CN117511837A - 一种高产o-乙酰-l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产O‑乙酰‑L‑高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用。本发明在底盘菌HS E.coliW3110的基础上，导入metX并用Ptrc启动子进行过表达，利用trc启动子替换aspC、asd、acs、PntAB、pta基因的原位启动子，将更多的碳流引入生产L‑高丝氨酸和生成乙酰辅酶A；导入fxpk并用Ptrc启动子进行过表达；敲除edd、pfkA基因，构建非氧化糖酵解途径，从葡萄糖中生成高产率的乙酰辅酶A，为O‑乙酰‑L‑高丝氨酸的生产提供足够的乙酰辅酶A。通过以上改造策略，成功获得了高产O‑乙酰‑L‑高丝氨酸的重组大肠杆菌菌株。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用。
背景技术
O-乙酰-L-高丝氨酸(OAH)是一种酰基化氨基酸，在生物系统中，O-乙酰-L-高丝氨酸不直接参与蛋白质的合成，但它是生物体内细胞代谢重要含硫物质合成过程中的重要前体物质，如L-蛋氨酸和S-腺苷甲硫氨酸。此外，O-乙酰-L-高丝氨酸还是一种人体内必需氨基酸的甲硫氨酸的前体，而甲硫氨酸不仅可以用作饲料和食品的添加剂，并且能够用作输液溶液和药物的原料。因此O-乙酰-L-高丝氨酸是一种很有应用前景的平台化学品，具有很高的市场需求和经济价值。
大肠杆菌是一种重要的工业微生物，可以用于生产L-天冬氨酸家族氨基酸，如L-苏氨酸和L-异亮氨酸，并且大肠杆菌也具有很大的O-乙酰-L-高丝氨酸生产潜力。然而野生型大肠杆菌中没有合成O-乙酰L-高丝氨酸的途径，因此需要将编码高丝氨酸乙酰基转移酶的metX基因导入大肠杆菌的基因组以合成O-乙酰-L-高丝氨酸，但是其产量、转化率依然有提升空间。因此需要寻找一种办法提高O-乙酰-L-高丝氨酸工程菌的生产性能。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌。本发明通过代谢工程手段和基因编辑技术改造大肠杆菌，从而获得高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌。
本发明解决上述问题的技术方案如下：
一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，由以下方法构建而成：
(1)以重组大肠杆菌HS E.coliW3110为底盘菌，在菌株HS E.coliW3110基因组上假基因位点flik导入高丝氨酸乙酰基转移酶基因metX并用Ptrc启动子进行过表达，得到重组菌株OAH-1；
(2)将重组菌株OAH-1基因组中的aspC基因的原位启动子替换为Ptrc启动子，得到重组菌株OAH-2；
(3)将重组菌株OAH-2基因组中的asd基因的原位启动子替换为Ptrcc启动子，得到重组菌株OAH-3；
(4)将重组菌株OAH-3基因组中的acs基因的原位启动子替换为Ptrc启动子，得到重组菌株OAH-4；
(5)在重组菌株OAH-4基因组的原位置对ptsG基因进行回补，得到重组菌株OAH-5；
(6)将重组菌株OAH-5基因组中的PntAB基因的原位启动子，替换为Ptrc启动子，得到重组菌株OAH-6；
(7)在重组菌株OAH-6基因组中假基因yncI位点导入双功能磷酸酮醇酶fxpk基因，并利用Ptrc启动子替换原启动子得到重组菌株OAH-7；
(8)将重组菌株OAH-7基因组中pta基因的原位启动子替换为Ptrc启动子，得到重组菌株OAH-8；
(9)敲除重组菌株OAH-8基因组中的edd基因，得到重组菌株OAH-9；
(10)敲除重组菌株OAH-9基因组中的pfkA基因得到重组菌株OAH-10，即所述高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌。
作为优选，所述高丝氨酸乙酰基转移酶基因metX核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，所述Ptrc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为优选，所述基因aspC核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述基因asd核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
作为优选，所述基因acs核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述基因ptsG核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
作为优选，所述基因PntAB核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
作为优选，所述双功能磷酸酮醇酶基因fxpk核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
作为优选，所述基因pta核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述基因edd核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
