CN106255700A - 具有高分泌效率的蛋白质分泌因子和包含其的表达载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型蛋白质分泌因子、包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列的载体和载体被引入的转化细胞。本发明还涉及使用包含载体的转化细胞制备靶蛋白的方法。

Description

具有高分泌效率的蛋白质分泌因子和包含其的表达载体
技术领域
本发明涉及新型蛋白质分泌因子、包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列的载体和载体被引入的转化细胞。此外，本发明涉及使用包含载体的转化细胞制备靶蛋白的方法。
背景技术
使用包括原核细胞和真核细胞的多种遗传修饰生物体制备包含抗体的重组多肽或蛋白质。因为用于医疗、研究等的许多蛋白质是糖蛋白，所以其不适合通过原核细胞例如细菌制备。由于该原因，已研发和广泛使用了使用真核细胞例如酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞的蛋白质表达系统。
用于制备异源蛋白的生物技术中的主要问题之一是制备和回收在遗传修饰生物体中不容易表达或分泌的多肽，例如蛋白质和蛋白质亚基。由于这些蛋白质或蛋白质亚基在细胞中以很低水平或正常水平表达，因此培养和纯化的规模趋于变得较大以获得期望量的蛋白质或蛋白质亚基。
用于解决该问题的典型方法是诱导细胞中表达的蛋白质或蛋白质亚基尽可能高水平地分泌到培养基中。甚至在纯化中，允许细胞中表达的蛋白质或蛋白质亚基分泌到细胞外培养基中也是非常有用的，因为这些蛋白质通过这样被轻易地纯化。此外，分泌到细胞外培养基中的重组蛋白或蛋白质亚基是有利的，可以防止细胞内出现的蛋白质分解，可以获得具有精确折叠的蛋白质产物。
为了将真核细胞表达的蛋白质成功分泌到细胞外，需要穿过细胞内内质网的蛋白质易位。在易位期间，蛋白质活化需要的几个修饰步骤同时发生，因此可以认为分泌到细胞外的蛋白质是立即被糖化或修饰的成熟细胞。
由细胞分泌的穿过细胞膜的蛋白质通常以前体形式在细胞中产生，其称为“前体蛋白”。该前体蛋白包含在氨基末端(NH3末端)的附加肽序列，该肽序列允许表达的蛋白质通过使蛋白质靶向进入细胞内内质网而进入分泌路径。该附加肽序列称为“蛋白质分泌因子”或“信号序列或信号肽”。
在重组蛋白的情况下，由于重组蛋白的天然信号序列在宿主细胞中不能充分运行，因此分泌未必如预期的进行。尽管存在可以用于特定重组蛋白分泌的许多已知信号序列，但对发现能够促进重组蛋白、具体的哺乳动物宿主细胞中免疫球蛋白的有效分泌的附加信号序列仍有需求。
发明内容
技术问题
同样地，本发明人已做出许多努力以研发能够更有效分泌和制备多种重组蛋白或靶蛋白的蛋白质分泌因子。因此，他们研发了能够从动物宿主细胞有效分泌靶蛋白至动物宿主细胞外的蛋白质分泌因子。此外，他们还发现了使用研发的蛋白质分泌因子可以有效分泌和表达的抗体，从而完成本发明。
技术方案
本发明的一个目的是提供新型蛋白质分泌因子。
本发明的另一个目的是提供包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列的表达组件，该核酸序列与编码靶蛋白的基因连接。
本发明的又一个目的是提供包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列的重组载体。
本发明的又一个目的是提供用于靶蛋白分泌型表达的载体，其包含表达组件。本发明的又一个目的是提供引入宿主细胞的转化细胞，载体被引入所述转化细胞中。
本发明的又一个目的是提供制备靶蛋白的方法，其包括培养引入包含表达组件的用于表达靶蛋白分泌的载体的转化细胞以表达靶蛋白和将靶蛋白分泌至细胞外；从细胞的培养物或培养物上清液中回收靶蛋白。
本发明的又一个目的是提供用于制备表达靶蛋白分泌的载体的蛋白质分泌因子的用途。
本发明的又一个目的是提供制备用于分泌靶蛋白的蛋白质分泌因子的用途。
有益效果
当使用根据本发明的蛋白质分泌因子时，靶蛋白的分泌显著增加，具体地，当相比于使用传统的蛋白质分泌因子时，其显示了对于抗体的显著优异的分泌效果。因此，本发明的蛋白质分泌因子可以广泛用于重组蛋白制备领域，特别是抗体制备领域。
附图说明
图1显示了具有本发明人制备的蛋白质分泌因子SP6的荧光素酶表达载体pCBIN-CLUC的质粒图。
图2显示了具有本发明人制备的蛋白质分泌因子SP1的荧光素酶表达载体pCBIN-CLUC1的质粒图。
图3显示了具有本发明人制备的蛋白质分泌因子SP2的荧光素酶表达载体pCBIN-CLUC2的质粒图。
图4显示了具有本发明人制备的蛋白质分泌因子SP3的荧光素酶表达载体pCBIN-CLUC3的质粒图。
图5显示了具有本发明人制备的蛋白质分泌因子SP4的荧光素酶表达载体pCBIN-CLUC4的质粒图。
图6显示了具有本发明人制备的蛋白质分泌因子SP5的荧光素酶表达载体pCBIN-CLUC5的质粒图。
图7显示了具有本发明人制备的蛋白质分泌因子SP7.2的荧光素酶表达载体pCBIN-CLUC7.2的质粒图。
图8显示了具有本发明人制备的蛋白质分泌因子SP7.3的荧光素酶表达载体pCBIN-CLUC7.3的质粒图。
图9是显示在将八种不同类型的质粒载体(pCBIN-CLUC1、pCBIN-CLUC2、pCBIN-CLUC3、pCBIN-CLUC4、pCBIN-CLUC5、pCBIN-CLUC、pCBIN-CLUC7.2和pCBIN-CLUC7.3)转化到CHO细胞系后第2天、第3天、第5天和第6天测量的在培养基中存在的荧光素酶的分泌量的结果图，其中在每个质粒载体中插入本发明人制备的荧光素酶基因。
图10是显示将蛋白质分泌因子(SP)与IgG1型单克隆抗体(Rx抗体)的轻链基因和重链基因通过框内可行连接过程的示意图。
图11是显示通过将每个蛋白质分泌因子与Rx抗体的轻链基因和重链基因连接而制备的pCB-Rx_v5.4质粒的通常形式的质粒图。在本发明中，制备基于pCB-Rx_v5.4的质粒使得只有插入到质粒图的轻链SP和重链SP中的蛋白质分泌因子不同，而质粒图的其他部分相同。
图12是显示依赖于与Rx抗体的轻链基因和重链基因连接的蛋白质分泌因子的组合的抗体分泌能力的图，其通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测量。
最佳实施方式
在一个实施方案中，本发明提供蛋白质分泌因子。
详细地，本发明提供具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质分泌因子。
如本文所使用的，术语“蛋白质分泌因子”指与蛋白质连接以引起蛋白质被分泌至细胞外的因子。具体地，蛋白质分泌因子可由多肽组成。在本发明中，可以将蛋白质分泌因子与信号序列、分泌序列、信号肽(SP)等共混使用。
具体地，蛋白质分泌因子可具有选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8的氨基酸序列，更具体地，其可具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但本发明不限于此。
与在前研究的正常胰腺组织相比(韩国专利申请公开号10-2007-0119250)，本发明人已经鉴定了在胰腺癌组织中不同表达的具有胰腺癌标记的人类基因LBFL313。以该方式鉴定的人类基因LBFL313可具有SEQ ID NO:47的cDNA序列，但不限于此。已知该人类基因可以用作检测胰腺癌或鉴定样品中正常组织和胰腺癌的诊断剂或标记，但是该基因是否具有分泌因子是未知的。
在本发明的示例性实施方案中，本发明人已经选择了假定具有用作分泌因子同时分析新鉴定基因结构的潜力的肽序列。其结果是，他们确定了具有SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的氨基酸序列的分泌因子候选(SP7.2和SP7.3)。在确定分泌因子候选后，将它们促分泌素的能力与六个已知的分泌因子(SP1至SP6)相比较。
测量每个分泌因子的荧光素酶分泌效力的结果是，相比于传统的信号序列(SP1)，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的和由基因LBFL313衍生的两种信号序列显示改善了荧光素酶分泌的水平(参考图9)。具体地，在SP7.2和SP7.3载体的情况下，在培养的早期(2天和3天)分泌非常大量的荧光素酶。
蛋白质分泌因子可以用于促进靶蛋白的分泌。
如本文所使用的，靶蛋白指意在使用蛋白质分泌因子在期望的宿主细胞中被表达和分泌的蛋白质。可以将编码靶蛋白的核酸序列命名为“目的基因”。
在本发明中，靶蛋白可以是在宿主细胞中内在表达的蛋白质或是通过引入其中的外源基因表达的蛋白质。靶蛋白的类型是不特别受限的，只要通过蛋白质分泌因子增加细胞外分泌效率。
靶蛋白的实例可以包括抗体、人生长激素、血清蛋白、免疫球蛋白、细胞因子、α-干扰素、β-干扰素或γ-干扰素、集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、磷脂酶激活蛋白(PLAP)、胰岛素、肿瘤坏死因子(TNF)、生长因子、激素、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑分泌因子、催乳素、绒毛膜促性腺素(chronic gonadotropin)、组织型纤溶酶原激活物、生长激素释放肽(GHRP)、胸腺体液因子(THF)、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、氨基酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶、胆红素氧化酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶和葡糖醛酸糖苷酶。其具体实例可以包括重链蛋白和轻链蛋白，但不限于此。此处，抗体是包括全长抗体、Fc片段和例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv的抗体片段的概念。此外，抗体轻链可以具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列，抗体重链可以具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列，但不限于此。
可以将蛋白质分泌因子与靶蛋白连接。具体地，蛋白质分泌因子在框内设计为与靶蛋白连接，从而引起宿主细胞中靶蛋白的分泌型表达。
同时，编码蛋白质分泌因子的核酸序列与编码靶蛋白的基因相连是包括核酸序列与基因直接连接和/或其通过连接体连接的概念。
连接体的实例可以包括亲和标签和/或蛋白酶识别序列。
亲和标签的实例可以包括GST、MBP、NusA、硫氧还蛋白、泛素、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD和S标签，但不限于此，可以使用本领域已知的各种亲和标签。
蛋白酶识别序列的实例可以包括通过哺乳动物嘌呤、因子Xa、肠激酶、枯草杆菌蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶、和泛素水解酶识别的序列，但不限于此，可以使用本领域已知的各种蛋白酶识别序列。
