CN1903876B - 一种多肽、编码它的核酸分子及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有SEQ ID No：3所示氨基酸序列中抗原表位的多肽，其选自SEQID NO：3所示氨基酸序列、SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列中第16-32位氨基酸、第1-30位氨基酸、第50-80位氨基酸、第170-200位氨基酸。本发明还涉及具有编码上述多肽的核苷酸序列的核酸分子，包含该核酸分子的重组载体和重组有该核酸分子的宿主细胞。另外，本发明还涉及上述多肽或核酸分子在制备诊断以EECP表达为特征的疾病的试剂、试剂盒或装置中的用途，以及增加或抑制EECP表达和/或活性的物质在制备用于治疗或预防以EECP表达为特征的疾病的药物中的用途。

Description

一种多肽、编码它的核酸分子及用途

技术领域

本发明涉及一种新型多肽，编码它的核酸分子、包含该核酸分子的重组载体和宿主细胞，以及这些多肽和核酸分子的用途。

背景技术

人类细胞和其它真核细胞由生物膜细分为许多功能上不同的区域。每个膜分隔区或细胞器包含细胞器功能必需的不同蛋白质。细胞使用“分选信号”将蛋白质靶向到特殊的细胞内细胞器，所述“分选信号”是位于蛋白质内的氨基酸基序。

一种类型的分选信号，称作信号序列、信号肽或前导序列，将一种类型的蛋白质定向到称为内质网(ER)的细胞器。内质网将膜结合蛋白质与其它类型的蛋白质区别开。一旦定位于内质网，两组蛋白质都可以进一步定向到另一个称为高尔基体的细胞器。此处，高尔基体将蛋白质分配至囊泡，包括分泌囊泡、细胞膜、溶酶体和其它细胞器。

通过信号序列靶向到内质网的蛋白质可以作为分泌型蛋白质被释放到细胞外空间。例如，包含分泌型蛋白质的囊泡可以和细胞膜融合并将它们的内容物释放到细胞外空间——称为胞吐过程。胞吐可以自主地或接受引发信号后发生。后一情况下，蛋白质储存于分泌泡囊(或分泌颗粒)内直到引发胞吐作用。同样地，也可以通过将蛋白质固定在膜上的“接头”的蛋白酶水解切割使存在于细胞膜上的蛋白质分泌到细胞外空间。

前列腺癌是最常见的癌症，是男性癌症死亡的第二主要原因。每年45,000名男性死于该疾病。男性一生中发生侵袭性前列腺癌的机会是6个中有1个。在50岁的时候，男性有大于40％的机率出现前列腺癌和接近3％死于这一疾病的机率。尽管已经在局限性癌症的治疗上取得了一些进展，前列腺癌一旦发生转移仍是不可治愈的。有转移的前列腺癌的患者接受激素剥夺疗法，但只是在短期内有效。最终，这些患者发展为雄激素不应状态导致病情加重和死亡。

前列腺癌治疗中常见和基本的问题是缺少可靠的能够准确地检出早期局部癌症和/或预测癌症易感性和进程的诊断和预测标志物。目前前列腺癌的早期发现和诊断依赖于前列腺特异抗原(PSA)检测、肛门指检(DRE)、经直肠超声(TRUS)和经直肠前列腺穿刺活检(TRNB)。血清PSA检测结合DRE代表了目前最新的检测手段。然而，这些检测手段的有其严重局限性，这促进了为发现更好的前列腺癌诊断标志物的研究。已确定一系列的标志物，但只有PSA在临床上得到广泛使用。然而，理想的前列腺癌标志物很难得到，还没有一个标志物被证明可以可靠的预示病情进展。因此，治疗前列腺癌需要有更可靠和有更多的信息的诊断和预测方法。

另外，由于对复发性或转移性前列腺癌患者缺乏有效的治疗方法，人们对发现可能适合作为治疗靶点的前列腺特异蛋白质有很大兴趣。虽然激素剥夺疗法可以减轻这些患者病情，绝大多数患者还是不可避免的要发展成不可治愈的、雄激素非依赖性的前列腺癌(Lalani et al.，1997，Cancer Metastasis Rev.16：29-66)。

PSA是在前列腺的上皮细胞中合成的33kD糖蛋白。它是一种分泌型的激肽释放酶家族的丝氨酸蛋白酶。PSA的成熟形式以异亮氨酸作为N端，含237个氨基酸残基，分子量为28,400D。

PSA是目前使用最广泛的筛选、诊断和监测前列腺癌的肿瘤标志物。特别是血清PSA的免疫测定在临床上被广泛使用。近来，已经建立了检测血清中PSA mRNA的逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)测定法。然而，PSA不是前列腺癌特异性标志物，BPH和前列腺炎患者可检出高百分比的PSA上升水平(25-86％)(Gao et al.，1997，Prostate 31：264-281)，其它非癌症患者和正常男性也有这种情况，这是明显限制该标志物诊断特异性的因素。例如，BPH患者的血清PSA的上升至4-10ng/ml，并在前列腺炎患者中观察到更高的值，尤其是急性前列腺炎。BPH对男性来说是非常常见的病症。使情况更复杂的是在DRE检查没有任何DRE指征的患者中发现了血清PSA上升，也有正好相反的情况。此外，现在认识到，PSA不仅仅存在于前列腺，并且具有多种复杂的生物活性(例如见Fortier et al.，J.Natl.Cancer Inst.1999，91(19)：1635-40)。

基于PSA的检测实验对前列腺疾病的诊断是有用的，但它们不足以特异性区别良性前列腺增生(BPH)和前列腺癌(PCa)。已采用多种不同的方法改善基于PSA的测定的特异性。例如，最近发现患有前列腺癌的男性血清中无活性并与α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)不结合的PSA(游离PSA)的水平升高与良性前列腺疾病有关。然而，这些方法在区别良性和癌性前列腺疾病时均缺乏重复性。另外，PSA诊断法的敏感度为57-79％(Cupp & Osterling，1993，Mayo Clin Proc 68：297-306)，因此相当数量的患病男性会发生前列腺癌的漏诊。

前列腺特异性膜抗原(PSMA)是最近被描述的前列腺癌细胞表面标志物，已经有不少的研究项目对它作为诊断和治疗标志物进行了评估。PSMA的表达主要限于前列腺组织，但是在脑、唾液腺、小肠和肾细胞癌中也观察到了PSMA mRNA的可检出水平(Israeli et al.，1993，Cancer Res 53：227-230)。PSMA蛋白质在大多数原发和转移的前列腺癌中大量表达，但也在大多数上皮内肿瘤标本中表达(Gao et al.，同上)。使用铟-111标记抗-PSMA的单克隆抗体对复发的前列腺癌成像的初步结果显示了一些希望(Sodee et al.，1996，Clin Nuc Med 21：759-766)。PSMA是需要功能性雄激素受体的激素依赖的抗原。由于并非所有的前列腺癌细胞都表达雄性激素受体，PSMA作为治疗靶点的临床应用受到固有的限制。设计用于检测PSMA免疫疗法有效性的临床试验也在进行中。

前列腺干细胞抗原(VISTA)是另一种最近被描述的前列腺癌细胞表面标志物(Reiter et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：1735-1740)。PSCA表达具有突出的前列腺特异性并在前列腺癌的所有阶段普遍高表达，包括高分化的前列腺上皮内肿瘤(PIN)、雄激素依赖性和雄激素非依赖性的前列腺肿瘤。PSCA基因定位于染色体8q24.2上，在80％以上的前列腺癌中有等位基因扩增区。从PSCA在前列腺癌细胞中具有细胞表面定位、前列腺特异性和表达上调的角度考虑，其显示了作为诊断和治疗靶点的前景。

由于缺乏能重现临床前列腺癌的实验动物模型系统，鉴定特异性标志物的进展放慢。试图解决这个问题的方法包括建立前列腺癌细胞系(Horoszewicz et al.，1983，Cancer Res.43，1809)和前列腺癌异种移植瘤(Pretlow et al.，1991，Cancer Res.51，3814；van Weerden et al.，1996，Am.J.Pathol.149，1055；Klein et al.，1997，NatureMed.3，402)。然而，这些方法只获得有限的成功。例如，异种移植瘤的长期存活率通常较低。另外，大多数广泛使用的人类前列腺癌细胞系-PC-3、DU-145和LNCaP均不能再现前列腺癌典型的成骨细胞损伤。DU-145和PC-3细胞系的更大局限性是这些细胞不表达前列腺特异抗原(PSA)或雄激素受体(AR)(Kaighn et al.，1979，Invest.Urol.17：16-23；Gleave et al.，1992，Cancer Res.52：1598-1605)，由此质疑它们与临床前列腺癌的相关性。LNCaP细胞系是雄激素应答性的，并表达PSA，但含有改变配体特异性的雄激素受体突变。

近来，报道了一系列遗传和表型特征与人临床状况类似的前列腺癌异种移植瘤(源自患者肿瘤)(Klein et al.，1997，Nature Med.3：402)。这些LAPC(洛杉机前列腺癌)异种移植瘤在重度联合免疫缺损(SCID)小鼠中传代存活超过一年。LAPC-4异种移植模型系统具有模仿从雄激素依赖性到雄激素非依赖性的转变和转移性损伤进程的能力(Klein et al.，1997，同上)。雄性小鼠在去势术后LAPC-4肿瘤消失，但是在2-3个月内重新发展成雄激素非依赖性肿瘤。雄激素依赖性(AD)和雄激素非依赖性(AI)LAPC-4异种移植肿瘤都表达相同水平的前列腺特异标志物PSA、PSMA和PSCA(前列腺干细胞抗原)，可对源自LAPC-4异种移植瘤的AD和AI变异株的cDNA进行差异分析来确定。

在最早对由精浆分离的游离PSA的一个研究中，观察到在Arg85、Lys145和Lys182(错误地确认为Lys185)上的内部切割位点(Watt，K.W. K.，et al.，Proc NatlAcad Sci USA，83：3166-3170，1986.)。接下来的研究大多集中在占优势的Lys145的切割位点(存在于30-40％的PSA)。Lys145切割的存在与PSA的失活有关，属于随机生理性切割，有时发生在PSA表达后。还观察到多数情况下被忽视了的Arg85和Lys182上的低水平切割(Zhang，W.M.，et al.，Clin Chem，41：1567-1573，1995)。

已从BPH组织结节上分离PSA，以确定其PSA的形式是否与精浆PSA有所不同。BPH结节包含基质成分的混合物和紧密包裹的上皮导管细胞，通过肉眼检查或低倍显微镜观察染色的前列腺组织切片可以看到。BPH结节的发展和前列腺体积的增大密切相关。伴随结节的发展的生物化学改变在前列腺膨大以及与BPH相关的临床症状中可能起作用。已发现BPH结节的PSA的Ile1、His54、Phe57和Lys146等位点的内部切割的百分比较精浆PSA的高。因此认为这些切割是造成精浆PSA比BPH结节中PSA酶活性低的原因(Price，H.，et al.，Hum Pathol，21：578-585，1990.)。

发明内容

本发明的一方面涉及一种多肽，其含有SEQ ID No：3所示氨基酸序列中的抗原表位，优选选自SEQ ID NO：3所示氨基酸序列、SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列中第16-32位氨基酸、第1-30位氨基酸、第50-80位氨基酸、第170-200位氨基酸。

本发明的另一方面涉及一种核酸分子，其具有编码权利要求1或2所述多肽的核苷酸序列，优选选自SEQ ID NO：1所示核苷酸序列、SEQ ID NO：1中第2-768位核苷酸、第18-644位核苷酸、第1-107位核苷酸、第54-107位核苷酸、第18-54位核苷酸。优选的是，本发明的核酸分子是DNA。

本发明的又一方面涉及一种重组载体，其包含上述的核酸分子。优选的是，所述核酸分子与启动子可操作连接。

本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其包含权利要求3-5中任意一项所述的核酸分子。

本发明还涉及上述多肽或核酸分子在制备诊断以EECP表达为特征的疾病的试剂、试剂盒或装置中的用途。所述疾病选自前列腺癌、乳腺癌、胃癌和结直肠癌。所述诊断以EECP表达为特征的疾病的试剂是上述多肽的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还涉及增加或抑制EECP表达和/或活性的物质在制备用于治疗或预防以EECP表达为特征的疾病的药物中的用途。所述以EECP表达为特征的疾病选自前列腺癌、乳腺癌、胃癌和结直肠癌。增加或抑制EECP表达/或活性的物质选自正义EECP cDNA序列、全长或部分EECP、特异性降解EECP的蛋白酶、与EECP特异性结合的抗体、抑制EECP表达的反义寡核苷酸、抑制EECP表达的核酶或直接特异性抑制EECP表达的siRNA。在本发明的一个优选实施方案中，增加或抑制EECP表达和/或活性的物质与放射治疗、化疗、激素或生物抗癌药联用。

本发明涉及来源于或基于新发现的基因EECP的诊断和治疗前列腺癌和乳腺癌的方法和组合，并在此广泛描述。本发明提供了包括完整的EECP基因编码序列的全长cDNA(图1)。此cDNA编码的蛋白质，与最近公布的HRPE773(Hilary F.Clarket al.，2003，Genome Research 13：2265-2270)基因相关，但结构显著不同。EECP基因的表达模式也与HRPE773极不相同。

另一方面，本发明提供EECP多肽，可以是全长EECP蛋白或其中的片段或它的类似物或同系物。

更具体地，本发明提供EECP基因全长或其部分序列及其互补链序列、以及mRNA和编码序列的多核苷酸，包括编码EECP蛋白及其片段的多核苷酸、DNA、RNA、DNA/RNA杂合物和相关的分子，与EECP基因或mRNA序列或其一部分互补的多核苷酸或寡核苷酸，以及与EECP基因、mRNA或编码EECP的多核苷酸杂交的多核苷酸或寡核苷酸。也提供分离cDNA和编码EECP的基因的方法。还提供包含EECP多核苷酸的重组DNA分子、转化或转导有这些分子的细胞和用于EECP基因产物表达的宿主载体系统。本发明进一步提供EECP蛋白和其多肽片段。

本发明提供在各种生物样品中检测EECP多核苷酸和蛋白质存在的方法，和鉴定表达EECP的细胞的方法。本发明还提供检测生物样品的预测和诊断方法，通过比较EECP在生物样品及其相应的正常样品中的状况证明特定患者的癌症的发生，其中EECP在生物样品中的状况变化与所述的特定患者的癌症发生相关。本发明进一步提供诊断前列腺癌和乳腺癌的各种诊断组合和策略。

本发明还提供治疗前列腺癌和乳腺癌的各种治疗组合和策略，具体包括：EECP多肽和EECP抗体治疗方法和组合、癌症疫苗和小分子治疗。

本发明提供结合EECP蛋白和其多肽片段的抗体，包括多克隆和单克隆抗体、小鼠的和其他哺乳动物抗体、嵌合抗体、人源化的和全人抗体以及带有可检测标志物或毒素或治疗组合物标记的抗体。这些和其它EECP抗体可用于分子诊断测试法和诊断成像方法中，以对前列腺癌和乳腺癌及其转移进行检测、定位和定性。

