CN114761418A - Cho细胞衍生的蛋白分泌因子和包含它的表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及：一种CHO细胞衍生的蛋白分泌因子，其中编码所述蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因被可操作连接的表达盒，包含所述表达盒的表达载体，其中引入有所述表达载体的转化细胞，以及使用所述转化细胞生产靶蛋白的方法。

Description

CHO细胞衍生的蛋白分泌因子和包含它的表达载体

技术领域

本发明涉及一种CHO细胞衍生的蛋白分泌因子，其中编码所述蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因被可操作连接的表达盒，包含所述表达盒的表达载体，其中引入有所述表达载体的转化细胞，以及使用所述转化细胞生产靶蛋白的方法。

背景技术

对于在体内难以获得的有用蛋白质组分来说，可以使用微生物或动物细胞系统通过基因重组技术大规模生产重组蛋白。重组蛋白可以被调节，使得它们可以在细胞内表达或分泌到细胞外。然而，细胞内表达的缺点在于蛋白质经常作为不溶性团块积累，并且由于分离和纯化困难而导致生产率降低。另一方面，通过细胞外分泌可以容易地获得具有正确蛋白质折叠的可溶性蛋白。因此，为了在蛋白质产量和质量控制方面获得更合适的细胞外分泌，优化的重组蛋白质表达系统是重要的。

为了生产重组蛋白，诸如宿主细胞、感兴趣的基因、表达载体、选择标记、启动子和信号肽序列的组分是必不可少的。重组蛋白的质量和生产率随着这些组分的选择而变。

就信号肽而言，它位于待生产的重组蛋白的N-端区域处，因此与重组蛋白的表达水平相关，并且是允许细胞外分泌的组分。取决于使用哪种信号肽，可以观察到表达水平的差异，并且由于信号肽的错误切割，信号肽序列可能保留在所述蛋白质的N-端处，影响重组蛋白的质量。

因此，选择不引起错误切割并且可以诱导高表达的信号肽是重要的。

同时，常规信号肽大多使用人类来源的信号肽，并且主要使用CHO细胞作为表达宿主细胞。在宿主细胞之间信号肽可以组合使用，但可能会导致质量问题。

在这些情况下，本发明人为了提高CHO细胞中的表达水平和解决错误切割问题付出了许多努力。结果，他们开发了一种新的信号肽，它是由源自于CHO细胞的第17至31位氨基酸序列组成的多肽，并通过确认所述信号肽可以显著提高表达并在切割位点处100％切割以防止错误切割，完成了本发明。

发明内容

[技术问题]

本发明的一个目的是提供一种蛋白分泌因子，其由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。

本发明的另一个目的是提供一种表达盒，其中编码由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因被可操作连接。

本发明的又一个目的是提供一种用于分泌靶蛋白的表达载体，所述表达载体包含表达盒，其中编码由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因被可操作连接。

本发明的又一个目的是提供一种转化细胞，其中所述表达载体被引入到宿主细胞中。

本发明的又一个目的是提供一种生产靶蛋白的方法，所述方法包括：

i)培养包含用于分泌靶蛋白的表达载体的转化细胞，所述表达载体包括表达盒，其中编码由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因被可操作连接；和

ii)从培养的细胞的培养基或培养上清液回收所述靶蛋白。

[技术解决方案]

在下文中将更详细地描述本发明。同时，本文中公开的每个解释和示例性实施方式可以应用于其他解释和示例性实施方式。也就是说，本文中公开的各种不同因素的所有组合均属于本发明的范围。此外，本发明的范围不应受到下文中提供的特定公开内容的限制。

此外，本领域普通技术人员可能仅使用常规实验即可识别或确认本文描述的本发明的特定方面的许多等效物。此外，这些等效物也打算被包括在本发明中。

为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种源自于CHO细胞的新的蛋白分泌因子。具体来说，本发明提供了一种由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子。更具体来说，所述蛋白分泌因子可以由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成，但不限于此。

本发明的“蛋白分泌因子”是指连接到靶蛋白以诱导所述靶蛋白的细胞外分泌的因子，并且可能由多肽组成。所述蛋白分泌因子可以促进作为内源蛋白和/或外源蛋白的靶蛋白的分泌，并且具体来说可以促进抗体的轻链和/或重链的细胞外分泌，但不限于此。

本发明中的蛋白分泌因子可以与“信号序列”或“信号肽(SP)”互换使用。

本发明的蛋白分泌因子可以具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列，但不限于此。此外，本发明的蛋白分泌因子还可以包括由SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子，但不限于此。

在本发明的一个特定实施方式中，所述蛋白分泌因子可以源自于CHO细胞，但不限于此。当在本文中使用时，术语“CHO细胞”是中华仓鼠卵巢细胞，并且可以是在本领域中常用于转化的宿主细胞。此外，可以对CHO细胞衍生的蛋白分泌因子进行选择，以提高在作为宿主细胞的CHO细胞中的表达水平。

在本发明中，所述由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子可以是组织蛋白酶B(Cat)，并且可以与本发明中的Cat分泌序列互换使用。所述由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子可以是C-C基序趋化因子(CC)，并且可以与本发明中的CC分泌序列互换使用。所述由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子可以是核连蛋白-2(NUC)，并且可以与本发明中的NUC分泌序列互换使用。

另外，所述由本发明的SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子可以是丛生蛋白(Clus)，并且可以与本发明中的Clus分泌序列互换使用。所述由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子可以是色素上皮衍生因子(Pig)，并且可以与本发明中的Pig分泌序列互换使用。所述由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子可以是前胶原C-内肽酶增强物1(Proco)，并且可以与本发明中的Proco分泌序列互换使用。所述由SEQ IDNO：7的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子可以是巯基氧化酶(Sulf)，并且可以与本发明中的Sulf分泌序列互换使用。所述由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子可以是脂蛋白脂肪酶(Lip)，并且可以与本发明中的Lip分泌序列互换使用。所述由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子可以是巢蛋白-1(Nid)，并且可以与本发明中的Nid分泌序列互换使用。所述由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子可以是蛋白质二硫键异构酶(Pro)，并且可以与本发明中的Pro分泌序列互换使用。

所述编码由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的组织蛋白酶B信号肽的核酸序列可以是SEQ ID NO：11的多核苷酸序列，所述编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的C-C基序趋化因子信号肽的核酸序列可以是SEQ ID NO：12的多核苷酸序列，并且所述编码由SEQ IDNO：3的氨基酸序列组成的核连蛋白-2信号肽的核酸序列可以是SEQ ID NO：13的多核苷酸序列。

此外，所述编码由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的丛生蛋白信号肽的核酸序列可以是SEQ ID NO：14的多核苷酸序列，所述编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的色素上皮衍生因子(Pig)信号肽的核酸序列可以是SEQ ID NO：15的多核苷酸序列，所述编码由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的前胶原C-内肽酶增强物1(Proco)信号肽的核酸序列可以是SEQ ID NO：16的多核苷酸序列，所述编码由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的巯基氧化酶(Sulf)信号肽的核酸序列可以是SEQ ID NO：17的多核苷酸序列，所述编码由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的脂蛋白脂肪酶(Lip)信号肽的核酸序列可以是SEQ ID NO：18的多核苷酸序列，所述编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的巢蛋白-1(Nid)信号肽的核酸序列可以是SEQ ID NO：19的多核苷酸序列，并且所述编码由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的蛋白质二硫键异构酶(Pro)信号肽的核酸序列可以是SEQ ID NO：20的多核苷酸序列。

尽管本发明的蛋白分泌因子被描述为“由特定氨基酸序列组成的分泌因子”，但显然只要所述分泌因子具有与由相应序列号的氨基酸序列组成的分泌因子相同或对应的活性，则它不排除可能通过所述氨基酸序列上游或下游的无意义序列添加而发生的突变、可能天然发生的突变或其沉默突变。即使存在所述序列添加或突变，它也落于本发明的范围之内。

例如，只要与由所述多核苷酸组成的核酸分子相同或相应的分泌因子可以起到信号肽的作用，则与上述序列显示出85％或更高，特别地90％或更高，更特别地95％或更高，甚至更特别地98％或更高或甚至更特别地99％或更高的同源性和/或同一性的核酸序列也可以不受限制地包括在本发明中。此外，显然在所述序列的一部分中具有缺失、修饰、替换或添加的核酸序列也可以被包括在本发明的范围之内，只要所述核酸序列具有这种同源性即可。

当在本文中使用时，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核酸序列之间的相关性程度，并且可以被表示为百分率。术语“同源性”和“同一性”通常可以彼此互换使用。

保守多核苷酸或多肽序列的序列同源性或同一性可以通过标准的比对算法来确定，并且可以与由所使用的程序建立的默认空位惩罚一起使用。基本上，通常预期同源或同一的序列在中等或高严紧条件下与所述序列全长的全部或至少约50％、60％、70％、80％或90％或更多杂交。还考虑了含有简并密码子而不是所述杂交多肽中的密码子的多核苷酸。

任两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性，可以通过已知的计算机算法例如“FASTA”程序(Pearson等，(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]:2444)，使用默认参数来确定。或者，它可以通过Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)来确定，所述算法使用EMBOSS软件包的Needleman程序来进行(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite)，Rice等，2000,Trends Genet.16:276-277)(优选为5.0.0版或随后的版本)，也可以使用GCG程序包(Devereux,J.等，Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等，J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；《大型计算机指南》(Guide to Huge Computers)，Martin J.Bishop主编，Academic Press,SanDiego,1994和[CARILLO等，(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)来确定。例如，同源性、相似性或同一性可以使用美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)(NCBI)的BLAST或ClustalW来确定。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过使用例如GAP计算机程序例如Needleman等，(1970)，J Mol Biol.48:443来比较序列信息，如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math(1981)2:482中所公开的来确定。概括来说，所述GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为通过用相似对齐的符号(即核苷酸或或氨基酸)的数目除以所述两个序列中较短者中符号的总数而获得的值。用于GAP程序的默认参数可以包括(1)一元比较矩阵(含有对于同一者来说为1并且对于非同一者来说为0的值)和Gribskov等，(1986)，Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，正如在Schwartz和Dayhoff主编的《蛋白质序列和结构图谱》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，National BiomedicalResearch Foundation,pp.353-358(1979)中所公开的(或EDNAFULL替代矩阵(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本))；(2)每个空位3.0的罚分和每个空位中的每个符号额外的0.10罚分(或10的空位开放罚分和0.5的空位扩展罚分)；和(3)对末端空位无罚分。因此，当在本文中使用时，术语“同源性”或“同一性”是指序列之间的相关性。

本发明的另一方面提供了一种表达盒，其中编码由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因被可操作连接。

本发明的“蛋白分泌因子”如上所述。

当在本文中使用时，术语“靶蛋白”可以是指在宿主细胞中内源表达的蛋白质或由引入到其中的外源基因表达的蛋白质。对靶蛋白的类型没有特别限制，只要细胞外分泌效率通过本发明的信号肽序列得以提高即可。

