CN105026575A - 氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株用于重组产生多肽的用途 - Google Patents

氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株用于重组产生多肽的用途 Download PDF

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Abstract

本文报道的是用于在原核细胞中产生多肽的方法，其包括在化学成分明确的基础生长培养基中培养包含编码多肽的一种或多种核酸的原核细胞并从所述原核细胞或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽的步骤，其中所述原核细胞是氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞，其中所述氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞在相同的培养条件下和在相同的生长培养基中相比于未恢复的原核细胞需要向所述生长培养基中补充较少的氨基酸，并且其中所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。

Description

氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株用于重组产生多肽的用途
本发明是重组多肽产生的领域。本文更精确地报道了使用营养缺陷型恢复的原核菌株在化学成分明确的基础生长培养基中重组产生非糖基化多肽的方法。
发明背景
近年来，治疗性多肽的生产稳步增加并且很可能的是在不久的将来治疗性多肽将成为可用于治疗多种疾病的最大治疗组。治疗性多肽的影响来自其特异性，如特定的靶标识别和/或结合功能。
细胞培养用于发酵过程中以产生物质，特别是多肽。在其中细胞培养物未被遗传修饰并且形成其自身的代谢产物的过程与其中生物以它们产生更大量的其自身物质如多肽或产生外源物质的这种方式被遗传修饰的过程之间进行区分。利用保证生物存活并使得能够产生想要的靶标化合物的营养培养基供应产生物质的生物。许多培养基因使得能够最优培养特定宿主的这些目的而闻名。
化学成分明确的基础生长培养基在培养重组细胞中用于重组产生治疗性多肽中的使用是有利的。其使得能够为所产生的治疗性多肽容易地开发下游加工和纯化，由于最小化的原材料差异提供最稳健的生产过程并降低产品成本。
化学成分明确的基础生长培养基不包含游离氨基酸，并且其需要使用原养型的细胞系，其具有完整的代谢途径以从化学成分明确的基础生长培养基的可用成分产生所需的氨基酸。
例如，当大肠杆菌(E.coli)用作宿主细胞系时，一般使用野生型菌株，如MG1655、W3110或BL21。这些菌株显示良好的生长特性，但是较次等的产品效价。
当与野生型菌株相比时，通过非定点诱变和选择已获得的突变体原核菌株在其基因组DNA中显示明显差异。已经基于可以获得的最大产物效价选择了突变株。因为突变株携带许多营养缺陷型，所以它们不能用于在化学成分明确的基础生长培养基中培养。突变株需要氨基酸的补料以补偿其营养缺陷型，导致增加的培养成本。
US 5,932,439报道了大肠杆菌(Escherichia coli)K-12菌株用于产生重组蛋白质。
发明概述
通过恢复营养缺陷型原核菌株其一种或多种营养缺陷型，所述营养缺陷型恢复的菌株可以在化学成分明确的基础生长培养基上生长，其中不再需要向所述化学成分明确的基础生长培养基中加入对应于已经恢复的营养缺陷型的物质。在昂贵物质的情况下，可以实现产品成本的降低并且可以更经济地产生重组多肽。
除了在缺少对应于已经恢复的营养缺陷型的物质的情况下恢复在化学成分明确的基础生长培养基上生长的能力外，已经发现与未恢复的菌株相比，可以维持或甚至增加可获得的产物效价。此外已经发现使用营养缺陷型恢复的原核菌株可获得的产物效价高于利用对应的原养型野生型菌株可获得的产物效价。
不希望受该理论束缚，当与对应的原养型野生型菌株(其中未曾进行该缺失和恢复)相比时，假定本文报道的氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株具有不同的代谢和代谢流。因此，原核菌株内某些酶的失活和再激活对菌株的完整代谢具有可检测的/显著的影响，其例如可以在与对应的原养型野生型菌株相比该菌株的增加的生产力中看到。
本文报道的一个方面是氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株，其特征在于
-已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和
-菌株可以在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核菌株中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核菌株是营养缺陷型恢复的大肠杆菌菌株。
本文报道的一个方面是氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株，其特征在于
-已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和
-细胞可以在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核细胞是营养缺陷型恢复的大肠杆菌细胞。
本文报道的营养缺陷型恢复的原核菌株/细胞可以用于重组产生治疗性多肽的方法中，其中与非营养缺陷型恢复的原核菌株/细胞相比，不需要补充至少一种氨基酸残基。
本文报道的一个方面是用于在(重组)原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养(重组)原核细胞从原核细胞或原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽，所述(重组)原核细胞已经通过将恢复亲本原核细胞的氨基酸营养缺陷型的核酸引入到亲本原核细胞的基因组中而被获得，所述(重组)原核细胞包含编码多肽的一种或多种核酸。
本文报道的一个方面是用于在(重组)原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：
-恢复对至少一种氨基酸营养缺陷的原核细胞的至少一种氨基酸营养缺陷型，
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养氨基酸营养缺陷型恢复的(重组)原核细胞，，并从原核细胞或原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽，所述(重组)原核细胞包含编码多肽的一种或多种核酸。
本文报道的一个方面是用于在(重组)原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养(重组)原核细胞，其包含编码多肽的一种或多种核酸，并从原核细胞或原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽，
其中所述(重组)原核细胞是氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞。
在用于产生多肽的所有方法的一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核细胞具有至少一种其他(未恢复的)氨基酸营养缺陷型。该营养缺陷型可以用于在引入编码目的多肽(所述多肽)的一种或多种核酸后选择重组体/转化体。
在用于产生多肽的所有方法的一个实施方案中，相比于在相同培养条件下和相同生长培养基中未恢复的原核细胞(亲本细胞)，氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞的生长需要向生长培养基中补充较少的氨基酸。
在用于产生多肽的所有方法的一个实施方案中，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
在用于产生多肽的所有方法的一个实施方案中，相比于非营养缺陷型恢复的原核细胞(亲本/亲本细胞)的培养所需，营养缺陷型恢复的原核细胞的培养需要向生长培养基中补充较少的一种或两种或三种或四种氨基酸。
在用于产生多肽的所有方法的一个实施方案中，在培养过程中不添加对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
在用于产生多肽的所有方法的一个实施方案中，在缺少对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸的情况下进行培养。
在用于产生多肽的所有方法的一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。
在用于产生多肽的所有方法的一个实施方案中，多肽是全长抗体链、单链抗体、单结构域抗体、scFv、scFab、或上述之一与非抗体多肽的缀合物。
在用于产生多肽的所有方法的一个实施方案中，多肽是scFv或scFab与细胞毒性剂的缀合物。
本文报道的一个方面是氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株用于(重组)产生多肽的用途。
在一个实施方案中，
-在氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株中，已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和
-氨基酸营养缺陷型恢复的菌株可以在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核菌株中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核菌株是营养缺陷型恢复的大肠杆菌菌株。
在一个实施方案中，多肽是全长抗体链、单链抗体、单结构域抗体、scFv、scFab、或上述之一与非抗体多肽的缀合物。
在一个实施方案中，多肽是scFv或scFab与细胞毒性剂的缀合物。
在所有方面的一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核菌株是非溶源性菌株。溶源性菌株被暂时性噬菌体感染，即非溶源性菌株没有噬菌体。
在所有方面的一个实施方案中，恢复是定向恢复，其仅靶向氨基酸营养缺陷型。
在所有方面的一个实施方案中，恢复是引入合成营养缺陷型氨基酸所需的一种或多种酶。
在所有方面的一个实施方案中，原核菌株具有基因型thi-1、ΔompT、ΔpyrF。
发明详述
开发大规模重组多肽产生方法的一个目标是在培养过程中降低培养基组分的需求量，即消耗。尤其是降低昂贵的培养基组分，如氨基酸的消耗在产品成本方面是有利的。
已经通过恢复氨基酸营养缺陷型菌株其至少一种、一些或所有的氨基酸营养缺陷型完成了该目标，以避免补料昂贵的氨基酸，于是降低重组产生目的多肽的成本。此外，可以使用化学成分明确的培养基，其导致提高的方法稳定性并促进下游加工(DSP)。
因此，本文报道的是在化学成分明确的基础生长培养基中使用营养缺陷型恢复的原核菌株重组产生非糖基化多肽的方法。
已经发现通过恢复营养缺陷型原核菌株其一种或多种营养缺陷型，所述营养缺陷型恢复的菌株可以在化学成分明确的基础生长培养基中生长，不再需要向所述化学成分明确的基础生长培养基中添加对应于已经恢复的营养缺陷型的物质。在昂贵物质，如例如氨基酸的情况下，可以实现产品成本的降低并且可以更经济地产生重组多肽。
除了在缺少对应于已经恢复的营养缺陷型的物质的情况下恢复在化学成分明确的基础生长培养基上生长的能力外，已经发现可以维持或甚至增加可获得的产物效价。此外已经发现，使用营养缺陷型恢复的原核菌株的可获得产物效价高于利用对应的原养型野生型菌株可获得的产物效价。
本文报道的一个方面是用于在原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养原核细胞，并从所述原核细胞或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽，所述原核细胞已经通过将恢复亲本原核细胞的氨基酸营养缺陷型的核酸引入到亲本原核细胞的基因组内获得，其包含编码多肽的一种或多种核酸。
本文报道的一个方面是用于在原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：
-恢复对至少一种氨基酸营养缺陷的原核细胞的至少一种氨基酸营养缺陷型，
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞，并从所述原核细胞或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽，所述原核包含编码多肽的一种或多种核酸。
本文报道的一个方面是用于在(重组)原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养(重组)原核细胞，并从所述原核细胞或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽，所述(重组)原核细胞包含编码多肽的一种或多种核酸，
其中所述(重组)原核细胞是氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞，
其中相比于在相同培养条件下和相同生长培养基中未恢复的原核细胞(亲本细胞)，氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞的生长需要向生长培养基中补充较少的氨基酸，并且