附图说明

图1.EECP的cDNA全长(SEQ ID NO：1)和其部分(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列。核苷酸包含编码EECP蛋白的EECP基因的编码区(全长或部分)。

图2.由其cDNA序列(SEQ ID NO：1)推断出的EECP蛋白的氨基酸(SEQ IDNO：3)序列。由其cDNA序列(SEQ ID NO：2)推断出的部分EECP蛋白的氨基酸(SEQID NO：4)序列。

图3A-B.图3A是EECP cDNA和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列。图3B是EECP读码框结构图示。

图4.HRPE773(SEQ ID NO：5)的cDNA序列和由此编码的蛋白质序列(SEQ IDNO：6)。近来公布的HRPE773(Hilary F.Clark et al.，2003，Genome Research 13：2265-2270)是EECP蛋白的相关蛋白质，但是结构上与之截然不同。

图5.该基因的翻译产物与以前公布的序列具有序列同源性。比对EECP和以前发表的HRPE773的序列(Hilary F.Clark et al.，2003，Genome Research 13：2265-2270)与发表的“类似普通唾液蛋白质1”的序列(LOC124220)(Strausberg R.L.，et al.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)，16899-16903)的氨基酸序列。氨基酸数目的差别用绿色(HRPE773和“类似普通唾液蛋白质1”之间)和红色(EECP和HRPE773之间)条表示。还标出了构成三种蛋白质的氨基酸数目的差别。还标注了三种蛋白质的预期分子量的大小。三种基因都定位于16号染色体上。

图6.抗EECP的单克隆抗体的鉴定。用纯化的GST-EECP融合蛋白产生抗EECP的单克隆抗体。通过Western印迹法筛选单克隆抗体，其针对用含编码EECP-Flag的pSG5载体转染的Du145细胞的细胞裂解液、转染细胞的培养上清液和人血浆。(A)用特异性识别EECP中第56-70位氨基酸的抗体(10F6)进行Western印迹，泳道1：pSG5-Flag转染细胞(作为对照)的裂解物；泳道2：pSG5/EECP-Flag转染细胞的裂解物；泳道3：pSG5-Flag转染细胞(作为对照)的上清液，泳道4：pSG5/EECP-Flag转染细胞的上清液；泳道5：肿瘤患者的血浆，泳道6：正常人体血浆。(B)用特异性识别EECP 19-32之间氨基酸的抗体(5D5)进行Western印迹，泳道1：pSG5-Flag转染细胞(作为对照)的上清液；泳道2：pSG5/EECP-Flag转染细胞的上清液；泳道3～4：培养细胞上清液中内源性分泌物：未转染的LNCap培养6个小时和24个小时至80％汇合时收集的细胞培养上清。分子量标准在一侧以千道尔顿(KD)显示。

图7.EECP的免疫细胞化学。22RV1细胞系在常规培养条件(10％FCS，未添加雄激素或其它相关产物)。(a)用10F6为一抗识别EECP，二抗为Cy3标记的山羊抗小鼠抗体。(b)用FITC标记的麦胚凝集素识别高尔基体。(c)合并图片显示EECP和高尔基体的重叠定位。(d)DAPI染色显现细胞核。

图8.用抗EECP单克隆抗体进行正常和前列腺癌组织切片的免疫组织化学分析。样品包括：(正常)用10F6染色的正常前列腺组织；(PCa)用10F6染色的前列腺癌组织。所有图片放大倍数为400倍。例如EECP染色定位显示其在正常前列腺和前列腺癌中的聚集情况明显不同：EECP主要在前列腺正常腺泡的基底层细胞表达；而在癌变前列腺组织中有蛋白质的不均一表达。此外，癌变细胞的EECP表达水平比正常基底层细胞低。该发现也为利用EECP作为诊断和治疗前列腺癌的靶点提供了确切证据。

图9.对前列腺组织裂解物和后尿道分泌物的Western印迹分析。(A)后尿道分泌物中的EECP去糖基化。应用镍-琼脂糖纯化后尿道分泌物中的EECP(来自正常男性自愿者)。随后利用N-糖苷酶F对EECP蛋白去糖基化。用抗EECP抗体10F6进行Western印迹法分析未处理的EECP(泳道1)和去糖基化的蛋白质(泳道2)。分子量标准在一侧以千道尔顿(KD)显示。(B)6例接受前列腺切除术的不同病例的癌变和正常前列腺组织裂解物。组织的“正常”和“PCa”部分首先通过在冷冻组织块上的冰冻切片进行组织学的诊断。随后以冰冻形式进行显微解剖。组织学家用显微镜分析的方式检查显微解剖的过程(从开始到结束的切割)。裂解物用10％和12％的SDS-PAGE分析，所用抗体针对：“动力蛋白”，为上样对照；“K5”，角朊细胞定量对照；和10F6，针对EECP。“正常”组织内的EECP表达以绿色箭头标记。肿瘤组织内的表达缺失以红色方块指出。

图10.人血浆的Western印迹分析。根据厂商的使用说明书用SIGMA和VIVAscience的白蛋白去除试剂盒处理人血浆样品。用12％的SDS-PAGE分析已去除白蛋白的血浆。加入1微升的患者血浆。加样量的均一性以转移的硝酸纤维素膜的丽春红染色校对。膜检测用抗EECP(10F6)的抗体。箭头指示25kD的全长EECP蛋白。结果显示，95％的前列腺癌患者的血浆样本中的EECP表达缺失，这为利用EECP作为诊断和治疗前列腺癌的靶点提供了确切的证据。此外，在某些通常只接受非侵入性治疗的前列腺癌转移病例中存在蛋白质的部分表达，表明EECP可作为预后标志物和治疗效果判断的标志物。其它的重要之处是：女性的EECP表达水平只是正常男性水平的一小部分，强烈提示循环中的EECP主要与男性生殖器官的EECP的内源性分泌物有关。

图11.用抗EECP单克隆抗体进行的正常和癌变乳腺样品的免疫组织化学分析。样品包括：(正常)用10F6染色的正常乳腺组织；(肿瘤)用10F6染色的乳腺癌的配对邻近组织。所有图片放大400倍。例如EECP染色定位显示其在正常乳腺和乳腺癌中的聚集情况明显不同：EECP只在正常乳腺的分泌细胞和导管细胞中广泛表达。清楚的显示了进入导管的EECP分泌物。但是与前列腺癌的不同的是，蛋白质在癌变乳腺组织内高度表达，通常失去正常的组织结构，说明大量EECP通过乳腺癌组织中损伤的基底膜释放到循环系统。该发现也为利用EECP作为诊断和治疗乳腺癌的靶点提供了确切证据。

图12.人血浆的Western印迹分析。根据厂商的使用说明书使用SIGMA和VIVAscience的白蛋白去除试剂盒处理人类血浆样品。用12％的SDS-PAGE分析已去除白蛋白的血浆。加入1微升的患者的血浆。加样量的均一性以转移的硝酸纤维素膜的丽春红染色校对。使用抗EECP抗体(10F6)。箭头指示25kD的全长EECP蛋白。结果显示乳腺癌和转移患者的血浆样品中EECP表达水平增加，这为利用EECP作为诊断和治疗乳腺癌的靶点提供了确切证据。重要的是，在乳腺“正常”和“肿瘤”之间的表达-差异-模式不同于前列腺的。事实上，正好相反。乳腺癌情况下，EECP循环水平高于正常情况。

图13.转染的和内源的EECP表达的Western印迹分析：EECP蛋白在细胞系中以全长和部分蛋白水解的形式表达。转染EECP的实验：用具有编码EECP-Flag的插入物的pSG5载体转染Du145细胞，收集细胞裂解液和转染细胞的培养上清液进行12％的SDS-PAGE凝胶，并用10F6抗体检测。收集的细胞裂解液包括用EECP(泳道“EECP”)或pSG5-Flag(作为对照，泳道“载体”)转染的Du145细胞。(10％FCS培养基组)包括用EECP(泳道“EECP”)或pSG5-Flag(作为对照，泳道“载体”)转染的那些Du145细胞的培养上清液。由于加入相同比例的“细胞裂解液”和“培养基”样品，很明显细胞产生的EECP的大部分都分泌至它们的生长环境中。在内源性的EECP分析中，前列腺癌(22RV1)和乳腺癌(T47D)细胞系选择在2％FCS的培养基内生长。在同样凝胶上分析培养细胞的上清液中内源性EECP的分泌。细胞培养6小时和24小时后至80％汇合时收集培养上清液。分子量标准在一侧以千道尔顿(KD)显示。值得注意的是，在22RV1细胞系的分泌物中由抗体检测出蛋白质变短的形式，其大小明显小于全长的EECP并在22kD左右。它可能是全长EECP的剪切变体或EECP的全长蛋白质的蛋白水解形式。

图14.转染的和内源的EECP表达以及人血浆内的EECP表达的Western印迹分析。对于转染的EECP实验，用具有编码EECP-Flag的插入物的pSG5载体转染Du145细胞，只收集这些转染细胞的培养上清液进行12％的SDS-PAGE凝胶，检测用的抗体为10F6抗体。(10％FCS培养基)来自用EECP(泳道“EECP”)或pSG5-Flag(作为对照，泳道“载体”)转染的Du145细胞的培养上清液。对于内源的EECP分析，另一种前列腺癌细胞系(LNCap)选择在2％FCS的培养基中生长。在同样凝胶上分析培养细胞的上清液中内源性EECP的分泌。细胞在培养6小时和24小时后达80％汇合时收集培养基。分子量标准在一侧以千道尔顿(KD)显示。值得注意的是，和22RV1一样，在LNCap细胞系的分泌物中也存在由抗体检测的蛋白质的相同变短形式，所述抗体的大小明显低于全长的EECP并在22kD左右。更重要的是，在人血浆中检测到的表达的EECP(未作白蛋白去除处理)与转染的或内源的体外培养细胞分泌的EECP具有25kD的同样大小。

图15.体外培养细胞分泌的内源性EECP(0％FCS)的Western印迹分析：EECP进行蛋白水解或用蛋白酶降解。在无血清培养条件(0％FCS，不加入雄激素或其它相关产物)下培养22RV1细胞系至80％汇合。在这种条件下，对蛋白酶敏感的蛋白质缺乏来自血清的非特异性保护。(泳道1)用于培养22RV1细胞的培养基(0％FCS)。(泳道2)培养22RV1的条件培养基。(泳道3-5)加入不同剂量的蛋白酶抑制剂培养22RV1细胞的条件培养基。该结果为蛋白质EECP是蛋白水解切割的或由蛋白酶降解提供了确切的证据。

具体实施方式

除非另外定义，所有技术的术语、标注和在此使用的科学术语，其含义都是被本领域的技术人员所公认的和普遍采用的。本领域的技术人员通常非常了解在此描述或引用的技术和步骤并普遍使用传统方法，例如，在Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.中描述的广泛地利用的分子克隆方法。适当的，除非另外指明，涉及使用商业上可得到的试剂盒和试剂的步骤通常按照制造者定义的方案和/或参数进行。

如此处所用，术语“多核苷酸”表示长度至少在10个碱基或碱基对的核苷酸的聚合形式，无论核糖核苷酸或脱氧核苷酸或者任一类型的核苷酸的修饰形式，均表示包括DNA的单链和双链形式。

如此处所用，术语“多肽”表示至少6个氨基酸的聚合物。整个说明书中使用标准的三个字母或单个字母符号表示氨基酸。例如在此上下文中，“EECP多肽”例如包括具有如图2(SEQ ID NO 3)和图3所示的208个氨基酸序列的蛋白质，以及例如图2(SEQ ID NO 4)所示的约30个氨基酸的结构域。

在氨基酸序列比较时，术语“一致性”用来表达在相同的相对位置的氨基酸残基的百分比是相同的。也在此文中，术语“同源性”用来表达在相同的相对位置的氨基酸残基的百分比是同一的或是相似的，如通常在技术上理解的使用BLAST分析的保守氨基酸的标准。例如，一致性％值可以通过WU-BLAST-2(Altschul et al.，1996，Methods in Enzymology 266：460-480；http://blast.wustl/edu/blast/README.html)产生。下面提供了在此标准下被认为保守的关于氨基酸替换的进一步细节。

下面分段提供了其它的定义。

本发明涉及诊断和治疗某些癌症的方法和组合，其使用分离的对应EECP基因的多核苷酸，由EECP基因及其片段编码的蛋白质和能够特异性地识别并结合EECP蛋白的抗体。在整个申请中，代表性的描述了用于前列腺癌和乳腺癌的诊断和治疗方法和组合。

新发现基因EECP的核苷酸和推导出的氨基酸序列如图1和2所示。EECP基因编码一种预测为208个氨基酸的蛋白质，含有多个结构域，包括的已经描述为HRPE773(Hilary F.Clark et al.，2003，Genome Research 13：2265-2270)的结构域(从它的第31位氨基酸至第208位氨基酸)，如图4和图5所示。同时，编码208个氨基酸的EECP基因也包含已经描述为“类似普通唾液蛋白质1”(Strausberg R.L.et al.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)，16899-16903)描述的结构域(从它的第37位氨基酸至第208位氨基酸)的结构域，如图5所示。HRPE773和“类似普通唾液蛋白质1”也定位于16号染色体上，和EECP所处的染色体相同。

申请者已经克隆了包含EECP基因的整个编码区域的全长cDNA，但是与已公布的HRPE773序列比较，它包含了额外的90多核苷酸的结构域序列。这个90多核苷酸序列不存在于HRPE773的cDNA序列中。该差异的特殊性质和重要性在图5、8、9、10、11、13和14中显示。因此，具有Hilary F.Clark et al.描述的序列的蛋白质可能具有与本专利描述的蛋白质明显不同的功能活性。此外，已知该基因有一定的变异性并且此变异性能影响包括与癌变相关的细胞生理学的各个方面(例如见Rebbeck et al.，J.Natl.Cancer Inst.90(16)：1225-1229(1998)和Tonin et al.，Semin.Surg.Oncol.18(4)：281-286(2000))。另外，与前面已知的HRPE773和“类似普通唾液蛋白质1”的表达模式比较，本申请人新发现的EECP具有完全不同的表达模式。

EECP主要表达于正常前列腺腺泡的基底细胞。但在癌变的腺泡中其表达水平显著地减少，且表达水平不均一。在乳腺中，EECP不仅在正常的分泌物和导管细胞中表达，而且在癌变细胞中以相同的或更高的水平表达。

很久以来就知道前列腺及其分泌物含有多种有效的蛋白水解活性(Mann andLutwak-Mann，1981)。假定分泌入精液的蛋白酶降解精液的蛋白质，尤其对人类的精液凝结物产生液化作用，并可能与精子互相影响以修饰它们的细胞表面和影响它们的受精能力。已经证实在人前列腺癌中不同类型的蛋白酶水平显著增加，例如组织蛋白酶B、IV型胶原蛋白酶、基质裂解素、基质金属蛋白酶、胶原酶和基质溶素。此外，在正常情况下基底膜将腺腔内分泌物和上皮细胞来源的蛋白酶与基质分隔开，由于基底膜的损伤，大量不同类型的蛋白酶进入前列腺癌患者的循环系统，例如PSA的情况下(综述Michael J.Wilson，Microscopy Res.And Technique，1995，30：305-318)。由于发明人已经示出，EECP在正常人类前列腺基底上皮细胞中高度表达和在分泌细胞中较低程度的表达，并且在后尿道分泌物中也发现EECP。有理由预测EECP可以由前列腺分泌的蛋白酶降解。并且如图15所示，发明人也在体外实验中证实了这个预测。