所述靶蛋白可以是抗体、抗体片段(Fab或ScFv)、融合蛋白、蛋白质支架、人生长激素、血清蛋白、免疫球蛋白、细胞因子、α-、β-或γ-干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、磷脂酶活化蛋白(PLAP)、胰岛素、肿瘤坏死因子(TNF)、生长因子、激素、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、脑啡肽、生长调节素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、生长分化因子、细胞黏附蛋白、催乳素、绒毛膜促性腺激素、组织纤溶酶原激活物、生长激素释放肽(GHPR)、胸腺体液因子(THF)、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、糜蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶、胆红素氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖脑苷脂酶或葡萄糖醛酸酶，并且具体来说，它可以是抗体的重链蛋白或轻链蛋白，但不限于此。

当在本文中使用时，术语“可操作连接”是指上述基因序列、启动子序列和信号肽序列之间的功能联系，以启动和介导编码本申请的蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因的转录。可操作连接可以使用本领域中已知的基因重组技术来制备，位点特异性DNA连接可以使用本领域中已知的连接酶来制备，但不限于此。

当在本文中使用时，术语“表达盒”是指调控一个或多个基因及其表达的序列，例如包括各种不同的顺式作用转录调控元件的任何组合的核酸序列。本发明的表达盒还可以包括各种不同元件，例如本领域中公认的表达调控所必需的核酸序列如启动子和增强子，以及编码蛋白分泌因子和靶蛋白的核酸序列。调控基因的表达的序列，也就是说调控基因的转录及其转录产物的表达的序列，通常被称为“调控单元”。大多数调控单元位于靶基因的编码序列的上游，使得它可操作连接到所述编码序列。此外，表达盒可以包括3′非翻译区，其包括在3′端处的多腺苷酸化位点。

本发明的表达盒可以是通过将编码由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因可操作连接，允许所述靶蛋白在宿主细胞中的细胞外分泌和表达的多核苷酸的组合。

本发明的另一方面提供了一种表达盒，在其中将编码靶蛋白的基因可操作连接到编码由SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列。

本发明的“蛋白分泌因子”、“靶蛋白”、“可操作连接”和“表达盒”如上所述。

在本发明中，所述由SEQ ID NO：11的多核苷酸序列编码的蛋白分泌因子可以是组织蛋白酶B(Cat)，所述由SEQ ID NO：12的多核苷酸序列编码的蛋白分泌因子可以是C-C基序趋化因子(CC)，所述由SEQ ID NO：13的多核苷酸序列编码的蛋白分泌因子可以是核连蛋白-2(Nuc)，所述由SEQ ID NO：14的多核苷酸序列编码的蛋白分泌因子可以是丛生蛋白(Clus)，所述由SEQ ID NO：15的多核苷酸序列编码的蛋白分泌因子可以是色素上皮衍生因子(Pig)，所述由SEQ ID NO：16的多核苷酸序列编码的蛋白分泌因子可以是前胶原C-内肽酶增强物1(Proco)，所述由SEQ ID NO：17的多核苷酸序列编码的蛋白分泌因子可以是巯基氧化酶(Sulf)，所述由SEQ ID NO：18的多核苷酸序列编码的蛋白分泌因子可以是脂蛋白脂肪酶(Lip)，所述由SEQ ID NO：19的多核苷酸序列编码的蛋白分泌因子可以是巢蛋白-1(Nid)，并且所述由SEQ ID NO：20的多核苷酸序列编码的蛋白分泌因子可以是蛋白质二硫键异构酶(Pro)。

本发明的另一方面提供了一种用于分泌靶蛋白的表达载体，所述表达载体包括表达盒，其中将编码由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因可操作连接。

本发明的“蛋白分泌因子”、“靶蛋白”、“可操作连接”和“表达盒”如上所述。

当在本文中使用时，术语“用于分泌靶蛋白的表达载体”是指一种表达载体，在其中将所述蛋白分泌因子和编码所述靶蛋白的基因可操作连接，以便当将所述载体引入到宿主细胞中并在其中表达时，诱导所述靶蛋白的细胞外分泌。

当在本文中使用时，术语“表达载体”通常是指作为载体的双链DNA片段，编码靶蛋白的靶DNA片段被插入到其中。可以不受限制地使用本领域中用于表达蛋白质的表达载体。一旦所述表达载体进入宿主细胞，所述表达载体可以独立于宿主染色体DNA进行复制，并且可以表达插入的靶DNA。为了提高转染的基因在宿主细胞中的表达水平，所述转染的基因必须被可操作连接到在所选的表达宿主细胞中运转的转录和翻译控制序列。

对在本发明中使用的表达载体没有特别限制，只要它可以在宿主细胞中复制即可，并且可以使用本领域中已知的任何载体。惯常使用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λⅨII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A和Charon21A等，而作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的载体。具体来说，所述载体可以是基于pTZ的载体，但不限于此。

在本发明的一个特定实施方式中，用于分泌靶蛋白的表达载体通过在pTz-D1G1载体(包括韩国专利号10-1038126的启动子的变体)的基础上，将编码由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列与编码靶蛋白的基因可操作连接来制备(实施例4)。

所述表达载体还可以包括编码由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9或SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列。

本发明的另一个方面提供了一种转化细胞，其中将所述表达载体引入到宿主细胞中。

本发明的“表达载体”如上所述。

当在本文中使用时，术语“转化”是指将包括编码靶多肽的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中的过程，从而允许所述多核苷酸编码的蛋白质在所述宿主细胞中表达。

只要所述转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，则它是被插入到宿主细胞的染色体中并位于其中还是位于染色体外并不重要，两种情况都可以包括。此外，所述多核苷酸包括编码靶多肽的DNA和RNA。所述多核苷酸可以以任何形式引入，只要它可以被引入到宿主细胞中并在其中表达即可。例如，所述多核苷酸可以以表达盒的形式引入到宿主细胞中，所述表达盒是包括自身表达所必需的所有元件的基因构建物。所述表达盒常规上可以包括与所述多核苷酸可操作连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。

转化本发明的载体的方法包括将核酸引入到细胞中的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞来选择本领域中已知的适合的标准技术来进行。例如，转化可以通过粒子轰击、电穿孔、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术、乙酸锂-DMSO技术来进行，但方法不限于此。

当在本文中使用时，术语“宿主细胞”是指具有本发明的蛋白分泌因子的活性的核酸分子被引入到其中并且可以在其中充当信号肽的真核细胞。所述宿主细胞可以包括例如公知的真核宿主，例如酵母、昆虫细胞如草地贪夜蛾(Spodoptera frupperda)和动物细胞例如CHO、COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10，但不限于此。

在本发明中，所述宿主细胞的实例可以是动物宿主细胞，并且具体来说，它可以是中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，但不限于此。

在本发明的一个特定实施方式中，将在重组蛋白的生产中广泛使用的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞用作宿主细胞(实施例4)。

当在本文中使用时，术语“转化体”是指转化的动物细胞，其中包括由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的信号肽和靶蛋白的表达载体被引入到作为宿主细胞的CHO细胞中。

在本发明的一个特定实施方式中，证实了所述转化体提高了作为靶蛋白的派姆单抗(即抗体)的轻链和重链的表达水平(实施例4)。

本发明的另一方面提供了一种生产靶蛋白的方法，所述方法包括：

i)培养包含用于分泌靶蛋白的表达载体的转化细胞，所述表达载体包括表达盒，其中编码由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因被可操作连接；和

ii)从培养的细胞的培养基或培养上清液回收所述靶蛋白。

本发明的“蛋白分泌因子”、“靶蛋白”、“可操作连接”、“表达盒”、“用于分泌靶蛋白的表达载体”、“宿主细胞”和“转化体”如上所述。

当在本文中使用时，术语“培养”是指将转化细胞在适合的人工控制的环境条件下生长的过程。在本发明中，所述使用CHO细胞作为宿主细胞生产靶蛋白的方法可以使用本领域中广泛已知的方法来进行。具体来说，所述培养可以通过分批过程、补料分批或重复补料分批过程以连续的方式进行，但不限于此。

用于培养的培养基应该以适合的方式满足特定细胞株的需求。可以在本发明中使用的碳源可以包括糖和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，油类和脂肪例如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油，脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类例如乙醇，以及有机酸例如葡萄糖酸、乙酸和丙酮酸，但不限于此。这些物质可以单独或混合使用。

可以在本发明中使用的氮源可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、脱脂豆饼和尿素或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，但不限于此。这些氮源也可以单独或混合使用。

可以在本发明中使用的磷源可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐，但不限于此。此外，培养基可以含有生长所需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，还可以使用生长必需物质例如氨基酸和维生素。此外，在培养基中可以使用适合的前体。这些物质可以在培养期间以分批或连续方式适当地添加到培养基中。

可以以适合的方式向培养基添加碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨水或酸性化合物例如磷酸或硫酸，以调节培养基的pH。此外，可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制泡沫的形成。为了将培养基维持在有氧状态下，可以将氧气或含氧气体注入到培养基中。培养基的温度通常可以是20℃至45℃，优选为25℃至40℃，但可以根据条件改变并且不限于此。

在本发明的一个特定实施方式中，将重组表达载体(即pCB-SP7.2-Pem、pCB-Clus-Pem、pCB-Pig-Pem和pCB-CC-Pem)引入到CHO宿主细胞(ExpiCHO-S^TM细胞)中，并在30mLExpiCHO表达培养基(CHO表达培养基)中通过补料分批培养方法培养12天(实施例4)。

本发明的用于生产靶蛋白的方法可以包括从培养基回收所述靶蛋白的步骤。当在本文中使用时，术语“回收”是从培养基获得靶蛋白的过程，并且可以使用本领域中已知的方法例如离心、过滤、阴离子交换层析、结晶、HPLC等来进行，但方法不限于此。

所述回收步骤可以包括纯化过程，并且本领域技术人员可以根据需要在各种不同的已知纯化过程中选择并使用。例如，可以通过常规的层析方法例如免疫亲和层析、受体亲和层析、疏水相互作用层析、凝集素亲和层析、尺寸排阻层析、阳离子或阴离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和反相HPLC，将宿主细胞与培养基或宿主细胞的培养上清液分离。此外，当所需蛋白质是带有特定标签、标记物或螯合组成部分的融合蛋白时，它可以通过特异性结合配偶体或药物来纯化。所述纯化的蛋白质可以被切割成所需蛋白质区域，例如除去所述分泌因子，或者它可以保持原样。包括额外氨基酸的所需形式的蛋白质可以通过在切割过程中切割所述融合蛋白来生产。

本发明的由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子可以是在所述靶蛋白的N-端切割位点处准确切割的分泌因子。

所述信号肽位于待生产的重组蛋白的N-端区域处，并且当所述靶蛋白被转运时，信号肽被信号肽酶降解。然而，由于错误切割问题，现有的蛋白分泌因子常常可能降低靶蛋白的质量。所述“错误切割”是指信号肽未在正确位置处完全降解，并且信号肽序列部分保留在靶蛋白的N-端处的现象。

