ES2387467T3 - Procedimientos de producción de proteínas que tienen estructura helicoidal triple - Google Patents
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Abstract
Un método de producción de una proteína que tiene una estructura de triple hélice, en el que el método comprende:(a) introducir AON que codifica una proteína que tiene una estructura de triple hélice en un vector;(b) transformar una células de ovario de hámster chino (CHO) por transferencia del vector génico; y(c) cultivar o reproducir el transformante, y recoger la proteína que tiene una estructura de triple hélice de la célulao del sobrenadante del cultivo de la misma,en el que la proteína que tiene una estructura de triple hélice es colágeno humano de tipo I o un péptido parcial delmismo.
Description
Procedimientos de producción de proteínas que tienen estructura helicoidal triple
La presente invención se refiere a procedimientos de producción de proteínas que tienen estructura helicoidal triple.
5 Más específicamente, la presente invención se refiere a procedimientos de producción de colágeno humano o péptidos parciales de colágeno humano. Un objeto de la presente invención es proporcionar colágeno humano y péptidos parciales de colágeno humano que son seguros para el cuerpo vivo y que se pueden purificar y obtener fácilmente, y procedimientos de producción de los mismos. Más específicamente, la presente invención proporciona procedimientos de producción de colágeno humano y péptidos parciales del mismo, transduciendo de forma estable células de ovario de hámster chino (CHO) con un vector de expresión de mamífero dentro del que se ha insertado ADNc de colágeno humano.
El colágeno es una proteína que se distribuye en casi todos los tejidos del cuerpo incluyendo la piel, el hueso y el cartílago, y es muy conocido por desempeñar funciones importantes, tales como el mantenimiento de estructuras de
15 tejidos y órganos, proporcionando armazones para las células. Mientras tanto, el colágeno es un material bioabsorbible que se descompone por las colagenasas secretadas a partir de los fibroblastos y por las colagenasas presentes en los fagocitos. Se considera que el colágeno es útil como biomaterial debido a que es un material biocompatible y bioabsorbible, como se describió anteriormente. Hasta ahora, el colágeno se ha usado como un biomaterial para cubrir piel herida y se ha notificado que mejora la cicatrización (documentos distintos de patente 1 y 2).
En la piel hay un cuarenta por ciento de colágeno total, y un 70 % o más del peso seco de la piel y del tendón es colágeno; por tanto, el colágeno es importante para desarrollar piel artificial. Se aplica como material útil para técnicas de cultivo de células y órganos, que ofrece una gran expectativa en sus aplicaciones en el campo en pleno auge de la medicina regenerativa. También se ha señalado que el colágeno (colágeno de tipo 11) se puede usar para suprimir el
25 reumatismo articular por ingestión oral (documentos distintos de patente 3 y 4). Como material de fuente para este colágeno, se han usado principalmente los derivados de tejidos de animales no humanos grandes, tales como cerdos y vacas.
[Documento distinto de patente 1] Surg. Forum, 10, 303 (1960)
Documento distinto de patente 2] J. Surg. Res., 10,485-491 (1970)
[Documento distinto de patente 3] Lancet, 342, 799 (1993)
[Documento distinto de patente 4] Science, 261,1727-1730 (1993)
[Documento de patente 1] Publicación kokai de la solicitud de patente japonesa n.o (JP-A) H10-179169 (solicitud de patente japonesa publicada, no examinada)
35 [Problemas para ser solucionados por la invención]
Como se describió anteriormente, el colágeno es útil como biomaterial o medicamento para terapia regenerativa y trasplante de órganos vivos, pero el colágeno usado hasta el momento se deriva de tejidos de animales no humanos grandes, tales como cerdos y vacas. Aunque el colágeno es una proteína con una inmunogenicidad baja por naturaleza, se ha reportado que cuando el colágeno de un animal xenogénico se trasplanta, se implanta o se administra como biomaterial se inducen reacciones inmunitarias a una frecuencia baja (J. Immunol., 136, 877-882 (1986), Biomaterials, 11,176-180 (1990)). Además, se ha vuelto imposible el uso de colágeno derivado de vaca debido al problema de la contaminación priónica en vacas. Además, no hay garantía de que no se produzcan problemas similares a la contaminación priónica en animales tales como los cerdos que se usan normalmente para la extracción de colágeno. De los aspectos mencionados anteriormente, es preferible el uso de colágeno derivado de ser humano
45 como biomaterial para aplicarse directamente en el cuerpo humano. Sin embargo, la extracción y la purificación de colágeno a partir de tejidos humanos no sólo tiene problemas éticos y técnicos, sino que también es problemático de forma cualitativa porque el colágeno obtenido forma entrecruzamientos inespecíficos y es difícil de purificar.
Para obtener colágeno no inmunogénico que esté libre de riesgo de contaminación por patógenos y que sea fácil de aislar y purificar, se ha estudiado la producción de colágeno usando técnicas de recombinación genética (Biochem. Soc., 28, 350-353 (2000)). Sin embargo, es muy complicado preparar un vector de expresión para introducir en las células huésped, un ADNc que codifique una molécula de colágeno con un peso molecular de más de 100.000. Además, los procedimientos convencionales tienen una productividad baja y están lejos de una aplicación práctica. Además, se sabe que las moléculas de colágeno tienen una estructura de triple hélice en la que están asociados tres péptidos. Esta estructura se forma como resultado de varias modificaciones en los productos de traducción primarios del gen (N. Engl. J. Med., 311, 376-386 (1984)); sin embargo, se cree que sólo las células específicas tienen esta capacidad de modificación.
Se han realizado esfuerzos para producir colágeno humano recombinante usando fibroblastos de ratón, células de pulmón de hámster y similares como huésped (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 764-768 (1987), J. Biol. Chem., 264,
5 20683-20687 (1989)). Aunque el colágeno producido en estos ejemplos tiene una estructura molecular normal, son moléculas de colágeno mezcladas de productos génicos de colágeno tanto de células huésped como humanas. En un ejemplo en el que se expresó colágeno de tipo 11 (Biochem. J., 298,31-37 (1994)), la cantidad producida fue tan solo de 0,5 a 1 mg por litro de medio de cultivo, y se encontró que el colágeno de tipo 11 expresado por el ADNc introducido estaba contaminado con una cantidad significativa de colágeno de tipo 11 derivado de huésped. Por tanto, fue necesario separar el colágeno de tipo 11 endógeno del colágeno de tipo 11 derivado del gen introducido.
Además de los ejemplos mencionados anteriormente, hay ejemplos de expresión de colágeno humano usando levaduras (publicación kohyo de patente japonesa n.o (JP-A) H7-501939 (publicación de fase nacional japonesa publicada, no examinada, correspondiente a una publicación internacional no japonesa)), células de insecto (publicación kokai de solicitud de patente japonesa n.o (JP-A) H8-23979 (solicitud de patente japonesa publicada, no
15 examinada)), Bacillus brevis (JP-A H11-178574), Y Escherichia coli (JP-A 2002-325584), pero las modificaciones posteriores a la expresión de los péptidos del colágeno pueden ser diferentes de las realizadas en células animales. Como se menciona anteriormente, no se ha notificado hasta ahora ningún procedimiento satisfactorio como procedimiento de recombinación genética para producir colágeno humano en términos de cantidad y calidad. Además, aún no se ha producido ninguna investigación sobre los procedimientos para producir grandes cantidades de proteínas con una estructura de triple hélice, tales como el colágeno.
La presente invención se logró en vista de las anteriores circunstancias. Un objeto de la presente invención es proporcionar métodos para producir proteínas con una estructura de triple hélice. Más específicamente, el objeto es proporcionar métodos para producir moléculas de colágeno humano que sean fáciles de aislar y de purificar, y que tengan sustancialmente la misma estructura que las moléculas de colágeno natural, sintetizando grandes cantidades
25 de proteína de colágeno humano en células huésped a las que se les ha introducido un gen de colágeno, incorporado en un vector de expresión alta, en donde las grandes cantidades de proteína de colágeno humano se derivan del gen introducido.
[Medios para resolver los problemas]
Los inventores de la presente invención realizaron diversos estudios para resolver los problemas anteriormente mencionados. Como resultado, los inventores descubrieron que se pueden producir grandes cantidades de colágeno humano apenas contaminadas con colágeno derivado de células huésped, seleccionando de diversas células de mamífero una célula huésped que tenga una expresión de colágeno baja e introduciendo una construcción de gen de colágeno en un vector que pueda realizar una alta expresión génica exógena, y de este modo completaron la presente invención. No se han reportado métodos de producción de colágeno que produzcan de forma preferente colágeno
35 humano en células huésped mediante la expresión masiva de un gen de colágeno introducido.
