KR101584414B1 - 알칼리 공급원 - Google Patents

알칼리 공급원 Download PDF

Info

Publication number
KR101584414B1
KR101584414B1 KR1020137007871A KR20137007871A KR101584414B1 KR 101584414 B1 KR101584414 B1 KR 101584414B1 KR 1020137007871 A KR1020137007871 A KR 1020137007871A KR 20137007871 A KR20137007871 A KR 20137007871A KR 101584414 B1 KR101584414 B1 KR 101584414B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
glu
ala
gln
lys
Prior art date
Application number
KR1020137007871A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130100301A (ko
Inventor
크리스티안 샨츠
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
Publication of KR20130100301A publication Critical patent/KR20130100301A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101584414B1 publication Critical patent/KR101584414B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

pH 조절을 위해 이용된 알칼리 용액에 아미노산을 첨가하는 것을 포함하는 박테리아 세포를 배양하는 방법이 보고된다. 또한, 한 측면은 a) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한 박테리아 세포를 제공하는 단계, b) 제공된 세포를 배양하는 단계, c) 배양하는 동안 아미노산을 포함하는 염기성 용액으로 pH 값을 조정하는 단계, d) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하여 폴리펩티드를 생산하는 단계를 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법이다.

Description

알칼리 공급원{ALKALINE FEED}
본 발명은 폴리펩티드의 생산을 위한 화학적으로 정의된 배지에서 대장균(Escherichia coli) 균주와 같은 원핵세포의 고세포밀도 배양을 위한 방법을 개시하며, 이때 농축된 알칼리 용액을 통하여 배양 배지의 pH를 조절하면서 동시에 질소원으로서의 역할을 하는 아미노산이 공급된다.
최근 단백질의 생산이 점차 증가되어 오고, 단백질이 가까운 장래에 다양한 질병의 치료에 사용할 수 있는 치료법의 가장 큰 군이 될 가능성이 높다. 단백질의 영향은 특정 표적 인식 및 결합 기능과 같은 특이성으로부터 나타난다.
세포 배양은 발효 공정에 사용되어 물질, 특히 단백질을 생산한다. 세포 배양이 유전적으로 변경되지 않고 그들 고유의 물질대사 생성물을 형성하는 공정과 유기체가 더 많은 양의 단백질과 같은 그들 고유의 물질을 생산하거나 외부 물질을 생산하는 방식으로 유전적으로 변경되는 공정 사이에 차이가 있다. 물질을 생산하는 유기체는 유기체의 생존을 보장하고 목적 표적 화합물의 생산을 가능하게 하는 영양소 배지와 함께 공급된다. 다양한 배양 배지가 특정 숙주의 최적의 배양을 가능케 하는 목적을 위해 공지되어 있다
대장균 고세포밀도 배양이 문헌[Riesenberg, D., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991) 380-384] 및 [Horn, U., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 46 (1996) 524-532]에 의하여 보고되었다. 미생물의 고세포밀도 배양이 문헌[Riesenberg, D. 및 Guthke, R., Appl. Microbiol. Biotechnol. 51 (1999) 422-430]에서 보고되었다. 고세포밀도로 대장균을 성장시키는 것은 문헌[Shiloach, J. 및 Fass, R., Biotechnol. Advances 23 (2005) 345-357]에 의하여 검토되었다.
국제특허출원공개 제91/10721호에서 교반 보일러 발효기에서 대장균의 고세포밀도 발효에 대한 공정이 보고되었다. 국제특허출원공개 제97/29190호에서 플라스미드 DNA 생산 및 정제 방법이 보고되었다. 제DD 295867호에서 용존 산소 농도 및 산소 전송 속도를 제어함으로써 호기성 침수 미생물의 성장을 제어하는 것이 보고되었다. 유럽특허 제0 866 876호에서 고세포밀도 발효에 의하여 대장균에서의 재조합 단백질의 제조 공정이 보고되었다.
국제특허출원공개 제03/048374호에서 방향족 아미노산 대사산물 또는 그의 유도체의 생산 공정이 보고되었다. 국제특허출원공개 제97/21829호에서 고세포밀도 발효에 의한 대장균에서 재조합 단백질의 제조 공정이 보고되었다.
아미노산이 알칼리 용액 중의 배양 배지에 첨가되는 경우, 원핵세포, 특히 아미노산 영양요구성 대장균 K12 균주는 화학적으로 정의된 배지에서 고세포밀도로 배양될 수 있다는 것이 발견되었다.
본원에 보고된 한 측면은 박테리아 세포, 특히 대장균 세포를 고세포밀도에서 배양하는 방법이며, 이때 세포는 재조합 폴리펩티드를 발현하고, 이때 배양하는 동안 배양은 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된 아미노산의 알칼리 용액의 첨가를 포함하며,
이때 아미노산은 20 ℃ 및 중성의 pH에서 그의 물 중에서의 용해도보다 큰 알칼리 용액 중에서의 농도를 갖고,
이때 배양된 박테리아 세포의 건조 세포 중량이 배양 중의 한 시점에서 20 g/l 이상이다.
본원에 보고된 한 측면은
a) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한 박테리아 세포, 특히 대장균 세포를 제공하는 단계,
b) 제공된 세포를 배양하는 단계,
c) 배양하는 동안 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 알칼리 용액으로 pH 값을 조정하는 단계,
d) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하여 폴리펩티드를 생산하는 단계
를 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법이다.
본원에 보고된 또다른 측면은 박테리아 세포를 배양하는 동안에 pH 값을 조정하기 위한 아미노산을 포함한 알칼리 용액의 용도이다.
또한 본원에 보고된 한 측면은 박테리아 세포의 배양에서 공급원으로서의 아미노산의 알칼리 용액의 용도이며, 이때 아미노산은 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택되고, 배양은 20 g/l 이상의 건조 세포 중량까지이다.
하기는 이전에 개요를 보여줬던 모든 측면의 구체적인 실시양태이다.
한 실시양태에서 아미노산은 물에 잘 녹지 않는 아미노산이다. 한 실시양태에서 박테리아 세포는 아미노산 영양요구성 세포이고, 상기 영양요구성은 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된 아미노산에 대한 것이다. 또다른 실시양태에서 박테리아 세포는 대장균 세포 또는 그의 돌연변이체이다. 추가의 실시양태에서 아미노산은 20 ℃에서 50 g/l 이하의 물 중에서의 용해도를 갖는다. 추가의 실시양태에서 아미노산은 20 ℃에서 40 g/l 이하의 물 중에서의 용해도를 갖는다. 또한 한 실시양태에서 아미노산은 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서 아미노산은 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 류신, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된다. 한 실시양태에서 아미노산은 류신이다. 여전히 또다른 실시양태에서 아미노산은 20 ℃에서 물 중에서의 용해도보다 높은 알칼리 용액 중에서의 농도를 갖는다. 한 실시양태에서 상기 용해도는 두 배 더 높으며, 또다른 실시양태에서 20 ℃에서 물 중에서의 용해도보다 세 배 더 높다. 또 다른 실시양태에서 용해도는 20 ℃ 및 pH 6 내지 8에서 물 중에서의 용해도보다 더 높다. 한 실시양태에서 아미노산은 알칼리 용액 중에서 25 g/l 이상의, 또는 추가의 실시양태에서 30 g/l 이상의, 또는 여전히 또다른 실시양태에서 35 g/l 이상의 농도를 갖는다. 한 실시양태에서 아미노산은 알칼리 용액 중에서 45 g/l 이상의 농도를 갖는다. 한 실시양태에서 아미노산은 알칼리 용액 중에서 약 50 g/l의 농도를 갖는다. 추가의 실시양태에서 알칼리 용액은 9 이상의, 추가의 실시양태에서 10 이상의, 및 여전히 또다른 실시양태에서 10.5 이상의 pH 값을 갖는다. 한 실시양태에서 알칼리 용액은 5% (w/v) 초과의, 또는 10% (w/v) 이상의, 또는 15% (w/v) 이상의 암모니아 용액이다. 한 실시양태에서 알칼리 용액은 물 중에서 약 12.5% (w/v)의 암모니아 용액이다. 또한 한 실시양태에서 폴리펩티드는 인간 아폴리포 단백질 A1 또는 그의 유도체이다. 추가의 실시양태에서 아폴리포 단백질 A1은 서열 번호 01 내지 서열 번호 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서 폴리펩티드는 서열 번호 01, 서열 번호 02, 서열 번호 34, 또는 서열 번호 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
도 1에서 분리된 아미노산 공급에 관한 실시예 3의 파라미터를 도시한다.
도 2에서 분리된 아미노산 공급에 관한 실시예 3의 파라미터를 도시한다.
도 3에서 결합된 아미노산 공급에 관한 실시예 4의 파라미터를 도시한다.
도 4에서 결합된 아미노산 공급에 관한 실시예 4의 파라미터를 도시한다.
본원에서 원핵세포, 예컨대 아미노산 영양요구성 박테리아 세포를 배양하는 방법이 보고되고, 이때 (영양요구성인 세포를 위하여) 하나 이상의 아미노산이 알칼리 용액 내에 첨가된다.
알칼리 용액 중에서 (세포가 그것에 대해 영양요구성을 갖는 것과 같은) 하나 이상의 아미노산을 포함하는 공급원이 배양 배지에 첨가된다면 원핵세포, 예컨대 아미노산 영양요구성 대장균 K12 균주가 고세포밀도에서 배양될 수 있다는 것을 발견했다. 이것은 아미노산이 물에 잘 녹지 않을 때 특히 유리하고, 용해도는 아미노산을 알칼리 용액 중에 용해시킴으로써 증가될 수 있다. 동시에 상기 알칼리 용액은 배양 배지의 pH 값을 조정하기 위하여 사용될 수 있다. 고농축된 단일 공급원 용액 중에서 아미노산 용액과 pH 조정 용액을 결합함으로써 추가된 부피가 감소될 수 있으며, 따라서 원핵세포의 고세포밀도 배양을 허용하게 된다. 추가적으로 알칼리 공급원 용액 중에서 아미노산의 45 g/l 이상의 농도는 재조합 폴리펩티드의 증가된 생산을 야기한다는 것이 발견되었다.
하나의 실시양태에서 원핵세포를 배양하는 방법은
a) 원핵세포를 제공하는 단계,
b) 원핵세포를 배양하는 단계,
c) 원핵세포를 배양하는 동안 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 알칼리 용액으로 pH 값을 조정하는 단계
를 포함한다.
"아미노산 영양요구성 원핵세포"는, 예컨대, 상응하는 생합성 경로의 단백질을 암호화하는 구조 유전자를 포함하는 유전자 자리의 돌연변이 또는 결실 때문에 필수 아미노산을 합성할 수 없는 원핵세포이다. 배양 배지에 각각의 아미노산의 첨가 없이 세포가 증식할 수 없다. 영양요구성은 임의의 아미노산에 대한 것이 될 수 있다. 원핵세포는 또한 하나 이상의 아미노산에 대한 영양요구성이 될 수 있다. 따라서, 하나의 실시양태에서 아미노산 영양요구성 원핵세포는 하나 이상의 아미노산에 대한 영양요구성이다. 또다른 실시양태에서 아미노산 영양요구성 원핵세포는 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상, 다섯 이상의 아미노산에 대한 영양요구성이다. 추가의 실시양태에서 아미노산 영양요구성 원핵세포는 다섯까지, 또는 열까지, 또는 열다섯까지의 아미노산에 대한 영양요구성이다. 또다른 실시양태에서 아미노산 영양요구성 원핵세포는 하나 내지 다섯의 아미노산, 또는 하나 내지 셋의 아미노산, 또는 하나 내지 둘의 아미노산, 또는 하나의 아미노산, 또는 둘의 아미노산, 또는 셋의 아미노산, 또는 넷의 아미노산에 대한 영양요구성이다. 아미노산 영양요구성 원핵세포는 박테리아 세포의 한 실시양태 중에 있다.
한 실시양태에서 세포는 대장균 세포, 또는 바실러스(Bacillus) 세포, 또는 락토바실러스(Lactobacillus) 세포, 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 세포, 또는 효모 세포(사카로마이세스(Saccharomyces), 캔디다(Candida), 또는 피키아(Pichia))이다. 추가의 실시양태에서 세포는 대장균 세포, 또는 바실러스 서브틸리스(subtilis) 세포, 또는 락토바실러스 아시도필러스(acidophilus) 세포, 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(glutamicum) 세포, 또는 피키아 파스토리스(pastoris) 효모 세포이다.
용어 "값을 조정하는 것"은 배양 내내 각각의 값이 예정된 수준에서 유지되는 것을 나타낸다. 즉, 값이 미리 설정된 수용 범위 밖에 있는지 값을 연속적으로 또는 예정된 일정한 시간 간격에, 수정액의 첨가에 의한 변화를 점검한다. 예를 들어, "pH 값을 조정하는 것"은 배양 배지의 pH 값이 정기적으로 고정된 시간 지점에서, 즉, 고정된 시간 간격으로 결정된다는 것을 나타내고, 만약 결정된 pH 값이 수용 범위 밖에 있는 경우(예컨대, 0.1 pH 단위 또는 0.15 pH 단위 또는 0.2 pH 단위), pH 값은 수정액(예컨대, 산 또는 알칼리 용액)을 첨가함으로써 예정된 pH 값으로 재조정된다.
원핵세포를 배양하는 방법 및 또한 아미노산 영양요구성 원핵세포를 배양하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예컨대, 문헌[Riesenberg, D., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991) 380-384] 참조). 배양은 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 한 실시양태에서 배양은 배치 배양, 유가 배양, 관류 배양, 반연속식 배양 또는 완전한 또는 부분적 세포 정체로 수행된다. 배양을 위한 유일한 요구는 알칼리 용액이 반드시 첨가되어야 한다는 것이다. 유일한 공급원 용액 또는 결합된 공급원 및 pH 조정 용액으로서 첨가될 수 있다.
세포 배양의 시작을 위해 사용된 배양 배지는, 공급되는 아미노산의 농도가 배지 중에 5 g/l 미만 또는 7.5 g/l 미만 또는 10 g/l 미만인, 당업자에게 공지된 임의의 배지가 될 수 있다. 각각의 화합물의 농도가 세포의 성장과 함께 부정적인 간섭이 예상될 수 없는 방식으로 선택되어야 한다는 것이 지적되어야 한다. 한 실시양태에서 배지는 정의된 포도당-미네랄염 배지이다.
한 실시양태에서 배양은 고세포밀도 배양이다. 용어 "고세포밀도 배양"은 배양된 원핵세포의 건조 세포 중량이 배양의 한 시점에서 10 g/l 이상이 되는 배양 방법을 나타낸다. 한 실시양태에서 건조 세포 중량은 배양 중 한 시점에서 20 g/l 이상, 또는 50 g/l 이상, 또는 100 g/l 이상, 또는 100 g/l 초과이다. 이러한 고세포밀도 상태에 도달하기 위하여 배양하는 동안 첨가되는 공급원 및/또는 조정 용액의 부피가 가능한 한 작아야 한다. 건조 세포 중량의 결정 방법은 예컨대, 문헌[Riesenberg, D., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 34 (1990) 77-82]에 보고되어 있다.
제공된 배지 중의 영양소는 배양하는 동안 대사작용을 할 것이고, 제한을 피하기 위하여 보충되어야 한다. 만약 아미노산이 저조한 용해도를 갖는다면 오직 적게 농축된 공급원 용액만이 제조되어 첨가될 수 있다. 요구되는 양의 아미노산을 제공하기 위하여 큰 부피의 공급원 용액이 첨가되어야 한다. 이것은 총 배양 부피의 증가, 배양액의 희석을 야기하고, 따라서 고세포밀도 공정에 불리하다.
20 개의 자연적으로 발생하는 아미노산의 용해도가 하기 표 1에 나열되어 있다.
아미노산 물 중에서의 용해도
[g/l] at [℃] 		용해도
[우수함/괜찮음/저조함]
알라닌 166.5 25 우수함
아르기닌 150 20 우수함
아스파테이트 22 20 저조함
아스파트산 4 20 저조함
시스테인 280 20 우수함
글루타민 26 18 저조함
글루탐산 11 25 저조함
글리신 225 20 우수함
히스티딘 38 20 저조함
이소류신 40 20 저조함
류신 24 20 저조함
리신 300 20 우수함
메티오닌 48 20 저조함
페닐알라닌 27 20 저조함
프롤린 1500 20 우수함
세린 364 20 우수함
트레오닌 90 20 괜찮음
트립토판 10 20 저조함
티로신 0.4 20 저조함
발린 88 20 괜찮음
아미노산 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신의 용해도는 50 g/l 미만이고, 따라서 이러한 아미노산들은 물에서 저조한 용해도를 가지고 있다고 칭해진다.
예를 들어, 아미노산 류신은 20 ℃에서 물 중에서 24 g/l의 용해도를 가지고, 따라서 저조하게 용해된다. 12.5% (w/v) 암모니아를 포함한 알칼리 용액에서 용해도는 76 g/l으로 증가하고, 따라서 물 중에서의 용해도의 3배 이상이다. 동시에 요구되는 공급원 부피는 60% 초과까지 감소된다. 만약 동시에 알칼리 용액이 또한 사용되어 배양물의 pH 값을 조정한다면 첨가된 부피는 그 이상 감소될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 티로신은 20 ℃에서 물 중에서 0.4 g/l의 용해도를 가지고, 따라서 저조하게 용해된다. 12.5% (w/v) 암모니아를 포함하는 알칼리 용액에서 용해도는 39 g/l으로 증가하고, 따라서 물 중에서의 용해도의 약 100배이다. .
한 실시양태에서 아미노산은 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및/또는 티로신이다. 또한 한 실시양태에서 아미노산은 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 류신, 트립토판 및/또는 티로신이다. 한 실시양태에서 아미노산은 류신이다. 한 실시양태에서 아미노산은 20 ℃에서 약 pH 7의 물 중에 저조하게 용해된 아미노산이다. 또한 한 실시양태에서 아미노산은 류신 및 프롤린이거나, 또는 아미노산은 류신 및 프롤린 및 트립토판이다. 추가의 실시양태에서 아미노산은 알칼리 용액에서 20 ℃에서 물 중에서의 용해도보다 높은 용해도를 갖는다. 추가의 실시양태에서 알칼리 용액 중에서의 용해도는 20 ℃에서 물 중에서의 용해도의 2 배 내지 10 배이다. 한 실시양태에서 아미노산은 40 g/l 이하의 물 중에서의 용해도를 갖는다. 또다른 실시양태에서 아미노산은 30 g/l 이하의 물 중에서의 용해도를 갖는다. 또한 한 실시양태에서는 아미노산은 25 g/l 이상의 알칼리 용액 중에서의 용해도를 갖는다. 추가의 실시양태에서 아미노산은 30 g/l 이상의 알칼리 용액 중에서의 농도를 갖는다. 또다른 실시양태에서 아미노산은 35 g/l 이상의 알칼리 용액 중에서의 농도를 갖는다. 또한 실시양태에서 아미노산은 50 g/l 이상의 알칼리 용액 중에서의 용해도를 갖는다.
하기 표 2에서 배양은 보여준 상이한 공급 방식으로 얻어진 동일한 류신 및 프롤린 영양요구성 대장균 세포의 10 l 작업량을 가진 배양 용기를 야기한다.
실험 공급원 총 바이오매스
(건조 물질)
[g/l] 		재조합 단백질 수율
[g/l] 		최종 배양 부피
[l]
1 분리된 공급원:
- 20 g/l L-류신
- 100 g/l L-프롤린		 49.4 10.0 11.8
2 분리된 공급원:
- 20 g/l L-류신
- 100 g/l L-프롤린		 50.6 9.0 12.2
3 결합된 공급원:
50 g/l L-류신 및 50 g/l L-프롤린을 포함하는 12.5% (w/v) NH3 용액		 75.7 16.5 10.2
4 결합된 공급원:
33 g/l L-류신 및 33 g/l L-프롤린을 포함하는 12.5% (w/v) NH3 용액		 56.5 13.5 9.3
두 아미노산이 분리된 공급원으로서 배양 배지에 첨가된 실험 1 및 2가, 아미노산이 동시에 사용되어 배양 배지의 pH 값을 조정하는 알칼리 공급원으로서 첨가된 실험 3 및 4에 비하여, 배양 말에 얻은 총 바이오매스 및 재조합 단백질의 수율이 더 낮다는 것을 알 수 있다. 또한 실험 3 및 4에서의 최종 배양 부피는 실험 1 및 2에서와 같이 배양 용기의 작업량을 초과하지 않는다.
한 실시양태에서 알칼리 용액은 12.5% (w/v) 암모니아 수용액이고 약 50 g/l 이상의 농도로 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서 알칼리 용액은 약 50 g/l의 농도로 류신 및 프롤린을 포함한다.
본원에 보고된 방법에서 사용될 수 있는 원핵세포는 하나 이상의 아미노산 영양요구성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 류신 생합성 경로가 결핍된 대장균 세포는 LeuB6 결핍된 세포 13-6, χ148, χ156, χ2224, χ462, χ463, χ474, χ478, χ515, χ65, χ697, χ760, 2000k MSE248, 342-167, 342MG, 679-680, A586, A592, A593, AA100, AA7852, AA787, AB1102, AB1111, AB1115, AB1122, AB1129, AB113, AB1132, AB1133, AB114, AB1157, AB1157-D, AB1314, AB1330, AB1331, AB1881, AB1884, AB1885, AB188, CP78, CP79, CR34 Thy-, CR34 Thy- SR, CR34/308, CR34/313, CR34/399, CR34/43, CR34/454, CR34/500, CR34/7a, CS130, CS312, CS419, CS425, CS426, CS460, CS471, CS472, CS50, CS81, CS85, CSR06, CSR603, CSR603/pDR1996, CT28-3b, DA10, DA11, DB1161, DB1257, DE1878, DE1882, DE2345, DF225, DF41, JRG94, JS10 C600r-m-, T6R, P678SSR pro-, PA20SR, PA200 SR, PA201 SR, PA214SRT6R, PA265 SR, PA309, PDE70, PA340, PA340/T6, PA360, PA414, PAM161, PAM162, PAM163, PAM164, PAM660, PAT84, PB349, PB69, PC1, PC2, PC3, PC5, PC6, PC8, PJ1, PJ2, PJ3, PJ4, PJ5, PJ C600 (= CRSR), W208 SR AzR, W2660, LAM-, W945his, WA2127, WA2379, WA2548, WA2552, WA2574, WA2899, WA921, WA946, WA960, Y10, Y46, Y53, Y70, YYC100으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서 원핵세포는 대장균 K12 세포 또는 대장균 B 세포이다.