在本发明的一个特定实施方式中，使用纯化的靶蛋白，通过Q-TOF MS质谱仪确认了蛋白分泌因子(信号肽)的切割。结果，证实了在预测的切割位点处观察到了100％切割。

因此，包含本发明的蛋白分泌因子(信号肽)的表达载体通过重组蛋白的高效表达和分泌提高了靶蛋白的生产率，并且可以是解决错误切割问题的强大遗传工具。

[有利效果]

本发明的蛋白分泌因子即信号肽可以通过高水平表达显著提高重组蛋白的生产率，并且预计可以用作强大的遗传工具，其可以通过在切割位点处100％切割来解决常规信号肽的错误切割问题。

附图说明

图1是使用SignalP4.1预测信号肽的图。

图2是通过瞬时表达确认信号肽-mCherry的表达水平的图。

图3是示出了用于位点特异性整合的载体图谱的图。

图4是比较了在位点特异性整合细胞中mCherry的表达水平的图。

图5是示出了质量数据的图，证实了与SP7.2和Clus融合的抗PD-1抗体的切割。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，提供这些实施例仅仅是出于说明的目的，而本发明的范围不打算限于这些实施例或受这些实施例限制。

实施例1.源自于CHO细胞的新的信号肽序列的制备

1-1.CHO HCP质量分析

将四种类型(ADH、BSA、PHO和ENL)的MassPREPTM蛋白质消化物标准品添加到如下所述用胰蛋白酶处理的CHO细胞培养基(DXB11)。在所述四种类型的MassPREPTM蛋白质消化物标准品中，PHO被用作内标，用于计算每种宿主细胞蛋白(HCP)的浓度。使用2D LC(高pHRP/低pH RP)-Q-TOF(UDMSe)方法分析每个样品的宿主细胞蛋白(HCP)。

对于每个级分来说，通过直接进样到Q-TOF MS中的2D柱中来获得MS数据(UDMSe)。使用ProteinLynx全球服务器(PLGS,Ver.3.0.2)软件将以上述方式获得的10个级分的MS数据(UDMSe)合并成一个数据。然后，使用每个样品的合并数据和中华仓鼠蛋白质数据库来鉴定HCP，并使用PHO作为内标计算每种HCP的浓度。

1-2.从CHO HCP数据选择信号肽

将蛋白质以高浓度的顺序排列，并从CHO基因组数据库(http://chogenome.org)确认每种蛋白质的氨基酸序列。将由此获得的氨基酸序列输入到SignalP4.1服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)中，以预测分泌蛋白和信号肽序列的存在(表1、图1和表4)。

[表1]

通过SignalP4.1预测的HCP分泌蛋白

实施例2.通过瞬时表达选择CHO衍生的高效信号肽

2-1.用于瞬时表达的重组蛋白表达载体的制备

为了确认在实施例1中选择的10种信号肽是否可以用作通用分泌因子，选择mCherry(pmCherry载体，Clontech,632522)蛋白作为靶蛋白。

编码mCherry蛋白的基因的多核苷酸序列示出在表2中。

[表2]

在编码mCherry蛋白的基因的基础上，使用从CHO HCP质量数据鉴定到的信号肽序列和含有KpnI/XhoI的引物进行PCR，并构建通过10种信号肽序列表达的mCherry。

当所述信号肽的长度长时，将引物分成两个，并进行两次PCR。将含有10种信号肽序列的mCherry PCR产物用KpnI和XhoI切割，然后克隆到pcDNA3.1(+)(Invitrogen，目录号V790-20)中以构建表达载体。

另外，为了用作阳性对照，以相同的方式制备了与作为已知分泌因子的SP7.2信号肽(韩国专利公开出版物10-2015-0125402A)融合的mCherry蛋白表达载体。所述SP7.2信号肽的序列示出在表3中。

[表3]

[表4]

2-2.瞬时表达

按照CHO-S细胞系Amaxa 4D-核转染剂方案，将由10种信号肽表达的每种mCherry表达载体转染(1mL)。然后，在第2和第6天，测量细胞内荧光和从培养基分泌的荧光蛋白的荧光值(图3)。

在细胞内荧光的情况下，使用FACS(Accuri)来测量以直方图表示的比阴性对照(空载体，pMaxGFP)更高的部分的平均值。

在分泌到培养基中的荧光蛋白的荧光值的情况下，在第2和第6天取样100μL，然后离心以便只获得上清液，并使用多波长读板器在587/610nm处测量荧光。

确认了具有在培养基中测量到的高荧光值的信号肽是Cat、CC、Nuc、Clus和Pig。此外，选择显示出比阳性对照SP7.2(SP7.2被用作阳性对照)更高的表达的四种分泌因子(Clus、Pig、Nuc和CC)和一种在细胞中具有高荧光值的信号肽(Proco)作为阴性对照。

实施例3.通过位点特异性整合进行的表达的比较

3-1.用于位点特异性整合的表达载体的构建

将包括在实施例2中选择的5种信号肽(Clus、Pig、Nuc、CC和Proco)和对照SP7.2的mCherry序列一致地插入到CHO基因组的特定位点中，以定量比较表达水平(图4和5)。

所述插入位点被设定在Hprt位点处，同源臂序列和sgRNA序列参考J.S Lee等，2015，“由CRISPR/Cas9和同源性指导的DNA修复途径介导的CHO细胞中的位点特异性整合”(Site-Specific integration in CHO Cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway)，Sci.Rep.,5来设计。

在5'同源臂的情况下，使用含有Bg1Ⅱ和NruI酶位点的引物以及作为模板的CHO-S基因组进行PCR。然后，将它克隆到用Bg1II/NruI消化的pcDNA3.1(+)载体中。

在3'同源臂的情况下，使用含有SalI位点的每个引物以及作为模板的CHO-S基因组进行PCR，然后与用5'同源臂插入的载体一起进行SalI单切，并将它克隆到NeoR基因的下游中(pcDNA3.1_hprt)。

为了确认只有那些已经历同源重组的片段被插入到基因组中，在5'同源臂的上游区域中构建了Cmy-GFP-BHG pA片段并插入到SpeI和Bg1Ⅱ中(pcDNA3.1_G_hprt)用于双重选择。

在GFP片段的情况下，首先使用NcoI/XbaI将它插入到pcDNA3.1(+)载体的MCS中，然后使用含有SpeI和Bg1II限制性位点的引物进行PCR。然后，使用Bg1II位点将SpeI插入到含有同源区的载体(pcDNA_hprt)中。

使用完成的pcDNA3.1_G_hprt载体，用KpnI和XhoI切下含有信号肽序列的mCherry基因序列，并将它插入到MCS区中。

结果，构建了含有表达盒的基于pcDNA3.1的表达载体，所述表达盒采取CMV-EGFP-pA-5'Hprt同源臂-CMV-信号肽候选物-mCherry-BGH pA-NeoR选择标记盒-3'Hprt同源臂的形式。

3-2.位点特异性整合

使用CRISPR-Cas9进行敲入，以便将6种类型的用于在Hprt位点中进行位点特异性整合的载体插入到CHO-S基因组中。将240ng sgRNA、1,250ng cas9蛋白和1μg供体载体与核转染溶液独立混合，以制备50μL混合物。

首先将1x10⁶个CHO-S细胞溶解在50μL核转染试剂中，然后与前面制备的混合物混合，然后对最终的100μL混合物进行电穿孔。

在进行电穿孔后，将所述混合物与0.5mL培养基混合，添加到2.5mL培养基，并在6孔板中在36.5℃和5％CO₂下培养。

2天后，在含有Zeneticin(0.5mg/L)的CD CHO培养基中进行选择，然后将细胞传代培养直至恢复90％的活力。

在恢复90％的活力后，将4mL细胞一式两份在6孔板中以3x10⁵个细胞/mL的浓度进行培养，并每2至3天测量Vi-Cell和培养基的荧光值(587nm/610nm)(图5)。

结果，证实了与对照SP7.2相比，CC、Clus和Pig分泌肽显示出更高的表达。

实施例4.抗PD-1抗体的表达和质量分析

4-1.用于生产抗PD-1抗体的表达载体的制备

在通过位点特异性整合比较了信号肽的表达能力后，表达了与包括显示出高表达的CC、Clus和Pig在内的4种类型的信号肽(CC、Pig、Clus和SP7.2)融合的抗PD-1抗体。使用派姆单抗

抗体序列作为靶蛋白。

合成了对应于轻链和重链的氨基酸序列的DNA序列，随后通过重叠PCR产生了与每个信号肽序列融合的序列。

在轻链的情况下，将氨基酸序列用BamHI和XhoI限制，并且在重链的情况下，将氨基酸序列用AscI和NotI限制，然后将抗体插入到pTz-D1G1载体中，所述载体是pcDNA3.1(+)的变体(包括韩国专利号10-1038126B1的启动子)。

pCB_SP7.2_Pem

'(N-端)-[BamHI限制性位点-信号肽(SEQ ID NO：33)-Pem轻链(SEQ ID NO：58)-XhoI限制性位点]-(C-端)'/'(N-端)-[AscI限制性位点-信号肽(SEQ ID NO：33)-Pem重链(SEQ ID NO：59)-NotI限制性位点]-(C-端)'

pCB_Clus_Pem

'(N-端)-[BamHI限制性位点-信号肽(SEQ ID NO：4)-Pem轻链(SEQ ID NO：58)-XhoI限制性位点]-(C-端)'/'(N-端)-[AscI限制性位点-信号肽(SEQ ID NO：4)-Pem重链(SEQ ID NO：59)-NotI限制性位点]-(C-端)'

pCB_CC_Pem

'(N-端)-[BamHI限制性位点-信号肽(SEQ ID NO：2)-Pem轻链(SEQ ID NO：58)-XhoI限制性位点]-(C-端)'/'(N-端)-[AscI限制性位点-信号肽(SEQ ID NO：2)-Pem重链(SEQ ID NO：59)-NotI限制性位点]-(C-端)'

pCB_Pig_Pem

'(N-端)-[BamHI限制性位点-信号肽(SEQ ID NO：5)-Pem轻链(SEQ ID NO：58)-XhoI限制性位点]-(C-端)'/'(N-端)-[AscI限制性位点-信号肽(SEQ ID NO：5)-Pem重链(SEQ ID NO：59)-NotI限制性位点]-(C-端)'

4-2.抗PD1抗体的表达

将制备的重组表达载体pCB-SP7.2-Pem、pCB-Clus-Pem、pCB-Pig-Pem和pCB-CC-Pem引入到ExpiCHO-S^TM细胞(Thermo Fisher Scientific)中，并在ExpiCHO表达培养基(Thermo Fisher Scientific；30mL)中培养12天(补料分批培养；第1天和第5天补料)，以表达融合多肽(即派姆单抗)。