其中所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
“氨基酸营养缺陷型原核细胞”是这样的原核细胞，其不能合成必需氨基酸，例如由于包含编码对应的生物合成途径的蛋白质的结构基因的基因座内的突变或缺失。不向培养基中添加各氨基酸，细胞则不增殖。营养缺陷型可以是对任何氨基酸的。原核细胞也可以是对多于一种氨基酸营养缺陷。因此，在一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是对至少两种氨基酸营养缺陷。在另一实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是对至少两种、至少三种、至少四种、至少五种氨基酸营养缺陷。在其他实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是对至少2种至高达5种、或高达10种、或高达15种氨基酸营养缺陷。在另一实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是对两种至五种氨基酸、或两种至三种氨基酸、或对两种氨基酸、或对三种氨基酸、或对四种氨基酸营养缺陷。在一个实施方案中，(氨基酸)营养缺陷型恢复的细胞具有至少一种氨基酸营养缺陷型、或至少两种氨基酸营养缺陷型、或至少三种氨基酸营养缺陷型、或一种至三种氨基酸营养缺陷型、或两种氨基酸营养缺陷型。
在一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是细菌细胞。
在一个实施方案中，细胞是大肠杆菌属(Escherichia)细胞，或芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，或乳杆菌属(Lactobacillus)细胞，或棒状杆菌属(Corynebacterium)细胞，或酵母细胞(酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)或毕赤酵母属(Pichia))。在其他实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞，或枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)细胞，或嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)细胞，或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)细胞，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)酵母细胞。
可以用于本文报道的方法中的原核细胞可以包含一种或多种氨基酸营养缺陷型。例如，在亮氨酸生物合成途径中缺陷的大肠杆菌细胞可以选自LeuB6缺陷的细胞13-6，
χ148，χ156，χ2224，χ462，χ463，χ474，χ478，χ515，χ65，χ697，χ760，2000kMSE248，342-167，342MG，679-680，A586，A592，A593，AA100，AA7852，AA787，AB1102，AB1111，AB1115，AB1122，AB1129，AB113，AB1132，AB1133，AB114，AB 1157，AB1157-D，AB1314，AB1330，AB1331，AB1881，AB1884，AB1885，AB188，CP78，CP79，CR34 Thy-，CR34 Thy-SR，CR34/308，CR34/313，CR34/399，CR34/43，CR34/454，CR34/500，CR34/7a，CS130，CS312，CS419，CS425，CS426，CS460，CS471，CS472，CS50，CS81，CS85，CSR06，CSR603，CSR603/pDR1996，CT28-3b，DA10，DA11，DB1161，DB1257，DE1878，DE1882，DE2345，DF225，DF41，JRG94，JS10 C600r-m-，T6R，P678SSR pro-，PA20SR，PA200 SR，PA201 SR，PA214SRT6R，PA265 SR，PA309，PDE70，PA340，PA340/T6，PA360，PA414，PAM161，PAM162，PAM163，PAM164，PAM660，PAT84，PB349，PB69，PC1，PC2，PC3，PC5，PC6，PC8，PJ1，PJ2，PJ3，PJ4，PJ5，PJ C600(＝CRSR)，W208 SR AzR，W2660，LAM-，W945his，WA2127，WA2379，WA2548，WA2552，WA2574，WA2899，WA921，WA946，WA960，Y10，Y46，Y53，Y70，YYC100。
在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌K12细胞或大肠杆菌B细胞。
术语“生长”指培养中活力细胞密度的改变。该改变可以是随时间的改变。可以通过测定578nm处的光密度来测定活力细胞密度。
在一个实施方案中，生长是时期内活力细胞密度的增加。在一个实施方案中，时期是接种后培养的0-30小时的时期。
术语“相同的”表示第二个值在第一个值的+/-20％之内。关于培养条件，术语“相同的”指培养时间、培养体积、培养温度、接种细胞密度、通气速率、pH值、搅拌器速度、补料速度(如果可应用)等。关于培养基，术语“相同的”表示第二种培养基相比于第一种培养基在至多5种组分上不同(不同＝存在或缺失)。
在一个实施方案中，相同的培养条件是同一的培养条件。在一个实施方案中,相同的培养基是同一的培养基。
用于培养原核细胞并也用于培养氨基酸营养缺陷型原核细胞的方法为本领域技术人员所知(参见例如Riesenberg,D.,等,Curr.Opin.Biotechnol.2(1991)380-384)。
可以利用任何方法进行培养。在一个实施方案中，培养是分批式培养、补料分批式培养、灌注培养、半连续培养、或具有完全或部分细胞截留(cellretention)的培养。
在一个实施方案中，培养是高细胞密度培养。术语“高细胞密度培养”表示这样的培养方法，其中培养的原核细胞的细胞干重在培养的一个点上是至少10g/L。在一个实施方案中，细胞干重在培养的一个点上是至少20g/L、或至少50g/L、或至少100g/L、或高于100g/L。为了达到这种高细胞密度状态，培养过程中添加的补料或/调整溶液的体积必须尽可能地小。例如在Riesenberg,D.,等,Appl.Microbiol.Biotechnol.34(1990)77-82中报道了用于测定细胞干重的方法。
所提供的培养基中的养分将在培养过程中被代谢，并且必须进行补充以避免受限。
从1号实验与2号实验的比较可以看出，在相同的培养条件下，利用营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6比利用其亲本菌株CSPZ-2可以实现更高的效价，即所述营养缺陷型恢复的菌株具有增加的生产率(体积生产率(volumetric productivity)，时空产率(time-space-yield))。
从2号实验与5号实验的比较可以看出，营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6不需要添加氨基酸脯氨酸和亮氨酸用于重组产生。可以在缺失脯氨酸和亮氨酸的情况下实现可比较的或甚至稍微增加的产物效价。
从5号实验与6号实验的比较可以看出，在相同的培养条件下，利用营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6比利用对应的野生型菌株(MG1655(ΔpyrF))可以实现更高的效价。
利用营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6可获得的产物效价也已经与利用另一对应的野生型菌株W3110(66C5＝W3110ΔpyrF)可获得的产物效价进行了比较。
从7号实验与8号实验的比较可以看出，在相同的培养条件下，利用营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6比利用对应的野生型菌株(W3110)可以实现更高的效价。
从7号实验与9号实验的比较可以看出，利用营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6比利用对应的野生型菌株(W3110)可以实现更高的效价，即使改进的培养条件(升高的温度)用于野生型菌株而不用于营养缺陷型恢复的菌株。
利用营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6可获得的产物效价也已经与利用另一对应的野生型菌株BL-21(CSPZ-14＝BL21ΔpyrF)可获得的产物效价进行了比较。
从10号实验与11号实验的比较可以看出，在相同的培养条件下，利用营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6比利用对应的野生型菌株(BL-21)可以实现更高的效价。
本文报道的一个方面是氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株，其特征在于
-已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，
-所述菌株可以在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核菌株中恢复的营养缺陷型的氨基酸，以及
-营养缺陷型恢复的菌株的生产率与亲本非营养缺陷型恢复的菌株以及与对应的野生型菌株(对应的基因型)的生产率相比有提高。
在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核菌株是营养缺陷型恢复的大肠杆菌菌株。
本文报道的一个方面是氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞，其特征在于
-已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和
-所述细胞可以在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核细胞是营养缺陷型恢复的大肠杆菌细胞。
本文报道的营养缺陷型恢复的原核菌株/细胞可以用于重组产生治疗性多肽的方法中，其中与非营养缺陷型恢复的菌株/细胞相比，不需要补充至少一种氨基酸残基。
本文报道的一个方面是用于在(重组)原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养(重组)原核细胞，所述(重组)原核细胞包含编码多肽的一种或多种核酸，并从所述原核细胞或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽，
其中所述(重组)原核细胞是氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞。
在一个实施方案中，相比于在相同培养条件下和相同生长培养基中未恢复的原核细胞(亲本细胞)，氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞的生长需要向生长培养基中补充较少的氨基酸。
在一个实施方案中，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
在一个实施方案中，相比于非营养缺陷型恢复的原核细胞(亲本细胞)的培养所需，营养缺陷型恢复的原核细胞的培养需要向生长培养基中补充较少的一种或两种或三种或四种氨基酸。
在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核细胞具有至少一种其他(未恢复的)氨基酸营养缺陷型。
在一个实施方案中，在培养过程中不添加对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
在一个实施方案中，在缺少对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸的情况下进行培养。
在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。
在一个实施方案中，多肽是全长抗体链、单链抗体、单结构域抗体、scFv、scFab、或上述之一与非抗体多肽的缀合物。
在一个实施方案中，多肽是scFv或scFab与细胞毒性剂的缀合物。
在一个实施方案中，培养接种后30小时时的活力细胞密度在营养缺陷型恢复的菌株的培养中比在未恢复的原核细胞的培养中高。
本文报道的一个方面是氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株用于(重组)产生多肽的用途。
在一个实施方案中，
-在氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株中，已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和
-氨基酸营养缺陷型恢复的菌株能够在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核菌株中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核菌株是营养缺陷型恢复的大肠杆菌菌株。
在一个实施方案中，多肽是全长抗体链、单链抗体、单结构域抗体、scFv、scFab、或上述之一与非抗体多肽的缀合物。
在一个实施方案中，多肽是scFv或scFab与细胞毒性剂的缀合物。
在一个实施方案中，用于在原核细胞中产生多肽的方法包括以下步骤：