通过差异显示，在一系列前列腺癌的显微解剖所获得的肿瘤活检标本与正常的、组织学上相关的前列腺组织的转录组水平的比较过程中分离了部分EECP序列。分离差异带并克隆到pGEMt-easy载体上，通过Reverse Northern杂交鉴定含产生原始差异显示谱的片段(未显示)的克隆。使用BLAST搜索算法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对克隆的序列分析显示它由对应于人的16号染色体，粘粒克隆352F10(LANL)(AC005361)上序列的500bp片段组成。为了开始分析这个新发现的基因，采用5′/3′RACE PCR方法从正常前列腺文库(Clontech)扩增和克隆了新发现的基因的全长cDNA。全长cDNA由四个外显子组成并定位于染色体16p12.3(图3)。

表达分析显示，所有受试的“正常”和“良性前列腺增生”患者的血浆中的全长EECP呈高水平表达，但是这种表达在95％以上的“前列腺癌”和“转移”病例中(图10)则没有。在前列腺的裂解物中存在大致相同的模式(图9B)。此外，免疫组织化学分析也发现许多前列腺癌样品中EECP表达呈较低水平(图8)。更重要的是，正常女性的EECP表达水平显著地低于正常男性(图10)。这强烈提示男性生殖器官的内源性分泌物是循环EECP水平的主要来源。而且，表1显示在“BPH”和“PCa”之间，PSA水平以及不同类型PSA之间的比率没有明显差别。这些结果显示EECP基因是可能参与前列腺癌发生和/或进程的主要的前列腺特异性基因。此外，与“正常”比较，许多乳腺癌和转移患者的血浆中通过Western印迹检测到EECP的较高水平表达(图12)；免疫组织化学分析也在许多乳腺癌样品发现较高水平的EECP表达(图11)。在此公开的这些数据显示EECP是分泌型分子，在循环系统中的水平与前列腺和乳腺的癌变程度高度相关。从而，该数据证明前列腺癌或乳腺癌患者的循环系统中EECP的表达水平能提供检测、诊断、预测和/或治疗上述患者癌症的分子基础，前列腺癌患者血浆(血清)中EECP表达缺失或显著降低，而乳腺癌患者血浆(血清)中的EECP显著升高。

表1.在图10中示出并检测的患者血浆样品中PSA表达的相关数据。

分组	年龄	性别	游离PSA(％)	PSA	cPSA	血浆	肿瘤分期	Gleason评分
									n1	42	男		0.55	0.3	正常人
n2	43	男		0.6	0.39	正常人
									n3	41	男		1.15	0.96	正常人
n4	51	男	23.9	1.55	1.35	正常人
									n5	41	男		0.45	0.35	正常人
n6	42	男		1.13	0.96	正常人
									n7	54	男		0.82	0.73	正常人
n8	47	男		0.5	0.29	正常人
									n9	47	男		0.67	0.34	正常人
n10	47	男		0.24	0.13	正常人
									n11	50	男		0.86	0.81	正常人

分组	年龄	性别	游离PSA(％)	PSA	cPSA	血浆	肿瘤分期	Gleason评分
									n12	49	男		0.65	0.53	正常人
n13	51	男		0.32	0.2	正常人
									n14	45	男		0.92	0.72	正常人
n15	41	男		0.72	0.71	正常人
									n16	61	男		0.41	0.21	正常人
									b1	51	男	12	3	2.84	良性前列腺增生患者
b2	57	男	12.2	2.7	3.21	良性前列腺增生患者
									b3	49	男	10.1	4.52	3.17	良性前列腺增生患者
b4	62	男	17.4	7.94	6.76	良性前列腺增生患者
									b5	49	男	10.2	4.63	4.35	良性前列腺增生患者
b6	57	男		2.81	2.53	良性前列腺增生患者
									b7	66	男	14.9	3.36	2.13	良性前列腺增生患者
b8	49	男	16.4	5.74	4.26	良性前列腺增生患者
									b9	64	男	14.1	8.44	5.92	良性前列腺增生患者
b10	68	男	13.2	5.62	4.43	良性前列腺增生患者
									b11	53	男	11.5	4.36	3.87	良性前列腺增生患者
b12	59	男	12.6	1.75	1.53	良性前列腺增生患者
									b13	63	男	11.6	3.45	3.15	良性前列腺增生患者
b14	64	男	16.3	10.1	7.83	良性前列腺增生患者
									b15	46	男	7.5	4.29	3.87	良性前列腺增生患者
b16	44	男	15.9	2.07	1.77	良性前列腺增生患者
									b17	59	男	13	2.16	1.86	良性前列腺增生患者
b18	58	男	10.2	2.05	1.84	良性前列腺增生患者
c1	40	男	9.1	1.59	1.28	前列腺癌患者	2c	6
									c2	74	男		444	239.8	前列腺癌患者		8
c3	71	男	11.5	8.73	7.27	前列腺癌患者		7
									c4	67	男	8.2	4.74	4.51	前列腺癌患者		6
c5	58	男		47.6	41.95	前列腺癌患者		8
									c6	54	男	7.5	3.88	3.4	前列腺癌患者		6

分组	年龄	性别	游离PSA(％)	PSA	cPSA	血浆	肿瘤分期	Gleason评分
									c7	73	男	12.2	5.82	4.76	前列腺癌患者		7
c8	59	男	9.7	2.16	1.84	前列腺癌患者	2c	7
									c9	63	男	20.1	7.68	5.71	前列腺癌患者		7
c10	69	男	5.9	9.93	9.17	前列腺癌患者		6
									c11	67	男	16.2	11.7	9.66	前列腺癌患者	3a	7
c12	54	男	17.4	1.78	1.34	前列腺癌患者	2c	7
									c13	42	男	11.3	1.86	1.43	前列腺癌患者	2a	6
c14	80	男	14.1	6.71	5.66	前列腺癌患者		6
									c15	60	男	15.6	4.61	3.98	前列腺癌患者		6
c16	63	男	19.1	4.51	4.19	前列腺癌患者		7

c17	62	男	28.7	4.98	3.71	前列腺癌患者	2c	6
									c18	71	男	24.1	13.2	11.47	前列腺癌患者		5
c19	79	男	15.2	11.4	10.43	前列腺癌患者		8
									c20	76	男	10.7	4.91	4.54	前列腺癌患者		6
									m1	69	男		＞50		前列腺癌转移患者
m2	86	男		＞50		前列腺癌转移患者
									m3	60	男		＞50		前列腺癌转移患者
m4	67	男		＞50		前列腺癌转移患者
									m5	72	男		2000		前列腺癌转移患者
m6	75	男		1875		前列腺癌转移患者
									m7	70	男		216		前列腺癌转移患者
m8	61	男		500		前列腺癌转移患者
									m9	63	男		104	51.35	前列腺癌转移患者
m10	56	男		2853	2712	前列腺癌转移患者
									m11	52	男		8076	5488	前列腺癌转移患者
m12	75	男		96.9	33.93	前列腺癌转移患者
									m13	80	男		1570	1433	前列腺癌转移患者

c17	62	男	28.7	4.98	3.71	前列腺癌患者	2c	6
									m14	71	男		1363	1133	前列腺癌转移患者
m15	62	男		229	162.2	前列腺癌转移患者
									m16	83	男		320	238.9	前列腺癌转移患者
m17	71	男		1513	1467	前列腺癌转移患者
f1	16	女
									f2	58	女
f3	46	女
									f4	54	女
f5	28	女
									f6	58	女
f7	46	女
									f8	22	女
f9	63	女
									f10	14	女
f11	49	女
									f12	38	女

因此，本发明提供独特的和有用的EECP基因(和蛋白质)，其具有图1、2和3所示的核苷酸和所编码的氨基酸序列。本发明提供在此公开的与全部或部分EECPcDNA序列对应的核苷酸探针，其可以用来分离或鉴定其它编码全部或部分EECP基因序列的cDNA。本发明更进一步提供了能够特异性扩增EECP基因或它的RNA转录本的引物。本发明更进一步提供已分离的含EECP基因产物的编码序列的多核苷酸。此多核苷酸可用于表达具有许多用途的EECP编码蛋白质和肽。EECP基因探针和引物也可以用于检测各种生物样品中EECP mRNA的存在与否，用于检测前列腺癌细胞和其它细胞中EECP的表达或缺乏，用于制备癌症疫苗，用于前列腺癌和乳腺癌的分子诊断和预后判断。EECP基因序列或其互补序列的多核苷酸可以在治疗前列腺癌和/或乳腺癌和前列腺癌和乳腺癌的转移中有用，例如，在调整EECP量和/或生物活性方面。

更具体而言，在本发明的实践中有用的EECP多核苷酸可以包含具有如图1所示的人EECP的核苷酸序列的多核苷酸(SEQ ID NO：1)或任何前述的多核苷酸片段。另一个实施方案包含图1所示编码EECP蛋白的前30个氨基酸的多核苷酸(SEQ IDNO：2)，及其互补序列或其多核苷酸片段。另一个实施方案包含能够在严格杂交条件下与如图1所示的EECP cDNA(SEQ ID NO：1)或其多核苷酸片段杂交的多核苷酸。

EECP多核苷酸的典型实施方案是具有图1所示序列(SEQ ID NO：1)的EECP多核苷酸。EECP多核苷酸可以包含具有图1所示人EECP的核苷酸序列的多核苷酸，其中T也可以是U；编码全部或部分EECP蛋白的多核苷酸；与前述互补的序列；或任何前述的多核苷酸片段。另一个实施方案包含图1所示序列的多核苷酸，从第18核苷酸残基到第644核苷酸残基，其中T也可以是U。

在此公开的本发明的典型实施方案包括含EECP mRNA序列特定部分的EECP多核苷酸(和那些与此序列互补的)，例如那些编码蛋白质和其片段的EECP多核苷酸。举例来说，在此公开的本发明的代表性实施方案包含：如图1和3所示编码EECP蛋白的大约氨基酸1到大约氨基酸10的多核苷酸，如图1和3所示编码EECP蛋白的大约氨基酸10到大约氨基酸20的多核苷酸，如图1和3所示编码EECP蛋白的大约氨基酸20到大约氨基酸30的多核苷酸，如图1和3所示编码EECP蛋白的大约氨基酸30到大约氨基酸40的多核苷酸，如图1和3所示编码EECP蛋白的大约氨基酸40到大约氨基酸50的多核苷酸，如图1和3所示编码EECP蛋白的大约氨基酸50到大约氨基酸60的多核苷酸，如图1和3所示编码EECP蛋白的大约氨基酸60到大约氨基酸70的多核苷酸，如图1和3所示编码EECP蛋白的大约氨基酸70到大约氨基酸80的多核苷酸，如图1和3所示编码EECP蛋白的大约氨基酸80到大约氨基酸90的多核苷酸，如图1和3所示编码EECP蛋白的大约氨基酸90到大约氨基酸100的多核苷酸等等。依据此图解，编码EECP蛋白的氨基酸100-208的氨基酸序列部分的多核苷酸是本发明的典型实施方案。也包括编码EECP蛋白的较大部分的多核苷酸。例如，如图1和3所示编码EECP蛋白的大约氨基酸1(或20或30或40等)到大约氨基酸20(或30或40或50等)的多核苷酸可以由公知的多种技术生成。

EECP多核苷酸的其他说明性实施方案包括由具有图1所示序列的下述多核苷酸组成的实施方案：从大约核苷酸1到大约核苷酸残基107、从大约核苷酸残基110到大约核苷酸330、从大约核苷酸330到大约核苷酸530、从大约核苷酸530号到大约核苷酸640、从大约核苷酸640到大约核苷酸768。在此公开的本发明的其他说明性实施方案包括编码EECP蛋白序列中的含一个或多个生物基序的EECP多核苷酸片段，并在下面讨论。

包含在本发明中的这些EECP多核苷酸是基因组DNA、cDNA、核糖酶和反义分子，还有基于替代性主链或包括替代性碱基的核酸分子，天然来源的或合成的。例如，反义分子可以是RNA或其它分子，包括肽核酸(PNA)或非核酸分子如硫代磷酸酯衍生物，其以碱基对依赖方式特异性结合DNA或RNA。熟练技术人员使用EECP多核苷酸和在此公开的多核苷酸序列能轻易获得这类核酸分子。例如，反义技术需要使用能与定位于细胞内的多核苷酸靶序列结合的外源寡核苷酸。术语“反义”指寡核苷酸是能与细胞内靶序列如EECP互补。例如见Jack Cohen，1988，OLIGODEOXYNUCLEOTIDES，Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRCPress；and Synthesis 1：1-5(1988)。本发明的EECP反义寡核苷酸例如诸如S-寡核苷酸的衍生物(硫代磷酸酯衍生物或S-oligos，见Jack Cohen，同上)，其显示增强的癌细胞生长抑制作用。S-oligos(硫代磷酸核苷酸酯)是寡核苷酸(O-oligos)的等电子类似物，其中磷酸基团的非桥氧原子由硫原子代替。本发明的S-oligos可通过使用硫代修饰剂3H-1，2-苯并二硫代-3-酮-1，1-二氧化物(3H-1，2-benzodithiol-3-one-1，1-dioxide)处理相应的O-oligos来制备。见Iyer，R.P.et al，1990，J.Org.Chem 55：4693-4698和Iyer，R.P.et al.，1990，J.Am.Chem.Soc.112：1253-1254，此处引用其完全公开的内容。

本发明的这方面的特定实施方案包含特异扩增EECP多核苷酸或者其中任何的特定部分的引物和引物对，选择性地或特异性地与EECP核酸分子或其中任何部分杂交的探针。探针可以用可检出的标志物标记，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。这样的探针和引物可用来检测样品中EECP多核苷酸的存在和用作检测表达EECP蛋白的细胞的工具。该探针的实例是包含如图1所示的人EECP cDNA序列(SEQ ID NO：1和2)的全部或部分的多核苷酸。能够特异性扩增EECP mRNA的引物对的实例也将在后面的实施例中描述。熟练技术人员能理解，很多不同的引物和探针可以基于在此提供的序列制备并有效地用于扩增、克隆和/或检测EECP mRNA。

本发明的EECP多核苷酸可用于达到多种目的，包括但不限于用作扩增和/或检测EECP基因、mRNA或其片段的探针和引物；用作前列腺癌和结肠癌诊断和/或预后判断的试剂；用作能够指导EECP多肽表达的编码序列；用作调节或抑制EECP基因的表达和/或EECP转录本的翻译的工具，以及作为治疗药。

本发明也提供例如可用于产生针对EECP各部分如膜结合片段和分泌型片段的抗体的EECP蛋白和多肽。在图2所示的多肽序列(SEQ ID NO：3和4)中，可用来产生针对EECP蛋白的任何部分的抗体的多肽例如包括：含图2所示EECP序列中至少6个氨基酸的多肽。