4-3.抗PD1抗体的纯化和质量分析

通过蛋白A对通过重组载体的表达生产的融合多肽进行纯化。具体来说，将回收的培养液用0.22μm滤器过滤，然后将装填有蛋白A树脂的柱(Hitrap MSS,GE Healthcare,11-0034-93)安装在AKTA^TM Avant25(GE Healthcare Life Sciences)上，并使PBS缓冲液流过以平衡柱。

在将过滤的培养液进样到柱中后，使PBS缓冲液再次流过以清洗柱。在柱的清洗完成后，将洗脱缓冲液(柠檬酸盐缓冲液，pH 3.5)流过柱以洗脱靶蛋白。使用Amicon Ultra过滤装置(MWCO 30K,Merck)和离心机将洗脱液浓缩。在进行浓缩后，使用PBS进行缓冲液交换。

所述融合多肽的定量分析通过使用UV分光光度计(G113A,AgilentTechnologies)测量280nm和340nm处的吸光值，并使用下述计算公式来进行。每种材料的消光系数是使用氨基酸序列计算的理论值(1.404)。

(*消光系数(0.1％)：它是在假设蛋白质浓度为0.1％(1g/L)，并且一级序列上的所有半胱氨酸均被氧化以形成二硫键的情况下，在280nm处的理论吸光值。通过ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)计算)

使用Q-TOF MS，将所述纯化的靶蛋白用于确认在蛋白质的N-端处信号肽的错误切割的存在(图6)。在稀释至1mg/mL的浓度后，将所述蛋白质用PNGaseF处理，然后用6M胍和DTT处理，然后载样到Q-TOF MS上(RMM-MT-001：ACQUITY UPLC+Q-TOF SYNAPT G2(Waters))。

结果，确认了在预测的切割位点处观察到100％切割。

基于所述结果，作为本发明的CHO细胞衍生的蛋白分泌因子的信号肽通过提高重组蛋白的表达水平来提高生产率，并通过经质量分析确认在预测的切割位点处观察到100％切割，暗示了本发明的信号肽可能是强大的遗传工具，其可以解决作为现有蛋白分泌因子的问题的错误切割。

尽管已参考特定说明性实施方式描述了本发明，但是本发明所属领域的技术人员会理解，在不背离本发明的技术精神或本质特征的情况下，本发明可以以其他特定形式体现。因此，上述实施方式在所有方面均被认为是说明性而不是限制性的。此外，本发明的范围由权利要求书而不是具体实施方式来定义，并且应当理解，源自于本发明的含义和范围的所有修改或变化及其等同物均包含在权利要求书的范围之内。

<110> 株式会社LG化学（LG CHEM, LTD.）

<120> CHO细胞衍生的蛋白分泌因子和包含它的表达载体

<130> OPA20173

<150> KR 10-2019-0158447

<151> 2019-12-02

<160> 59

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 组织蛋白酶B（Cat）的信号肽

<400> 1

Met Trp Trp Ser Leu Ile Pro Leu Ser Cys Leu Leu Ala Leu Ala Ser

1 5 10 15

Ala

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> C-C基序趋化因子（CC）的信号肽

<400> 2

Met Gln Phe Ser Ala Arg Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Val Ala

1 5 10 15

Ala Cys Ser Ile Tyr Val Leu Ala

20

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 核连蛋白-2（Nuc）的信号肽

<400> 3

Met Arg Trp Lys Ile Ile Gln Leu Gln Tyr Cys Phe Leu Leu Val Pro

1 5 10 15

Cys Met Leu Thr Ala Leu Glu Ala

20

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 丛生蛋白（Clus）的信号肽

<400> 4

Met Lys Ile Leu Leu Leu Cys Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Asp Asn

1 5 10 15

Gly Met Val Leu Gly

20

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 色素上皮衍生因子（Pig）的信号肽

<400> 5

Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Trp Thr Gly Ala Leu Leu Gly His

1 5 10 15

Gly Ser Ser

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 前胶原C-内肽酶增强物1（Proco）的信号肽

<400> 6

Met Leu Pro Ala Val Leu Thr Ser Leu Leu Gly Pro Phe Leu Val Ala

1 5 10 15

Trp Val Leu Pro Leu Ala Arg Gly

20

<210> 7

<211> 31

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 巯基氧化酶（Sulf）的信号肽

<400> 7

Met Arg Arg Cys Gly Arg His Ser Gly Ser Pro Ser Gln Met Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Ala Val Pro Gly Ala Gly Ala

20 25 30

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 脂蛋白脂肪酶（Lip）的信号肽

<400> 8

Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Gly Val Trp Leu Gln

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ala

20

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 巢蛋白-1（Nid）的信号肽

<400> 9

Met Leu Asp Ala Ser Gly Trp Lys Pro Ala Ala Trp Thr Trp Val Leu

1 5 10 15

Leu Leu Gln Leu Leu Leu Ala Gly Pro Gly Asp Cys Leu Ser

20 25 30

<210> 10

<211> 22

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 蛋白质二硫键异构酶（Pro）的信号肽

<400> 10

Met Asp Asp Arg Leu Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser

1 5 10 15

Gly Pro Trp Gly Gln Gly

20

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 组织蛋白酶B（Cat）的信号肽的基因

<400> 11

atgtggtggt ccttgattcc gctctcttgc ctgctggcac tggcaagtgc c 51

<210> 12

<211> 72

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> C-C基序趋化因子（CC）的信号肽的基因

<400> 12

atgcagttct ccgcaagaac gcttctgtgc ctgctactca cagttgctgc ctgtagcatc 60

tatgtgctgg cc 72

<210> 13

<211> 72

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 核连蛋白-2（Nuc）的信号肽的基因

<400> 13

atgaggtgga agatcatcca gctacagtac tgttttcttt tggtcccgtg catgcttact 60

gctctggaag ct 72

<210> 14

<211> 63

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 丛生蛋白（Clus）的信号肽的基因

<400> 14

atgaagattc tcctgttgtg cgtggggctg ctgctgacct gggacaatgg catggtcctg 60

gga 63

<210> 15

<211> 57

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 色素上皮衍生因子（Pig）的信号肽的基因

<400> 15

atgcaggccc tggtgctact cctctggaca ggagccctgc ttgggcatgg cagcagc 57

<210> 16

<211> 72

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 前胶原C-内肽酶增强物1（Proco）的信号肽的基因

<400> 16

atgctgcctg ctgtcctaac ctccctcctg gggccattcc ttgtggcctg ggtactgcct 60

cttgcccgag gc 72

<210> 17

<211> 93

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 巯基氧化酶（Sulf）的信号肽的基因

<400> 17

atgaggaggt gcggccgcca ctcggggtcg ccgtcgcaga tgctactgct gctgctgccg 60

ccgctgctgc tcgcggtgcc cggcgctggc gcg 93

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 脂蛋白脂肪酶（Lip）的信号肽的基因

<400> 18

atggagagca aagccctgct cctggtggct ctgggagtgt ggctccagag tttgaccgcc 60

60

<210> 19

<211> 90

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 巢蛋白-1（Nid）的信号肽的基因

<400> 19

atgctggacg cgagcggctg gaagcccgcg gcgtggacat gggtgctgct gctgcagcta 60

ttgctggcgg ggcccggaga ctgcctgagc 90

<210> 20

<211> 66

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 蛋白质二硫键异构酶（Pro）的信号肽的基因

<400> 20

atggatgatc ggctcctgac agtgttgctg ctcctgctgg gtgtctcagg cccatgggga 60

caggga 66

<210> 21

<211> 339

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 组织蛋白酶B（Cat）

<400> 21

Met Trp Trp Ser Leu Ile Pro Leu Ser Cys Leu Leu Ala Leu Ala Ser

1 5 10 15

Ala His Asn Lys Pro Ser Phe His Pro Leu Ser Asp Asp Leu Ile Asn

20 25 30

Tyr Ile Asn Lys Arg Asn Thr Thr Trp Gln Ala Gly Arg Asn Phe His

35 40 45

Asn Val Asp Ile Ser Tyr Leu Lys Arg Leu Cys Gly Thr Ile Met Gly

50 55 60

Gly Pro Lys Leu Pro Glu Arg Val Ala Phe Ala Glu Asp Met Glu Leu

65 70 75 80

Pro Glu Asn Phe Asp Ala Arg Glu Gln Trp Ser Asn Cys Pro Thr Ile

85 90 95

Lys Gln Ile Arg Asp Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Gly

100 105 110

Ala Val Gly Ala Met Ser Asp Arg Leu Cys Ile His Thr Asn Gly His

115 120 125

Val Asn Val Glu Val Ser Ala Glu Asp Leu Leu Thr Cys Cys Gly Ser

130 135 140

Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asn Gly Gly Tyr Pro Ser Gly Ala Trp Asn

145 150 155 160

Phe Trp Ile Lys Lys Gly Leu Val Ser Gly Gly Leu Tyr Asn Ser His

165 170 175

Val Gly Cys Leu Pro Tyr Thr Ile Pro Pro Cys Glu His His Val Asn

180 185 190

Gly Ser Arg Pro Gln Cys Thr Gly Glu Gly Asp Thr Pro Lys Cys Thr

195 200 205

Lys Ser Cys Glu Ala Gly Tyr Ser Pro Ser Tyr Lys Glu Asp Lys His

210 215 220

Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ser Val Ser Asn Asn Glu Lys Glu Ile Met

225 230 235 240

Ala Glu Ile Tyr Lys Asn Gly Pro Val Glu Gly Ala Phe Thr Val Phe

245 250 255

Ser Asp Phe Leu Thr Tyr Lys Ser Gly Val Tyr Lys His Glu Ala Gly

260 265 270

Asp Ile Met Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu Gly Trp Gly Val Glu

275 280 285

Asn Ser Val Pro Tyr Trp Leu Val Ala Asn Ser Trp Asn Val Asp Trp

290 295 300

Gly Asp Asn Gly Leu Phe Lys Ile Leu Arg Gly Glu Asp His Cys Gly

305 310 315 320

Ile Glu Ser Glu Ile Val Ala Gly Ile Pro Arg Thr Asp Leu Tyr Trp

325 330 335

Gly Arg Phe

<210> 22

<211> 143

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> C-C基序趋化因子（CC）

<400> 22

Met Gln Phe Ser Ala Arg Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Val Ala

1 5 10 15

Ala Cys Ser Ile Tyr Val Leu Ala Gln Pro Asp Ala Val Asn Ser Pro

20 25 30

Leu Thr Cys Cys Tyr Ser Phe Thr Ala Lys Arg Ile Pro Glu Lys Arg

35 40 45

Leu Glu Ser Tyr Lys Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala

50 55 60

Val Ile Phe Ile Thr Lys Leu Lys Arg Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys

65 70 75 80

Gln Asp Trp Val Gln Thr Tyr Thr Lys Lys Leu Asp Gln Ser Gln Ala

85 90 95

Lys Ser Glu Ala Ala Thr Val Tyr Lys Thr Ala Pro Leu Asn Ala Asn

100 105 110

Leu Thr His Glu Ser Ala Val Asn Ala Ser Thr Thr Ala Phe Pro Thr

115 120 125

Thr Asp Leu Arg Thr Ser Val Arg Val Thr Ser Met Thr Val Asn

130 135 140

<210> 23

<211> 420

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 核连蛋白-2（Nuc）

<400> 23

Met Arg Trp Lys Ile Ile Gln Leu Gln Tyr Cys Phe Leu Leu Val Pro

1 5 10 15

Cys Met Leu Thr Ala Leu Glu Ala Val Pro Ile Asp Val Asp Lys Thr

20 25 30

Lys Val His Asn Thr Glu Pro Val Glu Ser Ala Arg Ile Asp Pro Pro

35 40 45

Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Asp Glu Tyr Leu Lys Gln Val Ile Asp Val

50 55 60

Leu Glu Thr Asp Gln His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Lys Ala Asp Ile

65 70 75 80

Glu Glu Ile Arg Ser Gly Arg Leu Ser Lys Glu Leu Asp Leu Val Ser

85 90 95

His His Val Arg Thr Lys Leu Asp Glu Leu Lys Arg Gln Glu Val Ala

100 105 110

Arg Leu Arg Met Leu Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ser Leu Gln Asp Thr

115 120 125

Gly Met Asn His His Leu Leu Leu Lys Gln Phe Glu His Leu Asn His

130 135 140

Gln Asn Pro Asp Thr Phe Glu Ser Ser Asp Leu Asp Met Leu Ile Lys

145 150 155 160

Ala Ala Thr Ala Asp Leu Glu Gln Tyr Asp Arg Thr Arg His Glu Glu

165 170 175

Phe Lys Lys Tyr Glu Met Met Lys Glu His Glu Arg Arg Glu Tyr Leu

180 185 190

Lys Thr Leu Asn Glu Glu Lys Arg Lys Glu Glu Glu Ser Lys Phe Glu

195 200 205

Glu Met Lys Arg Lys His Glu Asn His Pro Lys Val Asn His Pro Gly

210 215 220

Ser Lys Asp Gln Leu Lys Glu Val Trp Glu Glu Ala Asp Gly Leu Asp

225 230 235 240

Pro Asn Asp Phe Asp Pro Lys Thr Phe Phe Lys Leu His Asp Val Asn

245 250 255

Asn Asp Gly Phe Leu Asp Glu Gln Glu Leu Glu Ala Leu Phe Thr Arg

260 265 270

Glu Leu Glu Lys Val Tyr Asp Pro Arg Asn Ala Glu Asp Asp Met Ile

275 280 285

Glu Met Glu Glu Glu Arg Leu Arg Met Arg Glu His Val Met Asn Glu

290 295 300

Ile Asp Asn Asn Lys Asp Arg Leu Val Thr Leu Glu Glu Phe Leu Arg

305 310 315 320

Ala Thr Glu Lys Lys Glu Phe Leu Glu Pro Asp Ser Trp Glu Thr Leu

325 330 335

Gly Gln Gln Gln Leu Phe Thr Glu Glu Glu Leu Lys Glu Tyr Glu Ser

340 345 350

Ile Ile Ala Met Gln Glu Asn Glu Leu Lys Lys Arg Ala Asp Glu Leu

355 360 365

Gln Lys Gln Lys Glu Glu Leu Gln Arg Gln His Asp His Leu Glu Ala

370 375 380

Gln Lys Gln Glu Tyr Gln Gln Ala Val Gln Gln Leu Glu His Lys Lys

385 390 395 400

Phe Gln Gln Gly Ile Ala Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Leu Glu Phe

405 410 415

Lys Pro Arg Met

420

<210> 24

<211> 447

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 丛生蛋白（Clus）

<400> 24

Met Lys Ile Leu Leu Leu Cys Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Asp Asn

1 5 10 15

Gly Met Val Leu Gly Glu Gln Glu Val Ser Asp Asn Glu Leu Lys Glu

20 25 30

Met Ser Thr Gln Gly Ser Arg Tyr Ile Asn Lys Glu Ile Gln Asn Ala

35 40 45

Val Gln Gly Val Lys Gln Ile Lys Thr Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu

50 55 60

Glu Arg Lys Ser Leu Leu Asn Ser Leu Glu Glu Ala Lys Lys Lys Lys

65 70 75 80

Glu Asp Ala Leu Asp Asp Thr Arg Asp Thr Glu Met Lys Leu Lys Ala

85 90 95

Phe Pro Glu Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala Leu Trp Glu Glu Cys

100 105 110

Lys Pro Cys Leu Lys Gln Thr Cys Met Lys Phe Tyr Ala Arg Val Cys

115 120 125

Arg Ser Gly Ser Gly Leu Val Gly Arg Gln Leu Glu Glu Phe Leu Asn

130 135 140

Gln Ser Ser Pro Phe Tyr Phe Trp Met Asn Gly Asp Arg Ile Asp Ser

145 150 155 160

Leu Met Glu Ser Asp Arg Gln Gln Ser Gln Val Leu Asp Ala Met Gln

165 170 175

Asp Ser Phe Thr Arg Ala Ser Gly Ile Met Asp Met Leu Phe Gln Asp

180 185 190

Arg Phe Phe Thr His Glu Pro Gln Asp Thr His Tyr Phe Ser Pro Phe

195 200 205

Gly Phe Pro His Arg Arg Pro His Phe Leu Tyr Pro Lys Ser Arg Leu

210 215 220

Val Arg Ser Leu Ile Pro Leu Ser His Tyr Gly Pro Pro Ser Phe His

225 230 235 240

Asp Met Phe Gln Pro Phe Leu Glu Met Ile His Gln Ala Gln Gln Ala

245 250 255

Met Asp Val Gln Phe His Arg Pro Ala Phe Gln Phe Pro Asp Lys Gly

260 265 270

Leu Arg Glu Gly Glu Asp Asp Arg Ala Val Cys Lys Glu Ile Arg His

275 280 285

Asn Ser Thr Gly Cys Leu Lys Met Lys Gly Gln Cys Glu Lys Cys Gln

290 295 300

Glu Ile Leu Ser Val Asp Cys Ser Ala Asn Asn Pro Ala Gln Ala His

305 310 315 320

Leu Arg Gln Glu Leu Asn Asp Ser Leu Gln Met Ala Glu Arg Leu Thr

325 330 335

Gln Gln Tyr Asn Glu Leu Leu His Ser Leu Gln Thr Lys Met Leu Asn

340 345 350

Thr Ser Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp Val Ser

355 360 365

Gln Leu Ala Asn Leu Thr Gln Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Leu Arg Val

370 375 380

Ser Thr Val Thr Thr His Ser Asn Asn Ser Glu Glu Pro Ser Arg Val

385 390 395 400

Thr Glu Val Val Val Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro Ile Thr Val Val

405 410 415

Leu Pro Glu Glu Val Ser Lys Asp Asn Pro Lys Phe Met Asp Thr Val

420 425 430

Ala Glu Lys Ala Leu Gln Glu Tyr Arg Lys Lys Ser Arg Ala Glu

435 440 445

<210> 25

<211> 378

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 色素上皮衍生因子（Pig）

<400> 25

Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Trp Thr Gly Ala Leu Leu Gly His

1 5 10 15

Gly Ser Ser Gln Asn Val Ala Ser Ser Ser Glu Glu Gly Ser Pro Ala

20 25 30

Pro Asp Ser Thr Gly Glu Pro Val Glu Glu Glu Glu Asp Pro Phe Phe

35 40 45

Lys Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser Asn Phe Gly Tyr

50 55 60

Asp Leu Tyr Arg Leu Arg Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ala Asn Val Leu

