를 통한 산업적 생산에는 어려움이 있는 것으로 알려져 있다.

이러한 L-발린은 근육 세포의 단백질 합성작용을 직접적으로 촉진시키는 필수성분으로서 우리 몸이 스트레스를 받았을 때 생기는 일시적인 근육단백 파괴를 감소시켜 근육을 보존하여 근력 및 근지구력 향상 등의 효능(건강보조제, 의약품, 음료첨가용) 및 특수 목적의 사료 첨가물 등으로 사용되고 있다. 때문에 L-발린의 생산능을 향상시키는 것은 산업적으로 매우 중요하다.

L-발린 생산균주를 개발하기 위해 종래의 기술에서는 가장 일반적으로 돌연변이법을 이용한 균주 개발방법을 사용하였다. 이것은 중간대사산물 또는 최종산물에 대한 내성주 선별법으로 돌연변이 유도 후, 발린의 유사 구조체에 대한 내성을 가지는 변이주를 선별하는 방법이다. 그러나 이러한 돌연변이법은 균주에 원하지 않는 돌연변이도 수반할 수 있고, 변이로 인해 과생산된 산물들이 세포 내 축적 되면서 세포 생육이 저하되는 등의 결과를 가져올 수 있다.

돌연변이법이 아닌 방법으로는 일반적으로 과발현 벡터를 이용한 L-발린의 생합성 경로강화 및 이소로이신, 로이신등의 생합성 경로 불활성화 또는 약화, 배출유전자 강화(발린, 이소로이신, 로이신)를 통해 L-발린의 생산능을 향상시켰다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 특허등록 제10-1117022호

본 발명자들은 박테리아 균주를 이용하여 발린을 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 박테리아 균주의 알라닌 배출 시스템(alanine exporter system)을 불활성화시킴으로써 발린의 생산능이 증가될 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 박테리아 균주의 발린(valine) 생산능의 증가 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 발린 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 알라닌 배출 시스템(alanine exporter system)을 불활성화시키는 단계를 포함하는 박테리아 균주의 발린(valine) 생산능의 증가 방법을 제공한다.

본 발명자들은 박테리아 균주를 이용하여 발린을 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 박테리아 균주의 알라닌 배출 시스템(alanine exporter system)을 불활성화시킴으로써 발린의 생산능이 증가될 수 있음을 규명하였다.

본 발명은 부산물인 알라닌의 배출유전자를 불활성화 시킴으로 인해서, 세포 내 축적되는 알라닌이 증가함으로 인해 알라닌의 생합성 경로가 약화되게 되고, 전구체인 피루브산(pyruvate)의 이용을 감소시켜 피루브산으로부터 시작되는 L-발린의 생합성 경로를 강화 시켜 박테리아 변이 균주의 발린 생산능이 증가됨을 확인하였다.

본 발명의 방법에서 알라닌 배출 시스템(alanine exporter system)을 불활성화시키는 단계는 공지된 방법을 통하여 실시될 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 알라닌 배출 시스템을 불활성화시키는 단계는 CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

한편, 본 명세서에서 "박테리아 균주의 발린(valine) 생산능의 증가 방법"은 "발린(valine) 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주의 제조방법"과 혼용되어 사용될 수 있고, 발린(valine) 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주의 제조방법으로 이해되는 경우, 본 발명은 형질전환이 되지 않은 박테리아 균주로부터 형질전환된 박테리아 균주를 분리 및 수득하는 단계를 포함한다.

상기 본 발명에서 형질전환이 되지 않은 박테리아 균주로부터 형질전환된 박테리아 균주를 분리 및 수득하는 단계를 실시하는데 있어서 선택표지된 벡터를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 이용하는 벡터는 플라스미드 또는 파지(phage)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 이용하는 선택표지는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있고, 바람직하게는 비용의 측면을 고려하여 암피실린 또는 카나마이신 내성유전자가 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 균주는 alaE를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 알라닌 배출 시스템이 불활성 된다. 그리고 alaE를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이다.