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养原核细胞，其包含编码多肽的一种或多种核酸，并从所述原核细胞或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽，
其中所述原核细胞是氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞。
其中相比于在相同培养条件下和相同生长培养基中未恢复的原核细胞，氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞的生长需要向生长培养基中补充较少的氨基酸，并且
其中所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
具体实施方案
1.氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株，其特征在于
-已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和
-所述菌株可以在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核菌株中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
2.项目1的菌株，其特征在于所述营养缺陷型恢复的原核菌株是营养缺陷型恢复的大肠杆菌菌株。
3.氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞，其特征在于
-已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和
-所述细胞能够在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
4.项目3的菌株，其特征在于所述营养缺陷型恢复的原核细胞是营养缺陷型恢复的大肠杆菌细胞。
5.用于在(重组)原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养(重组)原核细胞，并从所述原核细胞或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽，所述(重组)原核细胞已经通过将恢复亲本原核细胞的氨基酸营养缺陷型的核酸引入到亲本原核细胞的基因组内获得，所述(重组)原核细胞包含编码多肽的一种或多种核酸。
6.用于在(重组)原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：
-恢复对至少一种氨基酸营养缺陷的原核细胞的至少一种氨基酸营养缺陷型，
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养氨基酸营养缺陷型恢复的(重组)原核细胞，所述(重组)原核细胞包含编码多肽的一种或多种核酸，并从所述原核细胞或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽。
7.用于在(重组)原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养(重组)原核细胞，并从所述原核细胞或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽，所述(重组)原核细胞包含编码多肽的一种或多种核酸，
其中所述(重组)原核细胞是氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞。
8.项目5-7任一项的方法，其特征在于所述营养缺陷型恢复的原核细胞具有至少一种其他(未恢复的)氨基酸营养缺陷型。
9.项目5-8任一项的方法，其特征在于相比于在相同培养条件下和相同生长培养基中未恢复的原核细胞(亲本细胞)，氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞的生长需要向生长培养基中补充较少的氨基酸。
10.项目5-9任一项的方法，其特征在于所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
11.项目5-10任一项的方法，其特征在于相比于非营养缺陷型恢复的原核细胞(亲本/亲本细胞)的培养所需，所述营养缺陷型恢复的原核细胞的培养需要向生长培养基中补充较少的一种或两种或三种或四种氨基酸。
12.项目5-11任一项的方法，其特征在于在培养过程中不添加对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
13.项目5-12任一项的方法，其特征在于在缺少对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸的情况下进行培养。
14.项目5-13任一项的方法，其特征在于所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
15.项目5-14任一项的方法，其特征在于多肽是全长抗体链、单链抗体、单结构域抗体、scFv、scFab、或上述之一与非抗体多肽的缀合物。
16.项目5-15任一项的方法，其特征在于所述多肽是scFv或scFab与细胞毒性剂的缀合物。
17.氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株用于(重组)产生多肽的用途。
18.项目17的用途，其特征在于
-在氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株中，已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和
-氨基酸营养缺陷型恢复的菌株能够在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核菌株中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
19.项目1-18任一项的菌株或方法或用途，其特征在于所述营养缺陷型恢复的原核菌株是营养缺陷型恢复的大肠杆菌菌株。
20.项目1-19任一项的菌株或方法或用途，其特征在于多肽是全长抗体链、单链抗体、单结构域抗体、scFv、scFab、或上述之一与非抗体多肽的缀合物。
21.项目1-20任一项的菌株或方法或用途，其特征在于所述多肽是scFv或scFab与细胞毒性剂的缀合物。
22.项目1-21任一项的菌株或方法或用途，其特征在于所述营养缺陷型恢复的原核菌株是非溶源性菌株。
23.项目1-22任一项的菌株或方法或用途，其特征在于所述恢复是定向恢复，其仅靶向氨基酸营养缺陷型。
24.项目1-23任一项的菌株或方法或用途，其特征在于所述恢复是引入合成营养缺陷型氨基酸所需的一种或多种酶。
25.项目1-24任一项的菌株或方法或用途，其特征在于所述原核菌株具有基因型thi-1、ΔompT、ΔpyrF。
提供以下实施例、序列和图，以帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求中给出。应理解，可以在所示方法中进行修改，但不背离本发明的精神。
序列表
SEQ ID NO:01人干扰素衍生的序列。
SEQ ID NO:02六-组氨酸亲和标签。
SEQ ID NO:03 IgA蛋白酶切割位点。
SEQ ID NO:04四连蛋白载脂蛋白A-I融合多肽氨基酸序列。
SEQ ID NO:05 IgA蛋白酶切割后获得的N末端延伸的四连蛋白载脂蛋白A-I融合多肽氨基酸序列。
SEQ ID NO:06没有亲和标签和IgA蛋白酶切割的四连蛋白载脂蛋白A-I融合多肽氨基酸序列(N末端缩短的融合多肽)。
附图描述
图1亲本菌株CSPZ-2(菱形)与营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6(三角形)的生长比较。
图2亲本菌株CSPZ-2(菱形)与营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6(三角形)的产物产量比较。
图3 A：L-亮氨酸浓度的趋势图(CSPZ-2:菱形；CSPZ-6:三角形)。
B：L-脯氨酸浓度的趋势图(CSPZ-2:菱形；CSPZ-6:三角形)。
图4营养缺陷型恢复的和野生型的菌株在具有和不具有氨基酸补充的培养基上的生长比较(在补充有L-亮氨酸和L-脯氨酸的CDM上的CSPZ-6：三角形；CDM上的CSPZ-6：正方形；CDM上的MG1655衍生菌株：“X”)。
图5营养缺陷型恢复的和野生型的菌株在具有和不具有氨基酸补充的培养基上的产物产量比较(在补充有L-亮氨酸和L-脯氨酸的CDM上的CSPZ-6：三角形；CDM上的CSPZ-6：正方形；CDM上的MG1655衍生菌株：“X”)。
图6营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6(菱形)和野生型菌株66C5(正方形)在不具有氨基酸补充的培养基上的生长比较。
图7营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6(菱形，正常温度)、野生型菌株66C5(正方形，正常温度)，和升高温度下的野生型菌株66C5(三角形)在不具有氨基酸补充的培养基上的生长比较。
图8营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6(菱形)和野生型菌株66C5(正方形)在不具有氨基酸补充的培养基上的产物产量比较。
图9营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6(菱形，正常温度)、野生型菌株66C5(正方形，正常温度)，和升高温度下的野生型菌株66C5(三角形)在不具有氨基酸补充的培养基上的产物产量比较。
图10营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6(菱形)和野生型菌株BL21在不具有氨基酸补充的培养基上的生长比较。
图11营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6(菱形)和野生型菌株BL21(正方形)在不具有氨基酸补充的培养基上的产物产量比较。
图12营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6(菱形)和野生型菌株MG1655衍生物(三角形)的生长比较。
图13营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6(菱形)和野生型菌株MG1655衍生物(三角形)的产物产量比较。
实施例
材料和方法
重组DNA技术：
如Sambrook,J.,等,Molecular cloning:A laboratory manual；ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述，标准方法用于操作DNA。根据生产商的说明书来使用分子生物学试剂。
实施例1
营养缺陷型的恢复
大肠杆菌K12菌株CSPZ-2(leuB、proC、trpE、thi-1、ΔpyrF)恢复其基因leuB、proC、proBA和trpE中的基因缺陷。这通过使用定向遗传改造大肠杆菌染色体基因的方法来完成(Gene Bridges,Heidelberg,Germany；http://www.genebridges.com；参见例如WO 99/29837, WO 01/04288,US 6,355,412)。详细地，进行以下逐步改变：
leuB基因座的修复：
大肠杆菌CSPZ-2在基因座leuB中具有TCG至TTG的点突变，其导致在相应的3-异丙基苹果酸脱氢酶中的位置286上丝氨酸交换成亮氨酸氨基酸，致使该酶缺失。所述菌株因而不能够在没有补充L-亮氨酸的培养培养基上生长。利用编码野生型Ser286的具有侧翼序列的寡核苷酸，交换菌株CSPZ-2中的基因组突变以产生恢复菌株CSPZ-3(CSPZ-2leuB+)，其可以在补充有L-脯氨酸但不需要L-亮氨酸的M9培养基平板上生长。
proC(b0386)和proBA(b0242和b0243)基因座的修复：
菌株CSPZ-3仍然需要补充脯氨酸以在M9基础培养基上生长。PCR扩增proC基因座产生大概2.4kb的片段。对于大肠杆菌K12(野生型菌株)，预期1,024bp的片段(Blattner,F.R.,等,Science 277(1997)1453-1474)。对PCR产物测序揭示通过IS186(1,335bp)转位到基因组内破坏了proC基因座。通过PCR表征proBA基因座，但是扩增没有表明proBA操纵子的缺失。
从大肠杆菌菌株MG1655基因组DNA扩增的PCR产物用于Red/ET重组以恢复proC基因座中的缺陷。
在连续步骤中，通过Red/ET重组将proBA操纵子插入到基因组的infA-serW基因间区，以恢复CSPZ-4中的原养型表型。通过PCR扩增并测序整合位点并通过在M9基础培养基琼脂平板上平板培养来验证整合。脯氨酸原养型的营养缺陷型恢复的菌株被命名为CSPZ-5。
trpE(b1264)基因座的修复：
亲本菌株CSPZ-2的trpE基因座的DNA测序揭示了9个核苷酸的缺失，导致Glu139、Glu 140和Arg141的丢失。该突变不导致色氨酸营养缺陷表型，但是可能影响酶活性并导致生长变慢。因而，突变的trpE基因座通过Red/ET重组被野生型基因座交换。通过测序验证trpE基因的成功恢复并将所得菌株命名为CSPZ-6。
实施例2
制备表达质粒
四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽
通过重组手段制备四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽。所表达的融合多肽的氨基酸序列以N至C末端方向如下：
-氨基酸甲硫氨酸(M)，
-具有氨基酸序列CDLPQTHSL(SEQ ID NO:01)的干扰素序列的片段，
-GS接头，
-具有氨基酸序列HHHHHH(SEQ ID NO:02)的六组氨酸标签，
-GS接头，
-具有氨基酸序列VVAPPAP(SEQ ID NO:03)的IgA蛋白酶切割位点，和
-具有氨基酸序列SEQ ID NO:04的四连蛋白-载脂蛋白A-I。
如上所述四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽是前体多肽，通过使用IgA蛋白酶体外酶促切割从所述前体多肽释放四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽。
利用已知的重组方法和技术，通过连接适当的核酸区段装配编码前体多肽的融合基因。通过DNA测序验证通过化学合成制备的核酸序列。如下制备用于产生四连蛋白-载脂蛋白A-I的表达质粒。
制备大肠杆菌表达质粒
a)质粒5816
质粒4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)是用于在大肠杆菌中表达核心-链霉抗生物素的表达质粒。其通过连接来自质粒1966(1966-pBRori-URA3-LACI-T-重复；在EP-B 1 422 237中有报道)的3142 bp长EcoRI/CelII-载体片段与435bp长编码核心-链霉抗生物素的EcoRI/CelII-片段产生。
核心-链霉抗生物素大肠杆菌表达质粒包含以下元件：
-来自载体pBR322用于在大肠杆菌中复制的复制起始区(根据Sutcliffe,G.,等,Quant.Biol.43(1979)77-90，对应于bp位置2517-3160)，
-酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)编码乳清苷5’-磷酸脱酸酶的URA3基因(Rose,M.等Gene 29(1984)113-124)，所述乳清苷5’-磷酸脱酸酶允许通过补偿大肠杆菌pyrF突变株(尿嘧啶营养缺陷型)进行质粒选择，
-核心-链霉抗生物素表达盒，其包含
-T5杂合启动子(根据Bujard,H.,等,Methods Enzymol.155(1987)416-433和Stueber,D.,等,Immunol.Methods IV(1990)121-152的T5-PN25/03/04杂合启动子)，包括Stueber,D.,等的合成核糖体结合位点(参见上文)，
-核心-链霉抗生物素基因，
-两个细菌噬菌体来源的转录终止子，λ-T0终止子(Schwarz,E.,等,Nature 272(1978)410-414)和fd-终止子(Beck E.和Zink,B.Gene 1-3(1981)35-58)，
-来自大肠杆菌的lacI阻遏基因(Farabaugh P.J.Nature 274(1978)765-769)。
通过使用单一的侧翼EcoRI和CelII限制性核酸内切酶切割位点从质粒4980切除核心-链霉抗生物素结构基因并将编码前体多肽的核酸侧翼的EcoRI/CelII限制性位点插入到3142bp长EcoRI/CelII-4980载体片段中来制备用于表达四连蛋白-载脂蛋白A-I前体多肽的最终表达质粒5816。
b)质粒5830
质粒5830与质粒5816相同，除了编码三肽QKK的密码子从caa aaaaag(质粒5816)变成了cag aag aag(质粒5830)。
c)质粒5836
利用已知的重组方法和技术，通过连接适当的核酸区段装配用于表达缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的编码融合基因。通过DNA测序验证通过化学合成制备的核酸序列。可以如下制备用于产生SEQ ID NO:06的融合蛋白的表达质粒：
质粒4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)是用于在大肠杆菌中表达核心-链霉抗生物素的表达质粒。其通过连接来自质粒1966(1966-pBRori-URA3-LACI-T-重复；在EP-B 1 422 237中有报道)的3142 bp长EcoRI/CelII-载体片段与435bp长编码核心-链霉抗生物素的EcoRI/CelII-片段产生。
核心-链霉抗生物素大肠杆菌表达质粒包含以下元件：
-来自载体pBR322用于在大肠杆菌中复制的复制起始区(根据Sutcliffe,G.,等,Quant.Biol.43(1979)77-90，对应于bp位置2517-3160)，
-酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)编码乳清苷5’-磷酸脱酸酶的URA3基因(Rose,M.等Gene 29(1984)113-124)，所述乳清苷5’-磷酸脱酸酶允许通过补偿大肠杆菌△pyrF突变株(尿嘧啶营养缺陷型)进行质粒选择，
-核心-链霉抗生物素表达盒，其包含
-T5杂合启动子(根据Bujard,H.,等,Methods Enzymol.155(1987)416-433和Stueber,D.,等,Immunol.Methods IV(1990)121-152的T5-PN25/03/04杂合启动子)，包括Stueber,D.,等的合成核糖体结合位点(参见上文)，
-核心-链霉抗生物素基因，
-两个细菌噬菌体来源的转录终止子，λ-T0终止子(Schwarz,E.,等,Nature 272(1978)410-414)和fd-终止子(Beck E.和Zink,B.Gene 1-3(1981)35-58)，
-来自大肠杆菌的lacI阻遏基因(Farabaugh P.J.Nature 274(1978)765-769)。
通过使用单一的侧翼EcoRI和CelII限制性核酸内切酶切割位点从质粒4980切除核心-链霉抗生物素结构基因并将编码融合蛋白的核酸侧翼的EcoRI/CelII限制性位点插入到3142bp长EcoRI/CelII-1质粒片段中来制备用于表达缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白质的最终表达质粒5836。
d)质粒3036
用于重组产生IgA-蛋白酶的表达质粒3036基于载体OripBR-URA3-EK-IFN(参见例如US 6,291,245)。质粒3036因存在lacI阻遏基因和编码IgA蛋白酶蛋白的靶标基因不同于OripBR-URA3-EK-IFN。lacI阻遏基因来源于质粒pUHA1(Stueber,D.,等,Immunological Methods IV(1990)121-152)。其根据Mullis,K.B.和Faloona,F.A.(Methods Enzymology 155(1987)335-350)描述的方法通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，并克隆至质粒3036前体中。通过PCR产生编码来自淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)的IgA-蛋白酶蛋白的靶标基因并克隆至表达载体中。
IgA-蛋白酶表达质粒3036包含以下元件：
-来自载体pBR322用于在大肠杆菌中复制的复制起始区(根据Sutcliffe,G.,等,Quant.Biol.43(1979)77-90，对应于bp位置2517-3160)，
-酿酒酵母编码乳清苷5’-磷酸脱酸酶的URA3基因(Rose,M.,等,Gene 29(1984)113-124)，所述乳清苷5’-磷酸脱酸酶允许通过补偿大肠杆菌ΔpyrF突变株(尿嘧啶营养缺陷型)进行质粒选择，
-IgA-蛋白酶表达盒，其包含
-T5杂合启动子(Bujard,H.,等,Methods.Enzymol.155(1987)416-433和Stueber,D.,等,Immunol.Methods IV(1990)121-152的T5-PN25/03/04杂合启动子)，包括Stueber,D.,等的合成核糖体结合位点(参见上文)，
-IgA-蛋白酶的可读框(淋病奈瑟氏菌，GenBank登录号P09790),
-两个细菌噬菌体来源的转录终止子，λ-T0终止子(Schwarz,E.,等,Nature 272(1978)410-414)和fd-终止子(Beck,E.和Zink,B.,Gene 1-3(1981)35-58)，
-来自大肠杆菌的lacI阻遏基因(Farabaugh,P.J.,Nature 274(1978)765-769)。
实施例3
通过在已经补充有营养缺陷型互补氨基酸亮氨酸和脯氨酸的化学成分明确的基础生长培养基上进行培养来表达融合多肽
为了表达如WO 2012/028526中报道的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白，使用通过互补大肠杆菌营养缺陷型(pyrF)使得能够进行无抗生素质粒选择的大肠杆菌宿主/载体系统(参见EP 0 972 838和US 6,291,245)。
通过利用表达质粒5816电穿孔转化大肠杆菌K12菌株CSPZ-2(leuB、proC、trpE、thi-1、△pyrF)和CSPZ-6(thi-1、△pyrF)(参见实施例2)。转化的大肠杆菌细胞首先在琼脂平板上于37℃下生长。将从该平板上挑取的集落转移到3mL滚筒培养中并在37℃下生长至1-2的光密度(在578nm下测量)。然后将1000μL培养物与1000μL无菌86％-甘油混合并立即冰冻于-80℃长期储存。
首先在小规模摇瓶实验中验证该克隆的正确产物表达并在转移到10L发酵罐中之前利用SDS-Page进行分析。
预先培养：
为了预先培养，已经使用了化学成分明确的培养基(CDM)：
NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、柠檬酸1.6g/L、甘氨酸0.78g/L、L-丙氨酸0.29g/L、L-精氨酸0.41g/L、L-天冬酰胺*H2O 0.37g/L、L-天冬氨酸0.05g/L、L-半胱氨酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-组氨酸0.05g/L、L-异亮氨酸0.31g/L、L-亮氨酸0.38g/L、L-赖氨酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫氨酸0.27g/L、L-苯丙氨酸0.43g/L、L-脯氨酸0.36g/L、L-丝氨酸0.15g/L、L-苏氨酸0.40g/L、L-色氨酸0.07g/L、L-缬氨酸0.33g/L、L-酪氨酸0.51g/L、L-谷氨酰胺0.12g/L、Na-L-谷氨酸*H2O 0.82g/L,葡萄糖*H2O 5.0g/L,痕量元素溶液5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、硫胺素*HCL 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有MnSO4*H2O 1.28g/l、ZnSO4*7H2O 1.70g/L、H3BO3 0.30g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.18g/L、CoC12*6H2O 0.25g/L、CuSO4*5H2O 0.22g/L、EDTA 0.75g/L。
为了预先培养，利用0.9mL初级种子库安瓿接种具有四个隔板的1000mL锥形瓶中的300ml CDM。在旋转振荡器上于37℃和170rpm下进行培养9小时直至获得7-13的光密度(578nm)。然后将100g的该预先培养物转移到10L生物反应器中以接种分批培养基。
利用氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸的发酵(1号实验和2号实验)：
为了在10L Biostat C,DCU3发酵罐(Sartorius,Melsungen,Germany)中发酵，使用以下分批培养基：KH2PO4 4.73g/L、(NH4)2HPO4 7.47g/L、K2HPO4*3H2O 14.94g/L、柠檬酸2.07g/l、L-甲硫氨酸1.22g/L、L-脯氨酸4.08g/L、L-亮氨酸2.57g/L、柠檬酸铁铵0.08g/L、NaHCO3 0.82g/L、痕量元素溶液7.3mL/L、MgSO4*7H2O 1.42g/L、硫胺素*HC1 20.9mg/L、葡萄糖*H2O 29.3g/L、生物素0.2mg/L、1.2mL/L Synperonic 10％消泡剂。
痕量元素溶液含有在1N HCl溶液中溶解的FeSO4*7H2O 10g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L、CoC12*6H2O 0.42g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、H3BO3 0.50g/L、硫胺素-HCL 2.0g/L。
补料1溶液含有700g/L葡萄糖*H2O、KH2PO4 8.43g/L和K2HPO4*3H2O 22.38g/L。
补料2包含585g/L L-脯氨酸和150.3g/L MgSO4*7H2O。
所有组分均溶解在去离子水中。
用于pH调节的碱溶液是补充有11.25g/L L-甲硫氨酸、51.5g/L L-脯氨酸和56.25g/L L-亮氨酸的12.5％(w/v)NH3水溶液(参见WO 2012/028522)。