65 70 75 80

Leu Ser Pro Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly

85 90 95

Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp

100 105 110

Leu Ile Ser Asn Ser Asp Ile His Ser Thr Tyr Lys Glu Leu Leu Ala

115 120 125

Ser Val Thr Ala Pro Glu Lys Ser Leu Lys Ser Ala Ser Arg Ile Val

130 135 140

Phe Glu Arg Lys Leu Arg Val Arg Ser Ser Phe Val Ala Pro Leu Glu

145 150 155 160

Lys Ser Tyr Gly Thr Arg Pro Arg Ile Leu Thr Gly Asn Pro Arg Ile

165 170 175

Asp Leu Gln Glu Ile Asn Asn Trp Ile Gln Ala Gln Met Lys Gly Lys

180 185 190

Leu Ala Arg Ser Thr Arg Glu Met Pro Ser Ala Ile Ser Ile Leu Leu

195 200 205

Leu Gly Val Ala Tyr Phe Lys Gly Gln Trp Val Thr Lys Phe Asp Ser

210 215 220

Arg Lys Thr Ser Leu Gln Asp Phe His Leu Asp Glu Asp Arg Thr Val

225 230 235 240

Lys Val Pro Met Met Ser Glu Pro Lys Ala Ile Leu Arg Tyr Gly Leu

245 250 255

Asp Ser Asp Leu Asn Cys Lys Val Trp Glu His Gly Gly Trp Glu Gly

260 265 270

Ser Glu Arg Gly Arg Val Ser Ser Ile Arg Lys Ser Ile Trp Gly Tyr

275 280 285

Ser Lys Ile His Glu Leu Gln Ser Leu Phe Glu Ser Pro Asp Phe Ser

290 295 300

Lys Ile Thr Gly Lys Pro Val Lys Leu Thr Gln Val Glu His Arg Ala

305 310 315 320

Ala Phe Glu Trp Asn Glu Glu Gly Val Glu Thr Ser Pro Asn Pro Gly

325 330 335

Leu Gln Pro Val Arg Leu Thr Phe Pro Leu Asp Tyr His Leu Asn Gln

340 345 350

Pro Phe Ile Phe Val Leu Arg Asp Thr Asp Thr Gly Ala Leu Leu Phe

355 360 365

Ile Gly Lys Ile Leu Asp Pro Arg Gly Thr

370 375

<210> 26

<211> 468

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 前胶原C-内肽酶增强物1（Proco）

<400> 26

Met Leu Pro Ala Val Leu Thr Ser Leu Leu Gly Pro Phe Leu Val Ala

1 5 10 15

Trp Val Leu Pro Leu Ala Arg Gly Gln Thr Pro Asn Tyr Thr Arg Pro

20 25 30

Val Phe Leu Cys Gly Gly Asp Val Thr Gly Glu Ser Gly Tyr Val Ala

35 40 45

Ser Glu Gly Phe Pro Asn Leu Tyr Pro Pro Asn Lys Lys Cys Ile Trp

50 55 60

Thr Ile Thr Val Pro Glu Gly Gln Thr Val Ser Leu Ser Phe Arg Val

65 70 75 80

Phe Asp Met Glu Leu His Pro Ser Cys Arg Tyr Asp Ala Leu Glu Val

85 90 95

Phe Ala Gly Ser Gly Thr Ser Gly Gln Arg Leu Gly Arg Phe Cys Gly

100 105 110

Thr Phe Arg Pro Ala Pro Val Val Ala Pro Gly Asn Gln Val Thr Leu

115 120 125

Arg Met Thr Thr Asp Glu Gly Thr Gly Gly Arg Gly Phe Leu Leu Trp

130 135 140

Tyr Ser Gly Arg Ala Thr Ser Gly Thr Glu His Gln Phe Cys Gly Gly

145 150 155 160

Arg Met Glu Lys Ala Gln Gly Thr Leu Thr Thr Pro Asn Trp Pro Glu

165 170 175

Ser Asp Tyr Pro Pro Gly Ile Ser Cys Ser Trp His Ile Ile Ala Pro

180 185 190

Ser Asp Gln Val Ile Met Leu Thr Phe Gly Lys Phe Asp Val Glu Pro

195 200 205

Asp Thr Tyr Cys Arg Tyr Asp Ser Val Ser Val Phe Asn Gly Ala Val

210 215 220

Ser Asp Asp Ser Lys Arg Leu Gly Lys Phe Cys Gly Asp Lys Ala Pro

225 230 235 240

Ser Pro Ile Ser Ser Glu Gly Asn Glu Leu Leu Val Gln Phe Val Ser

245 250 255

Asp Leu Ser Val Thr Ala Asp Gly Phe Ser Ala Ser Tyr Lys Thr Leu

260 265 270

Pro Arg Asp Ala Val Glu Lys Glu Leu Ala Pro Ser Pro Gly Glu Asp

275 280 285

Val Gln Leu Gly Pro Gln Ser Arg Ser Asp Pro Lys Thr Gly Thr Gly

290 295 300

Pro Lys Val Lys Pro Pro Ser Lys Pro Lys Phe Gln Pro Ala Glu Lys

305 310 315 320

Pro Glu Val Ser Pro Asp Thr Gln Glu Thr Pro Val Ala Pro Asp Pro

325 330 335

Pro Ser Ala Thr Cys Pro Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Gly Thr Leu Gln

340 345 350

Ser Asn Phe Cys Ala Ser Ser Leu Val Val Thr Gly Thr Val Lys Thr

355 360 365

Met Val Arg Gly Pro Gly Glu Gly Leu Thr Val Thr Ile Ser Leu Leu

370 375 380

Gly Val Tyr Lys Ser Gly Gly Leu Asp Leu Pro Ser Pro Pro Thr Asp

385 390 395 400

Thr Ser Leu Lys Leu Tyr Val Pro Cys Arg Gln Met Pro Pro Met Lys

405 410 415

Lys Gly Ala Ser Tyr Leu Leu Met Gly Gln Val Glu Glu Asn Arg Gly

420 425 430

Pro Ile Leu Pro Pro Glu Ser Phe Leu Val Pro Tyr Lys Pro Asn Gln

435 440 445

Asp Gln Ile Leu Asn Asn Leu Arg Lys Arg Lys Cys Pro Ser Gln Pro

450 455 460

Arg Pro Ala Ala

465

<210> 27

<211> 571

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 巯基氧化酶（Sulf）

<400> 27

Met Arg Arg Cys Gly Arg His Ser Gly Ser Pro Ser Gln Met Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Ala Val Pro Gly Ala Gly Ala Val

20 25 30

Gln Val Ser Val Leu Tyr Ser Ser Ser Asp Pro Val Thr Val Leu Asn

35 40 45

Ala Asn Thr Val Arg Ser Thr Val Leu Arg Ser Asn Gly Ala Trp Ala

50 55 60

Val Glu Phe Phe Ala Ser Trp Cys Gly His Cys Ile Ala Phe Ala Pro

65 70 75 80

Thr Trp Lys Glu Leu Ala Tyr Asp Val Arg Glu Trp Arg Pro Val Leu

85 90 95

Asn Leu Ala Val Leu Asp Cys Ala Glu Glu Thr Asn Thr Ala Val Cys

100 105 110

Arg Asp Phe Asn Ile Ser Gly Phe Pro Thr Val Arg Phe Phe Lys Ala

115 120 125

Phe Ser Lys Asn Gly Ser Gly Ile Thr Leu Pro Val Ala Asp Ala Ser

130 135 140

Val Glu Thr Leu Arg Arg Lys Leu Ile Asp Ala Leu Glu Ser His Ser

145 150 155 160

Asp Met Trp Ser Ser Ser Arg Pro Lys Leu Lys Pro Ala Lys Leu Val

165 170 175

Glu Ile Asn Glu Phe Phe Ala Glu Thr Asn Glu Asp Tyr Leu Val Leu

180 185 190

Ile Phe Glu Asp Lys Asp Ser Tyr Val Gly Arg Glu Val Thr Leu Asp

195 200 205

Leu Phe Gln His His Ile Pro Val His Arg Val Leu Asn Thr Glu Arg

210 215 220

Asn Ala Val Ser Lys Phe Gly Val Val Glu Phe Pro Ser Cys Tyr Leu

225 230 235 240

Leu Phe Arg Asn Gly Ser Phe Ser Arg Val Pro Val Val Met Glu Ser

245 250 255

Arg Leu Phe Tyr Thr Ser Tyr Leu Lys Gly Met Ser Gly Pro Ile Leu

260 265 270

Val Asp Pro Pro Thr Thr Thr Ile Ser Thr Asp Ala Pro Val Thr Thr

275 280 285

Asp Val Val Pro Thr Val Trp Lys Val Ala Asn His Ala Arg Ile Tyr

290 295 300

Met Ala Asp Leu Glu Ser Ser Leu His Tyr Ile Phe Leu Val Glu Val

305 310 315 320

Gly Lys Phe Ser Val Leu Glu Gly Gln Arg Leu Leu Ala Leu Lys Lys

325 330 335

Leu Val Ala Val Leu Ala Lys Tyr Phe Pro Gly Arg Pro Leu Ala Gln

340 345 350

Asn Phe Leu His Ser Ile His Asp Trp Leu Gln Arg Gln Gln Arg Lys

355 360 365

Lys Ile Pro Tyr Lys Phe Phe Arg Ala Ala Leu Asp Asn Arg Lys Glu

370 375 380

Gly Ile Val Leu Thr Glu Lys Val Asn Trp Val Gly Cys Gln Gly Ser

385 390 395 400

Lys Pro His Phe Arg Gly Phe Pro Cys Ser Leu Trp Ile Leu Phe His

405 410 415

Phe Leu Thr Val Gln Ala Ser Arg Tyr Ser Glu Asn His Pro Gln Glu

420 425 430

Pro Ala Asp Gly Gln Glu Val Leu Gln Ala Met Arg Ser Tyr Val Gln

435 440 445

Trp Phe Phe Gly Cys Arg Asp Cys Ala Glu His Phe Glu Asn Met Ala

450 455 460

Ala Ser Thr Met His Arg Val Arg Ser Pro Thr Ser Ala Val Leu Trp

465 470 475 480

Leu Trp Thr Ser His Asn Lys Val Asn Ala Arg Leu Ser Gly Ala Pro

485 490 495

Ser Glu Asp Pro Tyr Phe Pro Lys Val Gln Trp Pro Leu Arg Glu Leu

500 505 510

Cys Phe Asp Cys His Asn Glu Ile Asn Gly Arg Glu Pro Val Trp Asp

515 520 525

Leu Glu Ala Thr Tyr Arg Phe Leu Lys Ala His Phe Ser Ser Glu Asn

530 535 540

Ile Ile Leu Asp Thr Pro Val Ala Gly Leu Ala Thr Gln Arg Asn Pro

545 550 555 560

Gln Ile Leu Gly Ala Thr Pro Glu Pro His Met

565 570

<210> 28

<211> 473

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 脂蛋白脂肪酶（Lip）

<400> 28

Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Gly Val Trp Leu Gln

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ala Ser Gln Gly Xaa Ala Ala Ala Asp Gly Gly Arg Asp

20 25 30

Phe Thr Asp Ile Glu Ser Lys Phe Ala Leu Arg Thr Pro Asp Asp Thr

35 40 45

Ala Glu Asp Asn Cys His Leu Ile Pro Gly Ile Ala Glu Ser Val Ser

50 55 60

Asn Cys His Phe Asn His Ser Ser Lys Thr Phe Val Val Ile His Gly

65 70 75 80

Trp Thr Val Thr Gly Met Tyr Glu Ser Trp Val Pro Lys Leu Val Ala

85 90 95

Ala Leu Tyr Lys Arg Glu Pro Asp Ser Asn Val Ile Val Val Asp Trp

100 105 110

Leu Tyr Arg Ala Gln Gln His Tyr Pro Val Ser Ala Gly Tyr Thr Lys

115 120 125

Leu Val Gly Asn Asp Val Ala Arg Phe Ile Asn Trp Met Glu Glu Glu

130 135 140

Phe Asn Tyr Pro Leu Asp Asn Val His Leu Leu Gly Tyr Ser Leu Gly

145 150 155 160

Ala His Ala Ala Gly Val Ala Gly Ser Leu Thr Asn Lys Lys Val Asn

165 170 175

Arg Ile Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Asn Phe Glu Tyr Ala Glu

180 185 190

Ala Pro Ser Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu

195 200 205

His Thr Phe Thr Arg Gly Ser Pro Gly Arg Ser Ile Gly Ile Gln Lys

210 215 220

Pro Val Gly His Val Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Thr Phe Gln Pro

225 230 235 240

Gly Cys Asn Ile Gly Glu Ala Ile Arg Val Ile Ala Glu Arg Gly Leu

245 250 255

Gly Asp Val Asp Gln Leu Val Lys Cys Ser His Glu Arg Ser Ile His

260 265 270

Leu Phe Ile Asp Ser Leu Leu Asn Glu Glu Asn Pro Ser Lys Ala Tyr

275 280 285

Arg Cys Asn Ser Lys Glu Ala Phe Glu Lys Gly Leu Cys Leu Ser Cys

290 295 300

Arg Lys Asn Arg Cys Asn Asn Val Gly Tyr Glu Ile Asn Lys Val Arg

305 310 315 320

Ala Lys Arg Ser Ser Lys Met Tyr Leu Lys Thr Arg Ser Gln Met Pro

325 330 335

Tyr Lys Val Phe His Tyr Gln Val Lys Ile His Phe Ser Gly Thr Glu

340 345 350

Ser Asp Lys Gln Leu Asn Gln Ala Phe Glu Ile Ser Leu Tyr Gly Thr

355 360 365

Val Ala Glu Ser Glu Asn Ile Pro Phe Thr Leu Pro Glu Val Ser Thr

370 375 380

Asn Lys Thr Tyr Ser Phe Leu Ile Tyr Thr Glu Val Asp Ile Gly Glu

385 390 395 400

Leu Leu Met Met Lys Leu Lys Trp Lys Ser Asp Ser Tyr Phe Ser Trp

405 410 415

Ser Asp Trp Trp Ser Ser Pro Gly Phe Val Ile Glu Lys Ile Arg Val

420 425 430

Lys Ala Gly Glu Thr Gln Lys Lys Val Ile Phe Cys Ala Arg Glu Lys

435 440 445

Val Ser His Leu Gln Lys Gly Lys Asp Ser Ala Val Phe Val Lys Cys

450 455 460

His Asp Lys Ser Leu Lys Lys Ser Gly

465 470

<210> 29

<211> 1212

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 巢蛋白-1（Nid）

<400> 29

Met Leu Asp Ala Ser Gly Trp Lys Pro Ala Ala Trp Thr Trp Val Leu

1 5 10 15

Leu Leu Gln Leu Leu Leu Ala Gly Pro Gly Asp Cys Leu Ser Arg Gln

20 25 30

Glu Leu Phe Pro Phe Gly Pro Gly Gln Gly Asp Leu Glu Leu Glu Ala

35 40 45

Gly Asp Asp Val Val Ser Pro Ala Leu Glu Leu Ile Gly Glu Leu Ser

50 55 60

Phe Tyr Asp Arg Ser Asp Ile Thr Ser Val Tyr Val Thr Thr Asn Gly

65 70 75 80

Ile Ile Ala Met Ser Glu Pro Pro Ala Arg Glu Ser His Pro Gly Thr

85 90 95

Phe Pro Pro Ser Phe Gly Ser Val Ala Pro Phe Leu Ala Asp Leu Asp

100 105 110

Thr Thr Asp Gly Leu Gly Asn Val Tyr Tyr Arg Glu Asp Leu Ser Pro

115 120 125

Ser Ile Met Gln Met Ala Ala Glu Tyr Val Gln Arg Gly Phe Pro Glu

130 135 140

Val Pro Phe Gln Pro Thr Ser Val Val Val Val Thr Trp Glu Ser Val

145 150 155 160

Ala Pro Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Ser Ser Ala Gln Glu Gly Lys Arg