한 실시양태에서 알칼리 용액은 강한 알칼리 용액이다. 또다른 실시양태에서 알칼리 용액은 pH 9 이상, 또는 pH 10 이상, 또는 pH 10.5 이상의 pH 값을 갖는다. 추가의 실시양태에서 알칼리 용액 중에서의 아미노산의 용해도는 물 중에서의 아미노산의 용해도의 두 배 이상이다.
한 실시양태에서 본원에 보고된 폴리펩티드를 생산하는 방법은
a) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한 아미노산 영양요구성 박테리아 세포를 제공하는 단계,
b) 제공된 세포를 배양하는 단계,
c) 배양하는 동안 박테리아 세포가 영양요구성을 갖는 아미노산을 포함하는 알칼리 용액으로 pH 값을 조정하는 단계,
d) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하여 폴리펩티드를 생산하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시양태
1. 폴리펩티드를 발현하는 대장균 세포를 배양하는 방법으로서,
배양하는 동안에 배양이 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된 아미노산의 알칼리 용액의 첨가를 포함하고;
상기 아미노산이 20 ℃ 및 중성의 pH에서 물 중에서의 용해도 초과의 알칼리 용액 중에서의 농도를 가지며, 상기 아미노산이 30 g/l 이상의 농도를 가지고;
상기 알칼리 용액이 10% (w/v) 이상의 암모니아 용액이고;
상기 배양된 박테리아 세포의 건조 세포 중량이 배양 중의 한 시점에서 20 g/l 이상인, 방법.
2. a) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한 대장균 세포를 배양하는 단계;
b) 배양하는 동안 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 알칼리 용액으로 pH 값을 조정하는 단계; 및
c) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하여 폴리펩티드를 생산하는 단계
를 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서,
상기 아미노산이 알칼리 용액 중에서 30 g/l 이상의 농도를 가지고;
상기 알칼리 용액이 10% (w/v) 이상의 암모니아 용액인, 방법.
3. 실시양태 1 및 2 중 어느 하나에 따른 방법으로서,
박테리아 세포가 아미노산 영양요구성 세포이고, 상기 영양요구성이 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된 아미노산에 대한 것인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 방법으로서,
알칼리 용액이 9 이상의 pH 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 방법으로서,
폴리펩티드가 인간 아폴리포 단백질 A1 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 실시양태 5에 따른 방법으로서,
아폴리포 단백질 A1이 서열 번호 01 내지 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 실시양태 6에 따른 방법으로서,
아폴리포 단백질 A1이 서열 번호 01, 02, 34 및 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 방법으로서,
아미노산이 약 50 g/l의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 방법으로서,
알칼리 용액이 물 중 약 12.5% (w/v)의 암모니아의 암모니아 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 방법으로서,
아미노산이 류신인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 방법으로서,
알칼리 용액이 류신 및 프롤린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 방법으로서,
알칼리 용액이 약 12.5% (w/v)의 암모니아 용액이고, 아미노산 류신 및 프롤린을 각각 약 50 g/l의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 박테리아 세포의 배양에서 공급원으로서 아미노산의 알칼리 용액의 용도로서,
아미노산이 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된 것이고, 배양이 건조 세포 중량 20 g/l 이상까지 일어나고, 알칼리 용액 중에서 아미노산이 30 g/l 이상의 농도를 가지고, 알칼리 용액이 10% (w/v) 이상의 암모니아 용액인 용도.
14. 실시양태 13에 따른 용도로서,
박테리아 세포가 아미노산 영양요구성 세포이고, 상기 영양요구성이 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된 아미노산에 대한 것인 것을 특징으로 하는 용도.
15. 실시양태 2 내지 12 중 어느 하나에 따른 방법으로서,
대장균 세포가 아미노산 영양요구성 대장균 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
하기 실시예, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 명시되어 있다. 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않고 명시된 절차 내에서 수정될 수 있다는 것이 이해된다.
재료 및 방법
배양물의 광학밀도를 DR2800 광도계(Hach-Lange, 독일 뒤셀도르프)로 578 nm에서 측정하였다. 단백질 농도를 SDS-Page 겔 상의 발효 샘플 내의 표준 단백질 밴드의 부피를 생산된 단백질의 밴드 부피와 비교함으로써 농도계에 의해 결정하였다.
실시예 1
암모니아 용액 내의 류신의 용해도 결정
류신의 계산된 양을 500 ml 플라스크에 재어 넣었다. 250 ml 탈이온수를 첨가한 후에 상기 용액을 오토클레이브에 의해 살균소독하였다. 그 후에 250 ml의 25% (w/v) 암모니아 용액을 첨가하고 류신이 용해되었는지 여부를 결정하였다. 류신의 용해 후에 용액의 최종 부피를 결정하였다. 만약 500 ml로부터 현저하게 벗어났다면 감소된 양의 물로 용액을 다시 제조하였다(표 3 참조).
Figure 112013026822514-pct00001
실시예 2
대 장균 발현 플라스미드의 제작 및 설명
테트라넥틴-아폴리포 단백질 A-Ⅰ 융합 폴리펩티드를 재조합 수단을 통해 제작하였다. N-말단에서 C-말단 방향으로 발현된 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기와 같다:
- 아미노산 메티오닌 (M),
- CDLPQTHSL (서열 번호 36)의 아미노산 서열을 갖는 인터페론 서열의 조각,
- GS 링커(linker),
- HHHHHH (서열 번호 37)의 아미노산 서열을 갖는 헥사-히스티딘 태그,
- GS 링커,
- VVAPPAP (서열 번호 38)의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위, 및
- 서열 번호 02의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아폴리포 단백질 A-I.
상기 기재된 테트라넥틴-아폴리포 단백질 A-I 융합 폴리펩티드는 테트라넥틴-아폴리포 단백질 A-I 융합 폴리펩티드가 IgA 프로테아제를 사용한 생체 외 효소 절단에 의해 방출된 것으로부터 유래된 전구체 폴리펩티드이다.
융합 유전자를 암호화하는 전구체 폴리펩티드를 적당한 핵산 분절을 연결함으로써 공지된 재조합 방법 및 기술로 조립하였다. 화학적 합성으로 제작된 핵산 서열을 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 확인하였다. 테트라넥틴-아폴리포 단백질 A-I의 생산을 위한 발현 플라스미드를 하기와 같이 제조하였다.
대 장균 발현 플라스미드의 제작
플라스미드 4980 (4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)은 대장균에서 코어-스트렙트아비딘(코어-스트렙트아비딘) 발현을 위한 발현 플라스미드이다. 그것은 플라스미드 1966 (1966-pBRori-URA3-LACI-T-반복; 유럽특허 제B 1 422 237호에 보고됨)으로부터 유래된 3142 염기쌍(bp) 길이의 EcoRI/CelII-벡터 조각의, EcoRI/CelII-조각을 암호화하는 435 염기쌍 길이의 코어-스트렙트아비딘과의 라이게이션(ligation)에 의하여 발생된다.
코어-스트렙트아비딘 대장균 발현 플라스미드는 하기 요소들을 포함한다:
- 대장균 내에서 복제를 위한 벡터 pBR322로부터 복제의 개시점(문헌[Sutcliffe, J.G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90]에 따르면, 염기쌍 위치 2517-3160에 상응함),
- 대장균 pyrF 돌연변이 균주(우라실 영양요구성)의 상보성에 의한 플라스미드 선택을 허용하는 오로티딘 5'-포스페이트 디카복실라아제를 코딩하는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 URA3 유전자(문헌[Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124]),
- 상기한 문헌[Stueber, D., et al.]에 따른 합성 리보솜 결합 부위를 포함하는 T5 혼성 프로모터(문헌[Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433] 및 [Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152]에 따른 T5-PN25/03/04 혼성 프로모터);
코어-스트렙트아비딘 유전자;
2개의 박테리오파지-유래된 전사 종결자, λ-T0 종결자(문헌[Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414]) 및 fd-종결자(문헌[Beck, E. 및 Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58])
를 포함하는 코어-스트렙트아비딘 발현 카세트,
- 대장균으로부터의 lacI 억제자 유전자(문헌[Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769]).
단일 플랭킹(flanking) EcoRI 및 CelII 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 사용하여 벡터 4980으로부터 코어-스트렙트아비딘 구조 유전자를 절제하고 3142 염기쌍 길이의 EcoRI/CelII-4980 벡터 조각에 전구체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 인접한 EcoRII/CelII 제한 부위를 삽입함으로써 테트라넥틴-아폴리포 단백질 A-I 전구체 폴리펩티드의 발현을 위한 최종 발현 플라스미드를 제조하였다.
실시예 3
분리된 용액으로서 류신 및 프롤린의 공급
본 참조 실시예에서 아미노산 L-류신 및 L-프롤린의 분리된 공급과 결합하여 상기한 문헌[Riesenberg, et al., 1991]에 보고된 고세포밀도 배양 방법을 사용하여 영양요구성 대장균 균주의 배양을 수행하였다.
대장균 K12 균주 CSPZ-2(leuB, proC, trpE, th-1, ΔpyrF)를 사용하였다. 치료용 단백질의 생산을 위해 균주를 발현 플라스미드로 형질전환하였고, 1차 종자은행으로서 정의된 전배양 배지에서 대략 1의 (578 nm에서 결정된) 광학밀도로 자란 균주 1 ml 및 글리세롤 85%(v/v) 1 ml를 함유하는 앰플에 유지시켜 -80 ℃에서 저장하였다.
정의된 전배양 배지는 1.0 g/l L-류신, 1.0 g/l L-프롤린 및 1.0 mg/l 티아민-HCl로 보충된, 문헌[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 따른 M9 배지였다.
발효를 위하여 상기한 문헌[Riesenberg, et al., 1991]에 따른 배치 배지를 사용하였다:
27.6 g/l 포도당,
13.3 g/l KH2PO4,
4.0 g/l (NH4)2HPO4,
1.7 g/l 구연산염,
1.2 g/l MgSO4*7H2O,
60 mg/l 구연산제3철,
2.5 mg/l CoCl2*6H2O,
15 mg/l MnCl2*4H2O,
1.5 mg/l CuCl2*2H2O,
3 mg/l H3BO3,
2.5 mg/l Na2MoO4*2H2O,
8 mg/l Zn(CH3COO)2*2H2O,
8.4 mg/l 티트리플렉스(Titriplex) III, 및
1.3 ml/l 신페로닉(Synperonic) 10% 소포제.
배치 배지를
5.4 mg/l 티아민-HCl, 및
1.2 g/l l-류신 및 l-프롤린 각각
으로 보충하였다.
공급원 1 용액은
700 g/l 포도당, 및
19.7 g/l MgSO4*7H2O
를 함유하였다.
공급원 2 용액은
20 g/l l-류신
을 함유하였다.
공급원 3 용액은
100 g/l l-프롤린
을 함유하였다.
아미노산을 칭량하고 아미노산을 물에 용해시키고 용액을 오토클레이브함으로써 공급원 2 및 3을 제조하였다. 그 후에, 상기 용액의 pH 값을 공급원 2는 약 6.15 및 공급원 3은 약 6.43이 되도록 결정하였다.
pH 조절을 위해 이용된 알칼리 용액은 12.5% (w/v) NH3 수용액이었다.
모든 요소를 탈이온수에 용해하였다.
3 개의 칸막이가 있는 1000 ml 삼각 플라스크 내에 전배양 300 ml M9-배지에 2 ml의 1차 종자은행 앰플을 접종하였다. 배양을 회전식 진탕기에서 13 시간 동안 37 ℃에서 (578 nm에서 결정된) 광학밀도가 1 내지 3에 도달할 때까지 수행하였다.
주 발효를 10 l 바이오스탯(Biostat) C DCU3 발효기(싸토리우스(Sartorius), 독일 멜중엔)에서 수행하였다. 6.4 l 살균한 배치 배지에 300 ml 전배양물을 더한 것으로 시작하여 상기 배치 발효를 37 ℃, pH 6.9 ± 0.2, 500 mbar 및 통기 속도 10 l/min에서 수행하였다. 초기에 보충된 포도당이 고갈되고 난 후 온도를 28 ℃로 바꾸고, 50%(DO-stat, 예컨대, 하기한 문헌[Shay, L.K., et al., 1987] 참조)에서 유지되는 용해된 산소(pO2)로, 및 일정하게 교반 속도(10 시간 내에 550 rpm에서 1000 rpm으로 및 16 시간 내에 1000 rpm에서 1400 rpm으로) 및 통기 속도(10 시간 내에 10 l/min에서 16 l/min으로 및 5 시간 내에 16 l/min에서 20 l/min으로)를 증가시키면서 공급원 1을 첨가함으로써 유가배양(fed-batch) 방식의 발효를 시작하였다. 추가의 아미노산의 공급을 pH가 조절 하한, 즉, pH 6.70에 도달했을 때, 공급원 2(14 시간 동안 33.8 ml/h로 시작한 다음 97.6　ml/h로 증가시켰음) 및 공급원 3(14 시간 동안 6.8 ml/h로 시작한 다음 19.　5 ml/h로 증가시켰음)의 첨가와 함께 시작하였다. 유량을 분리된 발효 실행(실시예 4 참조)으로부터 계산하여, 공급 전략으로부터 독립적으로 각각 정확히 동일한 양의 아미노산을 배양물에 도포하였다. 1 mM IPTG를 70의 광학밀도에서 첨가함으로써 재조합 치료용 단백질의 발현을 유도하였다.
이 발효의 파라미터 플롯이 도 1 및 2에 도시되었다.
접종 및 그 후 짧은 정체기(lag-phase) 후에, 세포가 최대 비성장속도 μmax = 0.30 l/h로 자랐다. 8 시간의 배양 후 pH 조절 하한에 도달하였고, pH를 12.5% NH4OH 용액의 첨가로 6.70에서 조절하였다. 공급원 2 및 3을 첨가함으로써 동시에 아미노산 공급을 시작하였다. 16 시간 후 포도당을 모두 사용하였고, 이는 pO2-값의 급격한 증가에 의하여 나타났다. 이때 배양 온도를 37 ℃에서 28 ℃로 바꿨다. 추가의 15 분 후, pO2-공급원 조절을 시작했고 연속적으로 교반 및 통기 속도를 각각 최대값인 1400 rpm 및 20 l/min으로 증가시키는 동안 공급원 1의 첨가에 의하여 pO2를 50%에서 조절하였다. 성장 속도는 연속적으로 0.15부터 대략 0.05 l/h로 감소되었다. 부수적으로 36 시간의 배양 후에 교반기 속도를 순차적으로 감소시켰다. 광학밀도에서 더 이상의 증가가 일어나지 않음이 결정될 수 있을 때, 발효를 종료시키고 채취 전 밤새 박테리아 세포를 4 ℃로 냉각시켰다.
발효 말에 총 바이오매스 수율이 49.4 g/l(건조 물질)이었다. 발효 동안에 아세테이트는 거의 배출되지 않았으나 끝을 향해갈 무렵에 농도가 7 g/l로 급격히 증가하였다. 재조합 단백질 형성은 9.96 g/l을 수득했다. 배양액의 부피가 발효기 용기의 정상 실용 부피를 초과하였고, 11.8 l로 증가하였다.
발효를 반복하였고 130의 최종 광학밀도, 50.6 g/l의 최종 바이오매스 수율 및 9.0 g/l의 재조합 단백질 수율을 얻었으며, 발효 말에 배양액 부피는 12.2 l였다.
실시예 4
pH 조절을 위한 알칼리 용액에 포함된 류신 및 프롤린의 공급
이 발효 아미노산 공급은 알칼리 pH 조절 용액 내에 포함되어 있었다. 이 발효의 기반은 실시예 3에서 사용된 상기한 문헌[Riesenberg, et al., 1991]에 따른 동일한 고세포밀도 배양 방법이다. 아미노산 L-류신 및 L-프롤린은 12.5% NH3 수용액에 포함되어 있고 pH 조절 동안 알칼리 첨가와 함께 공급되었다.
대장균 K12 균주 CSPZ-2(leuB, proC, trpE, th-1, ΔpyrF)를 사용하였다. 치료용 단백질의 생산을 위해 균주를 발현 플라스미드로 형질전환하였고, 1차 종자은행으로서 정의된 전배양 배지에서 대략 1의 (578 nm에서 결정된) 광학밀도로 자란 균주 1 ml 및 글리세롤 85%(v/v) 1 ml를 함유하는 앰플에 유지시켜 -80 ℃에서 저장하였다.
정의된 전배양 배지는 1.0 g/l L-류신, 1.0 g/l L-프롤린 및 1.0 mg/l 티아민-HCl로 보충된, 문헌[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 따른 M9 배지였다.
발효를 위하여 상기한 문헌[Riesenberg, et al., 1991]에 따른 배치 배지를 사용하였다:
27.6 g/l 포도당,
13.3 g/l KH2PO4,
4.0 g/l (NH4)2HPO4,
1.7 g/l 구연산염,
1.2 g/l MgSO4*7H2O,
60 mg/l 구연산제3철,
2.5 mg/l CoCl2*6H2O,
15 mg/l MnCl2*4H2O,
1.5 mg/l CuCl2*2H2O,
3 mg/l H3BO3,
2.5 mg/l Na2MoO4*2H2O,
8 mg/l Zn(CH3COO)2*2H2O,
8.4 mg/l 티트리플렉스 III, 및
1.3 ml/l 신퍼로닉 10% 소포제.
배치 배지를
5.4 mg/l 티아민-HCl, 및
1.2 g/l l-류신 및 l-프롤린 각각
으로 보충하였다.
공급원 1 용액은
700 g/l 포도당, 및
19.7 g/l MgSO4*7H2O
를 함유하였다.
pH 조절을 위해 이용된 알칼리 용액은 50 g/l L-류신 및 50 g/l L-프롤린이 각각 보충된 12.5%(w/v) NH3 수용액이었다.
모든 요소를 탈이온수에 용해하였다.
주 발효를 10 l 바이오스탯 C DCU3 발효기(싸토리우스, 독일 멜중엔)에서 수행하였다. 6.4 l 살균한 배치 배지에 300 ml 전배양물을 더한 것으로 시작하여 상기 배치 발효를 37 ℃, pH 6.9 ± 0.2, 500 mbar 및 통기 속도 10 l/min에서 수행하였다. 초기에 보충된 포도당이 고갈되고 난 후 온도를 28 ℃로 바꾸고, 50%(DO-stat, 예컨대, 문헌[Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. 2 (1987) 79-85] 참조)에서 유지되는 용해된 산소(pO2)로, 및 일정하게 교반 속도(10 시간 내에 550 rpm에서 1000 rpm으로 및 16 시간 내에 1000 rpm에서 1400 rpm으로) 및 통기 속도(10 시간 내에 10 l/min에서 16 l/min으로 및 5 시간 내에 16 l/min에서 20 l/min으로)를 증가시키면서 공급원 1을 첨가함으로써 유가배양 방식의 발효를 시작하였다. 추가의 아미노산의 공급을 pH가 조절 하한, 즉, pH 6.70에 도달했을 때, 알칼리의 첨가로부터 야기되었다. 알칼리 첨가의 시간 코스로부터 실시예 2 내에서 공급원 2 및 3에 대한 유량을 계산하여, 공급 전략으로부터 독립적으로 각각 정확히 동일한 양의 아미노산을 배양물에 도포하였다. 1 mM IPTG를 70의 광학밀도에서 첨가함으로써 재조합 치료용 단백질의 발현을 유도하였다.
전형적으로 이 발효의 파라미터 플롯이 도 3 및 4에 도시되었다.
접종 및 그 후 짧은 정체기 후에, 세포가 최대 비성장속도 μmax = 0.30 l/h로 자랐다. 8 시간의 배양 후 pH 조절 하한에 도달하였고, pH를 50 g/l L-류신 및 50 g/l L-프롤린이 각각 보충된 12.5% NH3 용액의 첨가로 6.70에서 조절하였다. 동시에 아미노산 공급을 시작하였다. 16 시간 후 제공된 포도당을 모두 사용하였다. 이때 배양 온도를 37 ℃에서 28 ℃로 바꿨다. 추가의 15 분 후 pO2-공급원 조절을 시작했고 연속적으로 교반 및 통기 속도를 각각 최대값인 1400 rpm 및 20 l/min으로 증가시키는 동안 공급원 1의 첨가에 의하여 pO2를 50%에서 조절하였다. 성장 속도는 연속적으로 0.15부터 대략 0.05 l/h로 감소되었다. 광학밀도에서 더 이상의 증가가 일어나지 않음을 인식할 수 있을 때, 발효를 종료시키고 채취 전 밤새 박테리아 세포를 4 ℃로 냉각시켰다.
발효 말에 광학밀도가 169였고, 총 바이오매스 수율이 75.7 g/l(건조 물질)이었다. 발효 동안에 아세테이트는 거의 배출되지 않았으나 끝을 향해갈 무렵에 농도가 1 g/l로 증가했다. 재조합 단백질 형성은 16.5 g/l을 수득했다. 배양액의 부피는 10.2 l였다.