作为优选，所述基因pfkA核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的另一目的是，提供上述重组大肠杆菌在微生物发酵制备O-乙酰-L-高丝氨酸中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明在底盘HS E.coliW3110的基础上，导入metX并用Ptrc启动子进行过表达，利用trc启动子替换aspC、asd、acs、PntAB、pta基因的原位启动子，将更多的碳流引入生产L-高丝氨酸和生成乙酰辅酶A；导入fxpk并用Ptrc启动子进行过表达；敲除edd、pfkA基因，构建非氧化糖酵解途径，从葡萄糖中生成高产率的乙酰辅酶A，为O-乙酰-L-高丝氨酸的生产提供足够的乙酰辅酶A。通过以上改造策略，成功获得了高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌菌株。
附图说明
图1为metX构建质粒图谱；
图2为fxpk构建质粒图谱；
图3为菌株OAH-1～OAH-10摇瓶发酵数据柱形图；
图4为菌株OAH-10在5L发酵罐补料发酵O-乙酰-L-高丝氨酸浓度曲线图。
具体实施方式
本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
LB培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水。固体培养基需要加终浓度20g/L琼脂。
本发明底盘菌HS为重组大肠杆菌HS E.coliW3110(ΔmetJ,ΔmetI,ΔmetB,ΔthrB,ΔmetA,ΔlysA,ΔlacI::Ptrc-rhtA,ΔiclR,ΔptsG,ΔgalR,Ptrc-metL,Ptrc-thrA,
Ptrc-rhtA,Ptrc-eamA,Ptrc-glk,Ptrc-gltB)，来源于Liu P,Zhang B,Yao Z H,etal.Multiplex design ofmetabolic network forproduction ofL-homoserine inEscherichia coli[J].Applied and Environmental Microbiology,2020,86(20).
本发明实例中基因片段委托北京擎科生物科技有限公司合成。
本发明实施例中所用引物序列如下表。
表1：本发明实施例中所用引物序列
实施例1：菌株OAH-1～OAH-10的构建
1、菌株OAH-1的构建
运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，以大肠杆菌HS E.coli W3110(ΔmetJ,ΔmetI,ΔmetB,ΔthrB,ΔmetA,ΔlysA,ΔlacI::Ptrc-rhtA,ΔiclR,ΔptsG,ΔgalR,Ptrc-metL,Ptrc-thrA,Ptrc-rhtA,Ptrc-eamA,Ptrc-glk,Ptrc-gltB)为底盘菌株导入外源基因metX，将基因在flik位置上替换并将原位启动子替换为Ptrc启动子，得到重组菌株OAH-1：
(1)连接片段Uflik-Ptrc-metX-Dflik
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，使用引物metX-p1-up和metX-p1-down、metX-p3-up和metX-p3-down分别扩增出基因flik的上游同源臂和下游同源臂，使用引物metX-p2-up和metX-p2-down扩增出metX基因片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后用DpnI于37℃处理3h，最后用Clean Up试剂盒回收纯化片段，将纯化片段使用引物metX-p1-up和metX-p2-down通过融合PCR获得连接片段Uflik-Ptrc-metX；使用引物metX-p1-up和metX-p3-down通过融合PCR获得连接片段Uflik-Ptrc-metX-Dflik；PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃2min，重复35个循环；72℃继续延伸10min。
(2)构建pTarget-metX(flik)-sg载体
以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以metX-PAM-up和metX-PAM-down为引物，扩增出能够识别靶定目的基因flik的sgRNA，构建pTarget-metX(flik)-sg突变载体，然后以pTX-XF和pTX-XR为引物将pTarget-metX(flik)-sg质粒线性化；PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃2.5min，重复35个循环；72℃继续延伸10min。
(3)构建pTarget-Ptrc-metX(flik)质粒
将步骤(1)中的连接片段Uflik-Ptrc-metX-Dflik和步骤(2)中的线性化突变载体pTarget-metX(flik)-sg进行一步克隆，反应程序为：37℃30min；将克隆产物转化至E.coliDH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。挑取阳性克隆菌株落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，使用质粒提取试剂盒获得pTarget-Ptrc-metX(flik)质粒。
(4)构建菌株OAH-1