可用在本发明的实践中的多肽(例如作为免疫原或侵袭的调节剂)典型地由下列多肽组成：包含图2所示EECP序列的至少6个氨基酸的多肽，包括第11位的赖氨酸；包含图2所示EECP序列的至少6个氨基酸的多肽，包括第24位的缬氨酸；包含图2所示EECP序列的至少6个氨基酸的多肽，包括第68位的谷氨酸；包含图2所示EECP序列的至少6个氨基酸的多肽，包括第119位的异亮氨酸；包含图2所示EECP序列的至少6个氨基酸的多肽，包括第150位的甘氨酸；包含图2所示EECP序列的至少6个氨基酸的多肽，包括第183位的色氨酸。任选的是，这些说明性的多肽实施方案包括图2所示的任何一个其它氨基酸，例如第1位的蛋氨酸。

在此公开的本发明的实施方案包括EECP蛋白的各种变异体，例如具有氨基酸插入、删除和替换的多肽。EECP变异体可以使用本领域技术人员公知的方法制造，例如定点突变、丙氨酸扫描和PCR突变。定点突变(Carter et al.，1986，Nucl.Acids Res.13：4331；Zoller et al.，1987，Nucl.Acids Res.10：6487)、盒式突变(Wells et al.，1985，Gene 34：315)、限制选择突变(Wells et al.，1986，Philos.Trans.R.Soc.London Ser.A，317：415)或其它已知技术可在克隆的DNA上进行以产生EECP变体DNA。扫描氨基酸分析也可用于鉴定连续序列中一个或多个氨基酸。在优先扫描的氨基酸之中是相对小、中性的氨基酸。这样的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸是典型的在这一组中优先扫描的氨基酸，因为它去除了超过β碳原子的侧链，同时不大可能改变变体的主链的构象。优选丙氨酸也因为它是最常见的氨基酸。更进一步，经常发现丙氨酸通常在隐藏和暴露的位置(Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，1976，J.Mol.Biol.，150：1)。如果丙氨酸替换不产生适当量的变体，则可以用isosteric氨基酸。

如上面论述的，所要求的发明的实施方案包括含有图2所示的EECP蛋白的少于208氨基酸序列的多肽(和编码此多肽的多核苷酸)。例如在此公开的本发明的典型实施方案包括下列多肽：由图2所示EECP蛋白的大约氨基酸1到大约氨基酸10组成的多肽，由图2所示EECP蛋白的大约氨基酸20到大约氨基酸30组成的多肽，由图2所示EECP蛋白的大约氨基酸30到大约氨基酸40组成的多肽，由图2所示EECP蛋白的大约氨基酸40到大约氨基酸50组成的多肽，由图2所示EECP蛋白的大约氨基酸50到大约氨基酸60组成的多肽，由图2所示EECP蛋白的大约氨基酸60到大约氨基酸70组成的多肽，由图2所示EECP蛋白的大约氨基酸70到大约氨基酸80组成的多肽，由图2所示EECP蛋白的大约氨基酸80到大约氨基酸90组成的多肽和由图2所示EECP蛋白的大约氨基酸90到大约氨基酸100组成的多肽等等。依据此图解，由EECP蛋白的氨基酸100-208的氨基酸序列部分组成的多肽是本发明的典型实施方案。也包括由EECP蛋白的较大部分组成的多肽。例如由如图2所示EECP蛋白的大约氨基酸1(或20或30或40等)到大约氨基酸20(或30或40或50等)组成的多肽可以由公知的多种技术产生。

能够特异性地结合和鉴定EECP蛋白或多肽的抗体可以用于检测任何的生物样品中分泌的EECP和/或EECP表达细胞的缺失和/或存在，确定其在血液循环中的水平、亚细胞定位，检测和显示前列腺癌细胞和/或乳腺癌细胞和前列腺瘤和/或乳腺瘤，调节或抑制EECP的生物活性。抗体也可依照下面更进一步描述在治疗上使用。产生多克隆抗体和单细胞抗体的方法是本领域中公知的。

本发明也提供包含EECP多核苷酸的重组DNA或RNA分子，包含但不限于噬菌体、质粒、噬粒、粘粒、YACs、BACs，还有本领域技术人员公知的病毒性和非病毒性载体，还提供用此重组DNA或RNA分子转化或转染的细胞。在此所用的重组DNA或RNA分子是已在体外进行了分子操作的DNA或RNA分子。产生这些分子的方法是公知的(例如见Sambrook et al，1989，同上)。

本发明更进一步提供宿主-载体系统，该系统中重组DNA分子位于合适的原核或真核宿主细胞内，所述重组DNA分子包含EECP多核苷酸。合适的真核宿主细胞实例包括酵母细胞、植物细胞或动物细胞，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞(举例来说，能受杆状病毒感染的细胞，如Sf9细胞)。适当哺乳动物细胞的实例包括各种前列腺癌细胞系，例如LnCaP、22RV1、PC-3、DU145、LAPC-4、TsuPr1；乳腺癌细胞系，例如T47D、MCF7、Hs578t、UACC-812，其它可转染或可转导的前列腺癌和乳腺癌细胞系，还有通常用于重组蛋白质表达的一些哺乳动物细胞(例如COS、CHO、293、293T细胞)。更具体而言，包含EECP编码序列的多核苷酸可以利用任何数目的本领域中常用并公知的的宿主-载体系统产生EECP蛋白或其片段。

可得到适用于EECP蛋白或其片段表达的各种宿主-载体系统，例如见Sambrooket al.，1989，Current Protocols in Molecular Biology，1995，同上。优选的哺乳动物表达的载体包含但不限于pSG 5、pcDNA 3.1myc-His-tag(Invitrogen)、逆转录病毒载体pSR.alpha.tkneo(Muller et al.，1991，MCB 11：1785)和/或Tag5载体(GenHunterCorporation，Nashville Tenn.)。使用这些表达载体，EECP可更适宜在一些前列腺癌和非前列腺癌的细胞系中表达，所述细胞系例如包括3T3、293、293TPC-3、LNCaP和TsuPr1。本发明的宿主-载体系统对EECP蛋白或其片段的生产是有用的。此宿主-载体系统可用于研究EECP和EECP突变的功能特征。

除了检测失控的细胞生长外，由EECP基因或其片段编码的蛋白质会有多种用途，包括但不限于产生抗体和鉴定配体、其它物质以及结合EECP基因产物的细胞组分的方法。该蛋白质也可用做癌症疫苗。抗EECP蛋白或其片段的抗体可用于诊断和预后分析、成像方法学(具体包括肿瘤成像)和由EECP蛋白表达的缺失和/或增加为特征的人类肿瘤如前列腺癌和乳腺癌的治疗方法。对EECP蛋白的检出有用的各种免疫学实验受到关注，包括但不限于各种类型的放射免疫实验、酶联免疫吸附实验(ELISA)、酶联免疫荧光实验(ELIFA)、免疫细胞化学方法等。可将这样的抗体标记并用作能够检查前列腺和/或乳腺细胞的免疫学成像试剂(例如在放射性闪烁照相成像方法中)。

在特定的实施方案中，具有人EECP氨基酸序列的新型EECP蛋白如图2所示(SEQ ID NO 3)。也包括全部或部分EECP蛋白与异源多肽的融合蛋白，谷胱甘肽-s-合成酶转移酶作为异源多肽是具有代表性的实施方案。另一个典型实施方案中，嵌合分子可包含EECP与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域的融合体。对于嵌合分子的二价形式(也称为“免疫粘附素”)，这样的融合可以针对IgG分子的Fc区域。Ig融合蛋白适合包括将Ig分子内的在至少一个可变区域替代为EECP多肽的可溶性形式(跨膜结构域缺失或失活)。特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合体包含IgG1分子的铰链区、CH2和CH3，或铰链区、CH1、CH2和CH3区域。各种融合多肽在本领域中公知，典型的实施方案描述于Current Protocols In MolecularBiology，Units 9 and 16，Frederick M.Ausubul et al.eds.，1995。

本发明的EECP蛋白可以表现为许多形式，优选是分离形式。如此处所用，当使用物理的、机械的或化学的方法从细胞组分、细胞分泌物和通常与蛋白质有关的人体液中取出EECP蛋白的时候，蛋白质被称为“分离的”。熟练的技术人员能很容易地使用标准的提纯方法获得分离的EECP蛋白。纯化的EECP蛋白质分子将基本上不含可能减弱EECP与抗体或其它配体结合的其它蛋白质或分子。分离和纯化的性质和程度取决于预定的用途。EECP蛋白的实施方案包括纯化的EECP蛋白和功能性的可溶性的EECP蛋白。同样，此功能性的可溶性的EECP蛋白或其片段具有结合抗体和配体的能力，和/或作为蛋白酶的底物。

编码EECP或其修饰形式的核酸也能用来产生转基因动物或“基因敲除”动物(或细胞系)，这些又用于研发和筛选治疗上有用的试剂。转基因动物(例如小鼠或大鼠)是具有包含转基因的细胞的动物，该转基因导入动物或出生前的动物原型，例如胚胎阶段。转基因是整合入细胞基因组中的DNA，所述细胞将发育成转基因动物。一个实施方案中，根据已经建立的技术和用于产生转基因动物的基因组序列，编码EECP的cDNA可用来克隆编码EECP的基因组DNA，所述转基因动物包含表达编码EECP的DNA的细胞。产生转基因动物、尤其是诸如小鼠和大鼠的动物的方法已经是本领域的常规技术，例如描述于U.S.Pat.Nos.4,736,866和4,870,009。典型地，与组织特异性增强子结合的EECP转基因会靶向特定的细胞。在胚胎阶段将编码EECP的转基因的拷贝导入动物的生殖细胞系内，所产生的转基因动物可用来检测编码EECP的DNA的表达增加的效应。这种转基因动物可作为药物研究的实验动物，例如研究防止因EECP超表达产生的病理状态的药物。根据本发明的这一方面，用药物处理动物，并与未经处理的转基因的动物相比较，减轻了这种病理状态将提示药物对病理状态潜在的治疗干预作用。

另一方面，EECP的非人类同源物可用来构建EECP基因“敲除”动物，所述EECP敲除动物具有缺失的或改变的编码EECP的基因，这是通过在编码EECP的内源基因和编码EECP的改变的基因组DNA之间经过同源重组导入动物的胚胎细胞的结果。例如，用编码EECP的cDNA按照已建立的技术克隆编码EECP的基因组DNA。编码EECP的基因组DNA的一部分可以删除或用另一个基因代替，例如可用来检测整合情况的编码选择标志物的基因。典型地，将一些未经改变的旁侧DNA的几千碱基(5′和3′端)包含在载体中(同源重组载体的描述例如见Thomas andCapecchi，1987，Cell 51：503)。将载体导入胚胎干细胞系内(例如通过电穿孔)，并筛选其中导入的DNA与内源性DNA发生同源重组的细胞(例如见Li et al.，1992，Cell 69：915)。然后将所筛选的细胞注入动物胚泡内(例如小鼠或大鼠)以形成聚集嵌合体(例如见Bradley，in Robertson，ed.，1987，Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells：A Practical Approach，(IRL，Oxford)，pp.113-152)。随后可以将嵌合胚胎植入适当的假孕雌性寄养动物，胚胎最终成为“基因敲除”动物。生殖细胞中含有同源重组DNA的后代可用标准技术鉴定，并用于繁殖所有细胞均含同源重组DNA的动物。“基因敲除动物”具有一些特征，例如抵抗特定病理状态的能力，由于缺少EECP多肽而发生某种病理状态。

重组方法可用于产生编码EECP蛋白的核酸。在这点上，在此描述的EECP编码的核酸分子提供产生EECP蛋白及其片段的手段。这样的EECP多肽尤其可用于产生结构域特异性抗体(例如识别分泌型为主或膜相关抗原表位为主的EECP蛋白)，发现与特定的EECP结构域结合的物质或细胞因子，以及各种治疗措施中，包括但不限于癌症疫苗。可以使用各种本领域已知的分析技术预测和/或鉴定含这种独特结构的EECP多肽，例如包括Chou-Fasman、Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jameson-Wolf分析方法或基于免疫原性的方法。

本发明的另一方面提供免疫特异性结合EECP蛋白和其多肽片段的抗体。最优化的抗体选择性地结合EECP蛋白，而不结合(或较弱结合)非EECP蛋白和多肽。主要的抗EECP抗体包括单克隆和多克隆抗体，还有含抗原结合结构域和/或这些抗体的一个或多个互补性决定区。如此处所用，抗体片段定义为与靶分子结合的免疫球蛋白分子可变区域的至少一部分，如抗原结合区域。

对于一些应用，可以期望产生能特异性与EECP蛋白和/或其定结构域内的抗原表位反应的抗体。例如以肿瘤成像诊断为目的的优选抗体是能与表达于癌细胞的EECP蛋白的膜结合区域中的抗原表位起反应的那些抗体。这样的抗体可用EECP蛋白或衍生自EECP分泌型或其它结构域的肽来产生，并用作免疫原。

本发明的EECP抗体在前列腺和乳腺癌的诊断和预后判断、成像方法和治疗方案中尤其有用。本发明提供各种用于检测和定量EECP的免疫学方法。这样的检测法通常包括一个或多个能够识别和结合EECP的抗体，并且可以在本领域技术人员公知的各种免疫学测试法中实现，包括但不限于各种类型的放射免疫实验、酶联免疫吸附实验(ELISA)、酶联免疫荧光实验(ELIFA)等。此外，本发明也提供了能够检测前列腺癌的免疫学成像方法，包括但不限于使用标记的EECP抗体的放射性闪烁照相成像法。这种方法可用于临床上前列腺癌和/或乳腺癌的检查、监控和预后判断，尤其对晚期前列腺癌和/或乳腺癌。

EECP抗体也可用于纯化EECP蛋白、多肽和分离EECP同源物及其相关分子的方法中。例如，在一个实施方案中，纯化EECP蛋白的方法包括：在使EECP抗体能结合EECP的状态下，将与固体基质偶联的EECP抗体与含EECP的裂解物或其它溶液进行孵育；清洗固体基质除去杂质并从偶联抗体中洗脱EECP。本发明的EECP抗体的其它用途包括产生能模拟EECP蛋白的抗独特型抗体。

EECP抗体例如也可用于调节或抑制EECP蛋白的量和/或生物活性，或靶向破坏EECP蛋白表达缺失或增加的细胞(例如前列腺癌和/或乳腺癌细胞)。前列腺癌和/或乳腺癌的抗体治疗在下面进一步详细描述。在此本发明的典型实施方案由抑制表达EECP的癌前病变或者癌细胞生长的方法组成，包括将癌细胞表达的EECP与有效量的抗EECP抗体接触，以抑制癌细胞的生长。优选的是，用于该方法的抗体识别主要与细胞表面相关的EECP抗原决定簇。抗体介导的抑制和细胞溶解的方法在本领域中公知，例如包括补体介导的或抗体-依赖性的细胞毒(ADCC)。本发明的另一实施方案是调节分泌型EECP的生物活性的方法，包括将分泌型EECP与有效量的抗EECP抗体接触，以调节分泌型EECP的活性。优选的是用于该方法的抗体识别主要为分泌型的EECP抗原表位。