以4.2L无菌分批培养基加来自预先培养的100mL接种物开始，在37℃,pH 6.9±0.2,800mbar回压下和10L/分钟的初始通气速率下进行分批发酵。通过增加搅拌器速率高达1500rpm在发酵过程中将溶解氧(pO2)的相对值保持在50％。在初始补充的葡萄糖耗尽(溶解氧值的陡然增加所示)后，温度转变成25℃并且15分钟后，发酵进入以两种补料(分别为50和13g/h)开始的补料分批模式。补料2的速率保持恒定，而补料1的速率以预先定义的补料模式在8.5小时内逐步从50增加至最后的160g/h。当二氧化碳废气浓度水平高于2％时，通气速率在5小时内从10恒定地增加至20L/分钟。通过加入2.4g IPTG，在150的光密度下诱导重组四连蛋白-载脂蛋白A-1融合蛋白的表达。
发酵结束时，在细胞质内，利用加热步骤(其中发酵罐中的全部培养液在收集前被加热至50℃，1小时)将可溶性表达的四连蛋白-载脂蛋白A-1融合蛋白转移到不溶性蛋白聚集体(所谓的包涵体)中(参见例如EP-B1 486 571)。然后，利用flow-through离心机(13,000rpm,13L/h)将发酵罐的内含物离心并将收集的生物量储存在-20℃直至进一步的加工。在不溶性蛋白聚集体(所谓的包涵体，IB)形式的不溶性细胞碎片部分中唯一地发现了合成的四连蛋白-载脂蛋白A-1融合蛋白。
产物形成的分析：
利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从发酵罐中抽取的样品，一份在诱导蛋白表达之前，另一份在诱导蛋白表达之后的专门时间点上。将来自每份样品的相同量的细胞(ODtarget＝5)重悬浮于5mL PBS缓冲液中并通过在冰上超声进行破碎。然后离心100μL各悬浮液(15,000rpm,5分钟)，取出各上清液并转移到单独的管中。这区分可溶性和不可溶性表达的靶蛋白。向各上清液(＝可溶性)部分中加入300μL SDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)和向各沉淀(＝不可溶性)部分中加入400μLSDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)。在强力混合下于95℃加热样品15分钟来溶解并还原样品中的所有蛋白。冷却至室温后，将5μL各样品转移到4-20％TGX Criterion Stain Free聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)中。此外，将5μL分子量标准物(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)和具有已知产物蛋白浓度(0.1μg/μL)的3份量(0.3μL、0.6μL和0.9μL)定量标准物定位在凝胶上。
电泳在200V下运行60分钟，然后将凝胶转移到GelDOC EZ Imager(Bio-Rad)上并利用UV辐射处理5分钟。使用Image Lab分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。利用三个标准，计算具有>0.99系数的线性回归曲线并因此计算原始样品中靶蛋白的浓度。
在八天放射性流出测定中测量了纯化的和脂化的TN-ApoA1的活性。通过PMA(咐拜十四烷酯(phorbol myristate acetate))区分细胞(THP-1)与巨噬细胞。利用乙酰化的LDL和3H-标记的胆固醇装载这些细胞。丢弃上清液并将细胞与平衡培养基温育5小时，以去除非特异性结合的胆固醇。加入脂化的TN-ApoA1，其使得能够将3H-标记的胆固醇在接下来的18小时内输出到细胞外。在上清液和细胞裂解物中测量放射性。
结果：
上文提及的发酵过程用于在对L-亮氨酸和L-脯氨酸营养缺陷的亲本菌株CSPZ-2中和在营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6中表达四连蛋白-载脂蛋白A-1。尽管后者菌株不再需要补料氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸，利用补充的发酵培养基测试该营养缺陷型恢复的菌株的性能用于与CSPZ-2进行直接性能比较。
尽管使用相同的培养基和发酵过程，但是营养缺陷型恢复的菌株比亲本菌株生长得更快(参见图1)。
尽管使用相同的培养基和发酵过程，但是营养缺陷型恢复的菌株比亲本菌株更快地表达更多的产物(参见图2)。
如从氨基酸亮氨酸和脯氨酸的浓度趋势(参见图3A和B)可以看出，营养缺陷型恢复的菌株由于完整的代谢途径现在能代谢L-亮氨酸和L-脯氨酸。因而，营养缺陷型恢复的菌株的生长在所应用的补料分批过程的葡萄糖受限培养条件下更快。
令人惊讶地，营养缺陷型恢复的菌株在相同的补充有氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸的化学成分明确的发酵培养基上比亲本菌株具有显著更好的性能。由于可以代谢所含氨基酸的可能性，该生长被加速，并且这也提高了产物形成。来自于此的结论是使用原养型大肠杆菌生产菌株。
实施例4
通过在已经补充有营养缺陷型互补氨基酸亮氨酸和脯氨酸的化学成分明确的基础生长培养基上进行培养来表达IgA蛋白酶
为了表达IgA-蛋白酶(106kDa)，使用通过互补大肠杆菌营养缺陷型(PyrF)使得能够进行无抗生素质粒选择的大肠杆菌宿主/载体系统(参见EP 0 972 838和US 6,291,245)。
通过利用表达质粒3036电穿孔转化大肠杆菌K12菌株CSPZ-2(leuB、proC、trpE、thi-1、△pyrF)和CSPZ-6(thi-1、△pyrF)。转化的大肠杆菌细胞首先在琼脂平板上于37℃下生长。将从该平板上挑取的集落转移到3mL滚筒培养中并在37℃下生长至1-2的光密度(在578nm下测量)。然后将1000μL培养物与1000μL无菌86％-甘油混合并立即冰冻于-80℃长期储存。首先在小规模摇瓶实验中验证该克隆的正确产物表达并在转移到10L发酵罐中之前利用SDS-Page进行分析。
预先培养：
为了预先培养，已经使用了化学成分明确的培养基(CDM)：
NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、柠檬酸1.6g/L、甘氨酸0.78g/L、L-丙氨酸0.29g/L、L-精氨酸0.41g/L、L-天冬酰胺*H2O 0.37g/L、L-天冬氨酸0.05g/L、L-半胱氨酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-组氨酸0.05g/L、L-异亮氨酸0.31g/L、L-亮氨酸0.38g/L、L-赖氨酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫氨酸0.27g/L、L-苯丙氨酸0.43g/L、L-脯氨酸0.36g/L、L-丝氨酸0.15g/L、L-苏氨酸0.40g/L、L-色氨酸0.07g/L、L-缬氨酸0.33g/L、L-酪氨酸0.51g/L、L-谷氨酰胺0.12g/L、Na-L-谷氨酸*H2O 0.82g/L,葡萄糖*H2O 6.0g/L,痕量元素溶液0.5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、硫胺素*HCl 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有在0.5M HCl中溶解的FeSO4*7H2O 10.0g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、H3BO3 0.50g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、CuSO4*5H2O1.0g/L。
为了预先培养，利用1.0mL初级种子库安瓿接种具有四个隔板的1000mL锥形瓶中的220ml CDM。在旋转振荡器上于37℃和170rpm下进行培养9小时直至获得11-13的光密度(578nm)。利用Vinoc.＝100mL*5/ODPC计算接种物体积并且其取决于预先培养物的光密度以接种具有等量细胞的10L生物反应器的分批培养基。
利用氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸的发酵(3号实验和4号实验)：
为了在10L Biostat C,DCU3发酵罐(Sartorius,Melsungen,Germany)中发酵，进行与实施例3中所述相同的方法，除了在发酵结束时不进行加热步骤。
产物形成的分析：
利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从发酵罐中抽取的样品，一份在诱导蛋白表达之前，另一份在诱导蛋白表达之后的专门时间点上。将来自每份样品的相同量的细胞(ODtarget＝10)重悬浮于5mL PBS缓冲液中并通过在冰上超声进行破碎。然后离心100μL各悬浮液(15,000rpm,5分钟)，取出各上清液并转移到单独的管中。这区分可溶性和不可溶性表达的靶蛋白。向各上清液(＝可溶性)部分中加入100μL SDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)和向各沉淀(＝不可溶性)部分中加入200μLSDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)。在强力混合下于95℃加热样品15分钟来溶解并还原样品中的所有蛋白。冷却至室温后，将5μL各样品转移到4-20％TGX Criterion Stain Free聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)中。此外，将5μL分子量标准物(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)和具有已知产物蛋白浓度(0.1μg/μL)的3份量(0.3μL、0.6μL和0.9μL)定量标准物定位在凝胶上。
电泳在200V下运行60分钟，然后将凝胶转移到GelDOC EZ Imager(Bio-Rad)上并利用UV辐射处理5分钟。使用Image Lab分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。利用三个标准，计算具有>0.99系数的线性回归曲线并因此计算原始样品中靶蛋白的浓度。
结果：
上文提及的发酵过程用于在对L-亮氨酸和L-脯氨酸营养缺陷的亲本菌株CSPZ-2中和在营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6中表达IgA蛋白酶。尽管后者菌株不再需要补料氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸，已经在补充的发酵培养基上测试了该营养缺陷型恢复的菌株的性能用于与亲本菌株CSPZ-2进行直接性能比较。
营养缺陷型恢复的菌株在氨基酸补充的分批培养基上的生长相比于亲本菌株显著更快。
实施例5
在化学成分明确的基础培养基上培养营养缺陷型恢复的大肠杆菌菌株和野生型菌株MG1655
营养缺陷型恢复的菌株的一个明显益处是由于原养型表型，不需要在培养的过程中在化学成分明确的培养基上补料更多的昂贵氨基酸。这会显著地降低了用于方法的产品成本。为了测试，进行利用营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6的相同发酵，其中从培养基和补料中简单地排除氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸。为了证明营养缺陷型恢复的菌株比同样原养型的野生型大肠杆菌菌株具有显著的优势，探究了相同发酵过程中K12菌株MG1655(pyrF基因缺失以适合无抗生素选择系统)的生长和产物形成。
通过利用表达质粒5816电穿孔转化大肠杆菌K12菌株CSPZ-6(thi-1、ΔpyrF)和MG1655衍生物(ΔpyrF、ΔompT)(参见实施例2)。转化的大肠杆菌细胞首先在琼脂平板上于37℃下生长。将从该平板上挑取的集落转移到3mL滚筒培养中并在37℃下生长至1-2的光密度(在578nm下测量)。然后将1000μL培养物与1000μL无菌86％-甘油混合并立即冰冻于-80℃长期储存。
首先在小规模摇瓶实验中验证该克隆的正确产物表达并在转移到10L发酵罐中之前利用SDS-Page进行分析。
预先培养：
为了预先培养，已经使用了化学成分明确的培养基(CDM)：
NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、柠檬酸1.6g/L、甘氨酸0.78g/L、L-丙氨酸0.29g/L、L-精氨酸0.41g/L、L-天冬酰胺*H2O 0.37g/L、L-天冬氨酸0.05g/L、L-半胱氨酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-组氨酸0.05g/L、L-异亮氨酸0.31g/L、L-亮氨酸0.38g/L、L-赖氨酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫氨酸0.27g/L、L-苯丙氨酸0.43g/L、L-脯氨酸0.36g/L、L-丝氨酸0.15g/L、L-苏氨酸0.40g/L、L-色氨酸0.07g/L、L-缬氨酸0.33g/L、L-酪氨酸0.51g/L、L-谷氨酰胺0.12g/L、Na-L-谷氨酸*H2O 0.82g/L,葡萄糖*H2O 5.0g/L,痕量元素溶液5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、硫胺素*HCl 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有MnSO4*H2O 1.28g/L、ZnSO4*7H2O 1.70g/L、H3BO3 0.30g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.18g/L、CoC12*6H2O 0.25g/L、CuSO4*5H2O 0.22g/L、EDTA 0.75g/L。