将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入出发菌株中，单克隆接种到LB试管中，30℃过夜培养，再以体积浓度1％的接种量接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μL 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm，30℃培养至OD6000.4～0.6，4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3edEdition,99-102)的描述。
取5μL pTarget-Ptrc-metX(flik)质粒与100μL电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM,BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2～3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，30℃倒置培养16-24h，单菌落通过菌落PCR并测序验证，将验证正确的菌株挑入含有50mg/L卡那霉素和5mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的LB培养基中30℃培养12h消去pTarget F质粒，将成功验证消除pTarget F质粒的单菌落挑入装有10mL LB培养基的试管，42℃过夜培养，消除pCas质粒(pCas质粒为温敏型，超过37℃培养易丢失)；最终得到无质粒菌株记为OAH-1。
2、菌株OAH-2的构建
以菌株OAH-1(E.coli W3110,ΔmetJ,ΔmetI,ΔmetB,ΔthrB,ΔmetA,ΔlysA,ΔlacI::Ptrc-rhtA,ΔiclR,ΔptsG,ΔgalR,Ptrc-metL,Ptrc-thrA,Ptrc-rhtA,Ptrc-eamA,Ptrc-glk,Ptrc-gltB,Δflik::Ptrc-metX)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，用Ptrc启动子替换aspC基因中的原始启动子序列以达到增强aspC基因表达的目的。具体操作如下：
(1)连接片段UaspC-Ptrc-DaspC
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，使用引物aspC-P1-up和aspC-P1-down、aspC-P2-up和aspC-P2-down分别扩增出基因aspC的上游同源臂和下游同源臂，使用引物aspC-P1-up和aspC-P2-down进行融合PCR，采用步骤1获得连接片段UaspC-Ptrc-DaspC。
(2)构建pTarget-aspC-sg载体
以pTarget质粒为模板，以aspC-PAM-up和aspC-PAM-down为引物，扩增出能够表达靶定目的基因aspC的sgRNA，构建pTarget-aspC-sg突变载体，然后以pTX-XF和pTX-XR为引物将pTarget-aspC质粒线性化。
(3)构建pTarget-Ptrc-aspC质粒
将步骤(1)中的连接片段UaspC-Ptrc-DaspC和步骤(2)中的线性化突变载体pTarget-aspC-sg进行一步克隆，采用步骤一方法获得pTarget-Ptrc-aspC质粒。
(4)构建菌株OAH-2
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将基因aspC的原始启动子替换为强的trc启动子；将pTarget-Ptrc-aspC质粒电转化至含有pCas9载体的OAH-1菌株中，操作步骤采用步骤1方法，以引物aspC-VF和引物aspC-VR进行PCR，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中存在1300bp的DNA条带，确认获得成功替换aspC原始启动子的阳性克隆菌株OAH-2。
3、菌株OAH-3的构建
以菌株OAH-2(E.coli W3110,ΔmetJ,ΔmetI,ΔmetB,ΔthrB,ΔmetA,ΔlysA,ΔlacI::Ptrc-rhtA,ΔiclR,ΔptsG,ΔgalR,Ptrc-metL,Ptrc-thrA,Ptrc-rhtA,Ptrc-eamA,Ptrc-glk,Ptrc-gltB,Δflik::Ptrc-metX,Ptrc-aspC)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，用Ptrc启动子替换asd基因中的原始启动子序列以达到增强asd基因表达的目的。具体操作同实施例1中步骤2。
4、菌株OAH-4的构建
以菌株OAH-3(E.coli W3110,ΔmetJ,ΔmetI,ΔmetB,ΔthrB,ΔmetA,ΔlysA,ΔlacI::Ptrc-rhtA,ΔiclR,ΔptsG,ΔgalR,Ptrc-metL,Ptrc-thrA,Ptrc-rhtA,Ptrc-eamA,Ptrc-glk,Ptrc-gltB,Δflik::Ptrc-metX,Ptrc-aspC,Ptrc-asd)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，用Ptrc启动子替换acs基因中的原始启动子序列以达到增强acs基因表达的目的。具体操作同实施例1中步骤2。
5、菌株OAH-5的构建
以菌株OAH-4(E.coli W3110,ΔmetJ,ΔmetI,ΔmetB,ΔthrB,ΔmetA,ΔlysA,ΔlacI::Ptrc-rhtA,ΔiclR,ΔptsG,ΔgalR,Ptrc-metL,Ptrc-thrA,Ptrc-rhtA,Ptrc-eamA,Ptrc-glk,Ptrc-gltB,Δflik::Ptrc-metX,Ptrc-aspC,Ptrc-asd,Ptrc-acs)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，在原位置对ptsG基因进行回补。具体操作如下：