Específicamente, los presentes inventores desarrollaron exitosamente métodos para producir una gran cantidad de colágeno humano que no requiere un procedimiento de purificación complejo, insertando un gen de colágeno humano en un vector que puede expresar altamente un gen exógeno y después introduciendo la construcción resultante en una célula de mamífero huésped con una expresión baja de colágeno (una proteína con estructura de triple hélice), y de este modo completaron la presente invención.
Específicamente, la presente invención proporciona:
[1] un método de producción de una proteína que tiene una estructura de triple hélice, en el que el método comprende:
- (a)
- introducir ADN que codifica una proteína que tiene una estructura de triple hélice en un vector;
- (b)
- transformar una célula de mamífero por transferencia del vector génico; y
45 (c) cultivar o reproducir el transformante, y recoger la proteína que tiene una estructura de triple hélice de la célula o del sobrenadante del cultivo de la misma;
[2] el procedimiento de [1], en el que la proteína que tiene una estructura de triple hélice es colágeno humano o un péptido parcial de la misma;
[3] el procedimiento de [2], en el que el colágeno humano consiste en al menos uno o más tipos de cadenas a;
[4] el procedimiento de [2], en el que el colágeno humano es colágeno humano de tipo 1;
[5] el procedimiento de [4], en el que el colágeno humano de tipo I es un complejo de cadenas a1 ya2;
[6] el procedimiento de [2], en el que el colágeno humano es colágeno humano de tipo 11;
[7] el procedimiento de [2], en el que el colágeno humano es colágeno humano de tipo 111;
[8] el procedimiento de [1], en el que el ADN que codifica una proteína que tiene una estructura de triple hélice es al menos un ADN seleccionado de:
- (a)
- un ADN que comprende una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEO ID NOs: 1, 4, 7, Y 10; Y
- (b)
- un ADN que hibrida bajo condiciones restrictivas con un ADN que comprende una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEO ID NOs: 1, 4, 7 Y 10;
[9] el método de uno cualquiera de [1 ] a [8], en el que la célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO);
[10] el método de uno cualquiera de [1] a [8], en el que la célula de mamífero es una célula de riñón embrionario humano (HEK293);
[11] el método de uno cualquiera de [1] a [10], en el que el vector que se va a introducir con el ADN que codifica una proteína que tiene una estructura de triple hélice es pNOW/CMV-AA;
[12] un colágeno humano producido de acuerdo con el método de una cualquiera de [1] a [11];
[13] un vector introducido con al menos un ADN seleccionado de:
- (a)
- un ADN que comprende una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SED ID NOs 1,4,7, Y 10; Y
- (b)
- un ADN que hibrida bajo condiciones restrictivas con un ADN que comprende una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEO ID NOs: 1,4,7 Y 10;
[14] una célula de mamífero que lleva el vector de [13]; y
[15] un kit para producir una proteína que tiene una estructura de triple hélice, en el que el kit comprende el vector de
[13] o la célula de mamífero de [14].
La fig. 1 muestra una construcción de expresión de una cadena 01 de colágeno humano de tipo 1. hColla1: ADNc de cadena 01 de colágeno humano de tipo 1, PCMV: promotor de citomegalovirus, BGHPA: señal de adición de poli (A) del gen de la hormona de crecimiento bovino, PSVd: promotor de virus de simio 40 desprovisto de potenciador, DHFR: ADNc de dihidrofolato reductasa de ratón, SVpA: señal de adición de poli (A) del virus de simio 40, CoIE1 ori: origen de replicación de Escherichia coli, Neor: marcador de selección para células de mamífero (resistencia a G418) y Escherichia coli (resistencia a kanamicina).
La fig. 2 muestra una construcción de expresión de una cadena 02 de colágeno humano de tipo 1. hColla2: ADNc del gen de cadena 02 de colágeno humano de tipo 1, PCMV: promotor de citomegalovirus, BGHPA: señal de adición de poli (A) del gen de la hormona de crecimiento bovino, PSVd: promotor de virus de simio 40 desprovisto de potenciador, DHFR: ADNc de dihidrofolato reductasa de ratón, SVpA: señal de adición de poli (A) del virus de simio 40, ColE1ori: origen de replicación de Escherichia coli, Neor: marcador de selección para células de mamífero (resistencia a G418) y Escherichia coli (resistencia a kanamicina).
La fig. 3 muestra una construcción de expresión de una cadena 01 de colágeno humano de tipo 11. hCollla1: ADNc de cadena 01 de colágeno humano de tipo 11, PCMV: promotor de citomegalovirus, BGHPA: señal de adición de poli (A) del gen de la hormona de crecimiento bovino, PSVd: promotor de virus de simio 40 desprovisto de potenciador, DHFR: ADNc de dihidrofolato reductasa de ratón, SVpA: señal de adición de poli (A) del virus de simio 40, CoIE1 ori: origen de replicación de Escherichia coli, Neor: marcador de selección para células de mamífero (resistencia a G418) y Escherichia coli (resistencia a kanamicina).
La fig. 4 muestra una construcción de expresión de una cadena 01 de colágeno humano de tipo 111. hColllla1: ADNc de cadena 01 de colágeno humano de tipo 111, PCMV: promotor de citomegalovirus, BGHPA: señal de adición de poli (A) del gen de la hormona de crecimiento bovino, PSVd: promotor de virus de simio 40 desprovisto de potenciador, DHFR: ADNc de dihidrofolato reductasa de ratón, SVpA: señal de adición de poli (A) del virus de simio 40, CoIE1 ori: origen de replicación de Escherichia coli, Neor: marcador de selección para células de mamífero (resistencia a G418) y Escherichia coli (resistencia a kanamicina).
La fig. 5 es una fotografía que muestra un análisis SDS-PAGE de colágeno humano de tipo I recombinante en sobrenadantes de cultivo. Carril 1: colágeno humano de tipo I (100 ¡Jg/ml), carril 2: colágeno de tipo I recombinante.
La fig. 6 es una fotografía que muestra un análisis SDS-PAGE de productos digeridos por pepsina de colágeno humano de tipo I recombinante en sobrenadantes de cultivo. Carril 1: colágeno humano de tipo I recombinante (185 ¡Jg/ml), carril 2: colágeno humano de tipo I recombinante (concentrado 20 veces).
La fig. 7 es un conjunto de fotografías que muestran la detección por Western blot de colágeno humano de tipo I recombinante purificado y de productos digeridos por pepsina del mismo.
A. Detección por un anticuerpo contra la cadena al de colágeno humano de tipo 1, carril 1 : colágeno humano de tipo I (50 ¡..Ig/m1), carril 2: colágeno de tipo I recombinante, carril 3: productos de colágeno de tipo I digeridos por pepsina recombinante.
B. Detección por un anticuerpo contra la cadena a2 de colágeno humano de tipo 1, carril 1 : colágeno humano de tipo I (10 ¡..Ig/ml), carril 2: colágeno de tipo I recombinante, carril 3: productos de colágeno de tipo I recombinante digeridos por pepsina.
La fig. 8 es una fotografía que muestra un análisis SDS-PAGE de colágeno humano de tipo 11 recombinante en sobrenadantes de cultivo. Carril 1: colágeno humano de tipo 11 (100 ¡..Iglml), carril 2: colágeno de tipo 11 recombinante.
La fig. 9 es una fotografía que muestra un análisis por Western blot de colágeno humano de tipo 11 recombinante en sobrenadantes de cultivo. Carril 1: colágeno humano de tipo 11 (10 ¡..Ig/ml), carril 2: colágeno de tipo 11 recombinante (diluido 10 veces)
La fig. lOes una fotografía que muestra un análisis SDS-PAGE de productos de colágeno humano de tipo 11 recombinante en sobrenadantes de cultivo digeridos por pepsina. Carril 1: colágeno humano de tipo 11 (100 ¡..Iglml), carril 2: colágeno de tipo 11 recombinante (concentrado 5 veces).
La fig. 11 es una fotografía que muestra un análisis por Western blot de productos de colágeno humano de tipo 11 recombinante en sobrenadantes de cultivo digeridos por pepsina. Carril 1: colágeno humano de tipo 11 (10 ¡..Ig/ml), carril
2: colágeno de tipo 11 recombinante.
La fig. 12 es una fotografía que muestra un análisis SDS-PAGE de colágeno humano de tipo 111 recombinante en sobrenadantes de cultivo. Carril 1 : colágeno humano de tipo 111 (100 ¡..Ig/ml), carril 2: colágeno de tipo 111 recombinante.
La fig. 13 es una fotografía que muestra un análisis porWestern blot de colágeno humano de tipo 111 recombinante en sobrenadantes de cultivo y productos digeridos por pepsina del mismo, carril 1: colágeno humano de tipo III (10 ¡..Ig/ml), carril 2: colágeno de tipo 111 recombinante (diluido 10 veces), carril 3: productos de colágeno de tipo 111 recombinante digeridos por pepsina.