用于制备抗体的各种方法在本领域中公知。例如，采用EECP蛋白、肽或片段以单独或免疫偶联的方式免疫适当的哺乳动物宿主来产生抗体(Antibodies：ALaboratory Manual，CSH Press，Eds.，Harlow，and Lane(1988)；Harlow，Antibodies，Cold Spring Harbor Press，NY(1989))。除此之外，也可以使用EECP的融合蛋白，例如EECP-GST融合蛋白。具体的实施方案中，可以制备包含图2全部的或大部份开放阅读框氨基酸序列的GST融合蛋白质，然后用作产生特异抗体的免疫原。这种GST融合蛋白可用于制备能与EECP发生免疫特异性反应的单克隆和/或多克隆抗体。表达或超表达EECP的细胞也可用作免疫原。同样地，也可采用任何表达EECP的基因工程细胞。该策略可产生具有增强识别内源型EECP能力的单克隆抗体和多克隆抗体。

如图2所示的EECP氨基酸序列(SEQ ID NO 3和4)可用于选择EECP蛋白的具有免疫原作用的特定区域。例如，EECP氨基酸序列的疏水性和亲水性分析可用于鉴定EECP结构中的亲水性区域。具有免疫原性结构的EECP蛋白区域和其它区域和结构域可轻易地使用本领域公知的方法鉴定，例如Chou-Fasman、Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jamson-wolf分析。例如，可以产生靶向特定EECP及其片段的抗体。

制备用作免疫原的蛋白质或多肽和制备与诸如BSA、KLH或其它载体蛋白的免疫偶联物的方法在本领域中公知。在某些情况之下，可使用直接的偶联，例如用碳二酰胺试剂偶联；在其它情况下，由Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill.提供的连接试剂是有效的。本领域中一般理解，EECP免疫原的施用通常需在适当的时间内注射，并使用适当的佐剂。在免疫期间，抗体的效价可用于确定抗体形成是否足够。

如上面提到的，EECP蛋白可以是或者包含由含SEQ ID NO：1的核酸序列编码的多肽或承抗原表位部分。这种EECP蛋白可用于运用标准免疫学技术制造抗体。针对蛋白质或其抗原表位的多克隆或单克隆的抗体可通过任一个已知技术来制备并用于免疫实验中。抗原表位指多肽的抗原决定簇。抗原表位可以含空间构象上的3个氨基酸，所述空间构象对抗原表位来说是唯一的。通常抗原表位至少由5个这样的氨基酸组成。确定氨基酸空间构象的方法在本领域中已知，例如包括X射线晶体学和二维核磁共振。

制备针对蛋白质抗体一个方法是选择和制备蛋白质全部或部分的氨基酸序列，化学合成序列并注射入适当的动物，通常是兔或小鼠。

可选择寡肽作为产生针对EECP蛋白的抗体的抗原候选物，尤其是那些位于亲水性区域的寡肽，其更可能在成熟蛋白质中暴露。典型的用于制备抗任一EECP的片段的抗体的肽序列至少长5-6个氨基酸，任选地与免疫原性载体蛋白如KLH或BSA融合。例如可以使用the Antigenicity Index，Welling，G.W.et al.，FEES Lett.188：215-218(1985)来确定其他的寡肽，该文献通过引用并入本文。

抗EECP的单克隆抗体是优选的，可以通过本领域中公知的方法产生。例如，分泌所期望单克隆抗体的永生化细胞系可以使用Kohler和Milstein的已知标准方法或实现淋巴细胞或脾细胞的永生化的改良方法来制备。分泌所需单克隆抗体的永生化细胞系通过免疫实验法筛选，其中抗原是EECP蛋白或EECP片段。当鉴定了分泌所期望抗体的适当永生化细胞培养物时，可以扩增细胞，并从体外培养液或腹水生产抗体。

也可以使用现有技术通过重组方法生产抗体或片段。与EECP蛋白的所设计抗原表位特异性结合的抗体区域也可以由嵌合体或多类型起源的CDR移植抗体生产。也可生产人源化或人EECP抗体。生产这种人源化抗体的方法是已知的，包括嵌合体和CDR移植方法；生产全人单克隆抗体的方法包括噬菌体展示和转基因方法(综述见Vaughan et al.，1998，Nature Biotechnology 16：535-539)。

可使用人Ig基因重组文库(如噬菌体展示)的克隆技术(Griffiths andHoogenboom，Building an in vitro immune system human antibodies from phagedisplay libraries.In：Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic andTherapeutic Applications in Man.Clark，M.(Ed.)，Nottingham Academic，pp 45-64(1993)；Burton and Barbas，Human Antibodies from combinatorial libraries.Id.，pp65-82)生产全人EECP单克隆抗体。也可使用如Kucherlapati等人的、1997年12月3日公开的PCT专利申请WO98/24893(也参见Jakobovits，1998，Exp.Opin.Invest.Drugs 7(4)：607-614)描述的用工程化以产生含人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠生产全人EECP单克隆抗体。这一方法避免噬菌体展示技术所需的体外操作，有效生产高亲和力的真正人抗体。

可通过一些公知的方法确定EECP蛋白与其抗体的反应，所述方法包括Western印迹、免疫沉淀、ELISA和FACS分析，适当的是使用表达EECP蛋白、肽、EECP的细胞或其提取物。

本发明的EECP抗体或其片段可以用可检测的标志物标记，或与第二个分子如细胞毒素或治疗药物偶联，以靶向EECP阳性细胞(Vitetta，E.S.et al.，1993，Immunotoxin therapy，in DeVita，Jr.，V.T.et al.，eds，Cancer：Principles and Practiceof Oncology，4th ed.，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，2624-2636)。多种适用于诊断和治疗的偶联物在本领域中公知，包括但不限于放射性同位元素如“alpha”发射物、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或多肽如酶。典型的偶联物例如描述于Current Protocols In Molecular Biology，Units 11 and 17，Frederick M.Ausubul et al.eds.，1995。本发明的优选实施方案中，诊断和治疗偶联物与识别主要与细胞表面相关的EECP抗原表位的抗体偶联。

本发明的抗体的典型特定实施方案描述如下：产生生产单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体命名为5D5(IgG1，K)、3C3(IgG2b)、6B10(IgG2a，K)、2G3(IgG1)、4E10(IgG1，2b)、10F6(IgG1，K)和6F10(IgG1，K)。因此本发明的特定抗体实施方案包括下述单克隆抗体，其表位结合位点竞争性抑制单克隆抗体1F9、2D10、2F8、6B11、3G3、8C6和/或9G8的基本所有的表位结合。本发明的相关特定实施方案包括免疫偶联物，后者包含含5D5、3C3、6B10、2G3、4E10、10F6和6F10抗原结合区域的分子。将单克隆抗体5D5、3C3、6B10、2G3、4E10、10F6和6 F10与诊断或治疗药结合。

利用多克隆抗体和命名为5D5、3C3、6B10、2G3、4E10、10F6和6F10的单克隆抗体的本发明的另外特定实施方案包括：确定哺乳动物的样品中的EECP抗原表位存在的丢失和增加以检测失控性细胞生长如癌症的方法，包括使单隆抗体与存在于样品中的EECP抗原表位反应，抗体通过与EECP抗原表位发生免疫结合来鉴定。所述单克隆和多克隆抗体具有抗原结合位点，并竞争性抑制由杂交瘤产生的名为5D5、3C3、6B10、2G3、4E10、10F6和6F10的抗体分别与靶抗原的免疫特异结合。利用多克隆抗体和命名为5D5、3C3、6B10、2G3、4E10、10F6和6F10的单克隆抗体的本发明的另外特定实施方案包括：抑制失控性细胞生长如癌症的方法，包括使EECP抗原表位与单克隆抗体或抗体结合片段结合，以抑制癌的进程，其中所说的单克隆抗体或抗原结合片段具有小鼠单克隆抗体5D5、3C3、6B10、2G3、4E10、10F6和6F10的抗原结合区域。

利用多克隆和单克隆抗体的本发明的另外特定实施方案包括确定生物样品中存在失控性细胞生长如癌的方法，包括使所述样品的标本与多克隆抗体和/或单克隆抗体或特异性结合EECP抗原表位的抗原结合片段结合，其中所述的单克隆抗体或抗原结合片段具有鼠单克隆抗体5D5、3C3、6B10、2G3、4E10、10F6和6F10的抗原结合区域，检测所述的抗体或片段与所述的生物样品的结合。

如下面详细讨论的，命名为5D5、3C3、6B10、2G3、4E10、10F6和6F10的单克隆抗体的本发明的另外特定实施方案包括抑制生物样品中失控性细胞生长如癌症的方法，包括使所述的生物样品的标本与样品单克隆抗体或其特异性结合EECP抗原表位的抗原结合片段结合，以抑制失控的细胞生长。其中所说的单克隆抗体或抗原结合片段具有鼠单克隆抗体5D5、3C3、6B10、2G3、4E10、10F6和6F10的抗原结合区域。

下面提供了本发明的其他说明性的诊断方法。这些方法只代表此处描述的本发明的典型实施方案，但无论如何不限定本发明。

本发明的例证性的诊断方法。

如上面提到的，评估个体中EECP(例如EECP基因和基因产物如mRNA和蛋白质的状态)状态的实验方法可用于提供该个体细胞生长或癌变的信息。具体发现是：EECP蛋白在前列腺癌患者血浆(血清)中丧失其正常水平(“男性的基础水平”)的约95％；相反，EECP蛋白在乳腺癌患者血浆(血清)中的表达水平非常高(与它的“女性的基础水平”比较)，因此熟练的技术人员可将这一基因和它的产物作为评估疑与EECP状态改变有关的相关疾病的靶点。

EECP在各种前列腺癌和乳腺癌细胞系中表达。它在前列腺癌患者血浆(血清)中的水平明显低于“男性的基础水平”，但在乳腺癌患者则高于“女性的基础水平”。因为上面讨论的那些特点，EECP的表达状态可以提供对确定包括增生、癌前病变的和癌细胞的出现、分期和位置、预后判断和/或准确估计肿瘤的侵袭能力有用的信息。因此，本发明的重要方面涉及各种分子预后和诊断方法，用于检测那些患有或疑似患有以失控性细胞生长为特征的疾病如癌症的个体的生物样品中EECP状态。已知癌变发生是多阶段过程，细胞的生长变得越来越失控，从正常的生理状态发展到癌前病变随后是癌的状态(例如见Alers et al.，Lab Invest.77(5)：437-438(1997)和Isaacset al.，Cancer Surv.23：19-32(1995))。因此，检测生物样品获得失控性细胞生长的证据(例如前列腺和乳腺癌中的EECP表达水平)可以在癌症发展到治疗方法的选择很有限的阶段之前早期发现这种异常细胞生理。在这种检测中，将感兴趣的生物样品(例如疑似具有失控性细胞生长的个体)中的EECP状态与对应的正常样品(例如没有被病理影响的个体，或者没有疑似具有失控性细胞生长的个体)中的EECP状态比较，感兴趣的生物样品(与正常样品的比较)中的EECP状态的改变提供失控性细胞生长的证据。除了使用没有受到病理影响的生物样品作为正常样品之外，也可以使用预定的标准化值例如预定的蛋白质和/或mRNA表达的正常水平(例如见Grever et al.，J.Comp.Neurol.1996Dec.9；376(2)：306-14和U.S.Pat.No.5,837,501)来比较正常样品与疑似样品中的EECP。

在此所指的术语“状态”根据它能接受的方式使用，如此处具体描述的，EECP的状态可以通过许多本领域已知的参数评估。生物样品中的EDCP状态可以通过检测此生物样品中EECP多核苷酸和/或多肽的序列来评估。或者，生物样品中的EDCP状态可以通过检测生物样品中EECP基因产物(例如mRNA和/或蛋白质)的水平来评估。或者，生物样品中的EECP状态可以通过正常生物样品中EECP的定位并比较它和疑似有失控性细胞生长迹象的生物样品中EECP的定位来评估。或者，生物样品中的EECP状态可以通过观察特定EECP种类例如来自翻译后自身催化断裂的22kD蛋白酶片段的存在或缺失来评估。或者，生物样品中的EDCP状态可以通过在生物样品中寻找特定EECP免疫反应复合体的存在或缺失来评估。

典型地，熟练的技术人员使用许多参数来评估基因和其产物的条件或状态。这包括但不限于基因及其调节序列的完整性和/或甲基化模式，基因表达产物(包括EECP表达细胞的位置)的定位，基因表达产物(例如EECP mRNA多核苷酸和多肽)的存在、水平和生物活性，对基因表达产物的转录和转译修饰的存在或者缺少，以及基因表达产物与其它生物分子如蛋白质结合配体的相关性。

EECP状态的改变可通过本领域公知的各种方法来评估，下面讨论那些典型的。典型的EECP状态变化包括EECP和/或表达EECP的细胞的位置改变、EECP mRNA和/或蛋白质表达的增加，和/或EECP与结合配体的结合或分离。如此处出现的数据提供了EECP蛋白主要由男性生殖器官的腺体结构分泌到血浆(血清)中的证据，但是在前列腺腺体结构破坏的情况下，原来在血浆(血清)中的EECP蛋白被释放到血浆(血清)中的蛋白酶有效的降解，此时EECP状态的特殊而有代表性的变化是血浆(血清)中分泌型EECP蛋白水平降低。相反，EECP蛋白在具有完整组织结构的正常乳腺的女性血浆(血清)中水平极低。但是它在腺体结构破坏的情况下被大量释放到血浆(血清)中。因为缺少在同期由乳腺释放到血浆(血清)中的有效蛋白酶，所述的血浆(血清)EECP水平增加。这是血浆(血清)中分泌型EECP蛋白水平改变的另一个特殊而有代表性的变化。

如此处详细讨论的，为了鉴定与失控性细胞生长相关的条件或现象，熟练技术人员可以通过许多方法评估生物样品中的EECP状态，包括但不限于基因组Southern分析(例如检测EECP基因中的异常)，EECP mRNA的Northern和/或PCR分析(例如检测EECP mRNA的多核苷酸序列或表达水平的改变)，以及Western和/或免疫组织化学分析(例如检测多肽序列的改变、样品中多肽定位的改变、EECP蛋白的表达水平的改变和/或EECP蛋白和多肽结合配体的相关性)。可检测的EECP多核苷酸例如包括EECP基因或其片段、EECP mRNA、替代性剪切变体EECPmRNAs，和含EECP多核苷酸的重组DNA或RNA分子。

当在各种诊断方法中检测EECP类型及其相对值时，也可以考虑例如不同类型的EECP在细胞内或细胞外定位的因素。这种观察在本领域中是公知的，可利用特异性针对分泌型类型的结构域的抗体或特异性针对细胞表面相关结构域的抗体进行。