알칼리 용액에 용해된 양이 다른 아미노산으로 발효를 반복하였다(33 g/l의 L-류신 및 L-프롤린). 공급된 아미노산의 양은 더 낮았고, 145의 광학밀도, 56.5 g/l의 최종 바이오매스 수율 및 13.5 g/l의 재조합 단백질 수율을 야기하였으며, 발효 말에 배양액 부피는 9.3 l였다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Alkaline feed <130> 26775 WO <140> PCT/EP2011/064598 <141> 2011-08-25 <150> EP10008997.8 <151> 2010-08-30 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I (1) <400> 1 Ala Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu 20 25 30 Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser 35 40 45 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 50 55 60 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 65 70 75 80 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 85 90 95 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 100 105 110 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 115 120 125 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 130 135 140 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 145 150 155 160 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 165 170 175 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 180 185 190 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 195 200 205 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 210 215 220 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 225 230 235 240 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 260 265 270 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 285 <210> 2 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I (2) <400> 2 Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu 1 5 10 15 Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys 20 25 30 Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 35 40 45 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 50 55 60 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 65 70 75 80 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 85 90 95 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 100 105 110 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 115 120 125 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 130 135 140 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 145 150 155 160 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 165 170 175 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 180 185 190 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 195 200 205 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 210 215 220 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 225 230 235 240 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 245 250 255 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 260 265 270 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apolipoprotein A-I mimetic (1) <400> 3 Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apolipoprotein A-I mimetic (2) <400> 4 Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 <210> 5 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 20 25 30 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 115 120 125 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 130 135 140 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 165 170 175 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 205 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 210 215 220 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 225 230 235 240 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 245 250 255 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 260 265 <210> 6 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Lys Leu Leu Ala Ala Thr Val Leu Leu Leu Thr Ile Cys Ser Leu 1 5 10 15 Glu Gly Ala Leu Val Arg Arg Gln Ala Lys Glu Pro Cys Val Glu Ser 20 25 30 Leu Val Ser Gln Tyr Phe Gln Thr Val Thr Asp Tyr Gly Lys Asp Leu 35 40 45 Met Glu Lys Val Lys Ser Pro Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr 50 55 60 Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly 65 70 75 80 Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln 85 90 95 Pro Ala Thr Gln 100 <210> 7 <211> 396 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Thr Leu Ala Leu Val Ala Val Ala 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His 35 40 45 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu 85 90 95 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg 100 105 110 Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Asp Asn Leu 115 120 125 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Ala Asp Gln Leu Arg Thr 130 135 140 Gln Val Asn Thr Gln Ala Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln 165 170 175 Ala Ser Leu Arg Pro His Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln 180 185 190 Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe 195 200 205 Lys Val Lys Ile Asp Gln Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Tyr Ala Gln Asp Thr Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 225 230 235 240 Leu Thr Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile 245 250 255 Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu 260 265 270 Asp Val Arg Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Arg Arg Val Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Met Glu Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val 325 330 335 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 340 345 350 Ser Phe Phe Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gln Asp Lys Thr Leu 355 360 365 Ser Leu Pro Glu Leu Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln 370 375 380 Gln Glu Gln Val Gln Met Leu Ala Pro Leu Glu Ser 385 390 395 <210> 8 <211> 366 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Ser Met Ala Ala Val Leu Thr Trp Ala Leu Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ala Phe Ser Ala Thr Gln Ala Arg Lys Gly Phe Trp Asp Tyr Phe Ser 20 25 30 Gln Thr Ser Gly Asp Lys Gly Arg Val Glu Gln Ile His Gln Gln Lys 35 40 45 Met Ala Arg Glu Pro Ala Thr Leu Lys Asp Ser Leu Glu Gln Asp Leu 50 55 60 Asn Asn Met Asn Lys Phe Leu Glu Lys Leu Arg Pro Leu Ser Gly Ser 65 70 75 80 Glu Ala Pro Arg Leu Pro Gln Asp Pro Val Gly Met Arg Arg Gln Leu 85 90 95 Gln Glu Glu Leu Glu Glu Val Lys Ala Arg Leu Gln Pro Tyr Met Ala 100 105 110 Glu Ala His Glu Leu Val Gly Trp Asn Leu Glu Gly Leu Arg Gln Gln 115 120 125 Leu Lys Pro Tyr Thr Met Asp Leu Met Glu Gln Val Ala Leu Arg Val 130 135 140 Gln Glu Leu Gln Glu Gln Leu Arg Val Val Gly Glu Asp Thr Lys Ala 145 150 155 160 Gln Leu Leu Gly Gly Val Asp Glu Ala Trp Ala Leu Leu Gln Gly Leu 165 170 175 Gln Ser Arg Val Val His His Thr Gly Arg Phe Lys Glu Leu Phe His 180 185 190 Pro Tyr Ala Glu Ser Leu Val Ser Gly Ile Gly Arg His Val Gln Glu 195 200 205 Leu His Arg Ser Val Ala Pro His Ala Pro Ala Ser Pro Ala Arg Leu 210 215 220 Ser Arg Cys Val Gln Val Leu Ser Arg Lys Leu Thr Leu Lys Ala Lys 225 230 235 240 Ala Leu His Ala Arg Ile Gln Gln Asn Leu Asp Gln Leu Arg Glu Glu 245 250 255 Leu Ser Arg Ala Phe Ala Gly Thr Gly Thr Glu Glu Gly Ala Gly Pro 260 265 270 Asp Pro Gln Met Leu Ser Glu Glu Val Arg Gln Arg Leu Gln Ala Phe 275 280 285 Arg Gln Asp Thr Tyr Leu Gln Ile Ala Ala Phe Thr Arg Ala Ile Asp 290 295 300 Gln Glu Thr Glu Glu Val Gln Gln Gln Leu Ala Pro Pro Pro Pro Gly 305 310 315 320 His Ser Ala Phe Ala Pro Glu Phe Gln Gln Thr Asp Ser Gly Lys Val 325 330 335 Leu Ser Lys Leu Gln Ala Arg Leu Asp Asp Leu Trp Glu Asp Ile Thr 340 345 350 His Ser Leu His Asp Gln Gly His Ser His Leu Gly Asp Pro 355 360 365 <210> 9 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 20 25 30 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 115 120 125 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 130 135 140 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 165 170 175 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 205 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 210 215 220 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 225 230 235 240 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 245 250 255 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 260 265 <210> 10 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 20 25 30 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 115 120 125 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 130 135 140 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 165 170 175 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 205 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 210 215 220 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 225 230 235 240 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 245 250 255 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 260 265 <210> 11 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Lys Ala Thr Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Thr Pro Trp 20 25 30 Asp Arg Val Lys Asp Leu Val Thr Val Tyr Val Glu Ala Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Lys Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Val Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 115 120 125 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 130 135 140 Pro Leu Arg Ala Glu Leu His Glu Gly Thr Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160 Leu His Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Val Arg Asp Arg Ala 165 170 175 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 205 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Ser Glu His Leu 210 215 220 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 225 230 235 240 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 245 250 255 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Ser Thr Gln 260 265 <210> 12 <211> 265 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Lys Ala Val Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Asp Pro Gln Ser Ser Trp Asp 20 25 30 Arg Val Lys Asp Phe Ala Thr Val Tyr Val Glu Ala Ile Lys Asp Ser 35 40 45 Gly Arg Asp Tyr Val Ala Gln Phe Glu Ala Ser Ala Leu Gly Lys Gln 50 55 60 Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Thr Leu Ala Ser Thr Leu 65 70 75 80 Ser Lys Val Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp 85 90 95 Asn Leu Glu Lys Glu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Glu Met His Lys Asp 100 105 110 Leu Glu Glu Val Lys Gln Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Glu Phe Gln 115 120 125 Lys Lys Trp His Glu Glu Val Glu Ile Tyr Arg Gln Lys Val Ala Pro 130 135 140 Leu Gly Glu Glu Phe Arg Glu Gly Ala Arg Gln Lys Val Gln Glu Leu 145 150 155 160 Gln Asp Lys Leu Ser Pro Leu Ala Gln Glu Leu Arg Asp Arg Ala Arg 165 170 175 Ala His Val Glu Thr Leu Arg Gln Gln Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Asp 180 185 190 Leu Arg Gln Arg Leu Thr Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Ser Glu Gln Leu Lys Ala 210 215 220 Leu Gly Glu Lys Ala Lys Pro Val Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu 225 230 235 240 Leu Pro Val Leu Glu Ser Leu Lys Val Ser Ile Leu Ala Ala Ile Asp 245 250 255 Glu Ala Ser Lys Lys Leu Asn Ala Gln 260 265 <210> 13 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Lys Ala Trp Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser Gln 1 5 10 15 Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Asp Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg 20 25 30 Val Lys Asp Phe Ala Thr Val Tyr Val Asp Ala Ile Lys Asp Ser Gly 35 40 45 Arg Asp Tyr Val Ala Gln Phe Glu Ala Ser Ala Leu Gly Lys His Leu 50 55 60 Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Leu Gly Ser Thr Phe Thr 65 70 75 80 Lys Val Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn 85 90 95 Leu Glu Lys Glu Thr Glu Ala Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu 100 105 110 Glu Glu Val Lys Lys Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Asn 115 120 125 Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Thr Tyr Arg Gln Lys Met Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Ala Glu Phe Arg Glu Gly Ala Arg Gln Lys Val Gln Glu Leu Gln 145 150 