La fig. 14 es una fotografía que muestra un análisis SDS-PAGE de colágeno humano de tipo 111 recombinante purificado en sobrenadantes de cultivo.
A. Colágeno de tipo 1, carril 1 : colágeno humano de tipo 1, carril 2: colágeno de tipo I recombinante.
B. Colágeno de tipo 111, carril 1: colágeno de tipo 111 humano, carril 2: colágeno de tipo 111 recombinante.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
A continuación en el presente documento, se muestra el mejor modo para llevar a cabo la presente invención y se explica la presente invención con más detalle.
La presente invención referida a métodos de producción de proteínas que tienen estructura helicoidal triple, comprende las etapas de:
- (a)
- introducir en un vector ADN que codifica una proteína que tiene una estructura de triple hélice;
- (b)
- transformar una célula de mamífero por transferencia del vector génico;
- (c)
- cultivar o reproducir el transformante, y recoger proteínas con una estructura de triple hélice de las células o sobrenadantes del cultivo de las mismas.
Las "proteínas que tienen una estructura de triple hélice" en la presente invención no están específicamente limitadas siempre que tengan una estructura de triple hélice, pero preferentemente son colágeno o colectina, y más preferentemente colágeno. Las proteínas que tienen una estructura de triple hélice pueden ser proteínas cuya estructura de triple hélice se construye durante las etapas de cultivo y producción, o después de las etapas de cultivo y producción por manipulaciones tales como la purificación. También es posible producir grandes cantidades de proteínas que pueden formar una estructura de triple hélice en un estado estructural monocatenario.
Se conocen más de 20 tipos diferentes de colágeno y aproximadamente 25 tipos de cadenas a constituyentes. Se han clonado genes que los codifican y se han dilucidado secuencias de nucleótidos de los mismos ("Connective Tissue and Its Heritable Disorders", p. 145-165, publicado por Weily-Liss Inc. (1992». Se pueden introducir estos genes en un vector usado en la presente invención que pueda expresar altamente genes exógenos mediante técnicas de recombinación de genes conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, "Molecular Cloning" segunda edición, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989». El ADNc de colágeno humano usado en la presente invención puede ser uno cualquiera de esos ADNc clonados de colágeno, e incluye ADNc de péptidos de colágeno parciales.
El colágeno de la presente invención no tiene un origen específicamente limitado, pero es preferible el colágeno derivado de mamífero, y es más preferible el colágeno derivado de ser humano.
Además, el colágeno de la presente invención también incluye colágeno cuya secuencia de aminoácidos está parcialmente modificada por sustitución, deleción, como tal, o tiene una adición de una secuencia de aminoácidos no derivada de colágeno. Además, hay métodos conocidos para obtener células transducidas que expresan moléculas proteicas introduciendo un vector en las células de mamífero huésped. Se pueden aplicar métodos similares a la presente invención.
Se puede usar el siguiente método para examinar si el colágeno se sintetiza como una proteína recombinante por células a las que se les introduce el vector de alta expresión génica exógena mencionado anteriormente. Específicamente, los péptidos de colágeno se pueden identificar por métodos inmunoquímicos tales como Western blot usando anticuerpos disponibles comercialmente que se unen específicamente al colágeno humano. Normalmente, el colágeno no migra de acuerdo con el peso molecular en la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (Nature, 227, 680-685 (1970)). Por tanto, se puede examinar la reactividad de una muestra con un anticuerpo anti-colágeno después de que la muestra se someta a electroforesis simultáneamente con colágeno como marcador y se transfiera a una membrana de nailon o a una membrana de nitrocelulosa de acuerdo con el método por Matsudaira et al. (J. Biol. Chem., 261,10035-10038 (1987)). Además, si una molécula que tiene una estructura de triple hélice está presente en los productos de colágeno recombinante generados por el vector de expresión se puede examinar como sigue.
Un colágeno fibroso típico es una molécula tricatenaria formada por tres subunidades (cadenas a), y tiene una estructura de triple hélice intramolecular. Además, se sabe que el colágeno que tiene una estructura de triple hélice es resistente a la digestión por pepsina. Por tanto, se puede confirmar la presencia de moléculas tricatenarias en una muestra de proteínas digiriendo los sobrenadantes del cultivo de células a las que se le introduce el vector de alta expresión génica endógena mencionado anteriormente con pepsina en una condición ácida, y examinando si la muestra tiene una estructura resistente a pepsina.
Específicamente, en la presente invención, las muestras de proteínas tratadas con pepsina se someten a electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS bajo condiciones reductoras. Como resultado, el colágeno recombinante obtenido mostró que tenía una resistencia a pepsina similar a la del colágeno natural, y por tanto, se espera que los péptidos de colágeno que tienen una propiedad resistente a pepsina estén contenidos en los sobrenadantes del cultivo de células a las que se les introduce un vector de alta expresión génica exógena. Los resultados mencionados anteriormente muestran que el vector de expresión de la presente invención tiene capacidad para sintetizar, en células huésped, colágeno que tiene resistencia a pepsina, lo que es una característica equivalente al colágeno hallado en el cuerpo vivo.
Los métodos de producción y purificación de las proteínas estructurales de triple hélice de la presente invención se muestran a continuación, sin limitarse a ellas.
Las células de mamífero usadas como célula huésped en la presente invención no están particularmente limitadas, pero son preferentemente células CHO o células HEK293.
El cultivo a gran escala de las células CHO o células HEK293 usadas en la presente invención se puede realizar por cultivo por suspensión. Por ejemplo, de 1 x 108 a 1 x 109 células CHO recombinantes a las que se le introduce un vector de expresión de colágeno humano que contiene un gen de neomicina fosfotransferasa debilitado, gen de dihidrofolato reductasa de ratón, y ADNc que codifica colágeno humano o un péptido parcial del mismo se pueden cultivar en un matraz de agitación o un matraz agitador usando de 100 mi a 1 L de medio de cultivo. Después de cultivar estas células durante un periodo de tiempo apropiado, se pueden extraer las proteínas de los sobrenadantes de cultivo recogidos en grandes cantidades.
En los sobrenadantes de cultivo de células CHO recombinantes a las que se le introduce el vector de expresión de colágeno humano que contiene gen de neomicina fosfotransferasa debilitado, gen de dihidrofolato reductasa de ratón, y ADNc que codifica colágeno humano o un péptido parcial del mismo, no sólo existen moléculas de colágeno tricatenarias con una estructura de triple hélice, sino también colágeno que no se ha formado en moléculas tricatenarias normales. Como se ha mencionado anteriormente, las moléculas de colágeno que no tienen una estructura de triple hélice se digieren por pepsina. Por tanto, las moléculas de colágeno que carecen de una estructura de triple hélice se pueden retirar por digestión con pepsina. Además, al mismo tiempo este tratamiento puede también degradar y restirar las proteínas distintas de colágeno en los sobrenadantes de cultivo. Usando las características mencionadas anteriormente, las proteínas distintas de colágeno así como el colágeno que carece de una estructura de triple hélice se pueden digerir y retirar por tratamiento directo con pepsina de las proteínas totales presentes en los sobrenadantes de cultivo de células CHO recombinantes a las que se le introduce un vector de expresión de colágeno humano que contiene un gen de neomicina fosfotransferasa debilitado, un gen de dihidrofolato reductasa de ratón, y ADNc que codifica colágeno humano o un péptido parcial del mismo.
En la presente invención, el colágeno humano de interés son todos los colágenos humanos que se conocen actualmente, incluyendo colágenos de tipo I a XXI, y también incluye péptidos parciales de los mismos. El tipo de colágeno de la presente invención no se limita particularmente, pero incluye, como ejemplos representativos, tipo 1, 5 tipo 11, tipo 111, tipo IV, tipo V, tipo VII, tipo IX, tipo XI, tipo XII, tipo XVII, Y tipo XVIII, y preferentemente tipo 1, tipo 11, tipo
111. Los tipos 1, IV, V, IX Y XI consisten en dos o tres tipos de cadenas a, y los tipos 11, 111, VII, XII, XVII Y XVIII consisten en un tipo de cadena a. Cada uno de ellos tiene la siguiente composición molecular, tipo 1: [a1 (1)]2a2(1), tipo 11: [a1 (11)]3, tipo 111: [a1 (11I)]a, tipo IV: [a1 (IV)]2a2(IV), tipo V: [a1 (V)]2a2(V) y a1 (V)a2(V)a3(V), tipo VII: [a1 (VII)]3, tipo IX: a1(IX)a2(IX)a3(IX), tipo XI: a1(XI)a2(XI)a3(XI), tipo XII: [a1(XIII)]3, tipo XVII: [a1(XVII)]a, o tipo XVIII: [a1(XVIII)]a; sin embargo, la composición molecular del colágeno de la presente invención no está particularmente limitada. Además, la composición molecular del colágeno de la presente invención no está restringida a la del colágeno natural, y puede estar compuesta artificialmente de tres tipos diferentes de cadenas a.