如下面详细讨论的，EECP可通过各种技术中的任一种分析，包括(i)免疫组织化学；(ii)原位杂交；(iii)RT-PCR；(iv)临床样品和细胞系的Western印迹分析；(v)组织芯片分析和(vi)体内成像。评估基因和其产物状态的例证性典型方案例如可在Current Protocols In Molecular Biology，Units 2[Northern Blotting]，4[SouthernBlotting]，15[Immunoblotting]and 18[PCR Analysis]，Frederick M.Ausubul et al.eds.，1995中查到。对检查EECP蛋白有用的各种特定免疫学检测方法包括但不限于各种类型的放射免疫实验、酶联免疫吸附实验(ELISA)、酶联荧光免疫实验(ELIFA)、免疫细胞化学方法等。作为实例，可以标记EECP抗体并可用作能够发现前列腺癌细胞和乳腺癌细胞的免疫学成像试剂(例如在放射性闪烁照相成像法中)。对于放射性闪烁照相体内成像法，放射性标记的EECP抗体与EECP的分泌型抗原表位特异性反应。

例如，鉴定与前列腺癌和乳腺癌中发生的与细胞生长失控和结构破坏相关的疾病的分析方法可包括检测各种生物样品之一中EECP多肽或多核苷酸的改变，以评估病理状态，例如血浆(血清)、尿、大便、精液还有来自可能在癌转移时受影响的前列腺、乳腺和其它组织的细胞制备物。典型样品包含外周血和/或血浆(血清)，其可以方便地检测EECP蛋白或癌细胞的存在，包含但不限于前列腺癌和乳腺癌。

例如使用免疫学或Northern或RT-PCR检测EECP，可在外周血和血浆(血清)中方便地检测EECP蛋白和/或前列腺癌或乳腺癌细胞的丧失或增加。目前正评估RT-PCR检验外周血中肿瘤细胞在诊断和治疗许多人类实体瘤中的用途。在前列腺癌领域，包括用于检测表达PSA和PSM的细胞的RT-PCR测试法(Verkaik et al.，1997，Urol.Res.25：373-384；Ghossein et al.，1995，J.Clin.Oncol.13：1195-2000；Heston et al.，1995，Clin.Chem.41：1687-1688)。另一个方法中，可以使用近来描述的检测和鉴定血液中癌细胞的敏感测试法(Racila et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：4589-4594)。这一测试法将免疫磁性富集与多参数流氏细胞术和免疫组织化学分析法结合，对血中癌细胞的检出高度敏感，据称能够在1毫升外周血中发现一个上皮细胞。

EECP与前列腺特异性抗原共有许多特性，包括雄激素调节、存在于血浆(血清)中、与一个或多个蛋白质形成复合体的能力和与肿瘤相关的表达水平的减少或增加。因此，各种本领域已知的评估PSA实验方法也提供用于评估EECP的典型方法的例证。下面提供了许多也可用于EECP的检测的有代表性的PSA检测方法。这些检测方法也可与评估EECP状态的方法结合使用。

通过引用并入本文的U.S.Pat.No.5,840,501提供了血液样品中检测免疫学上可确定的PSA的典型方法。在公知测试法的变换方式中，通过双位点免疫计量测试法检测PSA，将血液样品中的游离PSA(fPSA)遮盖以使游离PSA(fPSA)在免疫检测中不被发现。在此基础上，发现检测血液cPSA水平为前列腺癌辅助诊断和监测提供了高度敏感和特异性的方法，而且免去了许多患者经历不必要的前列腺活检的需要。U.S.Pat.No.5,840,501中描述的免疫分析法使用了三种抗-PSA抗体：既结合cPSA又结合fPSA的抗体(抗-tPSA)、以fPSA特异性抗体的结合阻断与fPSA的结合作为唯一特征的第二抗-tPSA抗体，以及作为fPSA特异性抗体的第三抗体。由此，fPSA特异性抗体与样品中PSA的结合只允许在免疫计量分析中检测cPSA。按照U.S.Pat.No.5,840,501中描述的方法，本领域的技术人员可以使用类似方法，例如使用三种抗-EECP抗体：既结合cEECP又结合fEECP的抗体(抗-tEECP)、以fEECP特异性抗体的结合阻断与fEECP的结合为唯一特征的第二抗-tEECP抗体，以及作为fEECP特异性抗体的第三抗体。由此，fEECP特异性抗体与样品中EECP的结合只允许在免疫计量分析中检测cEECP。

通过引用并入本文的U.S.Pat.No.5,939,533提供了另外的检测游离PSA和蛋白酶抑制剂复合体的典型免疫测试法。在U.S.Pat.No.5,939,533描述的方法中，使用至少两个不同单克隆抗体进行的非竞争性免疫测试来测定游离PSA和PSA复合体。该发明进一步特征在于：与α1-抗胰凝乳蛋白酶、α1-蛋白酶抑制剂(API)或α2-巨球蛋白形成PSA蛋白酶抑制剂复合体。此外，U.S.Pat.No.5,939,533描述的发明特征在于观察到游离PSA、PSA蛋白酶抑制剂复合体和它们的比率可以用于前列腺癌患者的诊断。按照U.S.Pat.No.5,939,533描述的方法，本领域的技术人员可以使用类似方法观察如图2所示EECP蛋白。对游离EECP和/或EECP-蛋白质复合体和它们比值的观察可以在前列腺癌或乳腺癌患者的诊断中应用。

通过引用并入本文的U.S.Pat.No.5,672,480提供了对前列腺特异性抗原(PSA)的另外的典型免疫测试法。U.S.Pat.No.5,672,480描述的方法中公开了PSA与.α..亚.1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)形成的复合体，其可以用作PSA免疫分析中的对照。U.S.Pat.No.5,672,480也提出了分离抗PSA多克隆抗体的方法，通过使用ACT部分遮盖PSA与多克隆抗体结合的抗原表位，来分离多克隆抗体。依照U.S.Pat.No.5,672,480描述的方法，本领域的技术人员可以使用U.S.Pat.No.5,672,480公开的分离抗EECP多克隆抗体的方法，使用类似ACT的物质来形成与EECP的复合体，部分遮盖EECP与多克隆抗体结合的抗原表位，并利用该复合体来分离针对EECP的多克隆抗体。

通过引用并入本文的U.S.Pat.No.5,614,372描述了另一种典型的前列腺特异抗原(PSA)生物亲和检测法，包括测定总PSA(PSA-T)的浓度、游离形式的PSA(PSA-F)的浓度或与α1-抗胰凝乳蛋白酶结合的PSA(PSA-ACT)的浓度，PSA-T是PSA-F和PSA-ACT的总和。根据U.S.Pat.No.5,614,372的公开内容，另外又测定人类腺激肽释放酶(hGK-1)的浓度。PSA-T和hGK-1的浓度可在一个实验或分开的实验中检测，PSA-T和hGK-1的浓度总和用于确定a)PSA-F/(PSA-T+hGK-1)和/或b)PSA-ACT/(PSA-T+hGK-1)比率。U.S.Pat.No.5,614,372的公开内容中，这两个比值显示可用于临床鉴别前列腺癌和良性前列腺增生。依据U.S.Pat.No.5,614,372描述的方法，本领域的技术人员可以使用分析EECP的类似方法，包括测定总EECP(EECP-T)的浓度、游离EECP(EECP-F)的浓度或与它的结合配体复合的EECP(EECP-BT)的浓度，EECP-T是EECP-F和EECP-BT之和。另外测定人类腺激肽释放酶(hGK-1)浓度并用于确定a)EECP-F/(EECP-T+hGK-1)和/或b)EECP-BT/(EECP-T+hGK-1)比值。如U.S.Pat.No.5,614,372中公开，这些比值可以应用于临床。

通过引用并入本文的U.S.Pat.No.5,939,258提供了诊断乳腺癌和前列腺癌微转移的其它典型方法，其中分离患者组织样品的核酸，扩增组织样品中乳腺癌和前列腺癌特异性的核酸，或扩增用特异性针对乳腺癌和前列腺癌的核酸的探针杂交产生的信号；检测到扩增的核酸是乳腺癌和前列腺癌微转移的指标。如下面详细例证的，可以同样扩增对EECP核酸特异性的探针；提供乳腺癌和前列腺癌微转移的证据。

通过引用并入本文的U.S.Pat.No.5,972,615提供了检测人类前列腺和乳腺疾病的其它典型诊断技术。该发明尤其具体用于评估RNA序列的存在和水平的探针和方法，转移性前列腺癌和乳腺癌与正常人类前列腺和乳腺、良性前列腺增生、非转移性前列腺癌和乳腺癌相比，所述RNA序列存在差异性表达。该发明也涉及评估RNA序列存在的探针和方法，将疾病状态个体和正常健康个体的外周血相比，所述RNA序列存在差异性的表达。描述了在发生转移的前列腺癌中确定的差异表达基因在治疗中应用的方法，以及筛选前列腺癌和乳腺癌治疗的药物有效性的方法。同样地，U.S.Pat.No.5,972,615提供了编码替代性剪切的前列腺特异膜(PSM)抗原的哺乳动物核酸分子、编码剪切变异的前列腺特异膜抗原启动子序列的核酸分子、检测受试者血源转移性肿瘤细胞以确定受试者前列腺癌进程的方法。如下面详细例证的，对特异EECP的分子可用于检测受试者的血源微转移性肿瘤细胞，以确定受试者前列腺癌和/或乳腺癌的进程。

如下面提供的各种典型实施方案的例证，确定个体中EECP状态的各种方法可用来提供预后和/或诊断信息。这些确定EECP状态的方法可以提供用于预测肿瘤的易感性、分期和进程和/或肿瘤侵袭性的信息。下面提供了本发明的各种例证方面作为确定EECP状态和评估与失控性细胞生长如癌症相关的综合表现的方法和测试法。

本发明的特别优选的实施方案由检测或测试生物样品中失控性细胞生长迹象的方法组成，包括比较受试生物样品中的EECP状态和对应的正常样品中的EECP，其中生物样品中EECP状态的改变与组织结构破坏和/或失控性细胞生长相关。因为组织结构的破坏和/或细胞生长失控(即，增生、癌前病变和癌变细胞等中发生的细胞增殖的异常)是肿瘤发生的复杂多阶段过程和肿瘤进展过程中的重要因素，发现指示组织结构的破坏和/或失控性细胞生长的状况或现象(如，EECP生物学的改变)，对于医药工作者来说具有特殊的意义，因为肿瘤的病理变化的早期发现对发病率和死亡率具有深刻的影响。

如下面详细讨论的，EECP的血浆(血清)水平提供了其参与癌变过程的有力证据。因此，与相应的来自如未受侵犯的邻近组织(例如正常乳腺或前列腺组织)或未患病的个体比较，确定受试样品中EECP状态的改变(例如血浆/血清)中水平的改变)提供失控性细胞生长如癌症的证据。

如上面详细描述的，生物样品中的EECP状态可以通过许多本领域公知的步骤检查。例如，生物样品中的EECP状态可以通过比较EECP多核苷酸或多肽在已知非肿瘤样品、癌前病变或癌样品中的相对表达水平来检查。通过该比较，可以评估EECP，包括SEQ ID NO：1所示的EECP多核苷酸序列以及SEQ ID NO：3所示的EECP多肽序列。

取自人体特定部位的生物样品也可以通过评估其中EECP表达细胞的存在与否进行检查。这种检查可以提供失控性细胞生长的证据，例如当在来自通常不含这种细胞的人体组织(例如淋巴结、骨或肝等)的生物样品中发现EECP表达细胞时，生物样品中EECP状态的这种改变经常与组织结构的破坏和/或失控性细胞生长相关联。具体而言，组织结构的破坏和/或失控性的细胞生长的一种指标是癌细胞从原发器官(例如前列腺或乳腺)转移到人体不同区域(例如淋巴结)。这种失控性细胞生长的证据对乳腺癌是重要的，因为对乳腺癌淋巴结转移分布的理解使在早期发现复发的淋巴结成为可能(例如见AJR Am J Roentgenol 1992 October；159(4)：757-61)。这种组织结构破坏和/或失控性细胞生长的证据对前列腺癌是重要的，因为可以在相当一部分前列腺癌患者中发现隐藏的淋巴结转移和血行转移，这种转移与已知的肿瘤预后相关(例如见J Urol 1995 August；154(2 Pt 1)：474-8)。

本发明的特定实施方案中，检测感兴趣生物样品(典型的来自疑似有肿瘤特征并显示一系列指标异常，其中之一是EECP高表达)中EECP mRNA状态改变的方法包括：使用至少一个引物通过逆转录从样品中产生cDNA；使用EECP多核苷酸的正义和反义引物从上述cDNA扩增其中的EECP cDNA；并检测扩增的EECP cDNA的存在。典型的实施方案中，检测生物样品中EECP基因的方法包括首先从样品分离基因组DNA；使用EECP多核苷酸正义和反义引物从分离的基因组DNA扩增其中的EECP基因，检测扩增的EECP基因的存在。由EECP提供的核苷酸序列(图1；SEQ ID NO：1)可设计任何数目的合适的正义和反义探针组合物用于扩增。另一个实施方案中，检测生物样品中EECP蛋白存在的方法包括首先使EECP抗体或含与EECP抗原表位结合的多肽，或包含与EECP抗原表位结合的重组蛋白质与所述样品接触，随后检测此样品中EECP蛋白的结合。

也提供了鉴定表达EECP和/或显示异常表达EECP的细胞的方法。一个实施方案中，鉴定表达EECP基因的细胞的分析法包括检测细胞中EECP mRNA的存在。检测细胞中特定mRNA的方法是公知的，例如包括使用互补DNA探针的杂交检测法(例如使用标记的EECP核酸探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)和各种核酸扩增检测法(例如使用EECP特异性的互补引物的RT-PCR和其它扩增型检测方法，例如，支化DNA、SISBA、TMA等)。另外，鉴定表达EECP基因的细胞的检测法包括检测细胞内或细胞分泌的EECP蛋白的存在。检测蛋白质的各种方法在本领域中公知并可以用于检测EECP蛋白和表达EECP的细胞。

本发明的典型实施方案提供了用于确定个体中癌症存在的方法。与相应的正常样品比较，受试个体的生物样品中EECP mRNA或蛋白质表达水平的显著增加或减少提示该个体肿瘤的存在。例如，EECP蛋白和/或mRNA的存在可以在生物样品中评价，包括但不限于血液和血浆(血清)还有来自胃、结肠、前列腺、胰腺和乳腺等的组织样品。此外，也可以评估来自癌组织和癌转移相关部位的生物样品，由于其相应的正常组织不表达EECP mRNA或蛋白质或以更高(对于前列腺)或更低(对于乳腺)水平表达，EECP表达水平的显著改变和/或EECP在这些组织中的任何变化可用于预示这些肿瘤的发生、进展、转移和预后。

本发明的典型实施方案提供用于确定个体中失控性生长的细胞和/或破坏的组织结构(例如发生在癌症中)的存在的检测方法，包括检测相对于与受试样品相应的正常细胞或组织而言其EECP mRNA或蛋白质表达的明显减少或增加。例如，乳腺样品EECP mRNA的增加可以指示乳腺癌的发生、发展、转移和预后。也可在蛋白质水平而不在核酸水平确定EECP基因产物的状态。例如，这种方法或实验包括确定受试组织样品中EECP蛋白的表达水平，并将其与相应的正常样品中EECP表达水平相比较。例如可以使用免疫组织化学方法评估EECP蛋白水平的变化。能检测EECP蛋白表达的EECP抗体或结合配体也可用于其他各种检测方法中。