155 160 Glu Lys Leu Ser Pro Leu Ala Glu Glu Leu Arg Asp Arg Leu Arg Ala 165 170 175 His Val Glu Ala Leu Arg Gln His Val Ala Pro Tyr Ser Asp Asp Leu 180 185 190 Arg Gln Arg Met Ala Ala Arg Phe Glu Ala Leu Lys Glu Gly Gly Gly 195 200 205 Ser Leu Ala Glu Tyr Gln Ala Lys Ala Gln Glu Gln Leu Lys Ala Leu 210 215 220 Gly Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu 225 230 235 240 Pro Val Leu Glu Asn Leu Lys Val Ser Ile Leu Ala Ala Ile Asp Glu 245 250 255 Ala Ser Lys Lys Leu Asn Ala Gln 260 <210> 14 <211> 266 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Lys Ala Ala Leu Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Gln Ser Pro Trp Asp 20 25 30 Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Ala Val Lys Asp Ser 35 40 45 Gly Arg Asp Tyr Val Ala Gln Phe Glu Ala Ser Ala Leu Gly Lys Gln 50 55 60 Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Leu Ser Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Lys Leu Arg Glu Gln Ile Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp 85 90 95 Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Val Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp 100 105 110 Leu Glu Glu Val Lys Gln Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln 115 120 125 Lys Lys Trp Gln Glu Glu Val Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Ala Pro 130 135 140 Leu Gly Ser Glu Leu Arg Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu Gln Glu Leu 145 150 155 160 Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Ala Glu Glu Leu Arg Asp Arg Ala Arg 165 170 175 Thr His Val Asp Ala Leu Arg Ala Gln Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Asp 180 185 190 Leu Arg Glu Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Ser Leu Ala Glu Tyr His Ala Arg Ala Ser Glu Gln Leu Ser 210 215 220 Ala Leu Gly Glu Lys Ala Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly 225 230 235 240 Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Leu Leu Ala Ala Ile 245 250 255 Asp Glu Ala Thr Lys Lys Leu Asn Ala Gln 260 265 <210> 15 <211> 206 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Lys Ala Val Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Arg Asp Glu Pro Arg Ser Ser Trp Asp 20 25 30 Lys Ile Lys Asp Phe Ala Thr Val Tyr Val Asp Thr Val Lys Asp Ser 35 40 45 Gly Arg Glu Tyr Val Ala Gln Phe Glu Ala Ser Ala Phe Gly Lys Gln 50 55 60 Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Leu Ser Ser Thr Val 65 70 75 80 Ser Lys Leu Gln Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp 85 90 95 Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Glu Glu Met Asn Lys Asp 100 105 110 Leu Gln Glu Val Arg Gln Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Glu Phe Gln 115 120 125 Lys Lys Trp Gln Glu Glu Val Glu Arg Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro 130 135 140 Leu Gly Ala Glu Leu Arg Glu Ser Ala Arg Gln Lys Leu Thr Glu Leu 145 150 155 160 Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Ala Glu Glu Leu Arg Asp Ser Ala Arg 165 170 175 Thr His Val Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Ala Ser Val 180 185 190 Gln Asn Val Leu Asp Glu Ala Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 195 200 205 <210> 16 <211> 265 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Lys Ala Val Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Gln Ser Ser Trp Asp 20 25 30 Arg Val Arg Asp Leu Ala Asn Val Tyr Val Asp Ala Val Lys Glu Ser 35 40 45 Gly Arg Glu Tyr Val Ser Gln Leu Glu Ala Ser Ala Leu Gly Lys Gln 50 55 60 Leu Asn Leu Lys Leu Val Asp Asn Trp Asp Thr Leu Gly Ser Thr Phe 65 70 75 80 Gln Lys Val His Glu His Leu Gly Pro Val Ala Gln Glu Phe Trp Glu 85 90 95 Lys Leu Glu Lys Glu Thr Glu Glu Leu Arg Arg Glu Ile Asn Lys Asp 100 105 110 Leu Glu Asp Val Arg Gln Lys Thr Gln Pro Phe Leu Asp Glu Ile Gln 115 120 125 Lys Lys Trp Gln Glu Asp Leu Glu Arg Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro 130 135 140 Leu Ser Ala Gln Leu Arg Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu Met Glu Leu 145 150 155 160 Gln Glu Gln Val Thr Pro Leu Gly Glu Asp Leu Arg Asp Ser Val Arg 165 170 175 Ala Tyr Ala Asp Thr Leu Arg Thr Gln Leu Ala Pro Tyr Ser Glu Gln 180 185 190 Met Arg Lys Thr Leu Gly Ala Arg Leu Glu Ala Ile Lys Glu Gly Gly 195 200 205 Ser Ala Ser Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ser 210 215 220 Ala Leu Gly Glu Lys Ala Lys Pro Val Leu Glu Asp Ile His Gln Gly 225 230 235 240 Leu Met Pro Met Trp Glu Ser Phe Lys Thr Gly Val Leu Asn Val Ile 245 250 255 Asp Glu Ala Ala Lys Lys Leu Thr Ala 260 265 <210> 17 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Lys Ala Val Val Leu Ala Val Ala Leu Val Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Trp His Val Trp Gln Gln Asp Glu Pro Gln Ser Gln Trp Asp 20 25 30 Lys Val Lys Asp Phe Ala Asn Val Tyr Val Asp Ala Val Lys Asp Ser 35 40 45 Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Ser Ser Ser Leu Gly Gln Gln 50 55 60 Leu Asn Leu Asn Leu Leu Glu Asn Trp Asp Thr Leu Gly Ser Thr Val 65 70 75 80 Ser Gln Leu Gln Glu Arg Leu Gly Pro Leu Thr Arg Asp Phe Trp Asp 85 90 95 Asn Leu Glu Lys Glu Thr Asp Trp Val Arg Gln Glu Met Asn Lys Asp 100 105 110 Leu Glu Glu Val Lys Gln Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Glu Phe Gln 115 120 125 Lys Lys Trp Lys Glu Asp Val Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Ala Pro 130 135 140 Leu Gly Ala Glu Leu Gln Glu Ser Ala Arg Gln Lys Leu Gln Glu Leu 145 150 155 160 Gln Gly Arg Leu Ser Pro Val Ala Glu Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg 165 170 175 Thr His Val Asp Ser Leu Arg Thr Gln Leu Ala Pro His Ser Glu Gln 180 185 190 Met Arg Glu Ser Leu Ala Gln Arg Leu Ala Glu Leu Lys Ser Asn Pro 195 200 205 Thr Leu Asn Glu Tyr His Thr Arg Ala Lys Thr His Leu Lys Thr Leu 210 215 220 Gly Glu Lys Ala Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg His Ser Leu Met 225 230 235 240 Pro Met Leu Glu Thr Leu Lys Thr Lys Ala Gln Ser Val Ile Asp Lys 245 250 255 Ala Ser Glu Thr Leu Thr Ala Gln 260 <210> 18 <211> 259 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Lys Ala Ala Val Leu Ala Val Ala Leu Val Phe Leu Thr Gly Cys 1 5 10 15 Gln Ala Trp Glu Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Gln Ser Gln Trp Asp 20 25 30 Arg Val Lys Asp Phe Ala Thr Val Tyr Val Asp Ala Val Lys Asp Ser 35 40 45 Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Ser Ser Thr Leu Gly Lys Gln 50 55 60 Leu Asn Leu Asn Leu Leu Asp Asn Trp Asp Thr Leu Gly Ser Thr Val 65 70 75 80 Gly Arg Leu Gln Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Ala 85 90 95 Asn Leu Glu Lys Glu Thr Asp Trp Leu Arg Asn Glu Met Asn Lys Asp 100 105 110 Leu Glu Asn Val Lys Gln Lys Met Gln Pro His Leu Asp Glu Phe Gln 115 120 125 Glu Lys Trp Asn Glu Glu Val Glu Ala Tyr Arg Gln Lys Leu Glu Pro 130 135 140 Leu Gly Thr Glu Leu His Lys Asn Ala Lys Glu Met Gln Arg His Leu 145 150 155 160 Lys Val Val Ala Glu Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Val Asn Ala Asp 165 170 175 Ala Leu Arg Ala Lys Phe Gly Leu Tyr Ser Asp Gln Met Arg Glu Asn 180 185 190 Leu Ala Gln Arg Leu Thr Glu Ile Arg Asn His Pro Thr Leu Ile Glu 195 200 205 Tyr His Thr Lys Ala Gly Asp His Leu Arg Thr Leu Gly Glu Lys Ala 210 215 220 Lys Pro Ala Leu Asp Asp Leu Gly Gln Gly Leu Met Pro Val Leu Glu 225 230 235 240 Ala Trp Lys Ala Lys Ile Met Ser Met Ile Asp Glu Ala Lys Lys Lys 245 250 255 Leu Asn Ala <210> 19 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Glu Ala Lys Ser Tyr Trp Asp Gln Ile Lys Asp Met Leu Thr Val 1 5 10 15 Tyr Val Asp Thr Ala Lys Asp Ser Gly Lys Asp Tyr Leu Thr Ser Leu 20 25 30 Asp Thr Ser Ala Leu Gly Gln Gln Leu Asn Lys Lys Leu Ala Asp Asn 35 40 45 Trp Asp Thr Val Ser Ser Ala Leu Leu Lys Ala Arg Glu Gln Met Lys 50 55 60 Pro Ile Ala Met Glu Phe Trp Gly Asn Leu Glu Lys Asp Thr Glu Gly 65 70 75 80 Leu Arg Gln Thr Val Ser Lys Asp Leu Glu Leu Val Lys Glu Lys Val 85 90 95 Gln Pro Tyr Leu Asp Ser Phe Gln Lys Lys Val Glu Glu Glu Leu Glu 100 105 110 Leu Tyr Arg Gln Lys Val Ala Pro Leu Ser Ala Glu Trp Arg Glu Gln 115 120 125 Ala Arg Gln Lys Ala Gln Glu Leu Gln Gln Lys Ala Gly Glu Leu Gly 130 135 140 Gln Gln His Arg Asp Arg Val Arg Thr His Val Asp Ala Leu Arg Thr 145 150 155 160 Asp Leu Ala Pro Tyr Gly Glu Glu Ala Arg Lys Leu Leu Leu Gln Arg 165 170 175 Leu Gln Asp Ile Lys Ala Lys Ser Gly Asp Leu Ala Glu Tyr Gln Thr 180 185 190 Lys Leu Ser Glu His Leu Lys Ser Phe Gly Glu Lys Ala Gln Pro Thr 195 200 205 Leu Gln Asp Leu Arg His Gly Leu Glu Pro Leu Trp Glu Gly Ile Lys 210 215 220 Ala Gly Ala Met Ser Met Leu Glu Glu Leu Gly Lys Lys Leu Asn Ser 225 230 235 240 Gln <210> 20 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Arg Gly Val Leu Val Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Thr 1 5 10 15 Gln Ala Arg Ser Phe Trp Gln His Asp Glu Pro Gln Thr Pro Leu Asp 20 25 30 Arg Ile Arg Asp Met Val Asp Val Tyr Leu Glu Thr Val Lys Ala Ser 35 40 45 Gly Lys Asp Ala Ile Ala Gln Phe Glu Ser Ser Ala Val Gly Lys Gln 50 55 60 Leu Asp Leu Lys Leu Ala Asp Asn Leu Asp Thr Leu Ser Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Lys Leu Arg Glu Asp Met Ala Pro Tyr Tyr Lys Glu Val Arg Glu 85 90 95 Met Trp Leu Lys Asp Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Leu Thr Lys Asp 100 105 110 Leu Glu Glu Val Lys Glu Lys Ile Arg Pro Phe Leu Asp Gln Phe Ser 115 120 125 Ala Lys Trp Thr Glu Glu Leu Glu Gln Tyr Arg Gln Arg Leu Thr Pro 130 135 140 Val Ala Gln Glu Leu Lys Glu Leu Thr Lys Gln Lys Val Glu Leu Met 145 150 155 160 Gln Ala Lys Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Ala Arg Asp Arg Leu Arg 165 170 175 Gly His Val Glu Glu Leu Arg Lys Asn Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu 180 185 190 Leu Arg Gln Lys Leu Ser Gln Lys Leu Glu Glu Ile Arg Glu Lys Gly 195 200 205 Ile Pro Gln Ala Ser Glu Tyr Gln Ala Lys Val Met Glu Gln Leu Ser 210 215 220 Asn Leu Arg Glu Lys Met Thr Pro Leu Val Gln Glu Phe Arg Glu Arg 225 230 235 240 Leu Thr Pro Tyr Ala Glu Asn Leu Lys Asn Arg Leu Ile Ser Phe Leu 245 250 255 Asp Glu Leu Gln Lys Ser Val Ala 260 <210> 21 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Arg Gly Val Leu Val Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Thr 1 5 10 15 Gln Ala Arg Ser Phe Trp Gln His Asp Asp Pro Gln Thr Pro Leu Asp 20 25 30 Arg Ile Arg Asp Met Leu Asp Val Tyr Leu Glu Thr Val Lys Ala Ser 35 40 45 Gly Lys Asp Ala Ile Ser Gln Phe Glu Ser Ser Ala Val Gly Lys Gln 50 55 60 Leu Asp Leu Lys Leu Ala Asp Asn Leu Asp Thr Leu Ser Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Lys Leu Arg Glu Asp Met Thr Pro Tyr Tyr Arg Glu Val Arg Glu 85 90 95 Met Trp Leu Lys Asp Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Leu Thr Lys Asp 100 105 110 Leu Glu Glu Val Lys Glu Lys Ile Arg Pro Phe Leu Asp Gln Phe Ser 115 120 125 Ala Lys Trp Thr Glu Glu Val Glu Gln Tyr Arg Gln Arg Leu Ala Pro 130 135 140 Val Ala Gln Glu Leu Lys Asp Leu Thr Lys Gln Lys Val Glu Leu Met 145 150 155 160 Gln Ala Lys Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Val Arg Asp Arg Leu Arg 165 170 175 Glu Gln Val Glu Glu Leu Arg Lys Asn Leu Ala Pro Tyr Ser Ser Glu 180 185 190 Leu Arg Gln Lys Leu Ser Gln Lys Leu Glu Glu Ile Arg Glu Arg Gly 195 200 205 Ile Pro Gln Ala Ser Glu Tyr Gln Ala Lys Val Val Glu Gln Leu Ser 210 215 220 Asn Leu Arg Glu Lys Met Thr Pro Leu Val Gln Glu Phe Lys Glu Arg 225 230 235 240 Leu Thr Pro Tyr Ala Glu Asn Leu Lys Asn Arg Leu Ile Asp Leu Leu 245 250 255 Asp Glu Val Gln Lys Thr Met Ala 260 <210> 22 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Arg Val Val Val Val Thr Leu Ala Leu Leu Phe Leu Thr Gly Thr 1 5 10 15 Gln Ala Arg Tyr Phe Trp Gln His Asp Glu Pro Gln Ala Pro Leu Asp 20 25 30 Arg Leu Arg Asp Leu Val Asp Val Tyr Leu Glu Thr Val Lys Ala Ser 35 40 45 Gly Lys Asp Ala Ile Ala Gln Phe Glu