在另一个实施方案中，本发明提供包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列的表达组件，该核酸序列与编码靶蛋白的基因连接。
在本发明中，蛋白质分泌因子、靶蛋白等与以上所描述的相同。
如本文所使用的，术语“表达组件”指调节一种或更多种基因和其表达的序列，即包含多种顺式作用转录调节元件的任意组合的核酸序列。本发明的表达组件还可以包含多种元件，例如，如在本领域中认为对于表达调节必要的启动子和增强子的核酸序列，以及编码蛋白质分泌因子和靶蛋白的核酸序列。调节基因表达的序列，即调节基因转录和其转录产物表达的序列，通常称作“调节单元”。调节单元多数位于靶基因的编码序列上游，使得其可行地与靶基因连接。此外，表达组件可以包含3'非转录区域，其包含在3'末端的聚腺苷酸化位点。
表达组件包括启动子序列和编码融合蛋白的核酸序列，在该核酸序列中蛋白质分泌因子与靶蛋白连接，将表达组件配置为使得启动子序列与编码融合蛋白的核酸序列功能性连接。
在此，术语“功能性连接”指一个DNA区域与另一个DNA区域功能性连接。例如，期望的基因序列与表达调节序列如启动子功能性连接，以使期望的基因通过启动子的活化被表达。
在本发明中，表达组件包含启动子序列和编码具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质分泌因子的核酸序列，其与编码靶蛋白的基因连接，将表达组件设计为实现靶蛋白在宿主细胞、具体地在动物宿主细胞中的细胞外分泌型表达。
在又一个实施方案中，本发明提供包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列的重组载体。
更具体地，本发明提供用于表达靶蛋白分泌的载体，其包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列，该核酸序列与编码靶蛋白的基因连接。
蛋白质分泌因子、靶蛋白、蛋白质分泌因子与靶蛋白的连接如以上所描述的相同。
进一步，根据本发明的表达靶蛋白分泌的载体还可以包含表达组件，其包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列，该核酸序列与编码SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8的靶蛋白的基因连接。
此外，根据本发明的表达靶蛋白分泌的载体可以是用于抗体分泌型表达的载体。
例如，用于表达靶蛋白分泌的载体可以包含：a)包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列的第一表达组件，该核酸序列与编码抗体轻链的基因连接；b)包含编码蛋白质分泌因子的核酸序列的第二表达组件，该核酸序列与编码抗体重链的基因连接。
具体地，用于抗体分泌型表达的载体可以包含：a)第一表达组件，其包含编码具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质分泌因子的核酸序列，该核酸序列与编码抗体轻链的基因连接；b)第二表达组件，其包含编码具有选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8的氨基酸序列的蛋白质分泌因子的核酸序列，该核酸序列与编码抗体重链的基因连接。例如，b)的蛋白质分泌因子可以是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白质分泌因子。
更具体地，a)的蛋白质分泌因子可以是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质分泌因子，b)的蛋白质分泌因子可以是具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白质分泌因子。在此，抗体轻链可以由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成，抗体重链可以由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成，但本发明不限于此。
如本文所使用的，术语“用于靶蛋白分泌型表达的载体”指表达载体，其包含编码蛋白质分泌因子的核酸，其与编码靶蛋白的基因连接以引起在将载体引入宿主细胞中并表达该载体时，靶蛋白的细胞外分泌。
如本文所使用的，术语“表达载体”指双链DNA片段作为将靶DNA片段插入其中的载体的。在本领域中用于表达蛋白质的表达载体可以没有限制的使用。在此，靶DNA指编码意在表达的靶蛋白的DNA。一旦表达载体在宿主细胞中，则可以复制该表达载体而不管宿主染色体DNA，可以表达插入的靶DNA。如本领域众所周知的，为了增加宿主细胞中转染基因的表达水平，转染基因必须可行地与转录和解码表达调节基因连接使得基因在选择的宿主细胞中显示功能。
在本发明的示例性实施方案中，基于具有‘CMVe’、‘CB’和‘Beta肌动蛋白内含子’的pTOP-BA-RL-pA载体(韩国专利申请公开号10-2012-0059222)，通过可行地将编码由SEQID NO:1至SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的蛋白质分泌因子的核酸序列与编码待制备蛋白质的基因连接而制备用于表达靶蛋白分泌的载体。
在本发明的具体实施方案中，本发明人通过从荧光素酶分泌测量试验中显示优异分泌诱导效果的信号序列中选择SP2(SEQ ID NO:4)、SP6(SEQ ID NO:8)和SP7.2(SEQ IDNO:1)制备了抗体表达载体(实施例5)，以确定制备的抗体表达载体是否即使对单克隆抗体也显示优异的分泌诱导能力，所述单克隆抗体需要工业化大规模生产。在该试验中，使用Rx抗体作为单克隆抗体，Rx抗体包含由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成的抗体轻链和由SEQID NO:49的氨基酸序列组成的抗体重链。
为了确定抗体分泌因子的最佳结构，将抗体轻链和抗体重链的分泌因子不同组合，检测其分泌效率。
即，抗体轻链和抗体重链由载体表达，测量其分泌，所述载体通过将选自SP1(SEQID NO:3)、SP2(SEQ ID NO:4)、SP6(SEQ ID NO:8)和SP7.2(SEQ ID NO:1)的信号序列分别与抗体轻链和抗体重链连接而制备。
为了检测体外细胞培养体系中信号序列的细胞外分泌效率，将信号序列转化到CHO细胞中，然后通过ELISA检测单克隆抗体的分泌水平。
通过ELISA试验测量抗体分泌水平的结果是，确定了来自表达载体pCB-Rx71_v5.4的高分泌水平，所述表达载体包含编码由LBFL313基因衍生的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的SP7.2信号序列(参见图12)。具体地，从与抗体轻链连接的SP7.2信号序列和编码SEQ IDNO:3的氨基酸序列且与抗体重链连接的SP1信号序列的组合中观察到显著的高分泌水平。进一步，确定了分泌水平还随着培养期的增加而增加。因此，与荧光素酶分泌试验结果相比，其中分泌水平在短期培养中显著增加，确定了当使用SP7.2信号序列时，甚至在长期培养中分泌水平也显著增加。
在又一个实施方案中，本发明提供将载体引入宿主细胞的转化细胞。
如本文所使用的，术语“转化”指将DNA引入宿主细胞中，从而DNA通过染色体整合进行复制。在本发明中，可以用于本发明转化的宿主细胞可以包括原核细胞或/和真核细胞。
在本发明中，宿主细胞的实例可以包括细菌；通常已知的原核宿主和真核宿主例如埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、真菌和酵母菌；昆虫细胞例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda，SF9)；动物细胞例如CHO、COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10。在本发明中，宿主细胞可以是动物宿主细胞，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，但不限于此。
在本发明的示例性实施方案中，在重组蛋白制备中广泛使用的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞作为宿主细胞。
在又一个实施方案中，本发明提供了制备靶蛋白的方法，其包括：i)培养引入用于靶蛋白分泌型表达的载体的转化细胞以表达靶蛋白和使靶蛋白分泌至细胞外；ii)从细胞的培养物或培养物上清液中回收靶蛋白。
制备靶蛋白的方法还可包括纯化回收的靶蛋白。如果必要，可以通过本领域中通常使用的蛋白质纯化法进行靶蛋白的纯化。例如，通过传统的色谱法，例如免疫亲和色谱、受体亲和色谱、疏水作用色谱、凝集素亲和色谱、尺寸排阻色谱、阳离子交换色谱或阴离子交换色谱、高效液相色谱(HPLC)或反相高效液相色谱，可以从宿主细胞的培养物或培养物上清液分离靶蛋白。同时，当靶蛋白是具有特质标签、标记或螯合部分的融合蛋白时，该靶蛋白可以使用特质结合配偶体或特质结合剂纯化。经纯化的蛋白质可以通过去除蛋白质分泌因子切割为期望的蛋白质部分或可以维持在其中。在切割融合蛋白的过程中，可以制备具有附加氨基酸的期望蛋白质。
在本发明中，蛋白质分泌因子、蛋白质、表达组件、靶蛋白、用于分泌型表达的载体、转化、宿主细胞等与以上所描述的相同。
在本方法中使用的宿主细胞可以是动物宿主细胞，具体是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。另外，如果必要，转化的宿主细胞可以通过本领域已知的普通培养法培养。
在又一个实施方案中，本发明提供用于制备靶蛋白分泌型表达的载体的蛋白质分泌因子的用途。
蛋白质分泌因子、载体和靶蛋白与以上所描述的相同。
在又一个实施方案中，本发明提供用于分泌靶蛋白的蛋白质分泌因子的用途。
蛋白质分泌因子、载体和靶蛋白与以上所描述的相同。
具体实施方式
在下文中，参考以下实施例会更详细地描述本发明。然而，提供这些实施例仅为了解释本发明，本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1：分子生物学技术
通常用于分子生物学的方法，例如限制酶处理、琼脂糖凝胶电泳、Gel ExtractionKit(QIAGEN)、质粒DNA纯化、聚合酶链反应(PCR)、DNA片段连接、大肠杆菌(E.coli)转化，根据文献(Sambrook J等人，2001Molecular cloning:A laboratory manual，第二版.ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)中所描述的方法以最小改变实施。
实施例2：信号序列的选择
2-1:试验方法
为了鉴定在使用动物宿主细胞表达异源蛋白的过程中用于增强分泌的信号序列，旨在由韩国专利第10-0954322号中公开的文献“与胰腺癌有关的新型基因LBFL313”检测高效率分泌型信号序列的可能性。
具体地，假定具有作为信号序列潜力的肽序列选自LBFL313基因，将这些选择的肽序列与在动物细胞中通常用作信号序列的传统六种信号序列相比较。在这一点上，作为第一比较试验，将在重组蛋白制备中广泛使用的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系用作宿主细胞，将分泌型荧光素酶基因用作靶基因。通过使用光度计测量由荧光素酶分泌至细胞外的荧光素(用作基质)氧化放射的光量确定分泌水平。