为了预先培养，利用0.9mL初级种子库安瓿接种具有四个隔板的1000mL锥形瓶中的300ml CDM培养基。在旋转振荡器上于37℃和170rpm下进行培养9小时直至获得6-13的光密度(578nm)。然后将100g的该预先培养物转移到10L生物反应器中以接种分批培养基。
无氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸的发酵(5号实验和6号实验)：
为了在10L Biostat C,DCU3发酵罐(Sartorius,Melsungen,Germany)中发酵，使用以下分批培养基：KH2PO4 4.73g/L、(NH4)2HPO4 7.47g/L、K2HPO4*3H2O 14.94g/L、柠檬酸2.07g/L、L-甲硫氨酸1.22g/L、柠檬酸铁铵0.08g/L、NaHCO3 0.82g/L、痕量元素溶液7.3mL/L、MgSO4*7H2O1.42g/L、硫胺素*HCl 20.9mg/L、葡萄糖*H2O 29.3g/L、生物素0.2mg/L、1.2mL/L Synperonic 10％消泡剂。
痕量元素溶液含有在1N HCl溶液中溶解的FeSO4*7H2O 10g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L、CoC12*6H2O 0.42g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、H3BO3 0.50g/L、硫胺素-HCl2.0g/L。
补料1溶液含有700g/L葡萄糖*H2O、KH2PO4 8.43g/L和K2HPO4*3H2O 22.38g/L。
补料2仅包含150.3g/L MgSO4*7H2O。
所有组分均溶解在去离子水中。
用于pH调节的碱溶液是补充有11.25g/L L-甲硫氨酸。
以4.2L无菌分批培养基加来自预先培养的100mL接种物开始，在37℃,pH 6.9±0.2,800mbar回压下和10L/分钟的初始通气速率下进行分批发酵。通过增加搅拌器速率高达1500rpm在发酵过程中将溶解氧(pO2)的相对值保持在50％。在初始补充的葡萄糖耗尽(溶解氧值的陡然增加所示)后，温度转变成25℃并且15分钟后，发酵进入以两种补料(分别为50和13g/h)开始的补料分批模式。补料2的速率保持恒定，而补料1的速率以预先定义的补料模式在8.5小时内逐步从50增加至最后的160g/h。当二氧化碳废气浓度水平高于2％时，通气速率在5小时内从10恒定地增加至20L/分钟。通过加入2.4g IPTG，在150的光密度下诱导重组四连蛋白-载脂蛋白A-1融合蛋白的表达。发酵结束时，在细胞质内，利用加热步骤(其中发酵罐中的全部培养液在收集前被加热至50℃，1小时)将可溶性表达的四连蛋白-载脂蛋白A-I转移到不溶性蛋白聚集体(所谓的包涵体)中(参见例如EP-B 1 486 571)。然后，利用flow-through离心机(13,000rpm,13l/h)将发酵罐的内含物离心并将收集的生物量储存在-20℃直至进一步的加工。在不溶性蛋白聚集体(所谓的包涵体，IB)形式的不溶性细胞碎片部分中唯一地发现了合成的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。
产物形成的分析：
利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从发酵罐中抽取的样品，一份在诱导蛋白表达之前，另一份在诱导蛋白表达之后的专门时间点上。将来自每份样品的相同量的细胞(ODtarget＝5)重悬浮于5mL PBS缓冲液中并通过在冰上超声进行破碎。然后离心100μL各悬浮液(15,000rpm,5分钟)，取出各上清液并转移到单独的管中。这区分可溶性和不可溶性表达的靶蛋白。向各上清液(＝可溶性)部分中加入300μL SDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)和向各沉淀(＝不可溶性)部分中加入400μLSDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)。在强力混合下于95℃加热样品15分钟来溶解并还原样品中的所有蛋白。冷却至室温后，将5μL各样品转移到4-20％TGX Criterion Stain Free聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)中。此外，将5μL分子量标准物(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)和具有已知产物蛋白浓度(0.1μg/μL)的3份量(0.3μL、0.6μL和0.9μL)定量标准物定位在凝胶上。
电泳在200V下运行60分钟，然后将凝胶转移到GelDOC EZ Imager(Bio-Rad)上并利用UV辐射处理5分钟。使用Image Lab分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。利用三个标准，计算具有>0.99系数的线性回归曲线并因此计算原始样品中靶蛋白的浓度。
在八天放射性流出测定中测量了纯化的和脂化的TN-ApoA1的活性。通过PMA(咐拜十四烷酯(phorbol myristate acetate))区分细胞(THP-1)与巨噬细胞。利用乙酰化的LDL和3H-标记的胆固醇装载这些细胞。丢弃上清液并将细胞与平衡培养基温育5小时，以去除非特异性结合的胆固醇。加入脂化的TN-ApoA1，其使得能够将3H-标记的胆固醇在接下来的18小时内输出到细胞外。在上清液和细胞裂解物中测量放射性。
结果：
上文提及的发酵过程用于在营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6和在代表K12野生型菌株MG1655的原养型MG1655衍生物菌株中表达四连蛋白-载脂蛋白A-I。两种菌株不需要补料氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸，其因而从培养基和补料中被排除。这显著地降低了用于方法的产品成本。
由于缺少较高浓度的L-亮氨酸的生长抑制影响，营养缺陷型恢复的和野生型菌株两者在没有氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸的培养基上均生长地更快(参见实施例3)。营养缺陷型恢复的菌株的最终光密度在缺少氨基酸的该培养基中得到了很好的提高，而野生型菌株的生长在诱导产物形成后和在发酵后期中显著降低(参见图4)。
尽管营养缺陷型恢复的菌株的产物形成在添加诱导物后的前几小时中在补充有氨基酸的发酵培养基中较快，但是最终产量与没有添加氨基酸的发酵相比几乎相同(参见图5)。因而，从培养基中去除氨基酸节省了显著成本但是没有降低产物产量。原养型野生型大肠杆菌MG1655衍生物菌株在生长和产物的产量中具有明显的缺陷。
总结：
即使不补充氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸，营养缺陷型恢复的菌株在相同的化学成分明确的发酵培养基上比原养型野生型大肠杆菌菌株显示更好的性能。因而，恢复高产大肠杆菌菌株的其氨基酸营养缺陷型是有利的，以允许在化学成分明确的基础生长培养基上培养它们，并且获益自使用该化学成分明确的基础生长培养基而不使用原养型野生型大肠杆菌菌株如MG1655或密切相关的W3110(Vijayendran,C.,等人,J.Biotechnol.128(2007)747-761)的优势，如可以进一步在实施例6中看到的。
实施例6
在化学成分明确的基础培养基上培养营养缺陷型恢复的大肠杆菌菌株和野生型菌株W3110
为了证明营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6比原养型野生型大肠杆菌菌株W3110(缺失pyrF基因以适合无抗生素选择系统)具有明显的优势，探究了在相同的发酵过程中的生长和产物形成。
通过利用表达质粒5830电穿孔转化大肠杆菌K12菌株CSPZ-6(thi-1、ΔpyrF)和66C5(＝W3110ΔpyrF衍生物)(参见实施例2)。转化的大肠杆菌细胞首先在琼脂平板上于37℃下生长。将从该平板上挑取的集落转移到3mL滚筒培养中并在37℃下生长至1-2的光密度(在578nm下测量)。然后将1000μL培养物与1000mL无菌86％-甘油混合并立即冰冻于-80℃长期储存。
首先在小规模摇瓶实验中验证该克隆的正确产物表达并在转移到10L发酵罐中之前利用SDS-Page进行分析。
预先培养：
为了预先培养，已经使用了化学成分明确的培养基(CDM)：
NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、柠檬酸1.6g/L、甘氨酸0.78g/L、L-丙氨酸0.29g/L、L-精氨酸0.41g/L、L-天冬酰胺*H2O 0.37g/L、L-天冬氨酸0.05g/L、L-半胱氨酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-组氨酸0.05g/L、L-异亮氨酸0.31g/L、L-亮氨酸0.38g/L、L-赖氨酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫氨酸0.27g/L、L-苯丙氨酸0.43g/L、L-脯氨酸0.36g/L、L-丝氨酸0.15g/L、L-苏氨酸0.40g/L、L-色氨酸0.07g/L、L-缬氨酸0.33g/L、L-酪氨酸0.51g/L、L-谷氨酰胺0.12g/L、Na-L-谷氨酸*H2O 0.82g/L,葡萄糖*H2O 5.0g/L,痕量元素溶液5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、硫胺素*HCl 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有在0.5M HCl溶液中溶解的FeSO4*7H2O 10.0g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、H3BO3 0.50g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、CoC12*6H2O 0.42g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L。
为了预先发酵，利用0.9ml初级种子库安瓿接种具有四个隔板的1000ml锥形瓶中的300ml CDM培养基。在旋转振荡器上于32℃和170rpm下进行培养8小时直至获得4-9的光密度(578nm)。利用Vinoc.＝100ml*5/ODPC计算接种物体积并且其取决于预先培养物的光密度以接种具有等量细胞的10L生物反应器的分批培养基。
无氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸的发酵(7号实验和8号实验)：
为了在10L Biostat C,DCU3发酵罐(Sartorius,Melsungen,Germany)中发酵，使用以下分批培养基：KH2PO4 1.58g/L、(NH4)2HPO4 7.47g/L、K2HPO4*3H2O 13.32g/L、柠檬酸2.07g/L、L-甲硫氨酸1.22g/L、柠檬酸铁铵0.08g/L、NaHCO3 0.82g/L、痕量元素溶液7.3mL/L、MgSO4*7H2O0.99g/L、硫胺素*HCl 20.9mg/L、葡萄糖*H2O 29.3g/L、生物素0.2mg/L、1.2mL/L Synperonic 10％消泡剂。
痕量元素溶液含有在0.5M HCl溶液中溶解的FeSO4*7H2O 10g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、H3BO3 0.50g/L。
补料1溶液含有700g/L葡萄糖*H2O、12.3g/L MgSO4*7H2O和0.1g/L FeSO4*7H2O。
补料2包含KH2PO4 52.7g/L、K2HPO4*3H2O 139.9g/L和(NH4)2HPO4 132.1g/L。
所有组分均溶解在去离子水中。
用于pH调节的碱溶液是补充有11.25g/L L-甲硫氨酸。
以4.2L无菌分批培养基加来自预先培养的100mL接种物开始，在31℃,pH 6.9±0.2,800mbar回压下和10L/分钟的初始通气速率下进行分批发酵。通过增加搅拌器速率高达1500rpm在发酵过程中将溶解氧(pO2)的相对值保持在50％。在初始补充的葡萄糖耗尽(溶解氧值的陡然增加所示)后，温度转变成25℃并且15分钟后，发酵进入以两种补料(分别为60和14g/h)开始的补料分批模式。补料2的速率保持恒定，而补料1的速率以预先定义的补料模式在7小时内逐步从60增加至最后的160g/h。当二氧化碳废气浓度水平高于2％时，通气速率在5小时内从10恒定地增加至20L/分钟。通过加入2.4g IPTG，在120的光密度下诱导重组四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的表达。发酵结束时，在细胞质内，利用加热步骤(其中发酵罐中的全部培养液在收集前被加热至50℃，1小时)将可溶性表达的四连蛋白-载脂蛋白A-I转移到不溶性蛋白聚集体(所谓的包涵体)中(参见例如EP-B 1 486 571)。然后，利用flow-through离心机(13,000rpm,13L/h)将发酵罐的内含物离心并将收集的生物量储存在-20℃直至进一步的加工。在不溶性蛋白聚集体(所谓的包涵体，IB)形式的不溶性细胞碎片部分中唯一地发现了合成的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。
产物形成的分析：