165 170 175

Asn Thr Phe Gln Ala Val Leu Ala Ser Ser Asn Ser Ser Ser Tyr Ala

180 185 190

Ile Phe Leu Tyr Pro Glu Asp Gly Leu Gln Phe Phe Thr Thr Phe Ser

195 200 205

Lys Lys Asp Glu Asn Gln Val Pro Ala Met Val Gly Phe Ser Gln Gly

210 215 220

Leu Val Gly Phe Leu Trp Arg Ser Asp Gly Ala Tyr Asn Ile Phe Ala

225 230 235 240

Asn Asp Arg Glu Ser Ile Glu Asn Leu Ala Lys Ser Ser Asn Ala Gly

245 250 255

His Gln Gly Val Trp Val Phe Glu Ile Gly Ser Pro Ala Thr Ala Lys

260 265 270

Gly Val Val Ser Ala Asp Val Asn Leu Gly Leu Asp Asp Asp Gly Ser

275 280 285

Asp Tyr Glu Asp Glu Glu Tyr Asp Leu Ala Thr Ser His Leu Gly Leu

290 295 300

Glu Asp Met Ala Thr Gln Pro Phe Pro Ser Pro Ser Pro Arg Arg Gly

305 310 315 320

Asn Thr His Pro His Asp Val Pro Arg Val Leu Ser Pro Ser Tyr Glu

325 330 335

Ala Thr Glu Arg Pro His Gly Ile Pro Thr Glu Arg Thr Arg Thr Phe

340 345 350

Gln Leu Pro Ala Glu Arg Phe His Gln Gln His Pro Gln Val Ile Asp

355 360 365

Val Asp Glu Val Glu Glu Thr Gly Ile Val Phe Ser Tyr Asn Ile Gly

370 375 380

Ser Gln Gln Thr Cys Ala Asn Asn Arg His Gln Cys Ser Val His Ala

385 390 395 400

Glu Cys Arg Asp Tyr Ala Thr Gly Phe Cys Cys Arg Cys Val Ala Asn

405 410 415

Tyr Thr Gly Asn Gly Arg Gln Cys Val Ala Glu Gly Ser Pro Gln Arg

420 425 430

Val Asn Gly Lys Val Lys Gly Arg Ile Phe Val Gly Asn Ser Gln Val

435 440 445

Pro Val Val Phe Glu Asn Thr Asp Leu His Ser Tyr Val Val Met Asn

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His Gly Arg Ser Tyr Thr Ala Ile Ser Thr Ile Pro Glu Thr Val Gly

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Tyr Ser Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ile Gly Gly Ile Ile Gly Trp Met

485 490 495

Phe Ala Val Glu Gln Asn Gly Phe Lys Asn Gly Phe Ser Ile Thr Gly

500 505 510

Gly Glu Phe Thr Arg Gln Ala Glu Val Thr Phe Leu Gly His Pro Gly

515 520 525

Lys Leu Val Leu Lys Gln His Phe Ser Gly Ile Asp Glu His Gly His

530 535 540

Leu Thr Ile Asn Thr Glu Leu Asp Gly Arg Val Pro Gln Ile Pro Tyr

545 550 555 560

Gly Ser Ser Val His Ile Glu Pro Tyr Thr Glu Leu Tyr His Tyr Ser

565 570 575

Ser Ser Val Ile Thr Ser Ser Ser Thr Arg Glu Tyr Thr Val Thr Glu

580 585 590

Pro Asp Pro Asp Gly Thr Ala Pro Ser His Thr His Val Tyr Gln Trp

595 600 605

Arg Gln Thr Ile Thr Phe Gln Glu Cys Val His Asp Asp Ser Arg Pro

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625 630 635 640

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645 650 655

Gly Pro Val Arg Glu Gly Ser Pro Asp Ala Leu Gln Asn Pro Cys Tyr

660 665 670

Ile Gly Thr His Gly Cys Asp Ser Asn Ala Ala Cys Arg Pro Gly Pro

675 680 685

Gly Thr Gln Phe Thr Cys Glu Cys Ser Ile Gly Phe Arg Gly Asp Gly

690 695 700

Gln Thr Cys Tyr Asp Ile Asp Glu Cys Ser Glu Gln Pro Ser Arg Cys

705 710 715 720

Gly Asn His Ala Ala Cys Asn Asn Ser Pro Gly Ala Tyr Leu Cys Glu

725 730 735

Cys Val Glu Gly Tyr His Phe Ser Asp Gly Gly Ile Cys Val Ala Asp

740 745 750

Val Asp Gln Arg Pro Ile Asn Tyr Cys Glu Thr Gly Leu His Asn Cys

755 760 765

Asp Ile Pro Gln Arg Ala Gln Cys Ile Tyr Met Gly Gly Ser Ser Tyr

770 775 780

Thr Cys Ser Cys Leu Pro Gly Phe Ser Gly Asp Gly Arg Ala Cys Gln

785 790 795 800

Asp Val Asp Glu Cys Gln Leu Ser Arg Cys His Pro Asp Ala Phe Cys

805 810 815

Tyr Asn Thr Pro Gly Ser Phe Thr Cys Gln Cys Lys Pro Gly Tyr Gln

820 825 830

Gly Asp Gly Phe Gln Cys Val Pro Gly Glu Val Gly Lys Thr Arg Cys

835 840 845

Gln Leu Glu Arg Glu His Ile Leu Gly Ala Ser Gly Val Ala Asp Ala

850 855 860

Gln Gln Pro Arg Leu Leu Gly Met Tyr Val Pro Gln Cys Asp Glu Tyr

865 870 875 880

Gly His Tyr Glu Pro Thr Gln Cys His His Gly Thr Gly Tyr Cys Trp

885 890 895

Cys Val Asp Arg Asp Gly Arg Glu Leu Glu Gly Thr Arg Thr Gln Pro

900 905 910

Gly Met Arg Pro Pro Cys Leu Ser Thr Val Ala Pro Pro Ile His Gln

915 920 925

Arg Pro Val Val Pro Thr Ala Val Ile Pro Leu Pro Pro Gly Thr His

930 935 940

Leu Leu Phe Ala Gln Thr Gly Lys Ile Glu Arg Leu Pro Leu Glu Gly

945 950 955 960

Asn Thr Met Lys Lys Thr Glu Ala Lys Ala Phe Phe His Ile Pro Ala

965 970 975

Lys Val Ile Ile Gly Leu Ala Phe Asp Cys Val Asp Lys Val Val Tyr

980 985 990

Trp Thr Asp Ile Ser Glu Pro Ser Ile Gly Arg Ala Ser Leu His Gly

995 1000 1005

Gly Glu Pro Thr Thr Ile Ile Arg Gln Asp Leu Gly Ser Pro Glu Gly

1010 1015 1020

Ile Ala Leu Asp His Leu Gly Arg Asn Ile Phe Trp Thr Asp Ser Gln

1025 1030 1035 1040

Leu Asp Arg Ile Glu Val Ala Arg Met Asp Gly Thr Gln Arg Arg Val

1045 1050 1055

Leu Phe Asp Thr Gly Leu Val Asn Pro Arg Gly Ile Val Thr Asp Ser

1060 1065 1070

Val Gly Gly Asn Leu Tyr Trp Thr Asp Trp Asn Arg Glu Asn Pro Lys

1075 1080 1085

Ile Glu Thr Ser Tyr Met Asp Gly Thr Asn Arg Arg Ile Leu Ala Gln

1090 1095 1100

Asp Asn Leu Gly Leu Pro Asn Gly Leu Thr Phe Asp Ala Phe Ser Ser

1105 1110 1115 1120

Gln Leu Cys Trp Val Asp Ala Gly Thr His Arg Ala Glu Cys Leu Asn

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Pro Ala Gln Pro Ser Ser Arg Lys Val Leu Glu Gly Leu Gln Tyr Pro

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Phe Ala Val Thr Ser Tyr Gly Lys Asn Leu Tyr Tyr Thr Asp Trp Lys

1155 1160 1165

Thr Asn Ser Val Ile Ala Met Asp Leu Ala Ile Ser Lys Glu Met Asp

1170 1175 1180

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1185 1190 1195 1200

Cys Pro Asn Ala Leu Lys Ala Thr Thr Thr Ala Gln

1205 1210

<210> 30

<211> 527

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 蛋白质二硫键异构酶（Pro）

<400> 30

Met Asp Asp Arg Leu Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser

1 5 10 15

Gly Pro Trp Gly Gln Gly Gln Glu Pro Glu Gly Pro Ser Glu Val Leu

20 25 30

Pro Glu Glu Ser Ser Gly Glu Glu Val Pro Lys Glu Asp Gly Ile Leu

35 40 45

Val Leu Ser His His Thr Leu Ser Leu Ala Leu Gln Glu His Pro Ala

50 55 60

Leu Met Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu

65 70 75 80

Ala Pro Glu Tyr Ser Lys Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ala Glu Ser Ala

85 90 95

Ser Val Thr Leu Ala Lys Val Asp Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Thr