其后，作为用于比较单克隆抗体分泌与第一比较试验中选择的信号序列分泌的第二比较试验，所述单克隆抗体是商业可购的蛋白质且替代荧光素酶，通过使用CHO细胞系作为宿主细胞的ELISA测量抗体轻链的信号序列和抗体重链的信号序列的多种组合分泌的抗体量。在此，通过用识别重链Fc部分的F(ab')2涂覆ELISA板固定分泌至细胞外的抗体，与轻链kappa部分结合的抗体用辣根过氧化物酶(HRP)标记，使用分光光度计测量用作基质的TMB氧化，从而确定分泌水平。
2-2:用于试验的信号序列
将预期作为信号序列的肽序列假定来自实施例2-1中的LBFL313基因。其结果是，选择了SP7.2和Sp7.3。
※SP7.2(SEQ ID NO:1)
NH3-MHRPEAMLLLLTLALLGGPTWA-CO2H
※SP7.3(SEQ ID NO:2)
NH3-MWRVPGTTRRPVTGESPGMHRPEAMLLLLTLALLGGPTWA-CO2H
将用于和以上选择的信号序列比较试验的六个传统信号序列命名为SP1至SP6。这些信号序列如下：
※SP1(SEQ ID NO:3)
NH3-MGWSYIILFLVATATDVHS-CO2H
※SP2(SEQ ID NO:4)
NH3-MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR-CO2H
※SP3(SEQ ID NO:5)
NH3-MDFQVQIISFLLISASVIMSRG-CO2H
※SP4(SEQ ID NO:6)
NH3-MGWSLILLFLVAVATRVLS-CO2H
※SP5(SEQ ID NO:7)
NH3-MLLLLLLLGLRLQLSLG-CO2H
※SP6(SEQ ID NO:8)
NH3-MKTLILAVALVYCATVHC-CO2H
在该试验中，SP1是源自小鼠IgG2的信号序列；SP2是源自人血清白蛋白(HSA)的信号序列；SP3是源自小鼠IkC的信号序列；SP4是人工合成的信号序列(非天然信号序列)，其是美国专利第7381560号中所使用的信号序列；SP5是源自分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的信号序列；SP6是源自海萤夜光虫(Cypridina noctiluca)荧光素酶(CLUC)的信号序列，所述荧光素酶为分泌型荧光素酶。
在该试验中，为了从这些质粒载体中通过最佳组合选择显示高靶蛋白分泌的质粒载体，通常，海萤夜光虫荧光素酶(CLUC)基因和Rx抗体基因作为报道基因，所述海萤夜光虫荧光素酶是容易测量的分泌型荧光激酶，所述Rx抗体基因是IgG1型抗体基因。
通过在框内连接编码八种信号序列的DNA序列与基因序列(海萤夜光虫荧光素酶(CLUC)基因或Rx抗体的轻链基因和重链基因)制备以下各种组合的质粒载体，所述Rx抗体是IgG1型抗体。在下表1中概述由此制备的质粒载体的组合和成分。
表1
质粒名称 成分
pCBIN-CLUC1 SP1+CLUC
pCBIN-CLUC2 SP2+CLUC
pCBIN-CLUC3 SP3+CLUC
pCBIN-CLUC4 SP4+CLUC
pCBIN-CLUC5 SP5+CLUC
pCBIN-CLUC SP6+CLUC
pCBIN-CLUC7.2 SP7.2+CLUC
pCBIN-CLUC7.3 SP7.3+CLUC
pCB-Rx11_v5.4 (SP1+抗体轻链)+(SP1+抗体重链)
pCB-Rx12_v5.4 (SP1+抗体轻链)+(SP2+抗体重链)
pCB-Rx16_v5.4 (SP1+抗体轻链)+(SP6+抗体重链)
pCB-Rx17_v5.4 (SP1+抗体轻链)+(SP7.2+抗体重链)
pCB-Rx21_v5.4 (SP2+抗体轻链)+(SP1+抗体重链)
pCB-Rx22_v5.4 (SP2+抗体轻链)+(SP2+抗体重链)
pCB-Rx26_v5.4 (SP2+抗体轻链)+(SP6+抗体重链)
pCB-Rx27_v5.4 (SP2+抗体轻链)+(SP7.2+抗体重链)
pCB-Rx31_v5.4 (SP3+抗体轻链)+(SP1+抗体重链)
pCB-Rx32_v5.4 (SP3+抗体轻链)+(SP2+抗体重链)
pCB-Rx36_v5.4 (SP3+抗体轻链)+(SP6+抗体重链)
pCB-Rx37_v5.4 (SP3+抗体轻链)+(SP7.2+抗体重链)
pCB-Rx61_v5.4 (SP6+抗体轻链)+(SP1+抗体重链)
pCB-Rx62_v5.4 (SP6+抗体轻链)+(SP2+抗体重链)
pCB-Rx66_v5.4 (SP6+抗体轻链)+(SP6+抗体重链)
pCB-Rx67_v5.4 (SP6+抗体轻链)+(SP7.2+抗体重链)
pCB-Rx71_v5.4 (SP7.2+抗体轻链)+(SP1+抗体重链)
pCB-Rx72_v5.4 (SP7.2+抗体轻链)+(SP2+抗体重链)
pCB-Rx76_v5.4 (SP7.2+抗体轻链)+(SP6+抗体重链)
pCB-Rx77_v5.4 (SP7.2+抗体轻链)+(SP7.2+抗体重链)
在使用CLUC的试验中，通过荧光素酶试验测量细胞外分泌水平，在使用Rx抗体的试验中，通过ELISA试验测量细胞外分泌水平。
实施例3：荧光素酶质粒载体的制备
制备具有在实施例2-2中设计的分泌型序列和具有作为报道基因的分泌型荧光素酶(CLUC)的质粒载体。
3-1：pCBIN-CLUC6的制备
为了构造具有CMV增强子(CMVe)和CMV/β-肌动蛋白融合启动子(CB)的报道载体，将通过用EcoRI和BamHI处理具有‘CMVe’、‘CB’和‘β-肌动蛋白内含子’的pTOP-BA-RL-pA载体(韩国专利申请公开号10-2012-0059222中公开)而获得的DNA片段(1762bp)插入用相同限制酶酶切的pCLuc-Basic2载体中(NEB，Cat#:N0317S)。以该方式构造的报道基因具有信号序列‘SP6’(pCBIN-CLUC)(参见图1)。
3-2：pCBIN-CLUC1的制备
将DNA片段(80bp)和DNA片段(1654bp)插入通过用BamHI和XbaI酶切pCBIN-CLUC载体获得的DNA片段(6049bp)的位点中，以制备pCBIN-CLUC1载体；其中使用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的两种引物，使用pCB-Ix6_v5.4作为模板，经由编码小鼠IgG2信号序列(SP1：SEQ ID NO:3)的肽序列的DNA序列的PCR扩增，然后用BamHI和NdeI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(80bp)；使用两种引物(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)和pCLuc-Basic2载体作为模板，经由PCR扩增CLUC基因，然后用NdeI和XbaI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(1654bp)(参见图2)。
使用的引物如下：
※oSP1-f(SEQ ID NO:9)
5'-tt GGATCC gcc acc atg gga tgg agc tat-3'
※oSP1-r(SEQ ID NO:10)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gga gtg gac atc tgt-3'
※oCLUC-N1-f(SEQ ID NO:11)
5'-tt c CATATG aa cct gat cca cca aa-3'
※oBasic-r(SEQ ID NO:12)
5'-tca gaa gcc ata gag ccc acc gca t-3'
3-3：pCBIN-CLUC2的制备
将DNA片段(95bp)和DNA片段(1654bp)插入通过用BamHI和XbaI酶切pCBIN-CLUC载体获得的DNA片段(6049bp)的分裂位点中，以制备pCBIN-CLUC2载体；其中通过使编码人血清白蛋白(HAS)信号序列的肽序列的DNA序列退火为两种寡核苷酸(SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14)，以使用退火的DNA序列作为模板，使用两种引物(SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16)经由PCR扩增产生的DNA序列，然后用BamHI和NdeI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(95bp)；使用两种引物(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)和pCLuc-Basic2载体作为模板，经由PCR扩增CLUC基因，然后使用NdeI和XbaI切割PCR扩增产物获得DNA片段(1654bp)(参见图3)。
使用的引物如下：
※oHSAL-U(SEQ ID NO:13)
5'-atg aag tgg gtg acc ttc atc tcc ctg ctg ttc ctg ttc tcc tcc gcctac tcc agg ggc gtg ttc agg agg-3'
※oHSAL-L(SEQ ID NO:14)
5'-cct cct gaa cac gcc cct gga gta ggc gga gga gaa cag gaa cag caggg-3'
※oSP2-f(SEQ ID NO:15)
5'-tt GGATCC gcc acc atg aag tgg gtg acc-3'
※oSP2-r(SEQ ID NO:16)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg cct cct gaa cac gcc-3'
3-4：pCBIN-CLUC3的制备
将DNA片段(89bp)和DNA片段(1654bp)插入通过用BamHI和XbaI酶切pCBIN-CLUC载体获得的DNA片段(6049bp)的限制位点中，以制备pCBIN-CLUC3载体；其中使用SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的两种引物，使用表达小鼠-人嵌合IgG1单克隆抗体的pCB-Rx载体(由本公司保存的表达载体，其中使用‘SP3’和‘SP4’作为信号序列)作为模板，经由PCR扩增，然后用BamHI和NdeI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(89bp)；使用两种引物(SEQ ID NO:11和SEQID NO:12)和pCLuc-Basic2载体作为模板，经由PCR扩增CLUC基因，然后用NdeI和XbaI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(6049bp)(参见图4)。
使用的引物如下：
※oSP3-f(SEQ ID NO:17)
5'-tt GGATCC gcc acc atg gac ttc cag gtg-3'
※oSP3-r(SEQ ID NO:18)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gcc cct gga cat gat-3'
3-5：pCBIN-CLUC4的制备