La secuencia de nucleótidos de un ADN que codifica la cadena a1 de colágeno de tipo I de la presente invención está indicada en la SEO ID NO: 1, la secuencia de nucleótidos de un ADN que codifica la cadena a2 de colágeno de tipo I
15 está indicada en la SEO ID NO: 4, la secuencia de nucleótidos de un ADN que codifica la cadena a1 de colágeno de tipo 11 está indicada en la SEO ID NO: 7, y la secuencia de nucleótidos de un ADN que codifica la cadena a1 de colágeno de tipo 111 está indicada en la SEO ID NO: 10.
Los ADN que codifican el colágeno de la presente invención incluyen oligonucleótidos que tienen una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEO ID NO: 1, 4, 7 Y 10, Y preferentemente incluyen oligonucleótidos que hibridan selectivamente con oligonucleótidos que tienen una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEO ID NO: 1, 4, 7 Y 10. "Hibridar selectivamente" se refiere a moléculas que ácidos nucleicos que hibridan con, forman hebras dobles con, o se unen sustancialmente a una molécula que tiene una secuencia predeterminada (es decir, un segundo oligonucleótido) presente en una muestra de ADN o ARN bajo condiciones de hibridación de astringencia apropiada. Las condiciones restrictivas son, por ejemplo, normalmente, condiciones de 42 oC, 2x SSC, Y 0,1 % de SDS,
25 preferentemente condiciones de 50 oC, 2x SSC, Y 0,1 % de SDS, y más preferentemente condiciones de 65 oC, 0,1 x SSC, Y 0,1 % de SDS, pero no están particularmente limitadas a estas condiciones. Las condiciones que afectan a la astringencia de la hibridación pueden incluir factores plurales tales como la temperatura y la concentración salina, y los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente estos factores para lograr la astringencia más apropiada.
El colágeno producido por la presente invención puede ser moléculas de procolágeno en las que un propéptido se une al extremo N y C terminal, o puede estar en una forma en la el propéptido es eliminado.
En la presente invención, "péptidos parciales de colágeno" se refiere a polipéptidos que están codificados por un 20 %
o más (por ejemplo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 %) de los polinucleótidos de un ADNc que codifica el colágeno. Los péptidos también incluyen aquellos en los que las secuencias de aminoácidos del colágeno están parcialmente modificadas o aquellos que tienen añadida una secuencia de aminoácidos distinta de colágeno.
35 En la presente invención, "células de mamífero con una expresión de colágeno baja" se refiere a células que producen 50 ng/ml de colágeno o menos cuando se cultivan a una densidad de 1 x 106 células/mi; y ejemplos preferidos son las células CHO y las células HEK293. En la presente invención, "expresión alta" se refiere a la expresión de 10 lJg/ml de colágeno o más, preferentemente la expresión de 50 IJg/ml o más de colágeno.
En la presente invención, "vector de alta expresión génica exógena se refiere, por ejemplo a vectores que comprenden un gen marcador débil seleccionable de fármacos en células de mamífero, de modo que el gen exógeno llevado por el vector se inserte selectivamente en una región que se transcribe activamente del cromosoma en células de mamífero. Estos vectores incluyen preferentemente el vector pNOW/CMV-AA. El vector pNOW/CMV-AA se conoce en JP-A H10-179169. En la presente invención, el método de cultivo puede ser en cultivo de suspensión o de adhesión.
Toda la literatura de la técnica anterior citada en la presente memoria descriptiva está incorporada en el presente 45 documento por referencia.
A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente usando ejemplos; sin embargo, no se interpreta como estar limitados a ellos.
[Ejemplo 1] Preparación del vector pNOW/CMV-AA
Se preparó el vector pNOW/CMV-AA usado por un procedimiento conocido (JP-A H10-179169).
[Ejemplo 2] Preparación de vectores de expresión de colágeno (1): aislamiento de ADNc de cadena a1 de tipo I humano
El gen de colágeno de cadena a1 de tipo I humano ya se ha clonado, y ya se ha informado de la secuencia de nucleótidos del mismo (Base de datos génica de EMBL, n.o de acceso: NM 000088). La secuencia se muestra en SEO ID NO: 1. Se amplificó el ADNc de a1 de tipo I humano a partir de ADNc derivado de testículo humano por el 55 procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ("PCR Technology", publicado por Stockton Press
(1989)). Específicamente, la secuencia de longitud completa de SEO ID NO: 1 se amplificó por PCR usando ADNc derivado de testículo humano (Becton, Dickinson and Company) como plantilla y los oligonucleótidos de SEO ID N.O: 2 (GCGGCCGCCACCATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCG) y SEO ID N.O: 3 (TTCT AGATT ACAGGAAGCAGACAGGGCCAA) como cebadores. Más específicamente, se llevó a cabo la reacción usando un kit de amplificación de PCR comercialmente disponible (TaKaRa LATaq con tampón GC: Takara Bio Inc.). Se calentó la mezcla de reacción a 94 oC durante 5 minutos, y después se sometió a 35 ciclos de las siguientes tres etapas: desnaturalización (94 oC, 20 segundos), alineamiento de cebadores (60 oC, 30 segundos) y amplificación (72 oC, 3 minutos 30 segundos), seguido de un tratamiento adicional a 72 oC durante 7 minutos para finalizarla reacción. A continuación en el presente documento, se llevaron a cabo todas las reacciones PCR en los ejemplos en el mismo ciclo de reacción. Se separó el producto de PCR obtenido por electroforesis en gel de agarosa y se ligó en un vector de clonación para productos de PCR (kits pT7Blue: Novagen Inc.) usando un kit de ligación (kit de ligación de ADN, ver.2: Takara Bio Inc.). Después de que el ADN ligado se introdujera en la cepa de Escherichia coli XL-I Blue, el ADN plasmídicose obtuvo cultivando las colonias resistentes a ampicilina aparecidas en medio LB agar (Difco Inc.). Se escindió un fragmento de ADN que codifica el colágeno de cadena a1 de tipo I humano a partir del ADN del plásmido, y se ligó con un producto digerido con Not I y Xba I del vector pNOW/CMV-AA preparado en el ejemplo 1, usando el kit de ligación de ADN, ver.2. Después de que el ADN ligado se introdujera en la cepa de Escherichia coli XL-I Blue, se obtuvo el ADN plasmídico (pNOW-hColla1, fig. 1) cultivando una colonia resistente a ampicilina que apareció en medio LB agar
[Ejemplo 31 Preparación de vectores de expresión de colágeno (2): aislamiento de ADNc de cadena a2 de tipo I humano
El gen de colágeno de cadena a2 de tipo I humano ya se ha clonado, y ya se ha informado de su secuencia de nucleótidos del mismo (Base de datos génica de EMBL, n.o de acceso: NM 000089). La secuencia se muestra en SEO ID NO 4. Se amplificó el ADNc de a2 de tipo I humano a partir de ADNc derivado de hígado humano por PCR. Específicamente, la secuencia de longitud completa de SEO ID NO: 4 se amplificó por PCR usando ADNc derivado de hígado humano (Wako Pure Chemical Industries, Ud) como molde y los oligonucleótidos de SEO ID NO: 5 (GCGGCCGCCACCATGCTCAGCTTTGTGGATACGCGGA) y SEO ID NO: 6 (ACTAGTTTATTTGAAACAGACTGGGCCAAT) como cebadores. Se separó el producto de PCR resultante por electroforesis en gel de agarosa y se ligó en un vector de clonación para productos de PCR (kits pT7Blue: Novagen Inc.) usando un kit de ligación (kit de ligación de ADN, ver.2: Takara Bio Inc.). Después de que el ADN ligado se introdujera en la cepa de Escherichia coli XL-I Blue, se obtuvo el ADN plasmídico cultivando cuatro colonias resistentes a ampicilina que aparecieron en medio LB agar (Difco Inc.). Se escindió un fragmento de ADN que codifica el colágeno de cadena a2 de tipo I humano a partir del ADN de plásmido, y se ligó en un vector pNOW/CMV-AA escindido con Not I y Xba I usando el kit de ligación de ADN, ver.2. Después de que el ADN ligado se introdujera en la cepa de Escherichia coli XL-I Blue, se obtuvo el ADN plasmídico (pNOW-hColla2, fig. 2) cultivando una colonia resistente a ampicilina que apareció en medio LB agar.