100 105 110

Lys Glu Phe Gly Val Val Gly Tyr Pro Thr Leu Lys Phe Phe Gln Asn

115 120 125

Gly Asn Arg Thr Asn Pro Glu Glu Tyr Thr Gly Pro Gln Lys Ala Glu

130 135 140

Gly Ile Ala Glu Trp Leu Arg Arg Arg Val Gly Pro Ser Ala Lys Arg

145 150 155 160

Leu Glu Asp Glu Glu Asp Val Gln Ala Leu Thr Asp Lys Trp Glu Val

165 170 175

Val Val Ile Gly Phe Phe Gln Asp Leu Gln Gly Glu Asp Val Ala Thr

180 185 190

Phe Leu Ala Leu Ala Arg Asp Ala Leu Asp Ile Thr Phe Gly Phe Thr

195 200 205

Asp Gln Pro Gln Leu Phe Gln Lys Phe Gly Leu Thr Lys Asp Thr Val

210 215 220

Ile Leu Phe Lys Lys Phe Asp Glu Gly Arg Ala Asp Phe Pro Val Asp

225 230 235 240

Lys Asp Thr Gly Leu Asp Leu Gly Asp Leu Ser Arg Phe Leu Val Thr

245 250 255

His Ser Met His Leu Val Thr Glu Phe Asn Ser Gln Thr Ser Pro Lys

260 265 270

Ile Phe Ala Ala Lys Ile Leu Asn His Leu Leu Leu Phe Val Asn Lys

275 280 285

Thr Leu Ala Gln His Arg Glu Leu Leu Thr Asp Phe Arg Glu Ala Ala

290 295 300

Pro Pro Phe Arg Gly Gln Val Leu Phe Val Met Val Asp Val Ala Ala

305 310 315 320

Asp Asn Asp His Val Leu Asn Tyr Phe Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala

325 330 335

Pro Thr Leu Arg Leu Ile Asn Val Glu Thr Thr Lys Lys Tyr Ala Pro

340 345 350

Thr Gly Leu Val Pro Ile Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Phe Cys Gln

355 360 365

Ala Val Leu His Gly Gln Val Lys Pro Tyr Leu Leu Ser Gln Glu Ile

370 375 380

Pro Pro Asp Trp Asp Glu Arg Pro Val Lys Thr Leu Val Gly Lys Asn

385 390 395 400

Phe Glu Gln Val Ala Phe Asp Glu Thr Lys Asn Val Phe Val Lys Phe

405 410 415

Tyr Ala Pro Trp Cys Ser His Cys Lys Glu Met Ala Pro Ala Trp Glu

420 425 430

Ala Leu Ala Glu Lys Tyr Arg Asp Arg Glu Asp Ile Val Ile Ala Glu

435 440 445

Leu Asp Ala Thr Ala Asn Glu Leu Glu Ala Phe Ser Val His Gly Tyr

450 455 460

Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro Ala Gly Pro Asp Arg Lys Val Ile Glu

465 470 475 480

Tyr Lys Ser Thr Arg Asp Leu Glu Thr Phe Ser Lys Phe Leu Asp Ser

485 490 495

Gly Gly Asn Leu Pro Glu Glu Glu Pro Lys Glu Pro Ala Ile Ser Thr

500 505 510

Pro Glu Ile Gln Asp Asn Ser Thr Val Gly Pro Lys Glu Glu Leu

515 520 525

<210> 31

<211> 236

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> mCherry

<400> 31

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

20 25 30

Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe

85 90 95

Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

100 105 110

Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys

115 120 125

Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

130 135 140

Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly

145 150 155 160

Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly

165 170 175

His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val

180 185 190

Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

195 200 205

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly

210 215 220

Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 32

<211> 711

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> mCherry的基因

<400> 32

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711

<210> 33

<211> 22

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> SP7.2

<400> 33

Met His Arg Pro Glu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Gly Gly Pro Thr Trp Ala

20

<210> 34

<211> 66

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> SP7.2的基因

<400> 34

atgcaccggc cagaggccat gctgctgctg ctcacgcttg ccctcctggg gggccccacc 60

tgggca 66

<210> 35

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cat_SP_F

<400> 35

agggggtacc gccaccatgt ggtggtcctt gattccgctc tcttgcctgc tggcactggc 60

aagtgccgtg agcaagggcg aggaggat 88

<210> 36

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CC_SP_F1

<400> 36

acagttgctg cctgtagcat ctatgtgctg gccgtgagca agggcgagga ggat 54

<210> 37

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CC_SP_F2

<400> 37

agggggtacc gccaccatgc agttctccgc aagaacgctt ctgtgcctgc tactcacagt 60

tgctgcctgt agcatcta 78

<210> 38

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nuc_SP_F1

<400> 38

ggtcccgtgc atgcttactg ctctggaagc tgtgagcaag ggcgaggagg at 52

<210> 39

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nuc_SP_F2

<400> 39

agggggtacc gccaccatga ggtggaagat catccagcta cagtactgtt ttcttttggt 60

cccgtgcatg cttactgctc t 81

<210> 40

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Clus_SP_F1

<400> 40

gggctgctgc tgacctggga caatggcatg gtcctgggag tgagcaaggg cgaggaggat 60

60

<210> 41

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Clus_SP_F2

<400> 41

agggggtacc gccaccatga agattctcct gttgtgcgtg gggctgctgc tgacctggga 60

caatg 65

<210> 42

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pig_SP_F

<400> 42

ggtaccgcca ccatgcaggc cctggtgcta ctcctctgga caggagccct gcttgggcat 60

ggcagcagcg tgagcaaggg cgaggaggat 90

<210> 43

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Proco_SP_F1

<400> 43

ccttgtggcc tgggtactgc ctcttgcccg aggcgtgagc aagggcgagg aggat 55

<210> 44

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Proco_SP_F2

<400> 44

agggggtacc gccaccatgc tgcctgctgt cctaacctcc ctcctggggc cattccttgt 60

ggcctgggta ctgcct 76

<210> 45

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sulf_SP_F1

<400> 45

atgctactgc tgctgctgcc gccgctgctg ctcgcggtgc ccggcgctgg cgcggtgagc 60

aagggcgagg aggat 75

<210> 46

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sulf_SP_F2

<400> 46

agggggtacc gccaccatga ggaggtgcgg ccgccactcg gggtcgccgt cgcagatgct 60

actgctgctg ctgccgccgc t 81

<210> 47

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lip_SP_F1

<400> 47

ggtggctctg ggagtgtggc tccagagttt gaccgccgtg agcaagggcg aggaggat 58

<210> 48

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lip_SP_F2

<400> 48

agggggtacc gccaccatgg agagcaaagc cctgctcctg gtggctctgg gagtgtggct 60

cc 62

<210> 49

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nid_SP_F1

<400> 49

gggtgctgct gctgcagcta ttgctggcgg ggcccggaga ctgcctgagc cgtgagcaag 60

ggcgaggagg at 72

<210> 50

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nid_SP_F2

<400> 50

agggggtacc gccaccatgc tggacgcgag cggctggaag cccgcggcgt ggacatgggt 60

gctgctgctg cagctattgc tgg 83

<210> 51

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pro_SP_F1

<400> 51

tgttgctgct cctgctgggt gtctcaggcc catggggaca gggagtgagc aagggcgagg 60

aggat 65

<210> 52

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pro_SP_F2

<400> 52

agggggtacc gccaccatgg atgatcggct cctgacagtg ttgctgctcc tgctgggtgt 60

ctcag 65

<210> 53

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mCherry XhoR

<400> 53

agggctcgag tttacttgta cagctcgtcc atgccg 36

<210> 54

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bgl_Hprt 5'F

<400> 54

agggagatct caccagtttt cattttctgt gtgaga 36

<210> 55

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hprt 5'_NruR

<400> 55

agggtcgcga attaggaata caaaataaat ctaggtcata gc 42

<210> 56

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sal_Hprt 3'F

<400> 56

aggggtcgac cactatgtcg aggatttgga aaagg 35

<210> 57

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hprt 3'_SalR

<400> 57

aggggtcgac gaggatggga gtgagagtga actg 34

<210> 58

<211> 218

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 派姆单抗的轻链

<400> 58

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 59

<211> 447

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 派姆单抗的重链

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

Claims (19)

1.一种蛋白分泌因子，其由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的蛋白分泌因子，其中所述蛋白是内源蛋白或外源蛋白。

3.一种表达盒，其中编码由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因被可操作连接。

4.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述靶蛋白选自抗体、抗体片段(Fab或ScFv)、融合蛋白、蛋白质支架、人生长激素、血清蛋白、免疫球蛋白、细胞因子、α-、β-或γ-干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、磷脂酶活化蛋白(PLAP)、胰岛素、肿瘤坏死因子(TNF)、生长因子、激素、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、脑啡肽、生长调节素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、生长分化因子、细胞黏附蛋白、催乳素、绒毛膜促性腺激素、组织纤溶酶原激活物、生长激素释放肽(GHPR)、胸腺体液因子(THF)、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、糜蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶、胆红素氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖脑苷脂酶和葡萄糖醛酸酶。

5.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述编码由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列由SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的核酸序列组成。

6.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述表达盒还包含编码由SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子中的任一者的核酸序列。

7.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述表达盒表达其中未添加额外氨基酸、当在细胞中表达时已从其中移除编码所述分泌因子的核酸序列的原样的靶蛋白。

8.一种用于分泌靶蛋白的表达载体，所述表达载体包含表达盒，其中编码由SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因被可操作连接。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其中所述靶蛋白选自抗体、抗体片段(Fab或ScFv)、融合蛋白、蛋白质支架、人生长激素、血清蛋白、免疫球蛋白、细胞因子、α-、β-或γ-干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、磷脂酶活化蛋白(PLAP)、胰岛素、肿瘤坏死因子(TNF)、生长因子、激素、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、脑啡肽、生长调节素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、生长分化因子、细胞黏附蛋白、催乳素、绒毛膜促性腺激素、组织纤溶酶原激活物、生长激素释放肽(GHPR)、胸腺体液因子(THF)、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、糜蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶、胆红素氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖脑苷脂酶和葡萄糖醛酸酶。

10.根据权利要求8所述的表达载体，其中所述编码由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列由SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的核酸序列组成。

11.根据权利要求8所述的表达载体，其中所述表达载体还包含编码由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子中的任一者的核酸序列。

12.根据权利要求8所述的表达载体，其中所述表达载体表达其中未添加额外氨基酸、当在细胞中表达时已从其中移除编码所述分泌因子的核酸序列的原样的靶蛋白。

13.一种转化细胞，其中根据权利要求8至12中的任一项所述的表达载体被引入到宿主细胞中。

14.根据权利要求13所述的转化细胞，其中所述宿主细胞是中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。

15.一种生产靶蛋白的方法，所述方法包括：

i)培养包含用于分泌靶蛋白的表达载体的转化细胞，所述表达载体包括表达盒，其中编码由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子的核酸序列和编码靶蛋白的基因被可操作连接；和

ii)从培养的细胞的培养基或培养上清液回收所述靶蛋白。

16.根据权利要求15所述的方法，其还包括纯化回收的靶蛋白。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述宿主细胞是中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的蛋白分泌因子在所述靶蛋白的N-端切割位点处被切割。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述靶蛋白是其中未添加额外氨基酸、已从其中移除编码所述分泌因子的核酸序列的靶蛋白本身。

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