Ala Ser Ala Val Gly Lys Gln 50 55 60 Leu Asp Leu Lys Leu Ala Asp Asn Leu Asp Thr Leu Gly Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Lys Leu Arg Glu Asp Met Ala Pro Tyr Tyr Lys Glu Val Arg Glu 85 90 95 Met Trp Leu Lys Asp Thr Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Thr Lys Asp 100 105 110 Leu Glu Glu Val Lys Glu Lys Ile Arg Pro Phe Leu Asp Gln Phe Ser 115 120 125 Ala Lys Trp Thr Glu Glu Leu Glu Gln Tyr Arg Gln Arg Leu Ala Pro 130 135 140 Val Ala Glu Glu Leu Lys Glu Leu Thr Lys Gln Lys Val Glu Leu Met 145 150 155 160 Gln Gln Lys Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Ala Arg Asp Arg Leu Arg 165 170 175 Gly His Val Glu Glu Leu Arg Lys Asn Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu 180 185 190 Leu Arg Gln Lys Leu Ser Gln Lys Leu Glu Glu Ile Arg Glu Lys Gly 195 200 205 Ile Pro Gln Ala Ala Glu Tyr Gln Ala Lys Val Val Glu Gln Leu Ser 210 215 220 Asn Leu Arg Glu Lys Met Thr Pro Leu Val Gln Asp Phe Lys Glu Arg 225 230 235 240 Leu Thr Pro Tyr Ala Glu Asn Leu Lys Thr Arg Phe Ile Ser Leu Leu 245 250 255 Asp Glu Leu Gln Lys Thr Val Ala 260 <210> 23 <211> 262 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Lys Phe Leu Ala Leu Ala Leu Thr Ile Leu Leu Ala Ala Gly Thr 1 5 10 15 Gln Ala Phe Pro Met Gln Ala Asp Ala Pro Ser Gln Leu Glu His Val 20 25 30 Lys Ala Ala Leu Ser Met Tyr Ile Ala Gln Val Lys Leu Thr Ala Gln 35 40 45 Arg Ser Ile Asp Leu Leu Asp Asp Thr Glu Tyr Lys Glu Tyr Lys Met 50 55 60 Gln Leu Thr Gln Ser Leu Asp Asn Leu Gln Gln Tyr Ala Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ser Leu Ala Pro Tyr Ser Glu Ala Phe Gly Thr Gln Leu Thr 85 90 95 Asp Ala Thr Ala Ala Val Arg Ala Glu Val Met Lys Asp Val Glu Glu 100 105 110 Leu Arg Ser Gln Leu Glu Pro Lys Arg Ala Glu Leu Lys Glu Val Leu 115 120 125 Asp Lys His Ile Asp Glu Tyr Arg Lys Lys Leu Glu Pro Leu Ile Lys 130 135 140 Glu His Ile Glu Leu Arg Arg Thr Glu Met Glu Ala Phe Arg Ala Lys 145 150 155 160 Met Glu Pro Ile Val Glu Glu Leu Arg Ala Lys Val Ala Ile Asn Val 165 170 175 Glu Glu Thr Lys Thr Lys Leu Met Pro Ile Val Glu Ile Val Arg Ala 180 185 190 Lys Leu Thr Glu Arg Leu Glu Glu Leu Arg Thr Leu Ala Ala Pro Tyr 195 200 205 Ala Glu Glu Tyr Lys Glu Gln Met Ile Lys Ala Val Gly Glu Val Arg 210 215 220 Glu Lys Val Ser Pro Leu Ser Glu Asp Phe Lys Gly Gln Val Gly Pro 225 230 235 240 Ala Ala Glu Gln Ala Lys Gln Lys Leu Leu Ala Phe Tyr Glu Thr Ile 245 250 255 Ser Gln Ala Met Lys Ala 260 <210> 24 <211> 262 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Lys Phe Leu Ala Leu Ala Leu Thr Ile Leu Leu Ala Ala Ala Thr 1 5 10 15 Gln Ala Val Pro Met Gln Ala Asp Ala Pro Ser Gln Leu Glu His Val 20 25 30 Lys Val Ala Met Met Glu Tyr Met Ala Gln Val Lys Glu Thr Gly Gln 35 40 45 Arg Ser Ile Asp Leu Leu Asp Asp Thr Glu Phe Lys Glu Tyr Lys Val 50 55 60 Gln Leu Ser Gln Ser Leu Asp Asn Leu Gln Gln Tyr Ala Gln Thr Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ser Leu Ala Pro Tyr Ser Glu Ala Phe Gly Ala Gln Leu Thr 85 90 95 Asp Ala Ala Ala Ala Val Arg Ala Glu Val Met Lys Asp Val Glu Asp 100 105 110 Val Arg Thr Gln Leu Glu Pro Lys Arg Ala Glu Leu Lys Glu Val Leu 115 120 125 Asp Lys His Ile Asp Glu Tyr Arg Lys Lys Leu Glu Pro Leu Ile Lys 130 135 140 Glu Ile Val Glu Gln Arg Arg Thr Glu Leu Glu Ala Phe Arg Val Lys 145 150 155 160 Met Glu Pro Val Val Glu Glu Met Arg Ala Lys Val Ser Thr Asn Val 165 170 175 Glu Glu Thr Lys Ala Lys Leu Met Pro Ile Val Glu Thr Val Arg Ala 180 185 190 Lys Leu Thr Glu Arg Leu Glu Glu Leu Arg Thr Leu Ala Ala Pro Tyr 195 200 205 Ala Glu Glu Tyr Lys Glu Gln Met Phe Lys Ala Val Gly Glu Val Arg 210 215 220 Glu Lys Val Gly Pro Leu Thr Asn Asp Phe Lys Gly Gln Val Gly Pro 225 230 235 240 Ala Ala Glu Gln Ala Lys Glu Lys Leu Met Asp Phe Tyr Glu Thr Ile 245 250 255 Ser Gln Ala Met Lys Ala 260 <210> 25 <211> 258 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Lys Phe Leu Val Leu Ala Leu Thr Ile Leu Leu Ala Ala Gly Thr 1 5 10 15 Gln Ala Phe Pro Met Gln Ala Asp Ala Pro Ser Gln Leu Glu His Val 20 25 30 Lys Ala Ala Leu Asn Met Tyr Ile Ala Gln Val Lys Leu Thr Ala Gln 35 40 45 Arg Ser Ile Asp Leu Leu Asp Asp Thr Glu Tyr Lys Glu Tyr Lys Met 50 55 60 Gln Leu Ser Gln Ser Leu Asp Asn Leu Gln Gln Phe Ala Asp Ser Thr 65 70 75 80 Ser Lys Ser Trp Pro Pro Thr Pro Arg Ser Ser Ala Pro Ser Cys Asp 85 90 95 Ala Thr Ala Thr Val Arg Ala Glu Val Met Lys Asp Val Glu Asp Val 100 105 110 Arg Thr Gln Leu Glu Pro Lys Arg Ala Glu Leu Thr Glu Val Leu Asn 115 120 125 Lys His Ile Asp Glu Tyr Arg Lys Lys Leu Glu Pro Leu Ile Lys Gln 130 135 140 His Ile Glu Leu Arg Arg Thr Glu Met Asp Ala Phe Arg Ala Lys Ile 145 150 155 160 Asp Pro Val Val Glu Glu Met Arg Ala Lys Val Ala Val Asn Val Glu 165 170 175 Glu Thr Lys Thr Lys Leu Met Pro Ile Val Glu Ile Val Arg Ala Lys 180 185 190 Leu Thr Glu Arg Leu Glu Glu Leu Arg Thr Leu Ala Ala Pro Tyr Ala 195 200 205 Glu Glu Tyr Lys Glu Gln Met Phe Lys Ala Val Gly Glu Val Arg Glu 210 215 220 Lys Val Ala Pro Leu Ser Glu Asp Phe Lys Ala Arg Trp Ala Pro Pro 225 230 235 240 Pro Arg Arg Pro Ser Lys Ser Ser Trp Leu Ser Thr Arg Pro Ser Ala 245 250 255 Arg Pro <210> 26 <211> 262 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Lys Phe Val Ala Leu Ala Leu Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Asn Leu Phe Gln Ala Asp Ala Pro Thr Gln Leu Glu His Tyr 20 25 30 Lys Ala Ala Ala Leu Val Tyr Leu Asn Gln Val Lys Asp Gln Ala Glu 35 40 45 Lys Ala Leu Asp Asn Leu Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Gln Tyr Lys Leu 50 55 60 Gln Leu Ser Glu Ser Leu Thr Lys Leu Gln Glu Tyr Ala Gln Thr Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ala Leu Thr Pro Tyr Ala Glu Thr Ile Ser Thr Gln Leu Met 85 90 95 Glu Asn Thr Lys Gln Leu Arg Glu Arg Val Met Thr Asp Val Glu Asp 100 105 110 Leu Arg Ser Lys Leu Glu Pro His Arg Ala Glu Leu Tyr Thr Ala Leu 115 120 125 Gln Lys His Ile Asp Glu Tyr Arg Glu Lys Leu Glu Pro Val Phe Gln 130 135 140 Glu Tyr Ser Ala Leu Asn Arg Gln Asn Ala Glu Gln Leu Arg Ala Lys 145 150 155 160 Leu Glu Pro Leu Met Asp Asp Ile Arg Lys Ala Phe Glu Ser Asn Ile 165 170 175 Glu Glu Thr Lys Ser Lys Val Val Pro Met Val Glu Ala Val Arg Thr 180 185 190 Lys Leu Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Arg Thr Met Ala Ala Pro Tyr 195 200 205 Ala Glu Glu Tyr Lys Glu Gln Leu Val Lys Ala Val Glu Glu Ala Arg 210 215 220 Glu Lys Ile Ala Pro His Thr Gln Asp Leu Gln Thr Arg Met Glu Pro 225 230 235 240 Tyr Met Glu Asn Val Arg Thr Thr Phe Ala Gln Met Tyr Glu Thr Ile 245 250 255 Ala Lys Ala Ile Gln Ala 260 <210> 27 <211> 260 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Lys Phe Ala Ala Leu Ala Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Gly Ser 1 5 10 15 His Ala Ala Ser Met Gln Ala Asp Ala Pro Ser Gln Leu Asp His Ala 20 25 30 Arg Ala Val Leu Asp Val Tyr Leu Thr Gln Val Lys Asp Met Ser Leu 35 40 45 Arg Ala Val Asn Gln Leu Asp Asp Pro Gln Tyr Ala Glu Phe Lys Thr 50 55 60 Asn Leu Ala Gln Arg Ile Glu Glu Met Tyr Thr Gln Ile Lys Thr Leu 65 70 75 80 Gln Gly Ser Val Ser Pro Met Thr Asp Ser Phe Tyr Asn Thr Val Met 85 90 95 Glu Val Thr Lys Asp Thr Arg Glu Ser Leu Asn Val Asp Leu Glu Ala 100 105 110 Leu Lys Ser Ser Leu Ala Pro Gln Asn Glu Gln Leu Lys Gln Val Ile 115 120 125 Glu Lys His Leu Asn Asp Tyr Arg Thr Leu Leu Thr Pro Ile Tyr Asn 130 135 140 Asp Tyr Lys Thr Lys His Asp Glu Glu Met Ala Ala Leu Lys Thr Arg 145 150 155 160 Leu Glu Pro Val Met Glu Glu Leu Arg Thr Lys Ile Gln Ala Asn Val 165 170 175 Glu Glu Thr Lys Ala Val Leu Met Pro Met Val Glu Thr Val Arg Thr 180 185 190 Lys Val Thr Glu Arg Leu Glu Ser Leu Arg Glu Val Val Gln Pro Tyr 195 200 205 Val Gln Glu Tyr Lys Glu Gln Met Lys Gln Met Tyr Asp Gln Ala Gln 210 215 220 Thr Val Asp Thr Asp Ala Leu Arg Thr Lys Ile Thr Pro Leu Val Glu 225 230 235 240 Glu Ile Lys Val Lys Met Asn Ala Ile Phe Glu Ile Ile Ala Ala Ser 245 250 255 Val Thr Lys Ser 260 <210> 28 <211> 396 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Thr Leu Ala Leu Val Ala Val Ala 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His 35 40 45 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu 85 90 95 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg 100 105 110 Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Asp Asn Leu 115 120 125 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Ala Asp Gln Leu Arg Thr 130 135 140 Gln Val Asn Thr Gln Ala Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln 165 170 175 Ala Ser Leu Arg Pro His Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln 180 185 190 Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe 195 200 205 Lys Val Lys Ile Asp Gln Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Tyr Ala Gln Asp Thr Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 225 230 235 240 Leu Thr Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile 245 250 255 Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu 260 265 270 Asp Val Arg Gly Asn Leu Lys Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Arg Arg Val Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Met Glu Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val 325 330 335 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 340 345 350 Ser Phe Phe Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gln Asp Lys Thr Leu 355 360 365 Ser Leu Pro Glu Leu Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln 370 375 380 Gln Glu Gln Val Gln Met Leu Ala Pro Leu Glu Ser 385 390 395 <210> 29 <211> 429 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Thr Leu Ala Leu Val Ala Val Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Ser Ser Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His 35 40 45 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu 85 90 95 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Arg Lys Glu Leu Glu Glu Val Arg Ala Arg 100 105 110 Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Glu Asn Val 115 120 125 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Thr Asp Gln Leu Arg Thr 130 135 140 Gln Val Asn Thr Gln Thr Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln 165 170 175 Thr Ser Leu Arg Pro His Ala Asp Gln Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln 180 185 190 Asn Val Glu Glu Leu Lys Glu Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe 195 200 205 Lys Val Lys Ile Asp Gln Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Tyr Ala Gln Asp Ala Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 225 230 235 240 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile 245 250 255 Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu 260 265 270 Asp Met Arg Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Arg His Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Leu Arg Val Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Met Glu Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val 325 330 335 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 340 345 350 Ser Phe Phe Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gln Asp Asn Thr Leu 355 360 365 Ser Leu Pro Glu Pro Glu Gln Gln Arg Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln 370 375 380 Gln Glu Gln Glu Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln 385 390 395 400 Gln Glu Gln Gln Arg Glu Gln Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln 405 410 415 Gln Gln Glu Gln Val Gln Met Leu Ala Pro Leu Glu Ser 420 425 <210> 30 <211> 395 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Phe Leu Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Leu Val Ala Ile Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Ala Glu Val Thr Ser Asp Gln Val Ala Asn Val Val Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Thr Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu Gln 35 40 45 Phe Gln