(1)扩增片段UptsG-ptsG-DptsG
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，使用引物ptsG-P1-up和ptsG-P1-down扩增出基因ptsG片段UptsG-ptsG-DptsG。
(2)构建pTarget-ptsG-sg载体
以pTarget质粒为模板，以ptsG-PAM-up和ptsG-PAM-down为引物，扩增出能够表达靶定目的基因ptsG的sgRNA，构建pTarget-ptsG-sg突变载体，然后以pTX-XF和pTX-XR为引物将pTarget-ptsG质粒线性化。
(3)构建pTarget-ptsG质粒
将步骤(1)中的连接片段UptsG-ptsG-DptsG和步骤(2)中的线性化突变载体pTarget-ptsG-sg进行一步克隆，采用步骤一方法获得pTarget-ptsG质粒。
(4)构建菌株OAH-5
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将基因ptsG的原始启动子替换为强的trc启动子；将pTarget-ptsG质粒电转化至含有pCas9载体的OAH-1菌株中，操作步骤采用步骤1方法，以引物ptsG-VF和引物ptsG-VR进行PCR，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中存在1300bp的DNA条带，确认获得成功替换ptsG原始启动子的阳性克隆菌株OAH-5。
6、菌株OAH-6的构建
以菌株OAH-5(E.coli W3110,ΔmetJ,ΔmetI,ΔmetB,ΔthrB,ΔmetA,ΔlysA,ΔlacI::Ptrc-rhtA,ΔiclR,ΔptsG,ΔgalR,Ptrc-metL,Ptrc-thrA,Ptrc-rhtA,Ptrc-eamA,Ptrc-glk,Ptrc-gltB,Δflik::Ptrc-metX,Ptrc-aspC,Ptrc-asd,Ptrc-acs,ptsG(回补))为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，用Ptrc启动子替换pntAB基因中的原始启动子序列以达到增强pntAB基因表达的目的。具体操作同实施例1中步骤2。
7、菌株OAH-7的构建
以菌株OAH-6(E.coli W3110,ΔmetJ,ΔmetI,ΔmetB,ΔthrB,ΔmetA,ΔlysA,ΔlacI::Ptrc-rhtA,ΔiclR,ΔptsG,ΔgalR,Ptrc-metL,Ptrc-thrA,Ptrc-rhtA,Ptrc-eamA,Ptrc-glk,Ptrc-gltB,Δflik::Ptrc-metX,Ptrc-aspC,Ptrc-asd,Ptrc-acs,ptsG(回补),Ptrc-pntAB)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，导入外源基因fxpk，将基因在yncI位置上替换并将原位启动子替换为Ptrc启动子，重组菌株OAH-7，具体操作同实施例1中步骤1。
8、菌株OAH-8的构建
以菌株OAH-7(E.coli W3110,ΔmetJ,ΔmetI,ΔmetB,ΔthrB,ΔmetA,ΔlysA,ΔlacI::Ptrc-rhtA,ΔiclR,ΔptsG,ΔgalR,Ptrc-metL,Ptrc-thrA,Ptrc-rhtA,Ptrc-eamA,Ptrc-glk,Ptrc-gltB,Δflik::Ptrc-metX,Ptrc-aspC,Ptrc-asd,Ptrc-acs,ptsG(回补),Ptrc-pntAB,Δflik::Ptrc-metX)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，用Ptrc启动子替换pta基因中的原始启动子序列以达到增强pta基因表达的目的。具体操作同实施例1中步骤2。
9、菌株OAH-9的构建
以菌株OAH-8(E.coli W3110,ΔmetJ,ΔmetI,ΔmetB,ΔthrB,ΔmetA,ΔlysA,ΔlacI::Ptrc-rhtA,ΔiclR,ΔptsG,ΔgalR,Ptrc-metL,Ptrc-thrA,Ptrc-rhtA,Ptrc-eamA,Ptrc-glk,Ptrc-gltB,Δflik::Ptrc-metX,Ptrc-aspC,Ptrc-asd,Ptrc-acs,ptsG(回补),Ptrc-pntAB,Δflik::Ptrc-metX,Ptrc-pta)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，敲除edd基因，具体操作如下：
(1)连接片段Uedd-Dedd
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，使用引物edd-P1-up和edd-P1-down、edd-P2-up和edd-P2-down分别扩增出基因edd的上游同源臂和下游同源臂，使用引物edd-P1-up和edd-P2-down进行融合PCR，采用步骤1获得连接片段Uedd-Dedd。
(2)构建pTarget-edd-sg载体
以pTarget质粒为模板，以edd-PAM-up和edd-PAM-down为引物，扩增出能够表达靶定目的基因edd的sgRNA，构建pTarget-edd-sg突变载体，然后以pTX-XF和pTX-XR为引物将pTarget-edd质粒线性化。