[Ejemplo 41 Preparación de vector de expresión de colágeno (3): aislamiento de ADNc de cadena a1 de tipo 11 humano
El gen de colágeno de cadena a1 de tipo 11 humano ya se ha clonado, y ya se ha informado de su secuencia de nucleótidos del mismo (Base de datos génica de EMBL, n.o de acceso: NM 001844.1) La secuencia se muestra en SEO ID NO: 7. Se amplificó el ADNc a1 de tipo 11 humano a partir de ADNc derivado de testículo humano por PCR. Específicamente, la secuencia de longitud completa de SEO ID NO: 7 se amplificó por PCR usando ADNc derivado de testículo humano (Becton, Dickinson and Company) como molde y los oligonucleótidos de SEO ID NO: 8 (GGCCCCGCGGTGAGCCATGATTCGCCTCG) y SEO ID NO: 9 (TCTAGATTACAAGAAGCAGACCGGCCCTAT) como cebadores. Se separó el producto de PCR obtenido por electroforesis en gel de agarosa y se ligó a un vector de clonación para productos de PCR (kits pT7Blue: Novagen Inc.) usando un kit de ligación (kit de ligación de ADN, ver.2: Takara Bio Inc.). Después de que el ADN ligado se introdujera en la cepa de Escherichia coli XL-I Blue, se obtuvo el ADN plasmídico cultivando cuatro colonias resistentes a ampicilina que aparecieron en medio LBagar (Difco Inc.). Se escindió un fragmento de ADN que codifica el colágeno de cadena a1 de tipo 11 humano a partir del ADN de plásmido, y se ligó con el vector pNOW/CMV-AA escindido con Not I y Xba I usando el kit de ligación de ADN, ver.2. Después de que el ADN ligado se introdujera en la cepa de Escherichia coli XL-I Blue, se obtuvo el ADN plasmídico (pNOW-hColla1, fig. 3) cultivando una colonia resistente a ampicilina que apareció en medio LB agar
[Ejemplo 5] Preparación de vectores de expresión de colágeno (4): aislamiento de ADNc de cadena a1 de tipo 111 humano
El gen de colágeno de cadena a1 de tipo 111 humano ya se ha clonado, y ya se ha informado de su secuencia de nucleótidos del mismo (Base de datos génica de EMBL, n.O de acceso: X14420). La secuencia se muestra en SEO ID NO: 10. Se amplificó el ADNc a1 de tipo 111 humano a partir de ADNc derivado de hígado humano por PCA. Específicamente, la secuencia de longitud completa de SEO ID NO: 10 se amplificó por PCR usando ADNc derivado de hígado humano (Wako Pure Chemical Industries, Ud) como molde y los oligonucleótidos de SEO ID NO: 11 (GCGGCCGCCACCATGATGAGCTTTGTGCAAAAGGGGA) y SEO ID NO: 12 (TCTAGATTATAAAAAGCAAACAGGGCCAAC) como cebadores. Se separó el producto de PCR obtenido por electroforesis en gel de agarosa y se ligó en un vector de clonación para productos de PCR (kits pT7Blue: Novagen Inc.) usando un kit de ligación (kit de ligación de ADN, ver.2: Takara Bio Inc.). Después de que el ADN ligado se introdujera en la cepa de Escherichia coli XL-I Blue, se obtuvo el ADN plasmídico cultivando cuatro colonias resistentes a ampicilina que aparecieron en medio LB agar. Se escindió un fragmento de ADN que codifica el colágeno de cadena a1 de tipo 11 humano a partir del ADN de plásmido, y se ligó en el vector pNOW/CMV-AA escindido con Not I and Xba I usando el kit de ligación de ADN, ver.2. Después de que el ADN ligado se introdujera en la cepa de Escherichia coli XL-I Blue, se obtuvo el ADN plasmídico (pNOW-hColllla1, fig. 4) cultivando una colonia resistente a ampicilina que apareció en medio LB agar
[Ejemplo 6] Producción de colágeno humano de tipo 1: transferencia del gen de colágeno humano de tipo I usando los vectores de expresión pNOW-hColla1 y pNOW-hColla2, y establecimiento de clones primarios resistentes a G418.
Se transfirió un microgramo de cada uno de pNOW-hColla1 y pNOW-hColla2 obtenidos en los ejemplos 2 y 3 a 1,5 millones de células CHO deficientes en DHFR (células DG44 CHO; proporcionadas por Dr. Gail Urlaub) en un matraz de cultivo de 25 cm2 por el método de lipofectina (reactivo de transfección Effectene, QIAGEN Inc.). Se llevó a cabo el procedimiento de transferencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas, se retiraron las células por tratamiento con tripsina y se contó el número de células. Después, se diluyeron 5x1 05 células con 100 mi de medio de Dulbecco modificado de Iscove que contenía 0,8 mg/ml de G418 y un 10% de suero fetal bovino dializado, y después se sembraron en diez placas de microvaloración de 96 pocillos (960 pocillos), seguido de cultivo a 37 oC durante tres semanas bajo la presencia de un 5 % de gas dióxido de carbono. Se transfirieron las células vivas en 197 pocillos a placas de 24 pocillos con 1 mi de medio Dulbecco modificado de Iscove que contenía 0,8 mg/ml de G418 y un 10 % de suero fetal bovino dializado y se cultivaron hasta confluencia. Después de desechar los sobrenadantes de cultivo, se añadió 1 mi de PBS (Invitrogen Inc.) en cada pocillo, y se descartaron de nuevo los sobrenadantes de cultivo. Se añadieron 0,5 mi de ProCH04 (Takara Bio Inc.), un medio CD para células CHO, a cada pocillo y se cultivó a 37 oC durante 96 horas bajo la presencia de un 5 % de gas dióxido de carbono. Posteriormente, se examinó la cantidad de colágeno humano de tipo I producido en los sobrenadantes de cultivo.
[Ejemplo 7] Ensayo cuantitativo del colágeno humano de tipo I producido en clones celulares transducidos con pNOW-hColla1 y pNOW-hColla2
Se ensayó la cantidad producida por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Se mezclaron 12,5 ¡JI del sobrenadante de cultivo con un volumen igual de solución de tratamiento de muestra Tris-SDS~-ME (Daiichi Pure Chemicals Co., Ud.), y se trató con calor a 95 oC durante 5 minutos. Se cargó la mezcla sobre un gel de poliacrilamida con SDS (PAGEL, ATTO Inc.) y se fraccionó por electroforesis. Después de la electroforesis, se detectó el colágeno humano de tipo I en el gel de poliacrilamida y se cuantificó tratando el gel con solución de tinción azul brillante de Coomassie (Amersham Biosciences). Como control comparativo, se usaron de 12,5 ¡Jg/ml a 100 ¡Jg/ml de colágeno humano de tipo I (Cosmo Bio Co., Ud.) tratado de la misma manera.
[Ejemplo 8] Producción de colágeno humano de tipo I
Entre las líneas celulares resistentes a G418, se estabilizó un clon celular que produjo la mayor cantidad de colágeno humano de tipo I efectuando pases y cultivando. El nivel de colágeno humano de tipo I producido fue de 85 ¡Jg/ml de medio de cultivo (cuatro días).
[Ejemplo 9] Análisis de SDS-PAGE de colágeno humano de tipo I recombinante en sobrenadantes de cultivo
Se ajustó el clon celular que producía masivamente colá~eno humano de tipo I obtenido por amplificación genética hasta 1 x 106 células/mi en un matraz de cultivo de 25 cm usando la solución de cultivo celular IS CHO-CD (IS Japan Co., Ud.). Después de cultivar a 37 oC durante 96 horas bajo la presencia de un gas dióxido de carbono al 5 %, se recogió el fluido de cultivo. Se retiraron las células por centrifugación para obtener un sobrenadante de cultivo. Se mezclaron 12,5 ¡JI del sobrenadante de cultivo con un volumen igual de solución de tratamiento de muestra Tris-SDS~-ME (Daiichi Pure Chemicals Co., Ud.), y se trató con calor a 95 oC durante 5 minutos. Se cargó la mezcla sobre un gel de poliacrilamida con SDS (PAGEL, ATTO Inc.) y se fraccionó por electroforesis. La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS descrita a continuación se llevó a cabo de la misma manera. Después de que terminara la electroforesis, se detectó el colágeno humano de tipo I en el gel de poliacrilamida tratando el gel con solución de tinción azul brillante de Coomassie (Amersham Biosciences). Se usaron 100 ¡Jg/ml de colágeno humano de tipo I tratado de la misma manera como control comparativo. La fig. 5 muestra el resultado del análisis de SDS-PAGE del sobrenadante de cultivo obtenido a partir del clon celular que produce colágeno humano de tipo 1. Los polipéptidos de 150 y 170 kDa que pueden ser cadenas a1 de colágeno humano de tipo I recombinante, y los polipéptidos de 130 y 150 kDa que pueden ser cadenas a2 de colágeno humano de tipo I recombinante se detectaron en el sobrenadante de cultivo.