Lys Thr Asp Val Thr Gln Gln Leu Ser Thr Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Asp Ala Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Val His Asn Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Val Val Gln Leu Ser Gly His Leu Ala Lys Glu Thr Glu 85 90 95 Arg Val Lys Glu Glu Ile Lys Lys Glu Leu Glu Asp Leu Arg Asp Arg 100 105 110 Met Met Pro His Ala Asn Lys Val Thr Gln Thr Phe Gly Glu Asn Met 115 120 125 Gln Lys Leu Gln Glu His Leu Lys Pro Tyr Ala Val Asp Leu Gln Asp 130 135 140 Gln Ile Asn Thr Gln Thr Gln Glu Met Lys Leu Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ile Gln Arg Met Gln Thr Thr Ile Lys Glu Asn Val Asp Asn Leu His 165 170 175 Thr Ser Met Met Pro Leu Ala Thr Asn Leu Lys Asp Lys Phe Asn Arg 180 185 190 Asn Met Glu Glu Leu Lys Gly His Leu Thr Pro Arg Ala Asn Glu Leu 195 200 205 Lys Ala Thr Ile Asp Gln Asn Leu Glu Asp Leu Arg Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Leu Thr Val Gly Val Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Met Glu Gly 225 230 235 240 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Gln Thr Lys Val 245 250 255 Ser Ala Lys Ile Asp Gln Leu Gln Lys Asn Leu Ala Pro Leu Val Glu 260 265 270 Asp Val Gln Ser Lys Val Lys Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Glu Asp Leu Asn Arg Gln Leu Glu Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Arg Thr Val Glu Pro Met Gly Glu Met Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Leu Glu Gln Phe Arg Gln Gln Leu Gly Pro Asn Ser Gly Glu Val 325 330 335 Glu Ser His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Ser Leu Arg Glu Lys Val Asn 340 345 350 Ser Phe Met Ser Thr Leu Glu Lys Lys Gly Ser Pro Asp Gln Pro Gln 355 360 365 Ala Leu Pro Leu Pro Glu Gln Ala Gln Glu Gln Ala Gln Glu Gln Ala 370 375 380 Gln Glu Gln Val Gln Pro Lys Pro Leu Glu Ser 385 390 395 <210> 31 <211> 401 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 1 5 10 15 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Ser Ser Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His 20 25 30 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp 35 40 45 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu 50 55 60 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Lys 65 70 75 80 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Arg Lys Glu Leu Glu Glu Val Arg Ala Arg 85 90 95 Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Glu Asn Val 100 105 110 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Thr Asp Gln Leu Arg Thr 115 120 125 Gln Val Asn Thr Gln Thr Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 130 135 140 Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Leu Arg Pro His Ala Asp Gln Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln 165 170 175 Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe 180 185 190 Lys Val Lys Ile Asp Gln Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala 195 200 205 Pro Tyr Ala Gln Asp Ala Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 210 215 220 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile 225 230 235 240 Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu 245 250 255 Asp Met Arg Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 260 265 270 Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Arg His Val Glu Glu Phe Arg 275 280 285 Leu Arg Val Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 290 295 300 Gln Met Glu Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val 305 310 315 320 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 325 330 335 Ser Phe Phe Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gln Asp Asn Thr Leu 340 345 350 Ser Leu Pro Glu Pro Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Glu 355 360 365 Gln Gln Gln Glu Gln Gln Glu Glu Gln Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln 370 375 380 Glu Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Val Gln Met Leu Ala Pro Leu Glu 385 390 395 400 Ser <210> 32 <211> 382 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Ser Leu Ala Leu Val Ala Val Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Glu Val Asn Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Gly Ser Asn Ala Lys Lys Ala Val Glu His 35 40 45 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Thr Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Thr Glu Asp Leu Gln Lys Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Thr Lys Asp Ser Glu 85 90 95 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Arg Arg Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg 100 105 110 Leu Leu Pro His Ala Thr Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Asp Asn Val 115 120 125 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Gly Pro Phe Thr Gly Gly Leu Arg Thr 130 135 140 Gln Val Asn Thr Gln Val Gln Gln Leu Gln Arg Gln Leu Lys Pro Tyr 145 150 155 160 Ala Glu Arg Met Glu Ser Val Leu Arg Gln Asn Ile Arg Asn Leu Glu 165 170 175 Ala Ser Val Ala Pro Tyr Ala Asp Glu Phe Lys Ala Lys Ile Asp Gln 180 185 190 Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Ser Leu Thr Pro Tyr Ala Glu Glu Leu 195 200 205 Lys Ala Lys Ile Asp Gln Asn Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Tyr Ala Gln Asp Val Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 225 230 235 240 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Gln Ala Glu Glu Leu Lys Ala Lys Ile 245 250 255 Ser Ala Asn Ala Asp Glu Leu Arg Gln Lys Leu Val Pro Val Ala Glu 260 265 270 Asn Val His Gly His Leu Lys Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Leu Glu Leu Arg Ser His Leu Asp Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Leu Lys Val Glu Pro Tyr Gly Glu Thr Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Val Glu Asp Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro Leu Ala Gly Asp Val 325 330 335 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 340 345 350 Thr Phe Phe Ser Thr Leu Lys Glu Glu Ala Ser Gln Gly Gln Ser Gln 355 360 365 Ala Leu Pro Ala Gln Glu Lys Ala Gln Ala Pro Leu Glu Gly 370 375 380 <210> 33 <211> 391 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Thr Val Ala Leu Val Ala Ile Thr 1 5 10 15 Gly Thr Gln Ala Glu Val Thr Ser Asp Gln Val Ala Asn Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Thr Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu Gln 35 40 45 Leu Gln Lys Thr Asp Val Thr Gln Gln Leu Asn Thr Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Asn Ile Asn Thr Tyr Ala Asp Asp Leu Gln Asn Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Val Gln Leu Ser Gly His Leu Thr Lys Glu Thr Glu 85 90 95 Arg Val Arg Glu Glu Ile Gln Lys Glu Leu Glu Asp Leu Arg Ala Asn 100 105 110 Met Met Pro His Ala Asn Lys Val Ser Gln Met Phe Gly Asp Asn Val 115 120 125 Gln Lys Leu Gln Glu His Leu Arg Pro Tyr Ala Thr Asp Leu Gln Ala 130 135 140 Gln Ile Asn Ala Gln Thr Gln Asp Met Lys Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ile Gln Arg Met Gln Thr Thr Ile Gln Asp Asn Val Glu Asn Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Met Val Pro Phe Ala Asn Glu Leu Lys Glu Lys Phe Asn Gln 180 185 190 Asn Met Glu Gly Leu Lys Gly Gln Leu Thr Pro Arg Ala Asn Glu Leu 195 200 205 Lys Ala Thr Ile Asp Gln Asn Leu Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Ala 210 215 220 Pro Leu Ala Glu Gly Val Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Met Glu Gly 225 230 235 240 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Gln Thr Lys Val 245 250 255 Ser Thr Asn Ile Asp Gln Leu Gln Lys Asn Leu Ala Pro Leu Val Glu 260 265 270 Asp Val Gln Ser Lys Leu Lys Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Glu Asp Leu Asn Lys Gln Leu Asp Gln Gln Val Glu Val Phe Arg 290 295 300 Arg Ala Val Glu Pro Leu Gly Asp Lys Phe Asn Met Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Met Glu Lys Phe Arg Gln Gln Leu Gly Ser Asp Ser Gly Asp Val 325 330 335 Glu Ser His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asn Leu Arg Glu Lys Val Ser 340 345 350 Ser Phe Met Ser Thr Leu Gln Lys Lys Gly Ser Pro Asp Gln Pro Leu 355 360 365 Ala Leu Pro Leu Pro Glu Gln Val Gln Glu Gln Val Gln Glu Gln Val 370 375 380 Gln Pro Lys Pro Leu Glu Ser 385 390 <210> 34 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I <220> <221> MISC_FEATURE <223> X = A or G or S or T <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 34 Xaa Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu 20 25 30 Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser 35 40 45 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 50 55 60 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 65 70 75 80 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 85 90 95 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 100 105 110 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 115 120 125 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 130 135 140 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 145 150 155 160 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 165 170 175 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 180 185 190 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 195 200 205 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 210 215 220 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 225 230 235 240 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 260 265 270 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 285 <210> 35 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I with N-terminal His-tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of AP, GP, SP, PP, GSAP, GSGP, GSSP, GSPP, GGGS, GGGGS, GGGSGGGS, GGGGSGGGGS, GGGSGGGSGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS, GGGSAP, GGGSGP, GGGSSP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of GGGSPP, GGGGSAP, GGGGSGP, GGGGSSP, GGGGSPP, GGGSGGGSAP, GGGSGGGSGP, GGGSGGGSSP, GGGSGGGSPP, GGGSGGGSGGGSAP, GGGSGGGSGGGSGP, GGGSGGGSGGGSSP, GGGSGGGSGGGSPP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of GGGGSAP, GGGGSGP, GGGGSSP, GGGGSPP, GGGGSGGGGSAP, GGGGSGGGGSGP, GGGGSGGGGSSP, GGGGSGGGGSPP, GGGGSGGGGSGGGGSAP, GGGGSGGGGSGGGGSGP, GGGGSGGGGSGGGGSSP, and GGGGSGGGGSGGGGSPP. <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 35 Met His His His His His His Xaa Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val 1 5 10 15 Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu 20 25 30 Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val 35 40 45 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 50 55 60 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 65 70 75 80 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 85 90 95 Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 100 105 110 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 115 120 125 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 130 135 140 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 165 170 175 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu 180 185 190 Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg 195 200 205 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala 210 215 220 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 225 230 235 240 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 245 250 255 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 260 265 270 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 275 280 285 Asn Thr Gln 290 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of an interferon sequence <400> 36 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 1 5 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hexa-histidine tag <400> 37 His His His His His His 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage <400> 38 Val Val Ala Pro Pro Ala Pro 1 5