将DNA片段(80bp)和DNA片段(1654bp)插入通过用BamHI和XbaI酶切pCBIN-CLUC载体获得的DNA片段(6049bp)的限制位点中，以制备pCBIN-CLUC4载体；其中使用SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的两种引物和表达小鼠-人嵌合IgG1单克隆抗体的pCB-Rx载体作为模板，经由PCR扩增，然后用BamHI和NdeI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(80bp)；使用两种引物(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)和pCLuc-Basic2载体作为模板，经由PCR扩增CLUC基因，然后用NdeI和XbaI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(1654bp)(参见图5)。
使用的引物如下：
※oSP4-f(SEQ ID NO:19)
5'-tt GGATCC gcc acc atg ggc tgg agc ctg-3'
※oSP4-r(SEQ ID NO:20)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gga cag cac cct ggt-3'
3-6：pCBIN-CLUC5的制备
将DNA片段(74bp)和DNA片段(1654bp)插入通过用BamHI和XbaI酶切pCBIN-CLUC载体获得的DNA片段(6049bp)的限制位点中，以制备pCBIN-CLUC5载体；其中使用SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的两种引物，和pSEAP-Basic2载体作为模板，经由PCR扩增，然后用BamHI和NdeI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(74bp)，所述pSEAP-Basic2载体是使用分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的报道载体；使用两种引物(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)和pCLuc-Basic2载体作为模板，PCR扩增CLUC基因，然后用NdeI和XbaI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(1654bp)(参见图5)。
使用的引物如下：
※oSP5-f(SEQ ID NO:21)
5'-tt GGATCC gcc acc atg ctg ctg ctg ctg ctg ctg ctg g-3'
※oSP5-r(SEQ ID NO:22)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg gcc cag gga gag ctg-3'
3-7：pCBIN-CLUC7.2的制备
将DNA片段(89bp)和DNA片段(1654bp)插入通过用BamHI和XbaI酶切pCBIN-CLUC载体获得的DNA片段(6049bp)的限制位点中，以制备pCBIN-CLUC7.2载体；其中使用SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:24的两种引物，和具有LBFL313基因的pLFG250(韩国专利申请公开号10-0954322)作为模板，经由PCR扩增，然后用BamHI和NdeI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(89bp)；使用两种引物(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)和pCLuc-Basic2载体作为模板，经由PCR扩增CLUC基因，然后用NdeI和XbaI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(1654bp)(参见图7)。
使用的引物如下：
※oSP7-B1-f2(SEQ ID NO:23)
5'-tt GGATCC gcc acc atg cac cgg cca gag-3'
※oSP7-N1-r(SEQ ID NO:24)
5'-ttC ATA TGg aca gtc ctg tgc cca ggt ggg gcc-3'
3-8：pCBIN-CLUC7.3的制备
将DNA片段(143bp)和DNA片段(1654bp)插入通过用BamHI和XbaI酶切pCBIN-CLUC载体获得的DNA片段(6049bp)的分裂位点中，以制备pCBIN-CLUC7.3载体；其中使用SEQ IDNO:24和SEQ ID NO:25的两种引物，和具有LBFL313基因的pLFG250(韩国专利号10-0954322)作为模板，经由PCR扩增，然后用BamHI和NdeI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(143bp)；使用两种引物(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)和pCLuc-Basic2载体作为模板，经由PCR扩增CLUC基因，然后用NdeI和XbaI酶切PCR扩增产物获得DNA片段(1654bp)(参见图8)。
使用的引物如下：
※oSP7-B1-f3(SEQ ID NO:25)
5'-tt GGATCC gcc acc atg tgg agg gtg ccc-3'
实施例4：荧光素酶质粒载体的体外分泌效力试验
配置实施例3制备的每种荧光素酶质粒载体，使得将源自海萤夜光虫的分泌型荧光素酶插入作为报道基因。为了检测在体外细胞培养体系中信号序列的细胞外分泌效力，将信号序列转化到CHO细胞中，然后通过荧光素酶试验检测信号序列的分泌诱导水平。
特别地，将实施例3制备的每种荧光素酶质粒载体转化到CHO细胞中，其在使用LipofectamineTM2000(Invitrogen，Cat.#:11668-019)、包含10％热灭活的胎牛血清(FBS，由GIBCO-BRL公司制造)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM，由GIBCO-BRL公司制造)中培养。在转化前一天，在24孔板(Falcon公司)的每个孔培养6×104个CHO细胞，第二天，将装有500ng的八种不同类型质粒载体(pCBIN-CLUC1、pCBIN-CLUC2、pCBIN-CLUC4、pCBIN-CLUC5、pCBIN-CLUC、pCBIN-CLUC7.2和pCBIN-CLUC7.3)和50μL的(invitrogen，Cat.#31985-070)的管1(1个孔反应量)、装有2μL的LipofectamineTM2000和48μL的的管2(1个孔反应量)分别在室温下放置5分钟，在所述每种质粒载体中插入了荧光素酶基因，然后将两个管混合，在室温下反应20分钟。将100μL体积的混合物添加到250μL中的CHO细胞，并在37℃下的培养箱(5％CO2)中培养，然后将包含20％FBS的DMEM加入每个孔中并培养6天。在转化后的第2天、第3天、第5天和第6天，收集100μL量的每个孔培养基作为样品，在20℃下储存，完全溶解，在第6天将20μL的每种生成物分别转移到试验板中，经受荧光素酶试验。
如图9所示，荧光素酶分泌效力的测量结果是，相比于现存的信号序列(SP1)，在源自LBFL313的两种信号序列和现存的两种信号序列的全部四种信号序列(SP2、SP6、SP7.2和SP7.3)中改善了荧光素酶的分泌水平。具体地，确定了在SP7.2和SP7.3载体的情况下，在培养的早期(2天和3天)分泌了大量荧光素酶。
实施例5：抗体表达质粒载体的制备
从实施例4中显示效果的信号序列中选择SP2、SP6和SP7.2制备以下各种抗体表达载体，以检测每种制备的抗体表达载体是否即使对单克隆抗体也显示优异的分泌诱导能力，所述单克隆抗体需要工业化大规模生产。
5-1：pCB-Rx11_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQID NO:28)和pCBIN-CLUC1载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR获得其中SP1与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表2)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC1载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR获得其中SP1与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx11_v5.4载体(参见图11和表3)。
使用的引物如下：
※oIxLs-r1(SEQ ID NO:26)
5'-cag cag gat gtc gcc cct gga cat gat cac-3'
※oRx-LF1(SEQ ID NO:27)
5'-cag atc gtg ctg tct cag tct-3'
※oIkC-M1X1-r(SEQ ID NO:28)
5'-tt ACGCGT CTCGAG tca aca ctc tcc c-3'
※oRHn-f(SEQ ID NO:29)
5'-tt GGCGCGCC atg gga tgg agc tat-3'
※oIxLs-r2(SEQ ID NO:30)
5'-cag cag gat gtc gga cag cac cct ggt ggc cac ggc-3'
※oRx_HF1(SEQ ID NO:31)
5'-cag gtg cag ctg cag cag ccc-3'
※oIgG1-X1N1-r(SEQ ID NO:32)
5'-aa CTCGAG GCGGCCGC tca ttt acc cgg aga c-3'
表2
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 9 E 29
B 26 F 30
C 27 G 31
D 28 H 32
表3
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx11_v5.4 SP1 SP1
5-2：pCB-Rx12_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQID NO:28)和pCBIN-CLUC1载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP1与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表4)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP2与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将该两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx12_v5.4载体(参见图11和表5)。
使用的引物如下：