如上面提到的，可以使用任何本领域公知的标准核酸和蛋白质检测和定量技术检测和定量此处描述的EECP mRNA或蛋白质的表达。检测和定量EECP mRNA的标准方法包括使用标记的EECP核酸探针的原位杂交、使用EECP多核苷酸探针的Northern印迹和相关技术、使用EECP特异性的引物的RT-PCR和其它扩增型检测方法，例如支化DNA、SISBA和TMA等。特定的实施方案中，半定量RT-PCR可用于检测和定量EECP mRNA表达。任何数目的能够扩增EECP的引物可用于此目的，包含但不限于各种引物组。标准的蛋白质检测和定量方法可用于此目的。特定的实施方案中，特异性地与EECP蛋白反应的单克隆或多克隆抗体可以用在活检组织的免疫组织化学检测中。

上面描述的方法的相关实施方案中，可以评估生物样品中完整的EECP核苷酸和氨基酸序列，以鉴定这些分子结构中的异常，例如插入、缺失、替换等。这样的实施方案是有用的，因为在很多与生长失控表型相关的蛋白质中发现了核苷酸和氨基酸序列的异常(例如见Marrogi et al.，J.Cutan.Pathol.26(8)：369-378(1999)。各种观察核苷酸和氨基酸序列异常的检测方法在本领域中公知。例如，EECP基因产物的核酸或氨基酸序列的大小和结构可以通过此处讨论的Northern、Southern、Western、PCR和DNA测序方案检测。另外，检测核酸和氨基酸序列异常的其它方法例如单链构象多态性分析在本领域中公知(例如见U.S.Pat.No.5,382,510和5,952,170))。

另一个实施方案中，可以检查生物样品中EECP基因的甲基化状态。基因5′调节区的CpG岛异常去甲基化和/或过度甲基化频繁发生于无限增殖的和转化的细胞中，可以引起各种基因表达的改变。例如，谷胱甘肽S-转移酶-pi(在正常的前列腺中表达，但在＞90％的前列腺癌中不表达的蛋白质)的启动子过度甲基化使该基因产生永久性转录沉默，是前列腺癌最常检测到的基因组改变(De Marzo et al.，Arm.J.Pathol.155(6)：1985-1992(1999))。除此之外，这一改变存在于至少70％的高分化前列腺上皮内肿瘤(PN)病例中(Brooks et al，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.，1998，7：531-536)。另一个实施例中，在类淋巴母细胞中脱氧氮胞苷可诱导肿瘤特异基因LAGE-I(不在正常前列腺中而在25-50％的前列腺癌中表达)的表达，提示LAGE-I表达是由于去甲基化作用(Lethe et al.，Int.J.Cancer 76(6)：903-908(1998))。各种检测基因甲基化状态的实验方法在本领域中公知。例如，可以在Southern杂交方法中利用不能切开含甲基化CpG位点序列的甲基化敏感性限制酶，来估定CpG岛的整体甲基化状态。除此之外，MSP(甲基化特异PCR)可以快速地检测给定基因CpG岛中存在的所有CpG位点的甲基化状态。这一过程包括先用亚硫酸氢钠修饰DNA(将所有的非甲基化胞嘧啶转换成尿嘧啶)，然后用甲基化特异性引物和非甲基化引物扩增DNA。涉及甲基化干扰的方案例如也可以在Current Protocols In MolecularBiology，Units 12，Frederick M.Ausubul et al.eds.，1995中查到。

基因扩增和表达增加的检测提供了评估EECP状态的另外方法。例如基于此处提供的序列，使用适当标记的探针，采用传统的Southern印迹法、点印迹(DNA分析)及原位杂交、Northern印迹法可以在样品中直接检测基因扩增或mRNA的转录[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)]。另外，抗体可用于识别特定的双链体，包括DNA双链、RNA双链和DNA-RNA杂合双链或DNA-蛋白质双联体。因此可以标记结合在双链体固相表面的抗体，检测与双链体结合的抗体的存在，从而定量特定的双联体。

本发明也包括预测个体中与EECP表达异常相关的疾病(例如癌症)的易感性。一个实施方案中，用于预测肿瘤易感性的方法包括检测生物样品中的EECP mRNA或EECP蛋白，其表达水平的改变指示对癌症的易感性。特定的实施方案中，检测血浆(血清)或前列腺或乳腺组织的EECP表达水平，样品中EECP的减少或增加分别指示前列腺癌或乳腺癌易感性(或前列腺肿瘤或乳腺肿瘤的出现或存在)。紧密相关的实施方案中，可以评估生物样品中全部的EECP核苷酸和氨基酸序列以发现这些分子的结构的异常，例如插入、缺失、替换等，样品中EECP基因产物的一个或多个失常的存在指示癌症的易感性(或肿瘤的出现、存在或转移)。

本发明的另一个相关方面是检测肿瘤侵袭性的方法。一个实施方案中，检测肿瘤的侵袭性的方法包括确定血浆(血清)、精液、尿、大便等或肿瘤样品的细胞中EECPmRNA或EECP蛋白的表达，并将其表达水平与相应的正常样品中的EECP mRNA或EECP蛋白的表达水平进行比较，所述正常样品取自其他正常的个体或同一个体的正常组织；相对于正常样品而言，疑似样品中EECP mRNA或EECP蛋白表达的水平指示侵袭的程度。特定的实施方案中，通过确定个体样品中EECP的表达范围来评估前列腺肿瘤或乳腺肿瘤的侵袭性，较低(例如前列腺癌和乳腺癌)或较高(例如乳腺癌)的表达水平能指示为更具侵袭性的肿瘤。紧密相关的实施方案中，可以评估生物样品中全部EECP核苷酸和氨基酸序列以发现这些分子结构的异常，例如插入、缺失、替换等，一个或多个异常的存在指示更具侵袭性的肿瘤。

本发明的另一个相关方面是动态观察个体中癌变进程。一个实施方案中，动态观察个体中癌变进程的方法包括确定生物样品中EECP mRNA或EECP蛋白的表达水平，将其表达水平与在不同时间取自同一个体的相同生物样品中EECP mRNA或EECP蛋白的表达水平相比较，样品中EECP mRNA或EECP蛋白表达水平的动态变化提供癌变进程信息。特定的实施方案中，前列腺癌的进程通过确定肿瘤细胞中EECP表达水平的动态变化范围来评价，较低表达水平指示前列腺癌的进程。可替代的实施方案中，通过确定血浆(血清)中EECP动态变化的范围来EECP评癌变进程，较低的浓度指示男性前列腺癌的进展，较高的浓度指示女性乳腺癌的进展。紧密相关的实施方案中，评估生物样品中全部EECP核苷酸和氨基酸序列以鉴定这些分子的结构的异常，例如插入、缺失、替换等，一个或多个异常的存在指示癌症的进展。

上述的诊断方法可以与任何一个本领域公知的各种预后和诊断的检测方法结合。例如，此处公开的本发明的另一个实施方案涉及检测肿瘤相关组织样品中EECP基因及其表达产物的异常和其他肿瘤相关因素之间的一致性的方法，作为肿瘤诊断和预测的方法。可以利用与癌变相关的各种因素，例如癌变相关基因的表达(包括PSA、PSCA、PSM和人腺体激肽释放酶的表达)及细胞学的检测(例如见Bocking et al.，Anal Quant Cytol.6(2)：74-88(1984)；Eptsein，Hum Pathol.1995 February；26(2)：223-9(1995)；Thorson et al.，Mod Pathol.1998 June；11(6)：543-51；Baisden etal.，Am J Surg Pathol.23(8)：918-24(1999))。检测EECP基因及其表达产物(或EECP基因及其表达产物中的异常)与肿瘤相关的其他因素之间的一致性的方法是有用的，因为一系列一致性的特定因素的存在为诊断和预测组织样品的状态提供决定性的信息。

典型的实施方案中，观察EECP基因及其表达产物与肿瘤相关的因素之间的一致性的方法涉及检测生物样品中EECP mRNA或蛋白质的缺失，检测生物样品中PSA mRNA或蛋白质的超表达，观察EECP mRNA或蛋白质的缺失和PSA mRNA或蛋白质的超表达的一致性。特定的实施方案中，检查血浆(血清)和前列腺组织中的EECPmRNA和PSA mRNA的表达。优选的实施方案中，样品中EECPmRNA或蛋白质的缺失和PSA mRNA的超表达的一致性指示有前列腺癌、前列腺癌易感性，或前列腺癌转移的出现或存在。

在这些方法中，可以检查各种各样的生物样品中EECP的状态，例如血浆(血清)、尿、大便、精液还有来自前列腺、乳腺和其它例如肿瘤转移时可受影响的组织制剂。除这些样品之外，可以方便的测试外周血和/或血浆(血清)中EECP蛋白水平或癌细胞，包含但不限于前列腺癌和乳腺癌。生物样品中EECP的状态通过公认的方法中任何一种技术来评估，所述方法包括Southern分析、Northern分析、聚合酶链式反应分析和免疫分析。优选的是，通过检查EECP mRNA表达或EECP蛋白表达的水平来评估生物样品。

本发明的可选择实施方案由确定个体中肿瘤证据的方法组成，通过检测来自个体受试生物样品中EECP基因表达的水平来鉴定，随后将来自个体受试生物样品中EECP基因表达水平(例如疑似有病理状态)与具有可比性的正常生物样品中(例如不怀疑有病理状态)发现的EECP基因表达水平相比较，其中受试生物样品与正常生物样品中EECP基因产物水平的差异即与肿瘤相关。通过检查EECP mRNA表达或EECP蛋白表达的水平来评估测试生物样品。本发明方法的特别优选的方法中，肿瘤是前列腺癌。在另一优选的方法中，肿瘤是乳腺癌。

本发明的典型优选实施方案在于通过检查来自个体受试生物样品中EECP基因表达来发现个体肿瘤，随后检查那些与破坏的组织结构和/或失控的细胞生长相关的因素，如果来自个体受试生物样品中的EECP基因表达和与破坏的组织结构和/或失控的细胞生长相关的因素之间存在一致则指示肿瘤存在。与失控的细胞生长相关的各种因素可作为其它因素，例如与失控的细胞生长相关的基因(包含粘蛋白、层粘连蛋白-5、PSA、PSCA和PSM)的表达以及细胞学观察(例如见Pyke et al.CancerRes.1995 Sep.15；55(18)：4132-9；Bocking et al.，Anal Quant Cytol.6(2)：74-88(1984)；Eptsein，Hum Pathol.1995 February；26(2)：223-9(1995)；Thorson et al.，Mod Pathol.1998 June；11(6)：543-51；Baisden et al.，Am J Surg Pathol.23(8)：918-24 91999))。本发明方法的特别优选的肿瘤是前列腺癌，其次是乳腺癌。这个方法的特定实施方案中，Southern分析、Northern分析、聚合酶链式反应分析和免疫分析(例如ELISA)用于检查EECP mRNA表达的水平或EECP蛋白表达的水平。

发现与EECP相互作用的分子

在此公开的EECP蛋白序列允许熟练的技术人员采用任一公认的方案发现与它们相互作用的分子。例如可以利用一个所谓相互作用诱捕系统(也称“双杂交试验”)。在该系统中，分子相互作用重构成转录因子并指导报告基因的表达，然后分析其表达。在体内通过真核转录激活因子的重构鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的典型系统已在U.S.Pat.Nos.5,955,280,5,925,523,5,846,722和6,004,746中公开。

可以通过检测可能与EECP反应的已知分子(基于类似分子的观察，例如PSA)例如血浆(血清)和精液中丝氨酸蛋白酶抑制剂，筛选与EECP蛋白序列相互作用的分子。另外，可以通过筛选肽库发现与EECP蛋白序列相互作用的分子。在这些方法中，通过筛选编码随机或受控集合的氨基酸的文库鉴定与选定受体分子如EECP结合的肽。具有各种各样用途的肽，例如治疗或诊断试剂，可以在没有任何有关配体或受体分子的预期结构信息的条件下被发现。可用于发现与EECP蛋白序列相互作用分子的典型肽文库和筛选方法已在U.S.Pat.Nos.5,723,286和5,733,731中公开。

另外，表达EECP的细胞系可用于鉴定由EECP介导的蛋白质-蛋白质相互作用。这种可能性可以使用本领域公知的免疫沉淀技术检测，也见Hamilton，B.J.，et al.，1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.261：646-51。典型EECP蛋白可以使用抗EECP抗体与表达EECP的前列腺癌或乳腺癌细胞系和/或这些细胞系的分泌物发生免疫沉淀。另外，抗His-Tag的抗体可用在工程化以表达EECP的细胞系中(上面提到的载体)。免疫沉淀的复合体可通过Western印迹法、蛋白质的³⁵S-甲硫氨酸标记、蛋白质微测序、银染和双向凝胶电泳检测。

这种筛选实验的相关实施方案包括鉴定与EECP相互作用的小分子的方法。典型的方法例如在U.S.Pat.No.5,928,868中讨论，包括形成杂合配体，其中至少一个配体是小分子。示例性的实施方案中，将可形成杂合配体的第一和第二表达载体导入细胞。每个表达载体分别含表达杂合配体的DNA。此外该细胞包含一个报告基因，该报告基因只在第一和第二杂合配体彼此结合时有条件的表达，这只发生在杂合配体与其靶位点结合时。然后通过筛选表达报告基因的细胞，鉴定未知的小分子和未知的杂合蛋白。

本发明的典型实施方案由筛选与如图2所示EECP氨基酸序列相互作用的分子的方法组成，包括将一组分子与EECP氨基酸序列接触，使这组分子在促进相互作用的条件下与EECP氨基酸序列发生相互作用，以确定能与EECP氨基酸序列发生相互作用的分子的存在，并将与EECP氨基酸序列相互作用的分子和不与EECP氨基酸序列相互作用的分子分离。特定的实施方案中，该方法进一步包括纯化与EECP氨基酸序列相互作用的分子。在优选的实施方案中，EECP氨基酸序列与肽库接触。

试剂盒

本发明进一步提供为以上描述或建议的诊断和治疗应用的试剂盒。这种的试剂盒是一个有分区的盒子，这些分区用来放一个或多个容器，例如小瓶、管子等，每个容器载有一个该方法中使用的单独的成分。例如其中一个容器可载有编码EECP蛋白的载体。另外的一个容器内载有标记的或可检测标记的探针。这种探针可以是分别对EECP蛋白或基因/mRNA特异的抗体(例如用在ELISA测试法中)或多核苷酸。试剂盒利用核酸杂交发现靶核酸时，试剂盒也包含扩增靶核酸序列的核苷酸和/或含报告分子的容器，所述报告分子例如生物素结合蛋白质、例如抗生物素蛋白或链霉素抗生物素蛋白，例如酶、荧光素或放射性同位素标记物。