본 발명의 방법은 박테리아 균주의 알라닌 배출 유전자인 alaE를 불활성화 시켜 발린의 생산량은 증가시킴과 동시에 부산물인 알라닌의 생산량을 획기적으로 감소시켰으며, 이는 알라닌 배출이 약화되어 전구체인 피루브산 이용이 감소하게 되어 이를 발린 생합성에 사용되는 것에 기인한 것으로서, 박테리아 및/또는 박테리아 배양액으로부터 발린을 분리 및 정제하는데 있어서 발린의 회수율 증가 및 발린의 분리 및 정제시 장애가 되는 알라닌의 생산을 효과적으로 감소시킨 방법이다.

본 발명의 명세서에서 “발린의 생산능의 증가”는 자연계로부터 이용할 수 있는 야생형 박테리아 균주로부터 생산되는 발린의 생산량보다 증가된 양을 의미한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 균주는 야생형 박테리아 균주와 비교하여 발린의 생산능이 증가된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 균주는 야생형 박테리아 균주와 비교하여 발린의 생산량이 5-30% 증가되고, 보다 바람직하게는 7-25%, 보다 더 바람직하게는 8-20% 증가된다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 균주는 알라닌 생산량 대비 발린 생산량의 증가비율이 40-500% 이고, 보다 바람직하게는 45-465%이다.

본 명세서에서 “알라닌 생산량 대비 발린 생산량의 증가비율”은 아래 수학식 1로 계산할 수 있다:

본 발명의 방법에 이용되는 균주는 자연계에 존재한 발린 생산능을 가지는 박테리아 균주라면 제한 없이 이용이 가능하다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서의 균주는 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균주이며, 보다 바람직하게는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헤르마니(Escherichia hermannii) 또는 에스케리치아 불네리스(Escherichia vulneris)이고, 보다 더 바람직하게는 에스케리치아 콜라이 또는 에스케리치아 블라태이며, 가장 바람직하게는 에스케리치아 콜라이이다.

본 발명에 이용되는 균주는 공지된 박테리아 균주의 배양방법을 통해 배양할 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다.

배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 불활성화 알라닌 배출 시스템(alanine exporter system)을 포함하는 발린(valine) 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주를 제공한다.

본 발명의 발린(valine) 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주는 상술한 본 발명의 발린(valine) 생산능의 증가 방법에 이용되는 균주이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 박테리아 균주의 발린(valine) 생산능의 증가 방법 및 발린 생산능이 증가된 박테리아 변이 균주를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 발린 생산능을 갖는 박테리아에서 alaE 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 불활성화시킴으로써 발린의 생산능은 증가시킴과 동시에 알라닌의 생산은 효과적으로 감소시킬 수 있다.

(ⅲ) 구체적으로, 본 발명은 부산물인 알라닌의 배출유전자를 불활성화 시킴으로 인해서, 세포 내 축적되는 알라닌이 증가함으로 인해 알라닌의 생합성 경로가 약화되게 되고, 전구체인 피루브산(pyruvate)의 이용을 감소시켜 피루브산으로부터 시작되는 L-발린의 생합성 경로를 강화 시켜 박테리아 변이 균주의 발린 생산능이 증가된다.

(ⅳ) 또한, 본 발명은 박테리아에서의 부산물인 알라닌의 생산능을 감소시킴으로써 발린을 높은 순도로 정제할 수 있다.

도 1은 alaE 유전자의 결실여부를 확인한 PCR 분석 결과를 보여주는 젤 사진이다.
도 2는 BSG25ΔalaE 균주가 모주인 BSG25 균주에 비해 L-발린 생산능이 증가함을 보여준다.
도 3은 WΔalaE 균주가 모균주인 E. coli W 균주에 비해 L-발린의 생산능이 증가함을 보여준다.
도 4는 모균주인 BSG25 및 alaE 결실 균주의 발린 생산량(능)을 5L 발효조에서 비교한 결과를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. alaE 유전자가 결손된 변이주 제조

alaE 유전자를 원스텝 불활성화방법 (One step inactivation; Warner et al., PNAS, 6:6650-6645(2000)에 의해서 결손시키고, 항생제(Kanamycine) 내성 부여 표식 유전자를 제거하였다. 결손하고자 하는 alaE 유전자의 뉴클레오타이트 서열은 서열번호 1과 같다.