※oAscI_SP2-f(SEQ ID NO:33)
5'-ctg gcg cgc cat gaa gtg ggt gac c-3'
※oSP2_RH-r(SEQ ID NO:34)
5'-gca gct gca cct gcc tcc tga aca c-3'
※oSP2_RH-f(SEQ ID NO:35)
5'-ctg ttc att gcc agg tgc agc tgc-3'
表4
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 9 E 33
B 26 F 34
C 27 G 35
D 28 H 32
表5
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx12_v5.4 SP1 SP2
5-3：pCB-Rx16_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQID NO:28)和pCBIN-CLUC1载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP1与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表6)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC3载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板PCR扩增获得其中SP6与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx16_v5.4载体(参见图11和表7)。
使用的引物如下：
※oAscI_SP6-f(SEQ ID NO:36)
5'-CAG GCG CGC CAT GAA GAC CTT AAT TC-3'
※oSP6_RH-r(SEQ ID NO:37)
5'-GCA GCT GCA CCT GGC AAT GAA CAG-3'
※oSP6_RH-f(SEQ ID NO:38)
5'-CTG TTC ATT GCC AGG TGC AGC TGC-3'
表6
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 9 E 36
B 26 F 37
C 27 G 38
D 28 H 32
表7
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx16_v5.4 SP1 SP6
5-4：pCB-Rx17_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQID NO:28)和pCBIN-CLUC1载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP1与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表8)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC7.2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP7.2与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx17_v5.4载体(参见图11和表9)。
使用的引物如下：
※oAscI_SP7.2-f(SEQ ID NO:39)
5'-cag gcg cgc cat gca ccg gcc aga g-3'
※oSP7.2_RH-r(SEQ ID NO:40)
5'-gca gct gca cct gtg ccc agg tgg g-3'
※oSP7.2_RH-f(SEQ ID NO:41)
5'-ccc acc tgg gca cag gtg cag ctg c-3'
表8
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 9 E 39
B 26 F 40
C 27 G 41
D 28 H 32
表9
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx17_v5.4 SP1 SP7.2
5-5：pCB-Rx21_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:28)和pCBIN-CLUC2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP2与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表10)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC1载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP1与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两种DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx21_v5.4载体(参见图10和表11)。
使用的引物如下：
※oSP7.2_RH-r(SEQ ID NO:42)
5'-gca gct gca cct gtg ccc agg tgg g-3'
※oSP7.2_RH-f(SEQ ID NO:43)
5'-ccc acc tgg gca cag gtg cag ctg c-3'
表10
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 9 E 39
B 42 F 40
C 43 G 41
D 28 H 32
表11
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx21_v5.4 SP2 SP1
5-6：pCB-Rx22_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:4和SEQID NO:28)和pCBIN-CLUC2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP2与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表12)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP2与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx22_v5.4载体(参见图10和表13)。
表12
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 9 E 33
B 42 F 34
C 43 G 35
D 28 H 32
表13
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx22_v5.4 SP2 SP2
5-7：pCB-Rx26_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:28)和pCBIN-CLUC2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP2与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表14)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP6与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx26_v5.4载体(参见图11和表15)。
表14
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 15 E 36
B 42 F 37
C 43 G 38
D 28 H 32
表15
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx26_v5.4 SP2 SP6
5-8：pCB-Rx27_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:28)和pCBIN-CLUC2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP2与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表16)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC7.2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP6与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx27_v5.4载体(参见图11和表17)。
表16
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 15 E 39
B 42 F 40
C 43 G 41
D 28 H 32
表17
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx27_v5.4 SP2 SP7.2
5-9：pCB-Rx32_v5.4的制备
DNA片段(参见图10和表18)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP2与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得，将该DNA片段插入pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx32_v5.4载体(参见图11和表19)。
表18
引物 SEQ ID NO:
E 33
F 34
G 35
H 32
表19
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx32_v5.4 SP3 SP2
5-10：pCB-Rx36_v5.4的制备
DNA片段(参见图10和表20)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP6与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得，将该DNA片段插入pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx36_v5.4载体(参见图11和表21)。
表20
引物 SEQ ID NO:
E 36
F 37
G 38
H 32
表21
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx36_v5.4 SP3 SP6
5-11：pCB-Rx37_v5.4的制备