(3)构建pTarget-edd质粒
将步骤(1)中的连接片段Uedd-Dedd和步骤(2)中的线性化突变载体pTarget-edd-sg进行一步克隆，采用步骤1方法获得pTarget-edd质粒。
(4)构建菌株OAH-2
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将基因edd的原始启动子替换为强的trc启动子；将pTarget-edd质粒电转化至含有pCas9载体的OAH-8菌株中，操作步骤采用步骤1方法，以引物edd-VF和引物edd-VR进行PCR，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中存在1100bp的DNA条带，确认获得成功替换edd原始启动子的阳性克隆菌株OAH-9。
10、菌株OAH-10的构建
以菌株OAH-9(E.coli W3110,ΔmetJ,ΔmetI,ΔmetB,ΔthrB,ΔmetA,ΔlysA,ΔlacI::Ptrc-rhtA,ΔiclR,ΔptsG,ΔgalR,Ptrc-metL,Ptrc-thrA,Ptrc-rhtA,Ptrc-eamA,Ptrc-glk,Ptrc-gltB,Δflik::Ptrc-metX,Ptrc-aspC,Ptrc-asd,Ptrc-acs,ptsG(回补),Ptrc-pntAB,Δflik::Ptrc-metX,Ptrc-pta,Δedd)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，敲除edd基因，具体操作同实施例1步骤9。
实施例2：菌株OAH-1～OAH-10的摇瓶发酵实验
对上述实施例1构建的菌株(OAH-1、OAH-2、OAH-3、OAH-4、OAH-5、OAH-6、OAH-7、OAH-8、OAH-9、OAH-10)在摇瓶中进行发酵实验测试如图3，以比较各基因型菌株之间生产O-乙酰-L-高丝氨酸的能力。
首先挑取单菌落至10mL LB液体培养基中，在37℃，200rpm恒温振荡培养箱中培养10h，作为摇瓶发酵的种子液。按照5％的接种量接种到含有20mL发酵培养基的500mL摇瓶中，然后加入0.5g无菌CaCO3。在30℃，180rpm恒温摇床中培养48h，针对每个基因型的菌株设置三个平行试验。发酵过程结束后，在摇瓶中取出2mL发酵液于2mL离心管中，室温条件下12000rpm离心2min，其中上清液转移至新的1.5mL离心管中，然后加入2mL超纯水重悬剩余的菌体(含有CaCO3)，再在室温条件下12000rpm离心2min，弃上清。再次重悬沉淀，离心弃上清。最后加入1.6mL超纯水重悬沉淀，并且加入1000μL 1mol/L盐酸，充分混合溶解其中的CaCO3，将此CaCO3溶解的菌液用超纯水稀释20倍，利用分光光度计测量其OD600值，为了保证测量的准确度，每个样品测量三次以减少操作带来的误差。菌株OAH-1～OAH-10的生物量OD600和O-乙酰-L-高丝氨酸及L-高丝氨酸的含量如图3和表2所示。
表2：菌株OAH-1～OAH-10摇瓶发酵结果
| 菌株 | 生物量OD600 | O-乙酰-L-高丝氨酸(g/L) | L-高丝氨酸(g/L) |
| OAH-1 | 11.42 | 8.26 | 1.04 |
| OAH-2 | 12.72 | 8.42 | 1.42 |
| OAH-3 | 12.94 | 7.94 | 1.76 |
| OAH-4 | 12.43 | 10.15 | 1.93 |
| OAH-5 | 13.47 | 8.53 | 0.24 |
| OAH-6 | 14.33 | 10.06 | 1.87 |
| OAH-7 | 14.69 | 10.25 | 0.22 |
| OAH-8 | 13.35 | 9.78 | 0.97 |
| OAH-9 | 12.33 | 10.93 | 1.26 |
| OAH-10 | 14.29 | 11.99 | 0.23 |
根据图3和表2可以看出，相比出发菌株OAH-1，重组大肠杆菌OAH-10生产O-乙酰-L-高丝氨酸的能力有较大提升，在摇瓶发酵中产量由8.26g/L提升至11.99g/L，提高了45.17％。
LB培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水。
摇瓶发酵培养基组成：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO416 g/L、酵母提取物4g/L、KH2PO41g/L、MgSO41 g/L、微量元素溶液1mL/L、氨基酸混合溶液2mL/L(过膜除菌)、CaCO325 g/L(单独灭菌)，溶剂为去离子水，pH值6.8。微量元素溶液组成：FeSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·7H2O0.5g/L、ZnSO40.5 g/L；氨基酸混合溶液：L-thr 5g/L、L-met 2g/L、L-lys 1g/L。
实施例3：菌株OAH-105L发酵罐发酵验证
在5L发酵罐中进行分批补料发酵，图4展示了发酵进程，包括了残糖、生物量(OD600)、O-乙酰-L-高丝氨酸及L-高丝氨酸产量随时间的变化。发酵液中初始15g/L葡萄糖和22.5g/L甘油在13h时基本消耗完毕，当葡萄糖和甘油消耗完毕时，发酵液的pH值升高，当pH大于6.83时开启自动补料，随着补料培养基的加入，pH值逐渐降低并维持在6.80，使培养基中的葡萄糖浓度始终维持在较低的水平(<3g/L)，避免高浓度葡萄糖对菌株细胞生长的抑制作用。发酵结束时O-乙酰-L-高丝氨酸最高产量达到64.47g/L的水平，糖酸转化率为0.47g/g葡萄糖。