[Ejemplo 10] Digestión con pepsina y análisis SDS-PAGE de colágeno humano de tipo I recombinante en el sobrenadante de cultivo
La digestión con pepsina del sobrenadante de cultivo obtenido a partir del clon celular que produce colágeno humano de tipo I se llevó a cabo añadiendo ácido acético al 99,7 % al sobrenadante hasta una concentración final de 0,5 M Y luego la pepsina (Sigma Inc.) hasta una concentración final de 24 unidades/mi, seguido por incubación a 20 oC durante dos horas. La digestión con pepsina descrita a continuación se llevó a cabo de la misma manera. Se analizó la muestra obtenida de la digestión con pepsina por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. 185 ¡Jg/ml de colágeno humano de tipo I recombinante disponible comercialmente (Beckton, Dickinson and Company) se usaron como control comparativo. La fig. 6 muestra el resultado analítico de los productos digeridos con pepsina por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Como se observó con el atelocolágeno humano de tipo I disponible comercialmente, cuando se trató con pepsina, se detectó el colágeno humano de tipo I recombinante en el sobrenadante de cultivo como polipéptidos de 130 y 120 kDa, que puede ser de cadena 01 y 02, respectivamente. Estos hechos mostraron que el colágeno humano de tipo I recombinante que tiene una resistencia a pepsina sustancialmente equivalente a la del tipo natural estaba contenido en el sobrenadante de cultivo obtenido a partir del clan celular que produce colágeno humano de tipo 1.
[Ejemplo 11] Análisis por Western blot del colágeno humano de tipo I recombinante en el sobrenadante de cultivo
Se sumergió el gel de poliacrilamida después de la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en un tampón de transferencia, y después se transfirió el colágeno humano de tipo I en el gel de poliacrilamida a una membrana de PVDF por un procedimiento convencional. Después del bloqueo con Block Ace, se hizo reaccionar la membrana con 2 ¡Jg/ml de un anticuerpo contra la cadena 01 del colágeno humano de tipo I y después con un anticuerpo de IgG anti-cabra marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Se detectaron los anticuerpos que reaccionaron por un procedimiento que usa el reactivo de peroxidasa TMB para detectar la actividad de HRP (Funakoshi Ca.). Se usaron 50 ¡Jg/ml de colágeno humano de tipo I recombinante (Beckton, Dickinson and Company) como control comparativo. Se detectó la cadena 02 del colágeno humano de tipo I usando un anticuerpo contra la cadena 02 del colágeno humano de tipo I en lugar de un anticuerpo de cadena 01 del colágeno humano de tipo 1. Se usaron 10 ¡Jg/ml de colágeno humano de tipo I como control comparativo. La fig. 7 muestra el resultado del análisis por Western blot. Un polipéptido de 170 kDa que puede ser una cadena 01 del colágeno humano de tipo I que se puede unir por un anticuerpo anti-cadena 01 del colágeno humano de tipo I y los polipéptidos de 130 y 150 kDa que pueden ser cadenas 02 de colágeno humano de tipo I recombinante que se pueden unir por un anticuerpo anti-cadena 02 del colágeno humano de tipo 1, se detectaron en el sobrenadante de cultivo.
[Ejemplo 12] Purificación de colágeno humano de tipo I en el sobrenadante de cultivo
Se purificaron 100 mi del sobrenadante de cultivo que contenía colágeno humano de tipo I como sigue.
Se concentraron los 100 mi de sobrenadante de cultivo filtrados a través de un filtro de membrana de 0,45 ¡Jm (Millipore Ca.) hasta 30 mi por centrifugación a 3.000 rpm a 4 oC usando un filtro de concentración para centrífuga (VIVASPIN20 (MWCO 10,000): Sartorius).
Se llevó a cabo el desalado añadiendo gradualmente 30 mi de solución de sulfato de amonio al 90 % al sobrenadante de cultivo concentrado anterior mientras se agitaba a 4 oC. Después de que se añadiera toda la solución de sulfato de amonio, se agitó adicionalmente la mezcla durante una hora. Después, se dejó que la muestra permaneciera en hielo durante una hora, y después se centrifugó a 18.000 rpm, 4 oC durante 30 minutos en una centrífuga refrigerada de alta velocidad. Se insolubilizó el colágeno en la solución desalando y flotó sobre la superficie de la solución, y después se recogió y se solubilizó completamente en 5 mi de D-PBS (Sigma Ca.). Se filtró esta solución a través de un filtro de membrana de 0,45 ¡Jm (Millipore Ca.), y después se purificó por filtración en gel usando Superase 6 (Amersham Biosciences) equilibrada con D-PBS, y se aisló el primer pico. Se concentró la fracción de pico recogida aproximadamente 20 veces usando VIVASPIN6 (MWCO 100.000). Se añadió una cantidad apropiada de D-PBS a la solución de colágeno concentrada para concentración adicional, y se retiraron los fragmentos de peso molecular bajo. Se repitió esta adición de D-PBS al menos tres veces o más.
Se concentró una solución de colágeno purificada obtenida a partir del sobrenadante de cultivo de 100 mi original hasta aproximadamente 300 ¡JI Y se sometió a electroforesis por SDS-PAGE para confirmar su pureza.
[Ejemplo 13] Prueba de producción de colágeno humano de tipo 11: transferencia del gen de colágeno humano de tipo 11 usando el vector de expresión pNOW-hCollla1 y establecimiento de clones primarios resistentes a G418.
Se transfirió un microgramo de pNOW-hCollla1 en 1,5 millones de células CHO-DG44 en un matraz de cultivo de 25 cm 2 usando un método con lipofectina. Se llevó a cabo el método de transferencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas, se retiraron las células por tratamiento con tripsina y se contó el número de células. se diluyeron 5x105 células con 100 mi de medio de Dulbecco modificado de Iscove que contenía 0,8 mg/ml de G418 y un 10 % de suero fetal bovino dializado, y después se sembraron en diez placas de microvaloración de 96 pocillos (960 pocillos), seguido de cultivo a 37 oC durante tres semanas bajo la presencia de un 5 % de gas dióxido de carbono. Se transfirieron las células vivas en 126 pocillos a placas de 24 pocillos con 1 mi de medio Dulbecco modificado de Iscove que contenía 0,8 mglml de G418 y un 10 % de suero fetal bovino dializado y se cultivaron hasta la confluencia. Después de que se desecharon los sobrenadantes de cultivo, se añadió 1 mi de PBS (Invitrogen Inc.) en cada pocillo, y se descartaron de nuevo los sobrenadantes de cultivo. Se añadieron 0,5 mi de ProCH04 (Takara Bio Inc.), un medio CD libre de suero para células CHO, a cada pocillo y se cultivó a 37 oC durante 96 horas bajo la presencia de un 5 % de gas dióxido de carbono. A continuación, se examinó la cantidad de colágeno humano de tipo 11 producido en los sobrenadantes de cultivo.
[Ejemplo 14] Ensayo cuantitativo del colágeno humano de tipo 11 producido en clones celulares transducidos con pNOW-hCollla1
Se ensayó la cantidad producida por electroforesis en gel de poliacrilamida con SOS. Se mezclaron 7,5 ¡JI del sobrenadante de cultivo con un volumen igual de solución de tratamiento de muestra Tris-SDSI3-ME (Daiichi Pure Chemicals Ca., Ud.), y se trató con calor a 95 oC durante 5 minutos. Se cargó la mezcla sobre un gel de poliacrilamida con SOS (PAGEL, ATTO Inc.) y se fraccionó por electroforesis. Después de que finalizara la electroforesis, se detectó el colágeno humano de tipo 11 en el gel de poliacrilamida y se cuantificó tratando el gel con solución de tinción azul brillante de Coomassie (Amersham Biosciences). Como control comparativo, se usaron de 12,5¡Jg/ml a 100 ¡Jg/ml de colágeno humano de tipo 11 (Cosmo Bio Ca., Ud.) tratado de la misma manera.
[Ejemplo 15) Amplificación de genes en líneas celulares resistentes a G418
Entre las líneas celulares resistentes a G418, se estabilizó un clan celular que producía la mayor cantidad de colágeno humano de tipo II efectuando pases y cultivando, y después se llevó a cabo una amplificación de genes usando MTX. Primero, se llevó a cabo la amplificación en un medio que contenía MTX 5 nM durante una semana, un medio que contenía MTX 25 nM durante una semana, un medio que contenía MTX 50 nM durante una semana, un medio que contenía MTX 250 nM durante tres semanas y un medio que contenía MTX 1 ¡JM durante tres semanas. Como resultado, el nivel de producción de colágeno humano de tipo 11 se incrementó hasta 70 ¡Jg/ml de medio de cultivo (cuatro días) cuando MTX alcanzó 25 nM. En general, se usan concentraciones de MTX múltiples de entre 10 nM y 10 ¡JM para la amplificación de genes, y 10 ¡JM a menudo se usa como concentración final. Sin embargo, la exposición a una concentración alta es problemática cuando se establecen líneas celulares recombinantes estables debido a la toxicidad celular. Por tanto, también es importante que se logre el criterio de productividad alta a concentraciones de MTX bajas, y por tanto, en este experimento se usaron concentraciones de hasta 1 ¡JM. Además, aunque el periodo de exposición a MTX, incluyendo la selección, normalmente es de seis a doce meses, el presente experimento se realizó aproximadamente en nueve semanas. A pesar de estas condiciones experimentales, se encontró que la cantidad de colágeno humano de tipo 11 producido se incrementó eficazmente. La amplificación de genes en las líneas celulares resistentes a G418 descrita a continuación se llevó a cabo de la misma manera.