DNA片段(参见图10和表22)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC7.2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP7.2与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得，将该DNA片段插入pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx37_v5.4载体(参见图11和表23)。
表22
引物 SEQ ID NO:
E 39
F 40
G 41
H 32
表23
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx37_v5.4 SP3 SP7.2
5-12：pCB-Rx61_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:28)和pCBIN-CLUC载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP6与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表24)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC1载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP1与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点、使用BamHI和XhoI，pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx61_v5.4载体(参见图11和表25)。
表24
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 44 E 29
B 45 F 30
C 46 G 31
D 28 H 32
表25
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx61_v5.4 SP6 SP1
使用的引物如下：
※oSP6-f(SEQ ID NO:44)
5'-tt GGATCC gcc acc atg aag acc tta att-3'
※oSP6_RL-r(SEQ ID NO:45)
5'-ACA GCA CGA TCT GGC AAT GAA CAG-3'
※oSP6_RL-f(SEQ ID NO:46)
5'-CTG TTC ATT GCC AGA TCG TGC TGT-3'
5-13：pCB-Rx62_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:28)和pCBIN-CLUC载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP6与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表26)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP2与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx62_v5.4载体(参见图11和表27)。
表26
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 44 E 33
B 45 F 34
C 46 G 35
D 28 H 32
表27
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx62_v5.4 SP6 SP2
5-14：pCB-Rx66_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:28)和pCBIN-CLUC载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP6与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表28)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP6与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点、使用BamHI和XhoI，pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx66_v5.4载体(参见图11和表29)。
表28
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 44 E 36
B 45 F 37
C 46 G 38
D 28 H 32
表29
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx66_v5.4 SP6 SP6
5-15：pCB-Rx67_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:28)和pCBIN-CLUC载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP6与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表30)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:32)和pCBIN-CLUC7.2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP7.2与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx67_v5.4载体(参见图11和表31)。
表30
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 44 E 39
B 45 F 40
C 46 G 41
D 28 H 32
表31
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx67_v5.4 SP6 SP7.2
5-16：pCB-Rx71_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:28)和pCBIN-CLUC7.2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP7.2与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表32)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32)和pCBIN-CLUC1载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP1与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点、使用BamHI和XhoI，pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx71_v5.4载体(参见图11和表33)。
表32
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 23 E 29
B 42 F 30
C 43 G 31
D 28 H 32
表33
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx71_v5.4 SP7.2 SP1
5-17：pCB-Rx72_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:28)和pCBIN-CLUC7.2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP7.2与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表34)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ IDNO:32)和pCBIN-CLUC7.2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP2与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx72_v5.4载体(参见图11和表35)。
表34
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 23 E 33
B 42 F 34
C 43 G 35
D 28 H 32
表35
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx72_v5.4 SP7.2 SP2
5-18：pCB-Rx76_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:28)和pCBIN-CLUC7.2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP7.2与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表36)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ IDNO:32)和pCBIN-CLUC载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP6与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4I的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx76_v5.4载体(参见图11和表37)。
表36
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 23 E 36
B 42 F 37
C 43 G 38
D 28 H 32
表37
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx76_v5.4 SP7.2 SP6
5-19：pCB-Rx77_v5.4的制备
DNA片段，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:28)和pCBIN-CLUC7.2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP7.2与抗体轻链连接的PCR产物，通过用BamHI和XhoI酶切该PCR产物获得；DNA片段(参见图10和表38)，其经由使用四种引物(SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ IDNO:32)和pCBIN-CLUC7.2载体和pCB-Rx_v5.4载体作为模板的PCR扩增获得其中SP7.2与抗体重链连接的PCR产物，通过用AscI和NotI酶切该PCR产物获得；将这两个DNA片段分别插入pCB-Rx_v5.4的BamHI和XhoI位点和pCB-Rx_v5.4的AscI和NotI位点，以制备pCB-Rx77_v5.4载体(参见图11和表39)。