利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从发酵罐中抽取的样品，一份在诱导蛋白表达之前，另一份在诱导蛋白表达之后的专门时间点上。将来自每份样品的相同量的细胞(ODtarget＝5)重悬浮于5mL PBS缓冲液中并通过在冰上超声进行破碎。然后离心100μL各悬浮液(15,000rpm,5分钟)，取出各上清液并转移到单独的管中。这区分可溶性和不可溶性表达的靶蛋白。向各上清液(＝可溶性)部分中加入300μL SDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)和向各沉淀(＝不可溶性)部分中加入400μLSDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)。在强力混合下于95℃加热样品15分钟来溶解并还原样品中的所有蛋白。冷却至室温后，将5μL各样品转移到4-20％TGX Criterion Stain Free聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)中。此外，将5μL分子量标准物(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)和具有已知产物蛋白浓度(0.1μg/μL)的3份量(0.3μL、0.6μL和0.9μL)定量标准物定位在凝胶上。
电泳在200V下运行60分钟，然后将凝胶转移到GelDOC EZ Imager(Bio-Rad)上并利用UV辐射处理5分钟。使用Image Lab分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。利用三个标准，计算具有>0.99系数的线性回归曲线并因此计算原始样品中靶蛋白的浓度。
在八天放射性流出测定中测量了纯化的和脂化的TN-ApoA1的活性。通过PMA(咐拜十四烷酯(phorbol myristate acetate))区分细胞(THP-1)与巨噬细胞。利用乙酰化的LDL和3H-标记的胆固醇装载这些细胞。丢弃上清液并将细胞与平衡培养基温育5小时，以去除非特异性结合的胆固醇。加入脂化的TN-ApoA1，其使得能够将3H-标记的胆固醇在接下来的18小时内输出到细胞外。在上清液和细胞裂解物中测量放射性。
结果：
上文提及的发酵过程用于在营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6和在代表K12野生型菌株W3110的原养型菌株66C5中表达四连蛋白-载脂蛋白A-I。两种菌株不需要补料氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸，其因而从培养基和补料中被排除。这显著地降低了用于方法的产品成本。
令人惊讶地，尽管是原养型的并且利用等量细胞接种，野生型菌株66C5当与营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6在相同的化学成分明确的培养基上和在相同的培养条件下相比时从开始就生长地极其缓慢(参见图6)。因此，葡萄糖补料速率必须适合于避免在培养基中过量补料和葡萄糖积累。同样，最终的光密度在两种菌株之间极大地不同。虽然营养缺陷型恢复的菌株达到多于300，但是野生型菌株仅获得143并且由于生长停滞发酵终止。利用升高的温度(9号实验)，针对分批期(37℃)和补料分批期(30℃)重复利用菌株66C5的发酵，但是生长产量不能被提高很多(参见图7)。
因为在相同的化学成分明确的培养基上和在相同的条件下培养时，野生型菌株66C5的生长远远落后于营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6的生长，同样产物形成也低得多(参见图8)。尽管营养缺陷型恢复的菌株在表达31小时后最终获得22.6g/L，但是由于生长停滞在培养38小时后野生型菌株66C5的发酵终止，因此产物产量仅定量在2.3g/L。同样，比生产率(specific productivity)更低(21.9mg/OD相对于71.1mg/OD)。利用升高的温度，分批期(37℃)和补料分批期(30℃)重复利用野生型菌株66C5的发酵，但是产物产量仅被提高到6.9g/L(参见图9)。原养型野生型大肠杆菌菌株与营养缺陷型恢复的菌株直接相比具有显著的缺陷。
总结：
营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6在相同的未补充除甲硫氨酸以外的其他氨基酸的化学成分明确的发酵培养基上比原养型野生型大肠杆菌菌株W3110衍生物具有好得多的性能。因而，恢复大肠杆菌菌株其氨基酸营养缺陷型是有力的，从而以使用化学成分明确的基础培养基用于培养并从使用该培养基而不使用原养型野生型大肠杆菌菌株，如例如MG1655或W3110的优势中获益。
实施例7
在化学成分明确的培养基上培养营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6和原养型野生型菌株BL21ΔpyrF衍生物
为了证明营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6比原养型野生型大肠杆菌菌株B菌株BL21(缺失pyrF基因以适合无抗生素选择系统，命名为CSPZ-14)具有显著的优势，已经探究了在相同的发酵过程中的生长和产物形成。
通过利用质粒第5836号(参见实施例2)电穿孔转化大肠杆菌K12菌株CSPZ-6(thi-1、ΔpyrF)和大肠杆菌B菌株CSPZ-14(＝BL21ΔpyrF衍生物)来表达缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白衍生物。转化的大肠杆菌细胞首先在琼脂平板上于37℃下生长。将从该平板上挑取的集落转移到3mL滚筒培养中并在37℃下生长至1-2的光密度(在578nm下测量)。然后将1000μL培养物与1000μL无菌86％-甘油混合并立即冰冻于-80℃长期储存。首先在小规模摇瓶实验中验证该克隆的正确产物表达并在转移到10L发酵罐中之前利用SDS-Page进行分析。
预先培养：
为了预先培养，已经使用了化学成分明确的培养基(CDM)：
NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、柠檬酸1.6g/L、甘氨酸0.78g/L、L-丙氨酸0.29g/L、L-精氨酸0.41g/L、L-天冬酰胺*H2O 0.37g/L、L-天冬氨酸0.05g/L、L-半胱氨酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-组氨酸0.05g/L、L-异亮氨酸0.31g/L、L-亮氨酸0.38g/L、L-赖氨酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫氨酸0.27g/L、L-苯丙氨酸0.43g/L、L-脯氨酸0.36g/L、L-丝氨酸0.15g/L、L-苏氨酸0.40g/L、L-色氨酸0.07g/L、L-缬氨酸0.33g/L、L-酪氨酸0.51g/L、L-谷氨酰胺0.12g/L、Na-L-谷氨酸*H2O 0.82g/L,葡萄糖*H2O 6.0g/L,痕量元素溶液0.5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、硫胺素*HCl 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有在0.5M HCl溶液中溶解的FeSO4*7H2O 10.0g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、H3BO3 0.50g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L。
为了预先培养，利用0.9mL初级种子库安瓿接种具有四个隔板的1000mL锥形瓶中的300ml CDM。在旋转振荡器上于32℃和170rpm下进行培养8小时直至获得4-9的光密度(578nm)。然后将100g的该预先培养物转移到10L生物反应器中以接种分批培养基。
无氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸的发酵(10号实验和11号实验)：
为了在10L Biostat C,DCU3发酵罐(Sartorius,Melsungen,Germany)中发酵，使用以下分批培养基：
KH2PO4 1.58g/L、(NH4)2HPO4 7.47g/L、K2HPO4*3H2O 13.32g/L、柠檬酸2.07g/L、L-甲硫氨酸1.22g/L、柠檬酸铁铵0.08g/L、NaHCO3 0.82g/L、痕量元素溶液7.3mL/L、MgSO4*7H2O 0.99g/L、硫胺素*HCl 20.9mg/L、葡萄糖*H2O 29.3g/L、生物素0.2mg/L、1.2mL/L Synperonic 10％消泡剂。
痕量元素溶液含有在0.5M HCl溶液中溶解的FeSO4*7H2O 10g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、H3BO3 0.50g/L。
补料1溶液含有700g/L葡萄糖*H2O、7.4g/L MgSO4*7H2O和0.1g/L FeSO4*7H2O。
补料2包含KH2PO4 52.7g/L、K2HPO4*3H2O 139.9g/L和(NH4)2HPO4 66.0g/L。
所有组分均溶解在去离子水中。
用于pH调节的碱溶液是补充有11.25g/L L-甲硫氨酸。
以4.2L无菌分批培养基加来自预先培养的100mL接种物开始，在31℃,pH 6.9±0.2,800mbar回压下和10L/分钟的初始通气速率下进行分批发酵。通过增加搅拌器速率高达1500rpm在发酵过程中将溶解氧(pO2)的相对值保持在50％。在初始补充的葡萄糖耗尽(溶解氧值的陡然增加所示)后，温度转变成25℃并且15分钟后，发酵进入以两种补料(分别为60和14g/h)开始的补料分批模式。补料2的速率保持恒定，而补料1的速率以预先定义的补料模式在7小时内逐步从60增加至最后的160g/h。当二氧化碳废气浓度水平高于2％时，通气速率在5小时内从10恒定地增加至20L/分钟。通过加入2.4g IPTG，在大约150的光密度下诱导重组四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的表达。发酵结束时，在细胞质内，利用加热步骤(其中发酵罐中的全部培养液在收集前被加热至50℃，1小时)将可溶性表达的四连蛋白-载脂蛋白A-I转移到不溶性蛋白聚集体(所谓的包涵体)中(参见例如EP-B 1 486 571)。然后，利用flow-through离心机(13,000rpm,13L/h)将发酵罐的内含物离心并将收集的生物量储存在-20℃直至进一步的加工。在不溶性蛋白聚集体(所谓的包涵体，IB)形式的不溶性细胞碎片部分中唯一地发现了合成的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。
产物形成的分析：
利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从发酵罐中抽取的样品，一份在诱导蛋白表达之前，另一份在诱导蛋白表达之后的专门时间点上。将来自每份样品的相同量的细胞(ODtarget＝5)重悬浮于5mL PBS缓冲液中并通过在冰上超声进行破碎。然后离心100μL各悬浮液(15,000rpm,5分钟)，取出各上清液并转移到单独的管中。这区分可溶性和不可溶性表达的靶蛋白。向各上清液(＝可溶性)部分中加入300μL SDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)和向各沉淀(＝不可溶性)部分中加入400μLSDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)。在强力混合下于95℃加热样品15分钟来溶解并还原样品中的所有蛋白。冷却至室温后，将5μL各样品转移到4-20％TGX Criterion Stain Free聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)中。此外，将5μL分子量标准物(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)和具有已知产物蛋白浓度(0.1μg/μL)的3份量(0.3μL、0.6μL和0.9μL)定量标准物定位在凝胶上。
电泳在200V下运行60分钟，然后将凝胶转移到GelDOC EZ Imager(Bio-Rad)上并利用UV辐射处理5分钟。使用Image Lab分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。利用三个标准，计算具有>0.99系数的线性回归曲线并因此计算原始样品中靶蛋白的浓度。
在八天放射性流出测定中测量了纯化的和脂化的缩短的TN-ApoA1的活性。通过PMA(咐拜十四烷酯(phorbol myristate acetate))区分细胞(THP-1)与巨噬细胞。利用乙酰化的LDL和3H-标记的胆固醇装载这些细胞。丢弃上清液并将细胞与平衡培养基温育5小时，以去除非特异性结合的胆固醇。加入脂化的缩短的TN-ApoA1，其使得能够将3H-标记的胆固醇在接下来的18小时内输出到细胞外。在上清液和细胞裂解物中测量放射性。
结果：
上文提及的发酵过程用于在营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6和在代表大肠杆菌B野生型菌株BL21的原养型菌株CSPZ-14中表达缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。两种菌株不需要补料氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸，其因而从培养基和补料中被排除。这降低了用于方法的产品成本。