Claims (15)

  1. a) 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함한 대장균(Escherichia coli) K12 균주 세포를 배양하는 단계;
    b) 배양하는 동안, 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 알칼리 용액으로 pH 값을 조정하는 단계; 및
    c) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하여 폴리펩티드를 생산하는 단계
    를 포함하며, 이때
    상기 아미노산이 알칼리 용액 중에서 30 g/l 이상의 농도를 갖고;
    상기 알칼리 용액이 10% (w/v) 이상의 암모니아 용액인, 폴리펩티드의 생산 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    박테리아 세포가 아미노산 영양요구성 세포이고, 상기 영양요구성이 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로부터 선택된 아미노산에 대한 것임을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    알칼리 용액이 9 이상의 pH 값을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    폴리펩티드가 인간 아폴리포 단백질 A1 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    아폴리포 단백질 A1이 서열 번호 01 내지 서열 번호 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    아폴리포 단백질 A1이 서열 번호 01, 서열 번호 02, 서열 번호 34 및 서열 번호 35로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    아미노산이 알칼리 용액 중에서 50 g/l의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    알칼리 용액이 물 중 12.5% (w/v)의 암모니아의 암모니아 용액인 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    아미노산이 류신인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    알칼리 용액이 류신 및 프롤린을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    알칼리 용액이 12.5% (w/v)의 암모니아 용액이고, 아미노산으로서의 류신 및 프롤린을 각각 알칼리 용액 중에 50 g/l의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
KR1020137007871A 2010-08-30 2011-08-25 알칼리 공급원 KR101584414B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10008997 2010-08-30
EP10008997.8 2010-08-30
PCT/EP2011/064598 WO2012028522A1 (en) 2010-08-30 2011-08-25 Alkaline feed