表38
引物 SEQ ID NO: 引物 SEQ ID NO:
A 23 E 39
B 42 F 40
C 43 G 41
D 28 H 32
表39
质粒 轻链类型(SP) 重链类型(SP)
pCB-Rx77_v5.4 SP7.2 SP7.2
实施例6：抗体表达质粒载体的体外分泌效力试验
配置实施例5制备的每种抗体表达质粒载体，使得将小鼠-人嵌合IgG1型单克隆抗体分泌到细胞外。为了检测在体外细胞培养体系中信号序列的细胞外分泌效力，将单克隆抗体转化到CHO细胞中，然后通过ELISA检测单克隆抗体的分泌水平。
具体的，将实施例5制备的每种抗体表达质粒载体转化到CHO细胞中，其在包含10％热灭活的胎牛血清(FBS，由GIBCO-BRL公司制造)、使用LipofectamineTM2000(Invitrogen，Cat.#:11668-019)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM，由GIBCO-BRL公司制造)中培养。在转化前一天，使用phi-100培养皿(Falcon公司)在每个培养皿中培养5×106个CHO细胞，第二天，将装有36ng的16种不同类型质粒载体1.5mL的(invitrogen，Cat.#31985-070)的管1(1个培养皿反应量)、装有90μL的LipofectamineTM2000和1410μL的的管2(1个培养皿反应量)分别在室温下放置5分钟，在所述每种质粒载体中插入了荧光素酶基因，然后将两个管混合以在室温下反应20分钟。将3mL体积的混合物添加到5mL的中的CHO细胞中，在37℃下的培养箱(5％CO2)中培养3小时，然后将包含20％FBS的DMEM培养基加入每个培养皿中5mL并培养8天。在转化后的第2天、第4天、第6天和第8天，分别收集500μL体积的每个培养皿的培养基作为样品，在20℃下储存，然后在第8天全部溶解，转移到100μL体积的试验板中，经受ELISA试验。
在4℃下，使用O/N涂覆的96孔板和抗人Kappa轻链过氧化物酶(A7164-1mL，sigma)，分别在将山羊抗人IgG的F(ab')2片段和Fcγ片段特异性(Pierce，31163)设置为0.2ug/mL的条件下进行ELISA试验。
如图12所示，通过ELISA试验测量抗体分泌水平的结果是，发现包含编码源自LBFL313基因的SEQ ID NO:1氨基酸序列的信号序列SP7.2的表达载体pCB-Rx71_v5.4的分泌水平高。具体地，发现将信号序列SP7.2与抗体轻链连接和编码SEQ ID NO:3氨基酸序列的信号序列SP1与抗体重链连接的组合的分泌量是显著高的，且其分泌量随培养时间的增加而增加。因此，相比于在短期培养中荧光素酶分泌水平高的荧光素酶分泌试验结果，发现当使用信号序列SP7.2时，该组合的分泌水平即使在长期培养中也是非常高的。
由上可知，本领域技术人员会理解可以对示例性实施方案做出许多变化和修改而基本不偏离本发明的本质。因此，本发明公开的优选实施方案仅用于一般的描述意义而不是为了限制。
序列表
<110> 株式会社LG生命科学
<120> 具有高分泌效率的蛋白质分泌因子和包含其的表达载体
<130> OPA15021
<150> KR 10-2014-0052752
<151> 2014-04-30
<160> 49
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 信号肽_SP7.2
<400> 1
Met His Arg Pro Glu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Thr Trp Ala
20
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> 信号肽_SP7.3
<400> 2
Met Trp Arg Val Pro Gly Thr Thr Arg Arg Pro Val Thr Gly Glu Ser
1 5 10 15
Pro Gly Met His Arg Pro Glu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala
20 25 30
Leu Leu Gly Gly Pro Thr Trp Ala
35 40
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 信号肽_SP1
<400> 3
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 4
<211> 24
<212> PRT
<213> 信号肽_SP2
<400> 4
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg
20
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 信号肽_SP3
<400> 5
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly
20
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 信号肽_SP4
<400> 6
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 信号肽_SP5
<400> 7
Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu Ser Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 信号肽_SP6
<400> 8
Met Lys Thr Leu Ile Leu Ala Val Ala Leu Val Tyr Cys Ala Thr Val
1 5 10 15
His Cys
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP1-f引物
<400> 9
ttggatccgc caccatggga tggagctat 29
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP1-r引物
<400> 10
ttcatatgga cagtcctggg agtggacatc tgt 33
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oCLUC-N1-f引物
<400> 11
ttccatatga acctgatcca ccaaa 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oBasic-r引物
<400> 12
tcagaagcca tagagcccac cgcat 25
<210> 13
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oHSAL-U引物
<400> 13
atgaagtggg tgaccttcat ctccctgctg ttcctgttct cctccgccta ctccaggggc 60
gtgttcagga gg 72
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oHSAL-L引物
<400> 14
cctcctgaac acgcccctgg agtaggcgga ggagaacagg aacagcaggg 50
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP2-f引物
<400> 15
ttggatccgc caccatgaag tgggtgacc 29
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP2-r引物
<400> 16
ttcatatgga cagtcctgcc tcctgaacac gcc 33
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP3-f引物
<400> 17
ttggatccgc caccatggac ttccaggtg 29
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP3-r引物
<400> 18
ttcatatgga cagtcctggc ccctggacat gat 33
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP4-f引物
<400> 19
ttggatccgc caccatgggc tggagcctg 29
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP4-r引物
<400> 20
ttcatatgga cagtcctggg acagcaccct ggt 33
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP5-f引物
<400> 21
ttggatccgc caccatgctg ctgctgctgc tgctgctgg 39
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP5-r引物
<400> 22
ttcatatgga cagtcctggc ccagggagag ctg 33
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP7-B1-f2引物
<400> 23
ttggatccgc caccatgcac cggccagag 29
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP7-N1-r引物
<400> 24
ttcatatgga cagtcctgtg cccaggtggg gcc 33
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP7-B1-f3引物
<400> 25
ttggatccgc caccatgtgg agggtgccc 29
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oIxLs-r1引物
<400> 26
cagcaggatg tcgcccctgg acatgatcac 30
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oRx-LF1引物
<400> 27
cagatcgtgc tgtctcagtc t 21
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oIkC-M1X1-r引物
<400> 28
ttacgcgtct cgagtcaaca ctctccc 27