本发明的试剂盒典型地包括以上描述的容器，和一个或多个其它从商业上或使用者角度需要的物质的容器，所述物质包括缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和其中的使用说明书。容器上可以有标签以指示组合物用于特殊的治疗或非治疗性应用，也可以指示其为体内或体外使用。

实施例

实施例1

通过克隆分离与EECP基因相应的cDNA及表达分析

材料和方法

细胞系和人体组织

所有细胞系培养在含10％胎牛血清的DMEM中。

用于RNA和蛋白质分析的人体组织源自患者。

RNA分离：

将肿瘤组织和细胞系在Trizol试剂(Life Technologies，Gibco BRL)中匀浆以分离总RNA，每g组织使用10ml Trizol，或每10⁸细胞使用10ml Trizol。使用Qiagen′sOligotex mRNA Mini和Midi装试剂盒，从总RNA纯化Poly A RNA。总RNA和mRNA通过分光光度法分析(O.D.260/280nm)定量和凝胶电泳分析。

对前列腺癌组织和对应的正常组织进行差异显示，使用5′引物HAP42与3′引物HT11C，根据GenHunter方案并如Liang et al [Liang，1998]描述的进行。分离差异带，使用相应的引物再扩增，通过琼脂糖凝胶电泳验证，并克隆到pGEMt-easy载体上(Promega)。每一条带在液体培养物中扩增8个菌落。2微升培养物用于PCR，在和扩增条件相同的条件下，使用pGEME 1和2引物(分别是5’-CGCGGTACC GGATCC ATG CAT TGG CGG CCG CGG GAA TTC-3’和5’-CGC GGT ACC GGATCC ATG CAT CAT ATG GTC GAC CTG CAG-3’)。用琼脂糖凝胶电泳证实PCR产物。

使用BLAST搜索算法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对克隆进行序列分析，表明它由对应于人染色体16，粘粒克隆352F10(LANL)(AC005361)上序列的片段组成。

实施例2

Reverse Northern分析和传统Northern分析

为通过Reverse Northern杂交检出阳性克隆，根据厂商说明书使用％孔的真空驱动的dot blot manifold(Bio-Rad)，直接将DNA点印在硝酸纤维素膜(Hybond N+Amersham)上。将膜变性(1.5M NaCl，0.5M NaOH)和中和(1.5M NaCl，0.5MTris-HCl pH 7.2，0.001M EDTA)，然后紫外交联。由于患者RNA的量有限，使用Clontech的SMART cDNA合成系统进行逆转录并且扩增总RNA作为探针使用。使用0.2ug总RNA合成第一条链，控制循环次数进行扩增以确保线性。使用100ng的SMART cDNA进行标记，并与所获得的每组克隆进行杂交，混合引物是那些在最初差异显示法中产生亚克隆时使用的，此处为HAP42和HT11C。通过Sephadex G50柱(Biorad)纯化探针。滤瞙在10％硫酸葡聚糖/0.1％SDS/10mM NaCl中65℃杂交过夜，65℃、0.2×SSC/0.1％SDS严格洗涤，-80℃ Biomax胶片上曝光3-24小时，接下来在Fuji phosphoimage screens及Typhoon phosphoimage analyser上定量。然后从原液体培养物中扩增阳性克隆，使用标准碱裂解方法提取质粒DNA，然后通过Nucleospin miniprep 柱提纯。对克隆序列进行测序。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast使用BLAST分析所有的序列。

传统Northern分析：使用Trizol从组织样品中提取总RNA。将20g的RNA进行琼脂糖/6％甲醛凝胶电泳，随后转移到尼龙膜上(Hybond N+，Amersham)。根据制造商的说明书将膜在42℃、50％甲酰胺中预杂交/杂交。使用Rediprime系统(Amersham)制备探针。膜杂交后，50℃、0.1×SSPE/0.1％SDS严格洗涤，然后X光片(柯达)曝光适当的时间。

实施例3

克隆全长EECP cDNA

分离实施例1所述的条带并将它克隆入pGEMt-easy载体，该克隆包含已产生的原差异显示的片段，通过Reverse Northern分析和传统Northern分析鉴定所述克隆。使用5′/3′RACE PCR方法从正常前列腺的基因文库(Clontech)扩增并克隆全长EECP cDNA。

全长EECP cDNA由四个外显子组成，定位于染色体16p12.3(图3)。对公众可利用的基因组数据的广泛搜索没有发现该基因的共生同源物或直向同源物(＞30％一致性)(http://www.tigr.org的小鼠、大鼠、爪蟾、果蝇和线虫，http://www.ensembl.org的小鼠和大鼠)。EECP在人类中无接近的同源物，在大鼠和小鼠中只有远同源物。在NCBI的SWISSPROT数据库中，通过蛋白质-蛋白质BLAST分析将EECP蛋白与其最接近的同源物进行比对。大鼠对应基因：大鼠前列腺精胺结合蛋白前体(Ratprostatic spermine-binding protein precursor，SBP)。Accession P08723(BLAST-致性＝37/139(26％)，阳性＝66/139(46％)，间隙＝4/139(2％))。小鼠对应基因：小鼠主要前列腺分泌型糖蛋白(Mouse major prostatic secretory glycoprotein，p25)。Accession X06246(BLAST一致性＝34/134(25％)，阳性＝60/134(44％)，间隙＝3/134(2％))。在http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html使用multalin软件进行对比。

实施例4

EECP RNA表达

原位杂交：在石蜡包埋切片上进行原位杂交，所述切片取自前列腺肿瘤和其周围的组织，及同一患者的组织学上正常的前列腺组织。从EECP-pGEMTeasy制备探针，原位杂交根据Niedereither and Dollé，1998[Niedereither，1998]中描述的步骤进行。

多组织表达芯片：根据厂商的说明书用人的多种组织表达(MTE^TM)芯片2(Clontech)检测。通过PCR标记([³²P]-dCTP)的全长EECP cDNA为探针与该芯片进行杂交。过夜曝光于Fuji磷成像屏之后，使用Typhoon ImageQuant软件定量分析。

在正常前列腺样品中发现预期大小的EECP mRNA，而在前列腺肿瘤中没有发现。总RNA印迹与EECP杂交并以36B4基因作为对照。样品包括正常前列腺(N)和前列腺癌(T)。基于18S和28S核醣体条带位置的RNA大小，和与36B4基因的相对关系，EECP mRNA的大小确定为700-800bp。在人类多组织表达芯片(MTE^TMClontech)中，使用EECP cDNA探针。

实施例5

产生EECP多克隆和单克隆抗体的EECP蛋白的特征(图2)

EECPmRNA的推定翻译显示了四个潜在的甲硫氨酸翻译启动密码子(图1)，都没有清楚的Kozac共有序列侧翼。因此为了帮助确定正确的翻译起点，制备了三个抗体，一个跨越氨基酸19-32，第二个跨越氨基酸55-75，第三跨越氨基酸178-193。这些抗体首先在通过将表达载体转染进Du145细胞中产生的EECP蛋白进行测试。构建的转染蛋白EECP包含所有的四个5′甲硫氨酸。所有的三种抗体容易并特异性的检测到Du145细胞裂解物中的外源EECP，条件培养基中的内源分泌性EECP和来自后尿道分泌物的天然EECP。因此基本确定EECP是由第一个甲硫氨酸翻译，虽然存在另一种可能性：EECP是作为缩短型产生的，并且5′氨基酸在分泌之前断裂掉。基本确定EECP蛋白是208氨基酸的蛋白质，预测的分子量为25kD。对序列中潜在的结构域和功能片段/指纹等的搜索没有发现与已知功能片段的显著的同源性(http://motif.genome.ad.jp/)。

EECP代表前列腺癌和乳腺癌潜在的治疗靶点。作为细胞表面相关抗原和分泌性蛋白，它可能是抗体治疗的特别好的靶点。为了探究这种可能性和进一步鉴定EECP蛋白，制备了抗GST-EECP融合蛋白质的单克隆抗体。分别针对蛋白质的第1-30氨基酸，50-80氨基酸和170-195氨基酸区域制备了小鼠单克隆抗体。通过PCR产生GST-融合蛋白质。将PCR产物插入pGEX-4T-3内。纯化GST-融合蛋白质并用于免疫小鼠。

用纯化的GST-EECP免疫小鼠并产生杂交瘤。使用EECP转染的Du145细胞的裂解物，通过Western印迹法筛选产生特异性抗体的杂交瘤上清液。由极限稀释获得亚克隆，并由Western印迹筛选。通过Western印迹法鉴定了七种特异性识别EECP的杂交瘤。

实施例6

EECP被前列腺癌和乳腺癌细胞释放到其培养液内，并由蛋白酶降解

选择EECP转染的Du145细胞系；没有转染的Du145、LNCap、22RV1和T47D细胞系。收集那些细胞系的培养液。使用抗-EECP单克隆抗体通过免疫沉淀法和Western印迹法分析培养液以检测EECP蛋白的存在。结果清楚的检测到这些细胞的培养基中的EECP蛋白(图6)。存在于培养基中的EECP量与加入培养基中的蛋白酶抑制剂量直接相关，随蛋白酶抑制剂的剂量增加而增加。

实施例7

EECP在基底层上皮细胞高表达，较少量表达于正常前列腺的分泌性上皮。表达水平在前列腺癌肿瘤细胞中显著地减少。此外，在肿瘤组织中的表达水平是不均一的。

用免疫组织化学分析检查前列腺的肿瘤活检标本和外科手术切除标本中的EECP表达。

临床标本分析显示所有正常前列腺的基底层上皮呈强染色，分泌细胞的腺腔面也出现较强的信号(图8)。前列腺组织染色是特异的，因为GST-EECP免疫原可竞争性抑制前列腺癌的组织染色，而单独的GST不能抑制。与PSA类似，发现EECP蛋白在腺腔内和导管内积聚，指示EECP蛋白质是由分泌上皮分泌的。

与相应的前列腺正常部分比较，发现前列腺癌变腺泡中EECP蛋白低水平表达。此外，在肿瘤细胞中EECP的表达是不均一的：约60％的癌变细胞失去EECP的表达。

对一些非前列腺组织的分析显示在大多数组织中没有染色，包括表达一些EECP mRNA信息的肾和肺。在正常的胰腺样品、正常乳腺组织和乳腺癌组织中发现EECP蛋白表达。正常乳腺的染色主要出现在腺体的分泌细胞和导管细胞中(图11)。乳腺癌组织中的染色通常比正常乳腺组织中的更深。导管内有显著的EECP积聚，这进一步提供了该蛋白是分泌性的证据。此外，如举例的，在乳腺癌中组织结构被破坏，这可能造成EECP漏入血流。

实施例8

观察生物(血浆/血清)样品中的EECP水平

为了确定EECP蛋白的水平是否在前列腺癌和乳腺癌中有生物上的和临床上的实用性，监测临床前列腺癌和乳腺癌患者血浆(血清)样品EECP蛋白表达。重要的是女性的EECP表达水平大大低于正常男性水平，强烈提示血液中的EECP水平主要与男性生殖器官的EECP内源性分泌有关。用抗EECP抗体通过Western印迹法对人类男性血浆样品的分析证明25kD EECP全长蛋白质在“正常”和“BPH(良性前列腺增生)”患者的血浆中高表达，但是不在“前列腺癌”和“具有转移的前列腺癌”中表达(图10)。“前列腺癌”和“具有转移的前列腺癌”患者的血浆(血清)中EECP的缺失可能是被蛋白酶降解的结果，而那些蛋白酶是从前列腺大量释放入循环系统内的。而且这一释放过程是由于肿瘤组织中基底膜和其它组织结构的破坏而产生的。此外，与“前列腺癌”的“不可检测的”EECP水平比较时，在一些“转移”病例中有EECP的“可发检测的”水平。这一结果证明EECP血浆(血清)水平也可用作前列腺癌预后和临床治疗效果判断的标志物。同时，用抗EECP抗体Western印迹分析女性的血浆样品证明，“正常”病例血浆中的25kD EECP全长蛋白质仅有极低的表达水平，但是在“乳腺癌”和“具有转移的乳腺癌”的血浆中明显比较高(图12)。与前列腺癌相反，这些在“乳腺癌”和“具有转移的乳腺癌”病例的血浆(血清)中新的分泌型EECP在血浆(血清)中积聚是因为缺少足够量的从乳腺癌组织释放入循环系统的蛋白酶。在肿瘤和正常血浆(血清)样品发现不同的EECP水平提示EECP可能是前列腺癌和乳腺癌的血浆(血清)诊断标志物。

实施例9

确定EECP作为前列腺和乳腺癌诊断和/或治疗靶点的方法学

可用本领域公知的各种方法来鉴定和定量前列腺癌和乳腺癌患者的临床体液中的EECP蛋白，使其作为前列腺和乳腺癌诊断和/或治疗靶点。例如，利用现有的一组单克隆抗体进一步建立敏感ELISA。这样的ELISA方案已在Current Protocols InMolecular Biology，Unit 11，Frederick M.Ausubul et al.eds.，1995中描述。另外，本领域的技术人员可以分析临床样品的光谱来评估EECP表达及其复合体的形成，例如使用免疫沉淀和Western方法。这样的方法已在Current Protocols In MolecularBiology，Unit 10，Frederick M.Ausubul et al.eds.，1995中描述。此外，可以制备一系列针对EECP蛋白的不同部分的单克隆抗体。

除此之外，可用本领域公知的各种方法来检测和鉴定血浆(血清)和精液中高分子量EECP免疫反应带。例如本领域的技术人员可以筛选一系列已知的可能与EECP发生相互作用的分子(基于对相似分子如PSA的观察)，例如血浆(血清)和精液丝氨酸蛋白酶抑制剂来发现EECP复合体形成。这种候选分子也包含α-1-抗胰凝乳蛋白酶(血浆中PSA和hK2复合体)、蛋白质C抑制剂(精液中PSA和hK2复合体)、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-抗纤溶酶、抗凝血酶3和其它丝氨酸蛋白酶抑制剂。此外，可以使用已知的蛋白质纯化(例如亲和柱)和测序技术对结合配体进行分离和测序。

除此之外，可用本领域公知的各种方法学来发现和鉴定特异性针对EECP的特定蛋白酶的蛋白水解活性和底物特异性。尤其，使用纯化的或重组的EECP，可采用蛋白酶测试法检查EECP多肽对体外和体内肿瘤生长的作用。除此之外，使用已知的技术，荧光肽底物可用于确定断裂特异性。

除此之外，可用本领域公知的各种方法学来检查抗EECP单克隆抗体、EECP蛋白和/或EECP重组蛋白质对肿瘤生长的体内外作用。

此外，可检查这些分子对体外增殖/侵袭/集落生长的作用。例如使用本领域公知的Matrigel实验作为肿瘤模型(例如见Bae et al.，Breast Cancer Res.Tret.24(3)：241-55(1993))。

<110>郑鸿

<120>一种多肽、编码它的核酸分子及用途

<130>IP062677sh

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

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<212>多肽

<213>人

Claims (1)

1.SEQ ID NO：3所示氨基酸序列之多肽的单克隆抗体或多克隆抗体在制备诊断前列腺癌或乳腺癌的试剂、试剂盒或装置中的用途。

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