令人惊讶地，尽管是原养型的并且利用等量细胞接种发酵，野生型菌株和BL21衍生物CSPZ-14当与营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6在相同的化学成分明确的培养基上和在相同的培养条件下相比时从开始就生长地显著较慢(参见图10)。因此，葡萄糖补料在1.2小时后开始，但是补料速率的增加与可比较发酵中的补料速率增加遵循相同的模式。最终的光密度在两种菌株之间极大地不同。尽管营养缺陷型恢复的菌株在最终加热步骤之前达到266的光密度，野生型菌株的光密度从33小时时的最大值降低至发酵结束(47小时)时的仅143。
通过在两种培养中大概150的光密度时加入2.4g IPTG诱导产物形成。由于菌株CSPZ-14的降低生长，当在相同的化学成分明确的培养基上和在相同的条件下培养时，与利用菌株CSPZ-6的19.5小时相比在22.2小时时达到该OD。虽然CSPZ-14的产物形成速率显著较低，但因而最终的产量在表达23小时后仅达到9.6g/L(参见图11)。与此相比，营养缺陷型恢复的菌株在诱导表达24小时后产生33.8g/L融合蛋白。同样，比生产率较低(67.1mg/OD vs 135.7mg/OD)。原养型野生型大肠杆菌菌株与营养缺陷型恢复的菌株直接相比具有显著的缺陷。
总结：
营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6在相同的未补充除甲硫氨酸以外的其他氨基酸的化学成分明确的发酵培养基上比原养型野生型大肠杆菌菌株CSPZ-14(BL21ΔpyrF衍生物)具有好得多的性能。因而，恢复大肠杆菌菌株其氨基酸营养缺陷型是有利的，从而在化学成分明确的基础培养基上培养它们并从使用该培养基而不使用原养型野生型大肠杆菌菌株，如例如MG1655、W3110或BL21的优势中获利。
实施例8
在化学成分明确的培养基上培养营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6和原养型野生型菌株MG1655
为了证明营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6比原养型野生型大肠杆菌菌株K12菌株MG1655(缺失pyrF基因以适合无抗生素选择系统，命名为CSPZ-9)具有显著的优势，已经探究了在两个菌株之间的相同的发酵过程中的生长和IgA-蛋白酶产物形成。
通过利用质粒3036电穿孔转化大肠杆菌K12菌株CSPZ-6(thi-1,ΔpyrF)和CSPZ-9(＝MG1655ΔpyrF衍生物)以表达IgA-蛋白酶。转化的大肠杆菌细胞首先在琼脂平板上于37℃下生长。将从该平板上挑取的集落转移到3mL滚筒培养中并在37℃下生长至1-2的光密度(在578nm下测量)。然后将1000μL培养物与1000μL无菌86％-甘油混合并立即冰冻于-80℃长期储存。首先在小规模摇瓶实验中验证该克隆的正确产物表达并在转移到10L发酵罐中之前利用SDS-Page进行分析。
预先培养：
为了预先培养，已经使用了化学成分明确的培养基(CDM)：
NH4Cl 1.0g/L、K2HPO4*3H2O 18.3g/L、柠檬酸1.6g/L、甘氨酸0.78g/L、L-丙氨酸0.29g/L、L-精氨酸0.41g/L、L-天冬酰胺*H2O 0.37g/L、L-天冬氨酸0.05g/L、L-半胱氨酸*HCl*H2O 0.05g/L、L-组氨酸0.05g/L、L-异亮氨酸0.31g/L、L-亮氨酸0.38g/L、L-赖氨酸*HCl 0.40g/L、L-甲硫氨酸0.27g/L、L-苯丙氨酸0.43g/L、L-脯氨酸0.36g/L、L-丝氨酸0.15g/L、L-苏氨酸0.40g/L、L-色氨酸0.07g/L、L-缬氨酸0.33g/L、L-酪氨酸0.51g/L、L-谷氨酰胺0.12g/L、Na-L-谷氨酸*H2O 0.82g/L,葡萄糖*H2O 6.0g/L,痕量元素溶液0.5mL/L、MgSO4*7H2O 0.86g/L、硫胺素*HCl 17.5mg/L。
痕量元素溶液含有在0.5M HCl溶液中溶解的FeSO4*7H2O 10.0g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、H3BO3 0.50g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L。
为了预先培养，利用0.9mL初级种子库安瓿接种具有四个隔板的1000mL锥形瓶中的220ml CDM。在旋转振荡器上于37℃和170rpm下进行培养8小时直至获得10-12的光密度(578nm)。为了接种具有等量细胞的10L生物反应器的分批培养基，利用Vinoc.＝100mL*5/ODPC计算接种体积并且其因而取决于预先培养物的光密度。
没有氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸的发酵(12号实验和13号实验)：
为了在10L Biostat C,DCU3发酵罐(Sartorius,Melsungen,Germany)中发酵，使用以下分批培养基：
KH2PO4 1.58g/L、(NH4)2HPO4 7.47g/L、K2HPO4*3H2O 13.32g/L、柠檬酸2.07g/L、L-甲硫氨酸1.22g/L、柠檬酸铁铵0.08g/L、NaHCO3 0.82g/L、痕量元素溶液7.3mL/L、MgSO4*7H2O 0.99g/L、硫胺素*HCl 20.9mg/L、葡萄糖*H2O 29.3g/L、生物素0.2mg/L、1.2mL/L Synperonic 10％消泡剂。
痕量元素溶液含有在0.5M HCl溶液中溶解的FeSO4*7H2O 10g/L、ZnSO4*7H2O 2.25g/L、MnSO4*H2O 2.13g/L、CuSO4*5H2O 1.0g/L、CoCl2*6H2O 0.42g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3g/L、H3BO3 0.50g/L。
补料1溶液含有700g/L葡萄糖*H2O、7.4g/L MgSO4*7H2O和0.1g/L FeSO4*7H2O。
补料2包含KH2PO4 52.7g/L、K2HPO4*3H2O 139.9g/L和(NH4)2HPO4 66.0g/L。
所有组分均溶解在去离子水中。
用于pH调节的碱溶液是补充有11.25g/L L-甲硫氨酸。
以4.2L无菌分批培养基加各接种物体积开始，在31℃,pH 6.9±0.2,800mbar回压下和10L/分钟的初始通气速率下进行分批发酵。通过增加搅拌器速率高达1500rpm在发酵过程中将溶解氧(pO2)的相对值保持在50％。在初始补充的葡萄糖耗尽(溶解氧值的陡然增加所示)后，温度转变成25℃并且15分钟后，发酵进入以两种补料(分别为60和14g/h)开始的补料分批模式。补料2的速率保持恒定，而补料1的速率以预先定义的补料模式在7小时内逐步从60增加至最后的160g/h。当二氧化碳废气浓度水平高于2％时，通气速率在5小时内从10恒定地增加至20L/分钟。通过加入2.4g IPTG，在大概150的光密度下诱导重组IgA-蛋白酶的表达。发酵进行高达48小时，尽管在光密度上没有显著的降低。在培养结束时，将发酵液冷却至4-8℃并在发酵罐容器中储存过夜。第二天利用flow-through离心机(13,000rpm,13L/h)将发酵罐的内含物离心并将收集的生物量储存在-20℃直至进一步的加工。在不溶性蛋白聚集体(所谓的包涵体，IB)形式的不溶性细胞碎片部分中唯一发现了合成的IgA-蛋白酶。
产物形成的分析：
利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从发酵罐中抽取的样品，一份在诱导蛋白表达之前，另一份在诱导蛋白表达之后的专门时间点上。将来自每份样品的相同量的细胞(ODtarget＝10)重悬浮于5mL PBS缓冲液中并通过在冰上超声进行破碎。然后离心100μL各悬浮液(15,000rpm,5分钟)，取出各上清液并转移到单独的管中。这区分可溶性和不可溶性表达的靶蛋白。向各上清液(＝可溶性)部分中加入100μL SDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)和向各沉淀(＝不可溶性)部分中加入200μLSDS样品缓冲液(Laemmli,U.K.,Nature 227(1970)680-685)。在强力混合下于95℃加热样品15分钟来溶解并还原样品中的所有蛋白。冷却至室温后，将5μL各样品转移到4-20％TGX Criterion Stain Free聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)中。此外，将5μL分子量标准物(Precision Plus Protein Standard,Bio-Rad)和具有已知产物蛋白浓度(0.15μg/μL)的3份量(0.3μL、0.6μL和0.9μL)定量标准物定位在凝胶上。
电泳在200V下运行60分钟，然后将凝胶转移到GelDOC EZ Imager(Bio-Rad)上并利用UV辐射处理5分钟。使用Image Lab分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。利用三个标准，计算具有>0.99系数的线性回归曲线并因此计算原始样品中靶蛋白的浓度。
利用如上所述的分子四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽测试重新折叠的和纯化的IgA-蛋白酶的活性，所述四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽是从中通过使用IgA蛋白酶体外酶促切割释放四连蛋白-载脂蛋白A-I融合多肽的前体多肽。切割活性在预期范围内。
结果：
上文提及的发酵过程用于在营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6和在代表大肠杆菌K12野生型菌株MG1655的原养型菌株CSPZ-9中表达IgA蛋白酶蛋白。两种菌株不需要补料氨基酸L-亮氨酸和L-脯氨酸，其因而从培养基和补料中被排除。这显著地降低了用于方法的产品成本。
野生型菌株和MG1655衍生物CSPZ-9当与相同的化学成分明确的培养基上和相同的培养条件下的营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6相比时在发酵开始时显示较快的生长。接种后24小时，光密度几乎相同。但是之后，两种菌株的光密度惊人地不同。菌株CSPZ-9的生长在培养30小时后显著地减缓，并由于补料1的连续补料，培养基中葡萄糖浓度增加至16g/L。因而，培养37小时后终止发酵。代谢物分析揭示，由于生长速率的显著降低，培养基中氨、谷氨酸、铁、镁和醋酸盐的浓度显著增加。最终的光密度在两种菌株之间极大地不同。恢复的菌株达到362时，野生型菌株的光密度从24小时时256的最大值降低至发酵结束(37小时)时仅177(参见图12)。
在光密度为大概150时添加2.4g IPTG诱导蛋白表达后，菌株CSPZ-6当与野生型菌株CSPZ-9相比时产生显著更多的IgA蛋白酶(参见图13)。
总结：
营养缺陷型恢复的菌株CSPZ-6在相同的未补充其他氨基酸的化学成分明确的发酵培养基上比原养型野生型大肠杆菌菌株CSPZ-9(MG1655ΔpyrF衍生物)显示改善的生长特性。因而，恢复高产大肠杆菌菌株其氨基酸营养缺陷型是有用的，从而能够在化学成分明确的基础培养基上培养它们并从使用此类培养基并且代替使用来自MG1655、W3110或BL21的原养型野生型大肠杆菌菌株衍生物的优势中获利。

Claims (8)

1.用于在原核细胞中产生多肽的方法，其包括以下步骤：
-在化学成分明确的基础生长培养基中培养原核细胞，并从所述原核细胞或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肽，所述原核细胞已经通过将恢复亲本原核细胞的氨基酸营养缺陷型的核酸引入到亲本原核细胞的基因组内获得，所述原核细胞包含编码多肽的一种或多种核酸。
2.权利要求1的方法，其特征在于相比于亲本非营养缺陷型恢复的原核细胞的培养所需，所述营养缺陷型恢复的原核细胞的培养需要向生长培养基中补充较少的一种或两种或三种或四种氨基酸。
3.权利要求1-2任一项的方法，其特征在于所述营养缺陷型恢复的原核细胞具有至少一种其他氨基酸营养缺陷型。
4.权利要求1-3任一项的方法，其特征在于在培养过程中不添加对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
5.权利要求1-3任一项的方法，其特征在于在缺少对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸的情况下进行培养。
6.权利要求1-5任一项的方法，其特征在于所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
7.权利要求1-6任一项的方法，其特征在于多肽是全长抗体链、单链抗体、单结构域抗体、scFv、scFab、或上述之一与非抗体多肽的缀合物。
8.权利要求7的方法，其特征在于所述多肽是scFv或scFab与细胞毒性剂的缀合物。
CN201480009903.4A 2013-02-22 2014-02-19 氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株用于重组产生多肽的用途 Pending CN105026575A (zh)

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