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oRHn-f引物
<400> 29
ttggcgcgcc atgggatgga gctat 25
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oIxLs-r2引物
<400> 30
cagcaggatg tcggacagca ccctggtggc cacggc 36
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oRx_HF1引物
<400> 31
caggtgcagc tgcagcagcc 20
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oIgG1-X1N1-r引物
<400> 32
aactcgaggc ggccgctcat ttacccggag ac 32
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oAscI_SP2-f引物
<400> 33
ctggcgcgcc atgaagtggg tgacc 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP2_RH-r引物
<400> 34
gcagctgcac ctgcctcctg aacac 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP2_RH-f引物
<400> 35
gtgttcagga ggcaggtgca gctgc 25
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oAscI_SP6-f引物
<400> 36
caggcgcgcc atgaagacct taattc 26
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP6_RH-r引物
<400> 37
gcagctgcac ctggcaatga acag 24
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP6_RH-f引物
<400> 38
ctgttcattg ccaggtgcag ctgc 24
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oAscI_SP7.2-f引物
<400> 39
caggcgcgcc atgcaccggc cagag 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP7.2_RH-r引物
<400> 40
gcagctgcac ctgtgcccag gtggg 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP7.2_RH-f引物
<400> 41
cccacctggg cacaggtgca gctgc 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP2_RL-r引物
<400> 42
acagcacgat ctgcctcctg aacac 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP2_RL-f引物
<400> 43
gtgttcagga ggcagatcgt gctgt 25
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP6-f引物
<400> 44
ttggatccgc caccatgaag accttaatt 29
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP6_RL-r引物
<400> 45
acagcacgat ctggcaatga acag 24
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oSP6_RL-f引物
<400> 46
ctgttcattg ccagatcgtg ctgt 24
<210> 47
<211> 196
<212> DNA
<213> 人LBFL313 cDNA
<220>
<221> CDS
<222> (53)..(196)
<223> 人LBFL313 cDNA
<400> 47
cgcttcttcc ttctggatgg gggcccaggg ggcccaggag agtataaagg cg 52
atg tgg agg gtg ccc ggc aca acc aga cgc cca gtc aca ggc gag agc 100
Met Trp Arg Val Pro Gly Thr Thr Arg Arg Pro Val Thr Gly Glu Ser
1 5 10 15
cct ggg atg cac cgg cca gag gcc atg ctg ctg ctg ctc acg ctt gcc 148
Pro Gly Met His Arg Pro Glu Ala Met Leu Leu Leu Leu Thr Leu Ala
20 25 30
ctc ctg ggg ggc ccc acc tgg gca ggg aag atg tat ggc cct gga gga 196
Leu Leu Gly Gly Pro Thr Trp Ala Gly Lys Met Tyr Gly Pro Gly Gly
35 40 45
<210> 49
<211> 451
<212> PRT
<213> Rx抗体重链a.a.
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450

Claims (18)

1.一种蛋白质分泌因子，其具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的蛋白质分泌因子，其中蛋白质是内在蛋白或外源蛋白。
3.根据权利要求1所述的蛋白质分泌因子，其中蛋白质选自人类生长激素、血清蛋白、抗体、免疫球蛋白、细胞因子、α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素、集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、磷脂酶激活蛋白(PLAP)、胰岛素、肿瘤坏死因子(TNF)、生长因子、激素、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑分泌因子、催乳素、绒毛膜促性腺素、组织型纤溶酶原激活物、生长激素释放肽(GHRP)、胸腺体液因子(THF)、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶、胆红素氧化酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、和葡糖醛酸糖苷酶。
4.一种表达组件，其包含(i)启动子和(ii)编码具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质分泌因子的核酸序列，所述核酸序列与编码靶蛋白的基因连接。
5.一种用于靶蛋白分泌型表达的载体，其包含表达组件，所述表达组件包含编码具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质分泌因子的核酸序列，所述核酸序列与编码靶蛋白的基因连接。
6.根据权利要求5所述的载体，其中蛋白质选自人生长激素、血清蛋白、抗体、免疫球蛋白、细胞因子、α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素、集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、磷脂酶激活蛋白(PLAP)、胰岛素、肿瘤坏死因子(TNF)、生长因子、激素、降钙素、降钙素基因相关肽(CGRP)、脑啡肽、生长调节素、红细胞生成素、下丘脑分泌因子、催乳素、绒毛膜促性腺素、组织型纤溶酶原激活物、生长激素释放肽(GHRP)、胸腺体液因子(THF)、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、过氧化物歧化酶、内毒素酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶、胆红素氧化酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、和葡糖醛酸糖苷酶。
7.根据权利要求5所述的载体，所述载体还包含表达组件，其包含编码具有选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:8的氨基酸序列的蛋白质分泌因子的核酸序列，所述核酸序列与编码靶蛋白的基因连接。
8.根据权利要求5所述的载体，其中载体用于抗体的分泌型表达。
9.根据权利要求8所述的载体，其中载体包含：
a)第一表达组件，其包含编码具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质分泌因子的核酸序列，所述核酸序列与编码抗体轻链的基因连接；
b)第二表达组件，其包含编码具有选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8的氨基酸序列的蛋白质分泌因子的核酸序列，所述核酸序列与抗体重链连接。
10.根据权利要求9所述的载体，其中b)的蛋白质分泌因子具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
11.根据权利要求9所述的载体，其中a)的蛋白质分泌因子具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，b)的蛋白质分泌因子具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
12.根据权利要求9所述的载体，其中抗体轻链具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列，抗体重链具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
13.一种转化细胞，其包含根据权利要求5至12中任一项的载体。
14.根据权利要求13所述的转化细胞，其中细胞是动物细胞。
15.根据权利要求14所述的转化细胞，其中动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
16.一种制备靶蛋白的方法，其包括：
i)培养引入根据权利要求5至12中任一项的载体的转化细胞以表达靶蛋白和将所述靶蛋白分泌到细胞外；
ii)从步骤i)的细胞培养物或细胞培养物上清液中回收靶蛋白。
17.根据权利要求16所述的方法，其还包括纯化所回收的靶蛋白。
18.根据权利要求16所述的方法，其中细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
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