[Ejemplo 16) Análisis de colágeno humano de tipo 11 recombinante en el sobrenadante de cultivo por electroforesis en gel de poliacrilamida con SOS
Se ajustó el clan celular que producía masivamente colá~eno humano de tipo 11 obtenido por amplificación de genes hasta 1 x 106 células/mi en un matraz de cultivo de 25 cm usando la solución de cultivo celular IS CHO-CD (IS Japan Ca., Ud.). Después de cultivar a 37 oC durante 96 horas bajo la presencia de un gas dióxido de carbono al 5 %, se recogió el fluido de cultivo y se retiraron las células por centrifugación para obtener un sobrenadante de cultivo. Se mezclaron 7,5 ¡JI del sobrenadante de cultivo con un volumen igual de solución de tratamiento de muestra Tris-SDSI3-ME (Daiichi Pure Chemicals Ca., Ud.), y se trató con calor a 95 oC durante 5 minutos. Se cargó la mezcla sobre un gel de poliacrilamida con SOS (PAGEL, ATTO Inc.) y se fraccionó por electroforesis. La electroforesis en gel de poliacrilamida con SOS descrita a continuación se llevó a cabo de la misma manera. Después de que terminara la electroforesis, se detectó el colágeno humano de tipo 11 en el gel de poliacrilamida tratando el gel con solución de tinción azul brillante de Coomassie (Amersham Biosciences). Se usaron 100 ¡Jg/ml de colágeno humano de tipo 11 (Cosmo Bio Ca., Ud.) tratado de la misma manera como control comparativo. La fig. 8 muestra el resultado del análisis de SDS-PAGE del sobrenadante de cultivo obtenido a partir del clan celular que produce colágeno humano de tipo 11. Los polipéptidos de 170 y 200-kDa que pueden ser colágeno humano de tipo 11 recombinante se detectaron en el sobrenadante de cultivo.
[Ejemplo 17) Análisis por Western blot del colágeno humano de tipo 11 recombinante en el sobrenadante de cultivo
Se sumergió el gel de poliacrilamida después de la electroforesis en gel de poliacrilamida con SOS en un tampón de transferencia, y después se transfirió el colágeno humano de tipo 11 en el gel de poliacrilamida a una membrana de PVDF por un método convencional. Después del bloqueo con Block Ace, se hizo reaccionar la membrana con 1 ¡Jg/ml de un anticuerpo contra la cadena del colágeno humano de tipo 11 (Cosmo Bio Ca., Ud.) y después con un anticuerpo de IgG anti-ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Se detectaron los anticuerpos que reaccionaron por un método de detección de la actividad de HRP usando el reactivo de peroxidasa TMB (Funakoshi Ca.). Se usaron 10 ¡Jg/ml de colágeno humano de tipo 11 (Cosmo Bio Ca., Ud.) como control comparativo. El polipéptido de 170 kDa que puede ser colágeno humano de tipo 11 recombinante que se puede unir a un anticuerpo contra la cadena de colágeno humano de tipo 11 se detectó en el sobrenadante de cultivo (fig. 9).
[Ejemplo 18) Digestión con pepsina y análisis de SDS-PAGE y análisis porWestern blot de colágeno humano de tipo 11 recombinante en el sobrenadante de cultivo
Se analizó una muestra obtenida de la digestión con pepsina por electroforesis en gel de poliacrilamida con SOS. Se usaron 100 ¡Jg/ml de colágeno humano de tipo 11 (Cosmo Bio Ca., Ud.) como control comparativo. La fig. 10 muestra el resultado de analizar los productos digeridos con pepsina por electroforesis en gel de poliacrilamida con SOS. Como se observó con el atelocolágeno humano de tipo 11 disponible comercialmente, cuando se trató con pepsina, el colágeno humano de tipo 11 recombinante en el sobrenadante de cultivo se detectó como un polipéptido de 130 kDa. Estos hechos mostraron que el colágeno humano de tipo 11 recombinante que tiene una resistencia a pepsina sustancialmente equivalente a la del tipo natural estaba contenido en el sobrenadante de cultivo obtenido a partir del clan celular que produce colágeno humano de tipo 11. Se obtuvieron los mismos resultados por Western blot (fig. 11).
[Ejemplo 19] Prueba de producción de colágeno humano de tipo 111: transferencia de gen de colágeno humano de tipo 111 usando el vector de expresión pNOW-hColllla1 y establecimiento de clones primarios resistentes a G418.
Se transfirió un microgramo de pNOW-hColllla1 en 1,5 millones de células CHO-DG44 en un matraz de cultivo de 25 cm2 por un procedimiento con lipofectina. Se llevó a cabo el procedimiento de transferencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas, se retiraron las células por tratamiento con tripsina y se contó el número de células. Después, se diluyeron 3x 103 células con 100 mi de medio de Dulbecco modificado de Iscove que contenía 0,8 mg/ml de G418 y un 10 % de suero fetal bovino dializado, y se sembraron en diez placas de microvaloración de 96 pocillos (960 pocillos), seguido de cultivo a 37 oC bajo la presencia de un 5 % de gas dióxido de carbono durante tres semanas. Como resultado, sólo se encontraron células vivas en 117 pocillos (resistentes a G418). Se transfirieron las células vivas a placas de 24 pocillos con 1 mi de medio Dulbecco modificado de Iscove que contenía 0,8 mg/ml de G418 y un 10 % de suero fetal bovino dializado y se cultivó hasta confluencia. Después de que se desecharon los sobrenadantes de cultivo, se añadió 1 mi de PBS (Invitrogen Inc.) en cada pocillo, y se descartaron de nuevo los sobrenadantes de cultivo. Se añadieron 0,5 mi de CHO-S-SFM 11 (Invitrogen Inc.), un medio libre de suero para células CHO, a cada pocillo y se cultivó a 37 oC durante 72 horas bajo la presencia de un 5 % de gas dióxido de carbono. Posteriormente, se examinó la cantidad de colágeno humano de tipo 111 producido en los sobrenadantes de cultivo.
[Ejemplo 20] Ensayo cuantitativo del colágeno humano de tipo 111 producido en clones celulares transducidos con pNOW -hColllla 1
Se sometió a ensayo la cantidad producida por un procedimiento de transferencia en mancha. Se manchó una membrana de nailon con I ¡JI de sobrenadante de cultivo de 72 horas, 1 ¡JI cada de cada colágeno humano de tipo 111 disponible comercialmente ( Beckton, Dickinson and Company) 2x diluido (de 0,125 a 8¡Jg/ml) en un medio libre de suero para células CHO, CHO-S-SFM 11, y un 1 ¡JI de CHO-S-SFM 11 solo; y después se secó en aire durante una hora. Después del bloqueo con Block Ace, se hizo reaccionar la membrana con 1 ¡Jg/ml de un anticuerpo anti-colágeno humano de tipo 111 (Cosmo Bio Co., Ud) y después con un anticuerpo de IgG anti-ratón marcado con HRP. Se detectaron los anticuerpos que reaccionaron por un procedimiento de detección de la actividad de con el reactivo SuperSignal West Pico usando Lumino Capture.
[Ejemplo 21] Amplificación de genes en líneas celulares resistentes a G418
Entre las líneas celulares resistentes a G418, se estabilizó un clon celular que producía la mayor cantidad de colágeno humano de tipo 111 efectuando pases y cultivando, y después se llevó a cabo una amplificación de genes con MTX. Se llevó a cabo la amplificación de genes primero en un medio que contenía MTX 15 nM durante dos semanas, un medio que contenía MTX 60 nM durante dos semanas, un medio que contenía MTX 250 nM durante dos semanas, y un medio que contenía MTX 1 ¡JM durante cuatro semanas. Como resultado, el nivel de producción de colágeno humano de tipo 111 se incrementó hasta 225 ¡Jg/ml de medio de cultivo (tres días).