알라닌 배출유전자를 코딩하는 유전자인 alaE 결실 균주를 제작하기 위해서 아래 표 1에서의 프라이머 쌍 ②와 E. coli wild-type 균주인 K-12의 genomic DNA 및 프라이머쌍 ① 및 ③과 pKD13 플라스미드(GenBank AY048744)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다(94℃ 5분/ 94℃ 30초-57℃ 30초-72℃ 1분30초 30사이클/72℃ 2분, 총 반응 50ul). 획득한 DNA 단편 3조각을 넣어 다시 PCR(94℃ 5분/ 94℃ 30초-68℃ 2분 30사이클/72℃ 2분, 총 반응 50ul)하여 연결된 DNA 단편(1711bp)을 얻었다.

획득한 DNA단편을 pKD46(GenBank No.AY048746)을 포함하고 있는 에스케리치아 콜라이 BSG25(K-12 CL588 유래) 세포 및 변이대장균 W 세포에 일렉트로포레이션 하였다.

이후 카나마이신 내성을 보이는 세포주를 대상으로 PCR 반응을 수행하여 alaE 유전자의 결실 여부를 확인하였다. 이때 프라이머는 아래 표 1의 alaE-CF/n2-in-F 프라이머쌍을 이용하였으며, 반응조건은 DNA단편을 얻을 때와 동일하다. n2-in-F 프라이머가 염색체내에 삽입된 DNA의 카나마이신 내성 유전자에 작용하는 것이므로, 도 1에서처럼 1178bp DNA 단편이 확인 됨을 통해 BSG25ΔalaE 및 WΔalaE를 확인하였다.

alaE 결실이 확인된 균주들을 이용하여 항생제 내성 표식 유전자를 제거하는 과정을 수행하였다.

alaE 유전자 결실주에 pCP20 플라스미드를 도입하여 FLP 재조합을 유도한 후, 항생제(카나마이신) 첨가 및 미첨가 LB 평판에서 생장 여부를 통해 항생제 제거 여부를 확인하였다. 항생제가 제거된 균주들은 LB평판에서 생장을 하나, 항생제(카나마이신)가 첨가된 LB 평판에서는 생장하지 못함을 확인 하였다.

프라이머		염기서열 (5' → 3')
①	alaE-HF1	GAGATCCACTGCTTTCATCT(서열목록 제2서열)
①	alaE-HR1	TGCAATTAAGATGTTCACCG(서열목록 제3서열)
②	FR-F (aE)	CGGTGAACATCTTAATTGCAgtgtaggctggagctgcttc(서열목록 제4서열)
②	FR-R (aE)	CAAGATCGCCACATACACCGctgtcaaacatgagaattaa(서열목록 제5서열)
③	alaE-HF2	CGGTGTATGTGGCGATCTTG(서열목록 제6서열)
③	alaE-HR2	ACCTGCTGGTAACGGCTGAC(서열목록 제7서열)
확인용	alaE-CF	CGCTTATAGCGTTACCTCAC(서열목록 제8서열)
확인용	n2-in-F	CATTCAGGGCACCGGACAGG(서열목록 제9서열)

실시예 2: E. coli BSG25 균주 및 E. coli W 균주와 alaE 유전자 결실 균주의 10 ml 플라스크에서 L-발린 생산능 비교

상기 실시예 1에서 얻어진 alaE 유전자 결실 균주의 발린 생산능을 확인하기 위하여 모균주인 E. coli BSG25와 E. coli W 및 alaE 유전자가 결실된 균주인 BSG25ΔalaE와 WΔalaE의 L-발린 생산능을 비교하였다. 상기 네 균주를 아래 표 2의 배지조성(pH 7.0)으로 구성된 10 ml 배지로 100 ml 플라스크에서 L-발린의 생산능을 비교하였다.

성분	함량
포도당	8.0%
효모추출물	0.2%
유안	2.0%
황산마그네슘	0.1%
제1인산 이수소칼륨	0.2%
황산철	10ppm
황산망간	10ppm
티아민-HCl	10ppm
탄산칼슘(별도 멸균)	3.0%

상기 배지조건으로 액량 10 ml로 수행하였으며, 물리적인 발효조건으로는 온도 35℃, 교반속도 160 rpm 이다.

아래 표 3 및 도 2의 결과와 같이 BSG25ΔalaE 균주는 모주인 BSG25 균주에 비해 L-발린 생산능이 12% 증가함을 확인할 수 있었다.

또한 변이주인 E. coli W 균주에서 alaE 유전자가 결실된 WΔalaE 균주의 경우에서도 모균주인 W 균주 대비 약 20%(0.4g/L → 0.48g/L) L-발린의 생산능이 증가함을 확인할 수 있었다(표 4, 도 3).

실시예 3: E. coli BSG25 균주와 alaE 유전자 결실 균주의 5 L 발효조에서 L-발린 생산능 비교

모균주인 E. coli BSG25 와 alaE가 결실된 균주인 BSG25ΔalaE의 5 L 발효조에서 생산능을 확인하였다.

탄소원 및 에너지원으로서 포도당을 포함하는 배지조성으로 사입 액량 2.0 L 및 추가 액량 798 ml으로 수행하였다. 물리적인 배양조건으로는 온도 37℃, pH 6.0, 교반속도 600 rpm 및 통기량 1.0 vvm의 조건으로 배양하였다.

하기 표 5 및 도 4는 모균주인 BSG25 및 alaE 결실균주의 발린 생산량(능)을 5L 발효조에서 비교한 결과이다.

BSG25ΔalaE 균주는 모균주 대비 L-발린 생산성이 8%(4.24% → 4.57%)향상되는 반면 부산물인 알라닌은 감소(0.089% → 0.017%)하는 결과를 확인할 수 있었다.

이들 실시예 들을 통해서 알라닌 배출 유전자인 alaE의 불활성화(결실)이 L-발린의 산업적 생산 시, 생기는 부산물인 알라닌을 줄일 뿐만 아니라 L-발린의 생산능 향상에 매우 효과적이라고 볼 수 있다.

이것은, L-발린 및 알라닌의 전구체인 피루브산의 이용이 알라닌 생합성 경로로의 이용이 감소함으로 인해 L-발린 생합성 경로 에서 보다 이용률이 높아지는데 기인한다

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> DAESANG Coporation <120> Method for Increasing of Valin Production Potential of Mutant Bacteria <130> PN140563 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 450 <212> DNA <213> Escherichia coli BSG25 alaE <400> 1 atgttctcac cgcagtcacg cttgcgtcat gcagttgcag atacgttcgc gatggttgtt 60 tactgttctg tcgtgaacat gtgtattgaa gttttcctct ccggaatgag cttcgaacag 120 tctttttatt ccagattggt agcgattccg gtgaacatct taattgcatg gccatacggt 180 atgtaccgtg atctgtttat gcgcgcggca cgcaaagtta gcccgtcggg ctggataaaa 240 aatctggcgg atatcctggc ttatgtgacg ttccagtcac cggtgtatgt ggcgatcttg 300 ttagtggtgg gcgcagactg gcatcagatt atggcggcgg tcagttcaaa catcgttgtt 360 tcgatgttga tgggggcggt ttatggctac ttcctcgatt attgccgccg actgtttaaa 420 gtcagccgtt accagcaggt aaaagcctga 450 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alaE-HF1 primer <400> 2 gagatccact gctttcatct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alaE-HR1 primer <400> 3 tgcaattaag atgttcaccg 20 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-F (aE) primer <400> 4 cggtgaacat cttaattgca gtgtaggctg gagctgcttc 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FR-R (aE) primer <400> 5 caagatcgcc acatacaccg ctgtcaaaca tgagaattaa 40 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alaE-HF2 primer <400> 6 cggtgtatgt ggcgatcttg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alaE-HR2 primer <400> 7 acctgctggt aacggctgac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alaE-CF primer <400> 8 cgcttatagc gttacctcac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> n2-in-F primer <400> 9 cattcagggc accggacagg 20

Claims

알라닌 배출 시스템(alanine exporter system)을 불활성화시키는 단계를 포함하는 박테리아 균주의 발린(valine) 생산능의 증가 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 alaE를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 알라닌 배출 시스템이 불활성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 야생형 박테리아 균주와 비교하여 발린의 생산능이 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 균주는 야생형 박테리아 균주와 비교하여 발린의 생산량이 5-30% 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 알라닌 생산량 대비 발린 생산량의 증가비율이 40-500%인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 에스케리치아 속 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 균주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헤르마니(Escherichia hermannii) 또는 에스케리치아 불네리스(Escherichia vulneris) 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
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