所述5L发酵罐培养基的配方为：无水葡萄糖15g/L、甘油22.5g/L、(NH4)2SO410 g/L、Yeast extract 8g/L、KH2PO45 g/L、MgSO42 g/L、甜菜碱2g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、微量元素溶液2mL/L、氨基酸混合溶液2mL/L(过膜除菌)、消泡剂1mL/L。
微量元素溶液组成：FeSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·7H2O 0.5g/L、ZnSO40.5g/L。
氨基酸混合溶液：L-thr 5g/L、L-met 2g/L、L-lys 1g/L。溶剂为去离子水。该过程补料培养基的配方为：无水葡萄糖500g/L、KH2PO45 g/L、(NH4)2SO410g/L、氨基酸混合溶液20mL。氨基酸混合溶液：L-thr 50g/L、L-met 20g/L、L-lys10g/L。
本发明重组大肠杆菌OAH-10在5L发酵罐发酵结束时O-乙酰-L-高丝氨酸最高产量达到64.47g/L的水平，糖酸转化率为0.47g/g葡萄糖，菌体生长量大、发酵时间缩短、糖酸转化率高、发酵成本低、发酵调控简单，为O-乙酰-L-高丝氨酸工业化生产奠定了一定基础，也为发酵生产氨基酸提供一定代谢改造思路。
Claims (10)
1.一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于：由以下方法构建而成：
(1)以重组大肠杆菌HS E.coliW3110为底盘菌，在菌株HS E.coliW3110基因组上假基因位点flik导入高丝氨酸乙酰基转移酶基因metX并用Ptrc启动子进行过表达，得到重组菌株OAH-1；
(2)将重组菌株OAH-1基因组中的aspC基因的原位启动子替换为Ptrc启动子，得到重组菌株OAH-2；
(3)将重组菌株OAH-2基因组中的asd基因的原位启动子替换为Ptrc启动子，得到重组菌株OAH-3；
(4)将重组菌株OAH-3基因组中的acs基因的原位启动子替换为Ptrc启动子，得到重组菌株OAH-4；
(5)在重组菌株OAH-4基因组的原位置对ptsG基因进行回补，得到重组菌株OAH-5；
(6)将重组菌株OAH-5基因组中的PntAB基因的原位启动子替换为Ptrc启动子，得到重组菌株OAH-6；
(7)在重组菌株OAH-6基因组中假基因yncI位点导入双功能磷酸酮醇酶fxpk基因，并利用Ptrc启动子替换原启动子得到重组菌株OAH-7；
(8)将重组菌株OAH-7基因组中pta基因的原位启动子替换为Ptrc启动子，得到重组菌株OAH-8；
(9)敲除重组菌株OAH-8基因组中的edd基因，得到重组菌株OAH-9；
(10)敲除重组菌株OAH-9基因组中的pfkA基因得到重组菌株OAH-10，即所述高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于：所述高丝氨酸乙酰基转移酶基因metX核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于：所述Ptrc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于：所述基因aspC核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述基因asd核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求1所述的一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于：所述基因acs核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述基因ptsG核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求1所述的一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于：所述基因PntAB核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
7.根据权利要求1所述的一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于：所述双功能磷酸酮醇酶fxpk基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
8.根据权利要求1所述的一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于：所述基因pta核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述基因edd核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
9.根据权利要求1所述的一种高产O-乙酰-L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于：所述基因pfkA核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
10.权利要求1～9任一所述重组大肠杆菌在微生物发酵制备O-乙酰-L-高丝氨酸中的应用。
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