[Ejemplo 22] Análisis SDS-PAGE del colágeno humano de tipo 111 recombinante en el sobrenadante de cultivo
Se ajustó el clon celular que producía masivamente colá~eno humano de tipo 111 obtenido por amplificación de genes hasta 1 x 106 células/mi en un matraz de cultivo de 25 cm usando el medio de cultivo IS CHO-CD (IS Japan Co., Ud.). Después de cultivar a 37 oC durante 96 horas bajo la presencia de un gas dióxido de carbono al 5 %, se recogió el fluido de cultivo y se retiraron las células por centrifugación para obtener un sobrenadante de cultivo. Se mezclaron 6,0 ¡JI del sobrenadante de cultivo con un volumen igual de solución de tratamiento de muestra Tris-SDSJ3-ME (Daiichi Pure Chemicals Co., Ud.), y se trató con calor a 95 oC durante 5 minutos. Se cargó la mezcla sobre un gel de poliacrilamida con SDS (PAGEL, AnO Inc.) y se fraccionó por electroforesis. La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS descrita a continuación se llevó a cabo de la misma manera. Después de que terminara la electroforesis, se detectó el colágeno humano de tipo 111 en el gel de poliacrilamida tratando el gel con solución de tinción azul brillante de Coomassie (Amersham Biosciences). Se usaron 100 ¡Jg/ml de colágeno humano de tipo 111 (Beckton, Dickinson and Company) tratado de la misma manera como control comparativo. La fig. 12 muestra el resultado del análisis de SDS-PAGE del sobrenadante de cultivo obtenido a partir del clon celular que produce colágeno humano de tipo 111. Los polipéptidos de 140 y 170 kDa que pueden ser colágeno humano de tipo 111 recombinante se detectaron en el sobrenadante de cultivo.
[Ejemplo 23] Análisis por Western blot del colágeno humano de tipo 111 recombinante en el sobrenadante de cultivo
Se sumergió el gel de poliacrilamida después de la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en un tampón de transferencia, y después se transfirió el colágeno humano de tipo 111 en el gel de poliacrilamida a una membrana de PVDF por un procedimiento convencional. Después del bloqueo con Block Ace, se hizo reaccionar la membrana con 1 ¡Jg/ml de un anticuerpo contra la cadena del colágeno humano de tipo 111 (Cosmo Bio Co., Ud) y después con un anticuerpo de IgG anti-ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Se detectaron los anticuerpos que reaccionaron por un procedimiento de detección de la actividad de HRP usando el reactivo de peroxidasa TMB (Funakoshi Co.). Se usaron 100 ¡Jg/ml de colágeno humano de tipo 111 (Beckton, Dickinson and Company) como control comparativo. Los polipéptidos de 140 y 170 kDa que pueden ser colágeno humano de tipo 111 recombinante que se pueden unir a un anticuerpo contra la cadena de colágeno humano de tipo 111 se detectaron en el sobrenadante de cultivo (fig. 13).
Como se observó con el atelocolágeno humano de tipo 111 disponible comercialmente (Beckton, Dickinson and Company), cuando se trató con pepsina, el colágeno humano de tipo 111 recombinante en el sobrenadante de cultivo se detectó como un polipéptido de 130 kDa. Estos hechos mostraron que el colágeno humano de tipo 111 recombinante que tiene una resistencia a pepsina sustancialmente equivalente a la del tipo natural estaba contenido en el sobrenadante de cultivo obtenido a partir del clon celular que produce colágeno humano de tipo 111.
[Ejemplo 24] Purificación de colágenos humanos de tipo I y de tipo 111 en los sobrenadantes de cultivo
Se llevó a cabo la purificación usando 100 mi del sobrenadante de cultivo que contenía colágeno humano de tipo I o de tipo 111 en el ejemplo 12. Se concentró una solución de colágeno purificada obtenida del sobrenadante de cultivo de 100 mi original hasta aproximadamente 300 ~I Yse sometió a electroforesis por SDS-PAGE para confirmar su pureza. (fig. 14).
La presente invención puede proporcionar vectores de expresión y células que producen colágeno humano que permiten la producción de colágeno humano recombinante que tiene una calidad alta y que está más próximo al de tipo natural. La invención también puede proporcionar células que producen colágeno humano con estructura de triple hélice.
Los métodos de producción de la presente invención no sólo se pueden aplicar a colágeno sino también a proteínas que tienen una estructura de triple hélice, tales como colectina.
Además, el método de producción de colágeno de la presente invención se puede usar para producir grandes cantidades de colágeno con estructura de triple hélice con una composición molecular novedosa, que no se puede producir (o no se ha descubierto) en la naturaleza, expresando simultáneamente diferentes tipos de cadenas o. El colágeno con estructura de triple hélice con una composición molecular novedosa puede tener propiedades que son diferentes de las del colágeno conocido, y por lo tanto se espera que se pueda aplicar como un material nuevo.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, L TD. GOBIERNO DE LA PREFECTURA DE OSAKA
<120> PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCiÓN DE PROTEíNA QUE TIENE UNA ESTRUCTURA HELlCOIDAL TRIPLE
<130> EP54146HV121 pau
<140> aún no asignado
<141> adjunto
<150> PCT/JP2006/306941
<151> 2006-03-31
<150> JP 2005-102999
<151> 2005-03-31
<160> 12
<170> Patentln versión 3.3
<210> 1
<211> 4395
<212> ADN
<213> Homo Sapiens
<400> 1
atgttcagct ttgtggacct ccggctcctg ctcctcttag cggccaccgc cctcctgacg 60 cacggccaag aggaaggcca agtcgagggc caagacgaag acatcccacc aatcacctgc 120 gtacagaacg gcctcaggta ccatgaccga gacgtgtgga aacccgagcc ctgccggatc 180 tgcgtctgcg acaacggcaa ggtgttgtgc gatgacgtga tctgtgacga gaccaagaac 240 tgccccggcg ccgaagtccc cgagggcgag tgctgtcccg tctgccccga cggctcagag 300 tcacccaccg accaagaaac caccggcgtc gagggaccca agggagacac tggcccccga 360 ggcccaaggg gacccgcagg cccccctggc cgagatggca tccctggaca gcctggactt 420 cccggacccc ccggaccccc cggacctccc ggaccccctg gcctcggagg aaactttgct 480 ccccagctgt cttatggcta tgatgagaaa tcaaccggag gaatttccgt gcctggcccc 540 atgggtccct ccggtcctcg tggtctccct ggcccccctg gtgcacctgg tccccaaggc 600 ttccaaggtc cccctggtga gcctggcgag cctggagctt caggtcccat gggtccccga 660 ggtcccccag gtccccctgg aaagaatgga gatgatgggg aagctggaaa acctggtcgt 720 cctggtgagc gtgggcctcc tgggcctcag ggtgcccgag gattgcccgg aacagctggc 780 ctccctggaa tgaagggaca cagaggtttc agtggtttgg atggtgccaa gggagatgct 840 ggtcctgctg gtcctaaggg tgagcctggc agccctggtg aaaatggagc tcctggtcag 900 atgggccccc gtggcctgcc tggtgagaga ggtcgccctg gagcccctgg ccctgctggt 960 gctcgtggaa atgatggtgc tactggtgct gccgggcccc ctggtcccac cggccccgct 1020 ggtcctcctg gcttccctgg tgctgttggt gctaagggtg aagctggtcc ccaagggccc 1080 cgaggctctg aaggtcccca gggtgtgcgt ggtgagcctg gcccccctgg ccctgctggt 1140
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5 <213> Artificial
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<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente 10
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<213> Artificial
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20 <223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
<400> 3 ttctagatta caggaagcag acagggccaa 30 25 <210> 4
<211> 4101 <212> ADN
<213> Horno sapiens
<400> 4
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<213>Homo sapiens
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<400> 12 tctagattat aaaaagcaaa cagggccaac 30
Claims (2)
- REIVINDICACIONES1. Un método de producción de una proteína que tiene una estructura de triple hélice, en el que el método comprende:(a) introducir AON que codifica una proteína que tiene una estructura de triple hélice en un vector;(b) transformar una células de ovario de hámster chino (CHO) por transferencia del vector génico; y 5 (c) cultivar o reproducir el transformante, y recoger la proteína que tiene una estructura de triple hélice de la célulao del sobrenadante del cultivo de la misma,en el que la proteína que tiene una estructura de triple hélice es colágeno humano de tipo I o un péptido parcial del mismo.
- 2. El método de la reivindicación 1, en el que el colágeno humano de tipo I es un complejo de cadenas 01 y 02.
- 10 3. El método de la reivindicación 1, en el que el AON que codifica una proteína que tiene una estructura de triple hélice es al menos un AON seleccionado de:
- (a)
- un AON que comprende la secuencia de nucleótidos de SEO ID NO: 1 ó 4; y
- (b)
- un AON que hibrida bajo condiciones astringentes con un AON que comprende la secuencia de nucleótidos de SEO ID NO: 1 ó 4.
- 15 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector que se va a introducir con el AON que codifica una proteína que tiene una estructura de triple hélice es pNOW/CMV-AA.
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