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130100301A KR20130100301A (ko) 2013-09-10
KR101584414B1 true KR101584414B1 (ko) 2016-01-13

Family

ID=43088050

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137007871A KR101584414B1 (ko) 2010-08-30 2011-08-25 알칼리 공급원

Country Status (12)

Country Link
US (2) US8951756B2 (ko)
EP (1) EP2611900B1 (ko)
JP (2) JP5798193B2 (ko)
KR (1) KR101584414B1 (ko)
CN (1) CN103068967B (ko)
BR (1) BR112013004396A2 (ko)
CA (1) CA2807428A1 (ko)
ES (1) ES2558751T3 (ko)
HK (1) HK1181811A1 (ko)
MX (1) MX339227B (ko)
RU (1) RU2631001C2 (ko)
WO (1) WO2012028522A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5798193B2 (ja) * 2010-08-30 2015-10-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ アルカリ性フィード
RU2014108240A (ru) 2011-08-25 2015-09-27 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Укороченный тетранектин-аполипопротеин а-i гибридный белок, содержащая его липидная частица и их применения
CA2838814A1 (en) 2011-08-25 2013-02-28 F.Hoffmann-La Roche Ag Cation and anion exchange chromatography method
CN104066436B (zh) * 2012-01-19 2016-12-14 辛辛那提大学 使用非糖基化载脂蛋白a‑iv治疗糖尿病的方法
JP6412509B2 (ja) 2013-02-22 2018-10-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチドの組換え生産のためのアミノ酸栄養要求性除去原核生物株の使用
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997021829A1 (de) 1995-12-11 1997-06-19 Merck Patent Gmbh Verfahren zur herstellung von rekombinanten proteinen in e. coli mittels hochzelldichte-fermentation
WO2002038609A2 (en) 2000-11-10 2002-05-16 Proteopharma Aps Apolipoprotein conjugates
WO2003048374A1 (en) 2001-12-05 2003-06-12 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of an aromatic amino acid metabolite or derivative thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60118196A (ja) * 1983-11-30 1985-06-25 Takeda Chem Ind Ltd インタ−フェロンの製造法
DD295867A5 (de) 1988-07-28 1991-11-14 Zi F. Mikrobiologie U. Exper. Therapie, Verfahren zur steuerung des wachstums von aerob-submersen mikroorganismen-kulturen
DE4001518A1 (de) 1990-01-19 1991-07-25 Biotechnolog Forschung Gmbh Verfahren zur hochzelldichte-fermentation von escherichia coli in einem ruehrkesselfermentor
SE9203753D0 (sv) * 1992-12-11 1992-12-11 Kabi Pharmacia Ab Expression system for producing apolipoprotein ai-m
GB9602825D0 (en) 1996-02-12 1996-04-10 Therexsys Ltd Method of plasmid dna production and purification
US6291245B1 (en) * 1998-07-15 2001-09-18 Roche Diagnostics Gmbh Host-vector system
CA2443365C (en) 2002-11-19 2010-01-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for the recombinant production of antifusogenic peptides
JP5798193B2 (ja) * 2010-08-30 2015-10-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ アルカリ性フィード

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997021829A1 (de) 1995-12-11 1997-06-19 Merck Patent Gmbh Verfahren zur herstellung von rekombinanten proteinen in e. coli mittels hochzelldichte-fermentation
WO2002038609A2 (en) 2000-11-10 2002-05-16 Proteopharma Aps Apolipoprotein conjugates
WO2003048374A1 (en) 2001-12-05 2003-06-12 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of an aromatic amino acid metabolite or derivative thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20130323783A1 (en) 2013-12-05
EP2611900B1 (en) 2015-11-25
BR112013004396A2 (pt) 2016-05-17
CN103068967B (zh) 2016-05-04
RU2013112563A (ru) 2014-10-10
RU2631001C2 (ru) 2017-09-15
MX2013002144A (es) 2013-04-03
JP2016005461A (ja) 2016-01-14
US20150132802A1 (en) 2015-05-14
US8951756B2 (en) 2015-02-10
CA2807428A1 (en) 2012-03-08
JP2013537432A (ja) 2013-10-03
EP2611900A1 (en) 2013-07-10
CN103068967A (zh) 2013-04-24
MX339227B (es) 2016-05-17
HK1181811A1 (zh) 2013-11-15
US9845347B2 (en) 2017-12-19
ES2558751T3 (es) 2016-02-08
JP5798193B2 (ja) 2015-10-21
KR20130100301A (ko) 2013-09-10
WO2012028522A1 (en) 2012-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101584414B1 (ko) 알칼리 공급원
EP3250692B1 (en) Promoter and uses thereof
Jensen et al. Production of recombinant human growth hormone in Escherichia coli: expression of different precursors and physiological effects of glucose, acetate, and salts
US7358067B2 (en) Fermentation method for production of heterologous gene products in lactic acid bacteria
JP4262206B2 (ja) 遺伝子組換えＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる補酵素Ｑ１０製造の発酵方法
KR101884659B1 (ko) 메나퀴논-７ 생성능이 향상된 신균주 바실러스 서브틸리스 ｂｓ４ 및 이를 이용한 메나퀴논-７의 대량 생산 방법
CN111286496B (zh) 异柠檬酸脱氢酶激酶突变体及其在制备芳香族氨基酸中的应用
CN111235136B (zh) 异柠檬酸裂合酶突变体及其在制备芳香族氨基酸中的应用
EA022946B1 (ru) Способ получения инсулина аспарт при помощи штамма дрожжей pichia pastoris
KR101775226B1 (ko) 페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소를 이용한 히드록시지방산 제조방법
TWI628281B (zh) 胺基酸營養缺陷復原型原核株用於重組生產多肽之用途
KR102031886B1 (ko) 신규한 프로모터 및 이의 용도
WO2000061722A1 (en) Process for the production of yeast biomass comprising functionally deleted $i(hxk2) genes
KR102016050B1 (ko) 신규한 프로모터 및 이의 용도
JP2004519239A (ja) タンパク質発現のための調節領域を含むｄｎａ配列
EP3677594A1 (en) Method for producing l-tryptophan using improved strains of the enterobacteriaceae family
JP2024014657A (ja) Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法
CN111500654A (zh) 使用改良的肠杆菌科菌株生产l-色氨酸的方法
CN113046282A (zh) 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用
Halvorson Genetic engineering: A new biotechnology

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee