JPH05505530A

JPH05505530A - 癌、特に悪性乳癌のための分析標識

Info

Publication number: JPH05505530A
Application number: JP92501188A
Authority: JP
Inventors: バセー，ポール; ベロック，ジャン―ピエール; シャンボン，ピエール
Original assignee: アンスティテュ・ナシオナル・ド・ラ・サンテ・エ・ド・ラ・ルシェルシュ・メディカル　（アンセルム）
Priority date: 1990-11-21
Filing date: 1991-11-21
Publication date: 1993-08-19
Anticipated expiration: 2019-04-05
Also published as: NZ240688A; PT99562B; WO1992009701A1; ES2101079T3; DE69125824D1; ZA919219B; NZ260705A; GB2250993B; DK0513316T3; ATE152179T1; DE69125824T2; EP0513316A1; IE914056A1; GR3023560T3; PT99562A; US5236844A; HU215165B; HU9202368D0; EP0513316B1; JP3516448B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】癌、特に悪性乳癌のための分析標識本発明は腫瘍関連酵素標識（マーカー）に関する。

本発明は、ストロメリンン−３（Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−３）をコードするＤＮＡおよびストロメリンン−３に結合し得る抗体を使用することにより、癌、具体的には悪性乳癌の診断法を提供するものである。

世界中の癌による死亡数は毎年主たる懸念材料であり続けており、特定の型の癌について数種の治療法が利用できるだけであって、またこれらが成功するという絶対的な保証もない。はとんどの治療は迅速に成長する細胞を死滅させる一般的な“ショｙトガン”法に頼っており、この方法は迅速に成長する癌細胞がこの治療によって死滅するか、もしくは少なくとも癌細胞数が減少することによってその身体の系による残りの癌細胞の排除が可能になるであろうことを期待するものである。

治療法の探索は、異なる形態の癌が異なる治療を必要とするという発見によって妨げられてきた。身体のほとんど全ての部分が癌に冒され得るとすれば、その課題は膨大なものになる。

しかしながら、それらの相違にもかかわらず癌はいくつかの類似点をも有している。その中で最も重要なことは非分化組織の成長である。しかしこれは、ある種の癌細胞がある程度の分化を示すという点て１００％正確な訳ではない。これは乳癌や精巣癌なとの性感て示されており、この場合腫瘍はホルモン受容体に関して陽性の場合もあり、陰性の場合もある。これらの腫瘍の治療はホルモン状態に依存し、タモキシフェンＴＩ″などの関連ホルモン拮抗薬を投与する程度に単純な場合もある。

はとんどの癌か共有しているもう１つの要素は、致死的であるためには癌が転移しなければならないということである。転移か起こる時までは、腫瘍はそれが悪性であっても身体の一領域に限定される。これは不快および／または痛みをもたらしたり、あるいはさらに重度な兆候を導くことさえあるか、その位置が特定できるのであれば、それを外科的に除去することができ、また十分な注意を払えば、さらなる問題を引き起こさない。

しかしいったん転移か始まれば、外科的切除によって原腫瘍を切除することはできるであろうか、癌細胞はその身体に侵入し終わっており、成功の見込みがあるのは化学療法か、もしくは特定の形態の標的療法のいくつかだけである。

したがって、局部的に侵入する可能性と一次腫瘍から離れた器官に転移する（腫瘍進行）可能性はほとんどの癌の過程において致命的な事象である。−次腫瘍を取り巻く細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の変性／分解および腫瘍細胞接着特性の変化は、転移性細胞の一次腫瘍細胞からの解離にとって極めて重要であることが知られている（Ｌｉｏｔｔａ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４６：１−７（１９８６）　：　Ｈａｒｔら＋　Ｂｉｏｃｈｉａ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ＝ @９８９・６５−８４（１９１１１９））。

腫瘍脈管形成は一次腫瘍の拡大と転移性腫瘍の広がりの両方にとって必須であり、脈管形成６体はＥＣＭ分解を必要とする（Ｂｌｏｏｄら、ＢｉｏｃｈｉＩＩｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　１０３２：８９−１１８（１９９０））。したがって悪性は、新生物細胞とその環境がその病理学的過程において決定的な役割を果す全身性疾患である（Ｆｉｄｌｅｒ、　［、Ｊ、　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖ、　５：２９−４９＜１９８６））。

悪性腫瘍に伴う遺伝子発現の変化の同定は、＠瘍の進行に関与するものも含めて、明らかに、癌を完全に理解するためたけてなく、癌に対する新しい合理的療法を開発するためにも欠くことのできない前提条件である。細胞遺伝子の２つの群（癌原遺伝子群および腫瘍抑圧遺伝子群）の発現の変異および／または異常制御が、多段階の過程で正常な成長制御の欠失を導き、転換した細胞表現型の獲得を導くことが示されている（ｌｌｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４９：３７１３−３７２１（１９８９戸。しかし腫瘍の進行を導く分子機構についてははるかに不明瞭である（！ｌｏｗｅｌｌ、　Ｐ、　Ｃ，、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４６：２２０３−２２０７（１９８６）　；　Ｆｉｄｌｅｒ、　１．　Ｊ、　、　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　１０：６７３−６８０（１９８９））。

したがって、癌細胞に特有の遺伝子が異常に発現した宿主遺伝子であることが極めて多いという点で新たな問題が生じる。極めて多くの場合、ある与えられた癌に関して特定のタンパク質標識がその癌中で過剰発現するが、この標識はその身体中の別の場所でも低レベルであるとはいえ発現する。

癌に関連するタンパク質のいくつかは、細胞群を互いに適切な関係に保つために重要な細胞外マトリックスを破壊する酵素である。

このような酵素の１種は金属プロテイナーゼ（ＭＭＰ）類（Ｍａｔｒｉｓｉａｎ。

Ｌ、　Ｍ、　、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、　ｆｉ：１２１−１２５（１９９０りであり、これらは亜鉛を結合するのてこのように呼ばれている。しかし、いくつかの存在が暗示され得るとはいうものの、癌あるいは特定の腫瘍の症状を示すことがわかっているものはなかった。

ＭＭＰ類は、ＥＣＭ改造および細胞移転が関係するい（つかの生理学的および病理学的過程（例えば形態発生および胚発育、リウマトイド関節炎、および腫瘍の浸潤および転移など）に関与する。ＭＭＰ阻害剤は、腫瘍の進行にとって極めて重要な騰瘍漫潤および脈管形成を実験モデル中で遮断し得ることが知られている。

マトリックス金属プロテイナーゼファミリー（族）の構成要素はすべてＥＣＭの少なくとも一成分を分解するプロテイナーゼであり、潜在型で分泌され、活性になるためには（例えばプラスミンによる）タンパク加水分解などの活性化を必要とする。間質コラーゲナーゼ類は結合組織コラ−ケン類（■から■まて）を特異的に攻撃し、一方、■型コラーゲナーゼ類（７２ｋＤおよび９２ｋＤ）はフィブロネクチンおよび基底膜中に存在するコラーゲンを分解する。ストロメリンン類（トランシン（ｔｒａｎｓｉｎ）類）−１および−２、モしてボンブー１　（ｐｕｍｐ−１）も、はるかに広い基質特異性を有し、プロテオグリカン類、ラミニン（１ａａ＋１ｎｉｎ）、フィブロネクチン、およびコラーゲン類（■から■まで）を分解する。

男性の場合悪性腫瘍のほとんどは癌腫であり、非喫煙者のなかでは乳癌が女性の癌による死亡率の主たる原因である（Ｗｉｌｌｅｔｔ、　Ｗ、　、　Ｎａｔｕｒｅ　３３８：３８９−３９４（１９８９））。数種の肺癌遺伝子の発現が悪性孔細胞およびＭ病中で変化することが報告されているが、−貫して乳癌に伴い得る特定の腫瘍遺伝子／抑圧遺伝子発現様式はない（Ｇｕｌｌｉｃｋ、　Ｗ。

Ｊ、　、　Ｐｒｏｇ、　Ｇｒｏｗｔｈ、　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｓ、　２　：　ｌ −１３（１９９０乃。

しかし乳腫病の新生物細胞はしばしば、その増殖の制御と転移能にとって重要でもあり得る脂肪および間葉支質中に埋め込まれている。実際、支質細胞か正常な乳房上皮の成長を正負両方に変調させ得ることか知られており（Ｓａｌｏｍｏｎら、“Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ：Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｌｉｐｐｍａｎ、　Ｍ、　Ｅ、およびＤｉｃｋｓｏｎ、　Ｒ，Ｂ、編）、　３６３〜３８９頁（Ｋｌｕｗｅｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　（１９８８）））、また上皮と支質成分との相互作用が乳腺における上皮発癌に影響を与え得ることが知られている（ＤｅＯｍｅら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３８：２１０３−２１１１（１９７ｇ））。

悪性乳腫病中に“活性化された″（Ｔｒｅｍｂｌａｙ、　Ｇ、　ＥＸＩ）、　Ｍｏ１．　Ｐａｔｈｏｌ、　３１　：２４ｇ−２６０（１９７９））および／または異常な（Ｇｒｅｙら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８６：２４３８−２４４２（１９８９））線維芽細胞が存在することが推測されており、乳癌は支質要求に対する依存性からの部分的逸脱または支質成分に対する異常に強い応答を表すのであろうと提唱されてきた。

癌組織の性質ゆえに、ある与えられた癌の連続的培養または株化細胞を作成（この操作により、ある与えられた治療法の効果の研究が容易になる）することは比較的簡単である。このような系の少なからぬ欠点はその性質そのものにある。試験的処置はそれが細胞に対して直接作用し得るかどうかを明確にするであろうが、その処置が生体内でどのような効果を有するかは決して明確ではな（、またこのような株の生化学的分析は必然的に、通常生体内の腫瘍を取り巻いている組織の非存在下で行うことになる。

本発明の目的は、乳癌肺中で発現か増大し、それによって乳癌腫かその周辺支質と相互作用する悪性上皮細胞とみなされる遺伝子を同定することにある。

本発明者らは過去に特徴づけられたことのないあるタンパク質か、ある種の浸潤性感、具体的には乳癌腫、頭部および首部偏平上皮細胞癌腫および皮膚（偏平および基底細胞型）癌腫の症状を示すことを新たに発見した。このタンパク質は見かけ土金属プロテイナーゼ群に属し、ここではこれをストロメリシン−３と呼ぶ。

実施例１に記述するように、Ｃ１乳癌腫および線維腺腫細胞から得たＲＮＡホレート（ｂｏｌａｔｅ）を別個に単離した４種のｃＤＮＡプローブを用いてプローブした。

暉７．ストロメリンンー３　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列ストロメリンン−３のｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を表す。下線を引いたヌクレオチド配列は５′末端から順に：推定シグナルペプチド；プロ金属プロテイナーゼに特有のＰＲＣＧＢＰＤ配列、亜鉛結合ドメインの保存されたヒスチジン残基およびポリ（Ａ゛）シグナル配列に対応する。

Ｚ溢：金属プロテイナーゼ配列の比較実施例３に記述するように、すべて推定上の金属プロテイナーゼであるストロメリシン−３、ストロメリシンー２、ストロメリンン＝１およびコラ−ゲナーゼ− １を並列し、比較する。

図４：ヒト金属プロテイナーゼのノーザンプロット分析４種のエストロゲン受容体陰性孔癌腫（Ｃ１，グレードＩＩ；Ｃ２゜Ｃ３およびＣ４，グレード■）、６種のエストロゲン受容体陽性孔癌腫（Ｃ５，Ｃ８およびＣ９，グレードＩ１．Ｃ６およびＣ７，グレード■；Ｃｉｏ、グレード■）および４種の乳線維腺腫（Ｆ２〜Ｆ５）から全ＲＮＡを調製した。

そのＲＮＡを（ａ）ストロメリ／ンー３　ＲＮＡ、（ｂ）１型コラーケナーゼＲＮＡ（Ｃｏｔ）、（ｃ）９２ｋｄ４型コラーゲナーセＲＮＡ（Ｃ０１Ｖ９２ｋ）、（ｄ）７２ｋｄ４型コラ−ゲナーゼＲＮＡ（ＣＯＩＶ　７２ｋ）、（ｅ）ストロメリシン−１および２　ＲＮＡ（ＳＴＩ／２）およびボンブーＩ　ＲＮＡ（ＰＵＩ）で実施例４に記述するようにプローブした。

（ａ）乳癌患者から得た５種の転移性腋窩リンパ節および３種の正常腋窩リンパ節；（ｂ）４種のエストロゲン受容体陰性乳癌肺株（ＢＴ−２０，ＭＤＡ−２３１，Ｓ　Ｋ−Ｂ　Ｒ−３，ＨＢ　Ｌ−１００）および４種のエストロゲン受容体陽性乳癌腫株（Ｔ−４７Ｄ、　Ｂ　Ｔ−４７４，Ｚ　Ｒ−７５−１，ＭＣＦ−７）；（ｃ）１０種の正常ヒト組織；および（ｄ）血清非含培地（１および２）中ｔＰＡ非存在下（１）またはｔＰＡ存在下（２）で培養した、２０　＋ｎｇ／　ｍ（ｊインシュリンを補足した血清非含培地（３〜６）中、ＰＤＧＦ非存在下（３）またはＰＤＧＦ存在下（４）、ＥＧＦ存在下（５）、あるいはｂＦＧＦ存在下（６）で培養した、ＨＦＬ−１ヒト胎児テプロイド線維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　１５３）、をストロノリシン−３配列で実施例５に記述するようにプローブした。

ヘマトキンリンで染色した組織切片の明視野顕微鏡写真（ｘｌ。

０）（Ａ、Ｃ，Ｅ、Ｇ、ＩおよびＫ）：ならびに、実施例６に記述するように原位置でアンチセンス・ストロメリンン−３ｃＲＮＡとハイブリッド形成させた後の同切片（やはりへマドキシリンで染色したもの）の暗視野画像（Ｂ、　Ｄ、Ｆ、　Ｈ，ＪおよびＬ）。

２ユニマウスＳＴ３　ｃＤＮＡのｃＤＮＡ配列マウスＳＴ３遺伝子のｃＤＮＡ配列およびヒトＳＴ３　ｃＤＮＡ配列との比較。

本発明は第１の側面として、ストロメリシン−３またはストロメリシン−３をコードするヌクレオチド配列の検出からなる浸潤性感、具体的には胸部、頭部および首部、ならびに皮膚の癌腫の診断法を提供する。

本発明はもう１つの側面として、浸潤性感、具体的には胸部、頭部および首部、ならびに皮膚の癌挿の治療または予防における、ストロメリ／ンー３の合成または活性を妨害する薬剤の使用を提供する。

転移性腫瘍は浸潤性であるが、浸潤性腫瘍か必ずしも転移性ではない（例えば基底細胞皮膚癌＠）ことは理解されるであろう。

ストコメリシン−３遺伝子の発現はＥＣＭ分解の領域に特異的であり、見かけ土金属プロテイナーゼをコードしているので、そのＥＣＭ分解活性は腫瘍の転移への進行にとって極めて重要であると考えられる。支質細胞によるストロメリシン −３の発現はＥＣＭ（７）！要な部分を破壊し、それによって癌細胞が原腫瘍から転移することを可能にすると思われる。

したがってストロメリンン−３の活性に影響を与え得る薬剤は転移に対する効果を有するであろう。そのような薬剤は、該タンパク質の合成を阻害するか、該タンパク質の成熟を阻害するか、あるいは該酵素の活性を遮断もしくは変化させることによってその活性を変化させるものか適しているであろう。

ストコメリシン−３遺伝子の発現が転移相にある乳癌の症状を示すことが初めてわかった。実際、この結果は切除された種々の腫瘍中のｍＲＮＡを検出することによって達成された。乳癌は非喫煙女性集団において癌による最も高い死亡率の原因であるので、乳癌を選択した。

ストロメリシン−３はほぼ確実にＭＭＰファミリーに属する新規タンパク質であり、ホルモン状態にかかわらず浸潤性乳癌腫に関与している。

ＭＶＰファミリーの構成要素は活性になるために活性化過程を必要とし、この過程にはプレーおよびブロー配列の除去が関与し得る。ブローおよび成熟−ストロメリシン−３のアミノ酸配列は過去に特徴づけられたＭＭＰ類のものとは著しく異なっており、成熟化、活性化およびＥＣＭ成分に対する特異性に関して異なる特性を示し得る。

ストロメリ／ンー３遺伝子はすべての一次浸潤性乳癌腫によって発現され、またその転移部のいくつかによっても発現され、そのような発現について分析された広範なＥＣＭ改造が起こることか知られている組織（子宮、胎盤、および肢芽）中でも発現されるか、乳線維腺挿および正常成人組織中では発現されない。このことはストロメリ／ンー３遺伝子産物が乳癌の進行において重要な役割を果すことを示唆している。またこの概念と一致して、通学前浸潤性病巣と見なされしばしば微小浸潤に関連するコメド型の原位置癌腫を除いて、ストロメリ／ンー３遺伝子はほとんどの原位置乳癌肺中で発現されない。したがって、その身体中の子宮または胎盤以外の別の場所に認められるような低濃度ではないストロメリシン −３ＲＮＡ転写物の存在は、転移性癌または浸潤性になる危険の高い癌の症状を示す。

ストロメリノン−３は浸潤性感成長に伴うと思われる溶解過程に関与し得る。あるいは、はとんどの浸潤性乳癌病巣に伴い、悪性細胞のさらなる拡大を防止するための宿主反応を表す結合織線維増生の形成において、ストロメリンン−３がある役割を果すことも考えられる（Ａｈａｍｅｄ、　Ａ、　、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ａｎｎｕ、　２５（Ｐｔ２）　：２３７−２８６（１９９０））。このような場合には、ストコメリシン−３活性の増大か有利であろう。

さらに、新生物細胞群（島）のすく周囲の支質線維芽細胞におけるストツメリシン−３遺伝子の限定された発現は、いくつかの腫瘍形成性細胞の悪性変換に関連することか知られているもう１つの金属プロテイナーゼであるコーラ−ゲナーゼ ■、および乳癌肺中でその発現が増大するリゾソームのアスパルチルプロテアーゼであるカセグレンＤ（両酵素とも線維芽細胞中では発現されないが、乳癌の新生物上皮細胞中で発現される）とは対照的である（Ｍｏｎｔｅａｇｕｄｏら、　Ａｍ。

Ｊ、　Ｐｈａｔｈｏｌ、　１３６：５８５−５９２（１９９０）　；　Ｇａｒｃｉａら、　５ｔｅｒｏｉｄ　ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ、　２７：S３９ −４４５（１９８７））。

新規乳癌標識を同定するために、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、線維線種供給源から得たポリ（Ａ＋）ＲＮＡで抽出した。この操作によって、このｃＤＮＡライブラリーは転移性癌に特有の配列に関して濃縮された。

いくつかのクローンを成長させ、転移性腫瘍および線維腺腫からのポリ（Ａ’）ＲＮＡから誘導したプローブを用いてスクリーニングした。次いで、転移性癌ポリ（Ａ”）ＲＮＡから誘導したプローブに対してかなり強く結合したクローンをさらに成長させた。

この方法で作成したクローンのうちの１つは、悪性乳癌および咽頭癌、頭部、首部、および皮膚（偏平および基底細胞型）癌腫、ならびに子宮および胎盤（これらのすべてにおいてＥＣＭの破壊が起こっており、この破壊は癌と関連した場合、癌細胞がその身体中に広がること（転移）を可能にする）中にのみ認められる高い発現率の程度にまで弁別的に発現されることがわかった。

子宮および胎盤の場合にはＥＣＭの破壊が自然に起こるが、それ以外の場所で起こる同じ事象は腫瘍成長の特徴であると思われる。

また、ＥＣＭの破壊を伴う胎児の肢発芽中の指間分化にストロメリ／ンー３遺伝子の発現が認められたことに注目することも興味深い。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を特徴づけることによって、読み取り枠の存在が明らかになった。コード化されているタンパク質配列を既知のライブラリーと比較することによって、このタンパク質かＥＣＭを破壊することか知られているファミリーに属することか立証された。ストロメリ／ンー３の配列はそのファミリーの他の構成要素に対して、他の構成要素間に認められるほどの類似性を有さないが、それでもこの酵素の性質の同定に利用できるいくつかの特徴的な領域を呈示している。したがって、このタンパク質はフラーゲナーゼの一種であるかも知れないし、全く異なるＥＣＭ構成成分を破壊するのかも知れないが、このタンパク質をストロメリ／ンー３と命名した。

ストロメリシン−３ｍＲＮＡの出現を立証するためのヌクレオチドプローブを構築することによって上述の組織分布が明らかになり、また、標識化によってストコメリシン−３遺伝子の発現領域を顕微鏡写真で正確に位置決定することが可能になった。

この方法で作成した顕微鏡写真の分析によって、やや意外なことに、ストツメリシン−３遺伝子が癌細胞そのものでは発現されず、その周辺支質で発現されることが示された。ざらに支質は、腫瘍の基底膜がまだ無傷である場合にはストロメリンン−３ｍＲＮＡの証拠を全く示さなかった（図６を繋照のこと）。ストロメリ／ンー３遺伝子はすべての一次浸潤性乳癌腫によって発現され、またその転移節のいくつかによっても発現され、そのような発現について分析された広範なＥＣＭ改造が起こることが知られている組織（子宮、胎盤、および肢芽）中でも発現されるか、乳線維腺腫および正常成人組織中では発現されない。このことはストロノリシン−３遺伝子産物が乳癌の進行において重要な役割を果すことを示唆している。またこの概念と一致して、通学前浸潤性病巣と見なされしばしば微小浸潤に関連するコメド型の原位置癌腫を除いて、ストコメリシン−３遺伝子はほとんどの原位置乳癌種牛で発現されない。ストロメリシン−３は常に転移性癌の支質中に出現し、原位置−次腫瘍（まだ基底膜を有しており、浸潤性でない腫瘍）中には出現しない。したがって、その身体中の子宮または胎盤以外の別の場所に認められるような低濃度ではないストロメリシン−３ＲＮＡ転写物の存在は、転移性癌または浸潤性になる危険の高い癌の症状を示す。

さらに、ＥＲ−陽性または陰性乳癌株化細胞のいくつかはＥＧＦ／ＴＧＦ−αおよびＦＧＦ（ストロメリ／ンー３遺伝子の発現に関与する因子）に対する受容体を分泌し保持していることか知られているにもかかわらず、ストロメリ／ンー３遺伝子の発現はいずれのＥＲ−陽性または陰性乳癌株化細胞中にも検出されなかった。

したがって、ストロメリンン−３、その前駆体あるいはそれをコードするヌクレオチド配列に標準的な検出技術を適用することにより、転移性癌を診断したり、あるいは−次腫瘍がまだ致命的な転移相に達していないことを確認することができる。

このような技術にはヌクレオチドプローブを例えば上述のように用いる検出法が含まれ、またこのような技術が例えば抗体あるいはその等傷物によるストロメリンンー３タンパク質の検出から構成されていてもよい。

ヌクレオチドプローブは、添付の図２に示す配列に対して天然に存在する他の配列に対するより強くハイブリッド形成するものなら何でもよい。プローブの種類にはｃＤＮＡ、リボプローブ、合成オリコヌクレオチドおよびゲノムプローブが含まれる。使用するプローブの種類は一般に特定の状況によって決まる（例えば、原位置）・イブリッド形成のためにはりホブローブ、ノーサンブロッティングのためにはｃＤＮＡ）。最も好ましいプローブは図２のｃＤＮＡの（−）鎖に対応するものである。またストロノリシノー３遺伝子中に位置するイントロンを認識するプローブを提供することもてきるか、これがＲＮＡ転写物の検出と同程度の信頼性を有するとは限らない。

ストロメリシンー３をコードする遺伝子そのものの検出は一般的には診断目的には有効でないであろうが、転写物および他の発現産物を検出するための他の形態の検定法は一般に有用であろう。プローブはストコメリシン−３ｍＲＮＡ転写物を弁別的に認識するために必要な程度に短くてもよく、例えば１５塩基長程度でもよい。

プローブの標識化（ラベル化）の形態は適切なものであれば何でもよく、例えば３ｔｐおよびｆｆ５８などの放射性同位体を使用することができる。放射性同位体による標識化は、そのプローブが化学的に合成されたものであれ、生物学的に合成されたちのあれ、適切に標識された塩基を用いることによって達成できる。

標識化の他の形態には、ＥＬＩＳＡの特徴であるように酵素あるいは抗体標識化か含まれ得るか、標識されたプローブによるｍＲＮＡ転写物の検出には一般にＸ −ラジオグラフィーか用いられるであろう。

ＲＮＡ転写物の検出はノーサンブロッティングによって達成できる。この方法では、例えばＲＮＡの調製物を変性化アガロースゲルに流シ、適切な支持体（例：活性化セルロース、ニトロセルロースまたは硝子またはナイロン膜）に移し、次いで、放射性標識ｃ　Ｄ　ＮＡまたはＲＮＡをこの調製物にハイブリダイズさせ、洗浄し、オートラジオグラフィーで分析する。

原位置ハイブリッド形成可視化法を用いることもできる（実施例６）。この方法では　ｒ３ａ３１−標識アンチセンスｃＲＮＡプローブを生検試料の薄片とハイブリダイズさせ、洗浄し、ＲＮａｓｅで切断し、オートラジオグラフィー用感受性乳剤にさらす。この試料をヘマトキノリンで染色することにより、試料の組織学的組成を明らかにすることができ、適切な光フィルターによる暗視野画像化によって顕色乳剤が明示される。

免疫組織化学を用いて生検試料中のストロメリシン−３の発現を検出することかできる。例えば適切な抗体を細胞の薄層と接触させ、洗浄し、次いで第２の標識抗体と接触させる。標識化はペルオキシダーゼ、アビジンなどの酵素、あるいは放射性標識によって行うことができる。色素原標識は顕微鏡下で検出できるので、一般に好ましい。

より一般的に好ましい検出法は、極めて迅速に実行できる免疫検定法（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ）でタンパク質を検出することである。したがって抗体または抗体等飾物を用いてストロメリンン−３を検出することか一般に好ましいが、適切に標識されたストロメリ／ンー３基質の使用も有利であり得る。

酵素過程の生成物がそれ自体の特性として検出可能であり特徴的である場合（例えば過酸化水素など）には、基質を標識する必要はないてあろう。しかし基質の標識化が必要な場合には、基質の標識化は酵素標識化、放射性同位体による標識化、抗体標識化、蛍光標識標識化、あるいは当業者にとって容易に理解されるであろう池の適切な形態のいずれによってもよい。

最も好ましいストロメリンンー３発現の検出法は、抗体を使用する方法である。

抗体は以下に記述するようにして調製することができ、ストロメリンンー３発現の検出に適したあらゆる方法で使用できる。

抗体に基づく技術にはＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）およびＲＩＡ（放射線免疫検定法）が含まれる。このような免疫検定法には従来の操作法のいずれを使用してもよい。この操作を以下のように実行するのも適切であり得るコストロメリ７ンー３標準を放射性同位体（例、１１５■または３５Ｓ）または検定可能な酵素（例：西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）で標識し、これを非標識試料と共に対応する抗体と接触させ、そこに第２の抗体を用いて第１の抗体を結合させ、放射活性または固定化酵素を検定する（競争的検定法）か、もしくは別法として、試料中のストロメリンン−３を対応する固定化抗体と反応させ、放射性同位体または酵素で標識された抗ストロメリシンー３抗体をこの系と反応させ、放射活性または酵素を検定する（ＥＬＩＳ、〜−サンドイッチ検定法）。他の従来法も使用に適し得る。

上記の技術は基本的に“一段階”または“二段階”検定法として実行できる。“ 一段階”検定法は、抗原と固定化抗体を接触させ、洗浄することなくこの混合物を標識抗体と接触させることを伴う。“二段階”検定法は、上記の混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄することを伴う。他の従来法も使用に適し得る。

ストロメリシン−３および／または抗体の酵素または放射線による標識化は従来の手段によって達成できる。一般的にそのような手段には、問題の抗原または抗体に対する酵素の（例えばグルタルアルデヒドによる）共有結合的連結が含まれる。具体的にはこの連結が酵素の活性に不利な影響を及ぼさないようにする。これは酵素が連結後でもその基質と相互作用できなければならないことを意味するが、検定を達成するに足る十分な活性か残っているのであれば、酵素のすべてが活性である必要はない。実際、酵素を結合させるいくつかの技術は非特異的であり（例えばホルムアルデヒドを用いる方法）、活性酵素の一部を与えるに過きないてあろう。

普通は、検定系の一成分を支持体上に固定化し、それによってその成分とその系の他の成分との接触を可能にし、困難で時間のかかる労力を伴わずに容易に除去できるようにすることが望ましい。第２層を固定化して第１層から分離することかできるか、通常は１層で十分である。

酵素自体を支持体に固定化することができるが、固相酵素が必要な場合には、抗体に結合させ、抗体を支持体に固定することによってこれを達成することが一般に最善の方法であり、そのモデルおよび系は当該技術分野でよく知られている。

単純なポリエチレンが適切な支持体を提供し得る。

標識化に使用できる酵素に特に制限はないが、例えばオキシダーゼ群の構成要素から選択することができる。これらの酵素はその基質との反応によって過酸化水素の生成を触媒し、グルコースオキシダーゼはその良好な安定性、利用の容易さおよび安価であること、ならびにその基質（グルコース）が容易に利用できることから頻繁に使用されている。オキシダーセの活性は、この酵素で標識した抗体を当該技術分野でよく知られている制御された条件下でその基質と反応させた後に生成する過酸化水素のａ度を測定することによって検定できる。

好みによって他の技術をストロメリシン−３の検出に使用することもできる。これらの１つはウェスタンブロッティング（Ｔｏｗｂｉｎう。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７６：４３５０（１９７９））であり、この方法では適切に処理した試料をＳＤＳ　ＰＡＧＥゲルに流した後、ニトロセルロースフィルターなどの固体支持体に移す。次に、抗ストロメリジンー３抗体（非標識）をこの支持体と接触させ、標識したプロティンＡや抗免疫グロブリン（適切な標識にはｌ！５）、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼが含まれる）などの第２免疫学的試薬で検定する。

診断用の試料は関連部位のいずれからでも得ることかできる。腫瘍から直接得た支質や細胞質なとの試料が理想的であろうが、例えば血液から得た試料もまた適切であろう。しかし試料を血液から得た場合には、ストロメリノン−３の量か血流中に希釈されているであろうから、高感度の検定法か必要であろう。このような診断は、腫瘍を切除するための外科手術後などの患者の経過を監視する際に特に重要であり得る。膠照値を手術後に読み取り、一定の間隔でもう１つの値を読み取れば、上昇は再発あるいは場合により転移を表し得る。このような値の読み取りは、例えば子宮中の活性を考慮に入れる必要があろう。

抗ストロメリシンー３抗体は画像化のためにも使用できる。酵素に加えて他の適切な標識には、放射性同位体・ヨウ素（”Ｉ、１！！■）、炭素（”Ｃ）、硫黄（”Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（ＩｌｌＩｎ）、およびテクネチウム（３ｓ′″Ｔｃ）；フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、およびビオチンが含まれる。

しかしインビボ画像化のためにはその位置がより限定的になり、抗体はそのままでは身体の外側から検出できないので、抗体を標識するか、もしくは他の方法で修飾することによって検出できるようにしなければならない。

この目的のための（学識は抗体の結合を実質的に妨害せず、外部からの検出を可能にするものあれば何でもよい。適切な標識には、Ｘ−ランオグラフィー、ＮＭＲまたはＥＳＲで検出できるものか含まれ得る。Ｘ−ラジオグラフィー技術に適した標識には、検出可能な放射線を放射するか患者にとって明白に有害でない放射性同位体（例えばバリウムまたはセシウムなど）が含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲに適した標識には一般に、重水素のように検出可能な特徴的スピンを伴い、例えば関連するハイブリドーマ用の栄養素を適切に標識することによって抗体中に導入できるものが含まれる。

インビボ画像化法の場合には、適切な検出可能画像化部分（放射性同位体く例：１３１ｉ、′■、ｓ９“Ｔｃ）、放射線不透過性物質、あるいは核磁気共鳴で検出できる物質など）で標識されている抗体または抗体断片を試験すべき対象（ヒトなど）中に（例えば非経口的、皮下的、あるいは腹腔内に）導入する。

対象のサイズおよび使用する画像化系が、診断的画像を作成するのに必要な画像化部分の量を決定するであろう。放射性同位体部分の場合、ヒト対象については、注射される放射活性の量は通常約５〜２０ミリキユリーの範囲のテクネチウム −９９ｍであってもよい。

次いで、標識した抗体または抗体断片がストロメリノン−３を含有する細胞の位置に優先的に蓄積するであろう。次いで、この標識抗体または抗体断片を既知の技術を用いて検出することかできる。

この技術分野に関する一般的議論については、Ｓ、　Ｉｌ、　Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、“Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｒ　ＲａｄｉｏＬａｂｅｌｌｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　ＴｈｅｉｒＦｒａｇｍｅｎｔｓ ″（”Ｔｕｍｏｒ　Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　ＣａｎＣｅｒ”、　Ｓ、　Ｉｌ、　ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ、　Ａ、　Ｒｈｏｄｅｓｍ、　Ｍａｓｓｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｉｎｃ（１９８２））の第１３章）を参照のこと。

抗体はストロメリシン−３のペプチドに対しても、またその全分子に対しても生じさせることができる。このようなペプチドはアルブミンなどの担体タンパク質と共に動物系に提供するか、あるいはそれが十分長いく例えば２５アミノ酸残基）場合には担体なしで動物系に提供できる。ストロメリシン−３は当己タンパク質に相当であろうから、ヒト抗体がストロメリシン−３を認識できるとは思われない。

本明細書において用語“ペプチド”とは、２以上のアミノ酸かペプチド結合を通して連結してなるあらゆる分子を意味する。したがってこの用語はオリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を包含する。

上記の技術で作成したポリクローナル抗体を直接使用してもよく、また適切な抗体産生細胞をその動物から単離し、これを用いて既知の手段（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：７９５および以下参照（１９７５））でハイブリドーマを作成することもできる。適切なハイブリドーマの選択も当業者には明白であろうし、得られる抗体はストロメリシン−３を同定するのに適した検定法で使用できる。

抗体またはその等価物を本発明に従って転移性感の治療または予防に用いることもできる。抗体の適切な投与量の投与はストロメリシン−３の生産を遮断するか、もしくはストロメリシン−３の有効活性を遮断するよう作用することができ、これは悪性成長を治療するための極めて重要な時間を提供するであろう。

どのような場合にも何が実際に転移を導くのかはわかっていないので、予防はこの疾患のまさに初期段階でも適切であり得る。したがってストコメリシン−３活性を妨害する抗体、その等価物または因子類（例えばＴＩＭＰ類（ＭＭＰ類を調節する天然化合物−金属プロテイナーゼの組織阻害因子））の投与を癌が診断されると同時に実施することかでき、必要なかきり長期間、好ましくはこの疾をのおそれが排除されるまで治療を続けることかできる。

治療の好ましい形態はいわゆるマジック・ビユレット技術であり、この方法では腫瘍の領域に誘導する抗体に適切な毒素を結合させる。

このような毒素は当該技術分野でよく知られており、１細胞あたりたった１または２分子程度で作用し得るリシンなどの天然分子に限らず、毒性放射性同位体、重金属、酵素および補体活性化因子からなってもよい。このような技術をホルモン拮抗薬あるいは例えば癌の治療に使用できる生理学的に活性な他の適切な化合物の局在化した投与量を送達するために使用することもできる。

本発明に従って使用するための抗体が診断的応用であれ、治療的応用であれ、モノクローナルでもポリクローナルでも適切であり得ることは理解されるであろう。これらの抗体等価物は例えば抗体のＦ　ａｂ’断片（Ｆ　ａｂ、　Ｆ　ａｂ’ 、Ｆ　（ａｂ”）ｔおよびＦｖなど）、イディオタイプ、あるいはアロトープ移植の産物（′ｅ、者中での免疫応答を避けるために、動物抗体の認識領域がヒト抗体の適切な領域に移植されているもの）なとからなり得る。他の適切な修飾物および／または薬剤は当業者に明白であろう。

ストロメリシン−３を阻害または除去するための抗体の使用に加えて、他の形態の阻害剤を用いることもできるであろう。そのような阻害剤は（例えばＥＣＭ分解酵素について）汎用であってもよいし、ストロメリシン−３に対して特異的であってもよい。金属プロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）類の組織阻害因子はその存在が知られており、ストロメリシン−３に対して特異的なＴＩＭＰが存在する可能性は極めて高い。このようなＴ　ＩＭＰは標準的な技術によって容易に同定できる。

ストロメリシン−３の合成阻害剤も製造することができ、これらは一般に酵素活性の作用を受ける基質の領域に対応するであろう。

このような阻害剤が基質と切断生成物との間の凍結中間体に相当することが一般に好ましいが、その結合部位の立体障害型か、あるいはそれ自体がストロメリシン−３に不可逆的に結合するであろう型の結合部位を提供することもできる。他の適切な阻害剤は当業者に明白であろう。

ストロメリンンー３活性を遮断するために他の方法を用いることもできる。これらは例えば変性剤からなってもよいが、これらは非特異的である傾向が強く、例えば特異的抗体の使用などによってそれらを誘導できる場合にのみ適当に使用できる。ストコメリシン−３遮断活性の他の形態は、プレープロタンパク質からタンパク質への進行を遮断することによって達成され得る。この過程は数個の標的段階を提供し、唯一必要なことは他の必須酵素に影響を与えないように独立に遮断し得る段階、あるいは再度標的にされ得る段階を同定することだけである。

ストロメリシン−３の３次構造を選択的に認識し、それによってその酵素活性を遮断するために、ペプチドまたは他の小分子を用いることもできるであろう。このような活性遮断物質が必ずしも活性部位に結合する必要はなく、それでもストロメリ／ン−３の３次構造を改変または凍結してその活性を破壊、一時停止、または改変するよう作用することができる。またこの遮断物質が必ずしもそれ自体によって作用する必要はなく、この目的のためのもう１つの物質に結合させることかできるし、あるいは適切な不活化剤のための認識部位として機能することもできる。

■型コラーケナーセおよび９２ｋＤＩＶ型コラ−ゲナーゼのｍＲＮＡの出現はもっばら悪性腫瘍に伴うか、その逆は常に成り立つわけではない（即ち、腫瘍は常にこのタンパク質を伴うわけではない）ことが、本発明者らの研究によって立証された。

浸潤性乳癌種牛でのストツメリシン−３遺伝子の発現とテナ／ン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）遺伝子の発現との間には明らかに類似点がある。ＥＣＭ糖タンパク質テナシン（Ｃｈｉｑｕｅｔ−ＥｈｒｉｓＩｌｌａｎｎら、Ｃｅ１ｌ　４７：１３１− １３９（１９８６））は上皮開票細胞相互作用、および正常発育中の細胞移動（器官形成中の乳腺のものを含む）に必須の役割を果していると思われる。

テナシンは悪性孔腫瘍の線維性支實中で過剰発現されることが一貫して認められてきており、ストロメリシンー３に類似した様式で誘導されると思われる。フィブロネクチンと比較した場合、テナシンは乳房腫瘍上皮細胞の付着に関する基質として劣っており、このことはそれらか浸潤性になることを可能にし得ることを示唆している。

したがってストロメリ／ン−３は乳癌の＋２相中にテナシンと共同して作用し得る。またストロメリシン−３およびテナシンは胚形成中に、上皮−間葉相互作用が重要な役割を果すことが知られている領域、および細胞移動が起こる領域で同時発現し得る。

したがって本発明は、上記のタンパク質のいずれか、もしくはそれらをコードするヌクレオチド配列の検出をも含む、上に定義した転移性癌の診断法をも提供する。

また本発明は、上記のタンパク質のいずれかを結合する薬剤の使用をも含む転移性癌の治療または予防における使用をも提供する。

さらに、本発明はストロメリシン−３の一部または全体をコードするヌクレオチド配列をも提供する。ストロメリシン−３の配列は添付の図２に示すものが好ましく、またそのヌクレオチド配列も図２に示すものが好ましい。しかし、遺伝子コードの縮重ゆえに、その配列がストロメリシン−３の少なくとも一部をコードしている限りにおいて、ヌクレオチド配列がこの図に示したものとは実質的に異なり得ることは理解されるであろう。

必要な配列はそれを利用する方法によってさらに変化することさえあり得る。生物学的試料中のＲＮＡ転写物を検出するための使用を意図する場合には、普通は図２に記載した配列にかなり密接に対応することが好ましいてあろう。しかしそれでも、ハイブリッド形成が選択した厳密性条件下で可能である場合には、その配列はさらに変化し得る。

当業者は図２のペプチド配列から逆にプローブを作成することができる。しかし遺伝コードの縮重性ゆえに、逆に作成したある配列が同じペプチドから逆に作成した相補的配列と必ずしも充分にハイブリッド形成するとは限らず、あるいは全くハイブリッド形成しないこともあることは理解されるであろうから、このようなプローブの使用は制限されるであろう。これは当業者の計画には共通の要素であり、いかなる配列の縮重性もしばしば非常に広いためにどのような１配列のためのプローブの数も極めて多数になる。

ヌクレオチド配列かストロメリ／ンー３ペプチドまたは該酵素全体の発現のために必要な場合には、上述のように遺伝子コードの点、ならびにストロメリシン− ３の構造または機能に有意な影響を与えることなくこの酵素のい（つかのアミノ酸配列を変化させ得るという点で、かなり大きな自由度か存在し得る。

このような配列の相違を意図する場合には、活性を決定する極めて重要な領域がこの分子上に存在するであろうことに注意すべきである。通常このような領域は結合部位を形成する残基群か、もしくは結合部位に影響を及ぼす３次構造を形成する残基群からなるであろう。一般論として、類似の機能を発揮する残基を使用する限りにおいて、３次構造を形成する残基群を置換することができる。他の例では、残基の種類は全く重要でないこともある。

したがって本発明は、ストロメリノン−３の例えば抗体の作成に使用するための特徴的領域を示すか、もしくはまだ実際にストロメリ／ンー３活性を示す、その配列上の変種および変異体をも包含する。このような変種および変異体には欠失体、付加体、挿入体、反転体、反復体および型置換体（例えば、ある親水性残基で別の親水性残基を置換するが、一般に高度に親水性の残基で高度に疎水性の残基を置換しない）が含まれる。小さい変化は一般に、それらがその分子の必須部分でない限り活性にほとんど影響を与えないであろう。また小さい変化は遺伝子操作の副産物でもあり得るし、例えば追加の制限部位を作成する場合などには小さい変化が望まれるべきである。修飾には１以上の残基を他の適切な残基で置換することも含まれ、このような置換は１：ｌでもよいし、あるいは１以上または１以下の他の適切な比でもよい。

遺伝子操作／発現を異なった方法で補助するため、あるいはストロノリシン−３分子を増大させるか、もしくは他の方法で都合よく修飾するために、コード配列中に点変異および他の変化を導入することによって、例えば制限部位を付加または欠失させることができる。

ストロノリシン−３等価物が他の動物（具体的には哺乳類）中でも発見されるであろうこと、またそのような供給源から得られる配列情報かストウメリン／−３分子の保存された領域を解明するために特に重要であり得ることも理解されるであろう。例えば、マウスの対応する配列ではストロメリンン−３に特有のプロトメイン中の１０アミノ酸配列なとを含む約８０％が保存されている。ヒトストロノリノン−３配列に対応する動物配列か当該技術分野で既知の方法および上述の方法によって容易に検出できるであろうこと、およびそのような配列およびそれらのペプチドがその変異体および変種と共に本発明の一部を構成していることは理解されるであろう。

所望により、制限部位を提供するように本発明の配列を加工することもできる。

この加工はコードされているストロメリシン−３のペプチド配列を干渉しないように行うことが可能であり、また最終生成物が望ましい特性を有するという条件下で、望ましい程度あるいは必要な程度に干渉することもできる。

上述にようにハイブリッド形成は信頼性の低い配列相同性の指標であり得るが、好ましい配列は一般に図２の配列に対して５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を示すものであろう。

池の金属ブロテイナーセ類の場合と同様に、ストロメリ／ンー３は最初はプレープロ酵素として発現される。したかって生体内では２つの切断段階が観測される。切断はインビトロ発現にとって必ずしも必要条件ではなく、例えば大腸菌は成熟タンパク質を発現することができるであろう。

ストロメリシン−３またはその特徴的なペプチドを発現させることを望む場合、適切な系はすべて使用することができる。適切なベクター、発現ベクターおよびその構築法の一般的性質は当業者には理解できるであろう。

“特徴的な”という表現はストロメリンン−３に特有の配列を有するあらゆるペプチドを意味する。このような配列はストコメリシン−３活性にとって重要であってもよいし、あるいはただ単に他のペプチドには認められない配列であるだけでもよい。しかし一般にストコメリシン−３活性にとって重要な配列が好ましい。というのはこれらは母集団内で保存されている可能性がより高いからである。

適切な発現ベクターはファージまたはプラスミドに基づいていてもよく、これらは両者とも一般に宿主特異的であるが、これらを他の宿主のために加工することもしばしば可能である。他の適切なベクターにはコスミドおよびレトロウィルスならびに他のあらゆる媒体が含まれ、これらは与えられた系に関して特異的であってもよく、また特異的でなくてもよい。また認識、プロモーター、オペレーター、誘導因子、終止因子、および発現の制御に不可欠および／または有用な他の配列などの制御配列は当業者には容易に理解できるであろう。またこれらの制御配列は天然のストコメリシン−３配列に伴っているものでもよいし、あるいは使用するベクターに伴っているものでもよく、あるいは他の供給源から適切に誘導することができる。これらのベクターはあらゆる適切な方法で修飾または加工することができる。

ヌクレオチド配列の正しい調製は、例えばＳａｎｇｅｒらの方法（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３−７（１９７７））によって確認することができる。

本発明のストロメリシン−３をフードしているｃＤＮＡ断片は適切なベクター中に容易に挿入できる。受容ベクターが容易な挿入に適した制限部位を有することが理想的であるが、例えば平滑末端連確定性を導くであろう。このような場合には発現に関して形質転換体を試験することは当然のことであり、これらの形質転換体は６細巾１個の割合で正しい読み枠を有するはずである。当然のことながら、当業者は望ましい発現系に応じて適切なベクターを選択することができる。

適切な生物（好ましくはＨｅＬａなどの真核細胞株）を得られたプラスミドで形質転換し、アンピシリンまたは必要ならば他の適切な手段によって形質転換体を選択し、トリプトファンまたは必要ならば他の適切なプロモーター−誘導物質（インドールアクリル酸など）を添加することによって、目的のストロメリシン− ３を発現させることができる。発現の程度をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動：　Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　（Ｌｅｍｅｌｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５（１９７０））で分析することかできる。

培養などの生育および形質転換に適した方法は例えばＭａｎｉａｔｉｓ（“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｎｏｔｅｂｏｏｋ″、Ｍａｎｉａｔｉｓらｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｓ、ＮＹ（１９８９））に実用的に明示されている。

ストロメリシン−３またはそのペプチドの生産に有用な培養はあらゆる生存細胞の培養が適切であり得、原核生物発現系から真核生物発現系までに及び得る。好ましい原核生物系の１つは、その操作の容易さゆえに大腸菌の系である。しかし、より高等な系（哺乳類細胞株など）も真核タンパク質の発現に使用できる。現在のところ仮発現とって好ましい細胞株はＨｅ　Ｌ　ａおよびＣｏｓ細胞株である。

他の発現系にはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株か含まれる。

価値ある系の１つはバクロウィルス系であり、この系では蝶細胞をストロメリシンー３または適切なペプチドをコードしているＤＮＡベクターおよびバクロウィルスＤＮＡで同時トランスフェクションする。組換えがその細胞内で起こり、適切なバクロウィルス組換体を襟章的な技術で選択することかできる。その１麦、その組換体を用いて望ましい細胞株を感染させることができ、感染によってストロメリンン−３またはペプチドが発現される。この系に特有の利点は生産されるタンパク質の量てあり、その量は約１〜約５００　ｍｇ／ａの範囲に及び得る。

このような系は大腸菌糸はど使用しやすくない傾向にあるが、その利点は一次合成後のタンパク質のプロセシングにある。例えハ大腸菌はブレープロタンパク質のプロセシングに哺乳類細胞と同じ系を使用しない。

使用し得る他の発現系には、例えばストレプトミセス科の放線菌、およびサツカロミセス種、具体的にはサツカロミセス・セレビシェなどの酵母が含まれる。一般に操作者が何を要求するかに依存して、所望によりどのような系も使用できる。適切な系を用いて遺伝物質を増幅することもできるが、そのＤＮＡの増殖だけが必要なこの目的には一般に大腸菌の使用が便利である。

成熟酵素の配列はブローおよびプレブロー配列にも共通であるので、抗体を生しさせるためには成熟酵素だけを生産することか有利であろう。しかし、プロおよびプレプロ部分の切断かこの分子の３次構造を変化させるかも知れず、したかって成熟酵素に対して生じた抗体が例えばプロ酵素を検出できないこともあり得ることは理解されるであろう。初期段階のいずれかにある酵素および／または切断されるプレーまたはプローペプチドに対して生じた抗体も有用となるであろう。

ペプチドまたはヌクレオチド配列は、それを使用する目的が考慮されたスト口メリ７ン−３に特徴的なものであれば何でもよい。配列はストロメリ／ンー３に完全に特徴的であることが理想的であろうが、そのような配列の長さはストロメリ／ンー３分子のその領域に応じて様々であり得る。最も好ましい領域は高度に保存されている領域、および他のタンパク質に共通しない領域であるか、その配列がＭＭＰ類、もしくはより具体的にはＷＲ性腫瘍に関連するＭＭＰ類に特徴的な配列である場合にはそれが有利であり得る。

本発明は上記のペプチドおよびヌクレオチド配列の等価物を包含し、これに関連する。ここで用語“等価物”は前述の意味で使用されており、換言すればＣ−またはＮ−末端あるいは他のいずれかの位置に置換を有する配列という意味の等価物である。

本発明は本配列の変異体をも包含する。ここで用語“変異体”は、上述の制限を前提とする配列中のアミノ酸残基または塩基の欠失体、付加体、挿入体、反転体および置換体に関して使用されている。

さらに本発明は配列の変種をも包含し、この用語は、図２に示す配列と基本的には同じ配列を共有するが、大きい母集団内で予期される程度に変化している、ときおり発見されるであろう他の天然に存在するストロメリシン−３に関連して使用されている。この定義内にはアレル変種および類似型の活性を示し関連する配列を有する他の種由来のペプチドが含まれる。またあまり好ましくはないが、動物配列も含まれる。

本発明者らはストロメリンン−３の発現が例えば成長因子および腫瘍プロモーターによって刺激され得ることをも発見した。このような因子の典型例にはＥＧＦ　ＦＧＦおよびＰＤＧＦおよびＴＰＡか含まれる。したかって上述の方法と共に、腫瘍試料中のこれらの因子のいずれかの検出は癌の転移状態を診断するためにも役立ち得る。

したかって本発明は、ストコメリシン−３遺伝子の発現を変化させることによる転移性感の治療をも提供する。これはストロメリシン−３の生産を刺激するために必要な因子を、例えばこの因子に対する特異的抗体を使用するなどして妨害することによって達成することができ、目的の結果を達成するためにこの抗体をさらに修飾してもよい。この因子の受容体を遮断すること（これは例えば抗体または合成ペプチドであり得る必要な結合剤の局在化によってより容易に達成され得る）も可能であろう。

ストコメリシン−３遺伝子の発現に影響を与えることは、例えばゲノムＤＮＡ上のプロモーターなどの部位の遮断などによってより直接的にも達成され得る。

例えば抗体を患者に投与するために本発明を用いる場合には、これは適切な経路のいずれによってもよい。腫瘍がまだ局在化していると思われるか、もしくはそのように診断される場合には、適切な投与法はその部位への直接的な注射による方法であり得る。標的が乳癌である場合には乳房への注射で十分であり得、また埋め込み剤を用いてもよい。例えばＴ　ＩＭＰ類を投与すべき場合には、長期間持続する投与のために皮膚バッチを使用することもできるであろう。

咽頭癌の場合には、さらなる選択枝として例えばうがい剤を用いる経口投与であってもよい。

いずれかの例において、投与を別法として、あるいは追加的に、皮下、筋肉内、静脈内および皮肉注射を含む注射によって行ってもよい。

製剤はその投与経路に適したものであれば何でもよく、当業者には自明であろう。本製剤は食塩水などの適切な担体を含有してもよく、またバルキング剤、他の医薬Ｒ製物、佐剤および他のあらゆる適切な医薬成分を含有してもよい。

適切な調製物にはストロメリシン−３またはその特徴的なペプチドを含有するワクチンも含まれ得る。このようなワクチンは能動型であっても受動型であってもよいが、ストロメリンン−３の発現が子宮内で起こり、抗ストロメリシンー３抗体への不明確な暴露が望ましくない効果を有するかも知れないので、一般的には受動型が好ましい。しかし能動予防接種が有利なこともあり、具体的には患者が既に子宮切開術を受けている場合にはどの組織もストロメリシン−３を正常には発現しないであろうから、能動予防接種が有利であり得る。他の適切なワクチンにはストロメリシン−３またはその特徴的なペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含有する組換えウィルスが含まれる。このようなウィルスの適切なものの１つはワクシニアウィルスである。

以下の実施例は本発明を明示するよう機能するものであり、いかなる形でも本発明を制限することを意図するものではない。

−次乳癌の外科的切除試料（腫瘍Ｃ１と呼ぶ）から得たボ！Ｊ（Ａ”）ＲＮＡを用いて乳癌ｃＤＮＡライブラリーをλｇｔｌｏベクター中に構築した。それぞれＣＩ−ポリ（Ａ”）ＲＮＡおよび乳線維腺腫（Ｆｌと呼ぶ）から得たポリ（Ａ” ）ＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡに対応する（＋）および（−）プローブを用いて５００００プラークを個別にスクリーニングした。

図１にＣ１−乳癌腫およびＦｌ−線維腺腫から得た全ＲＮＡの、線維腺腫中より癌腫中でより高い発現レベルを示す４種の遺伝子のＣＤＮＡプローブ（Ａ−Ｄ）を用いたノーザンプロット分析を示す。各レーンは８μｇの全ＲＮＡを含有する。偏在的に発現する遺伝子に対応する３６Ｂ４プローブを用いてこれらのフィルターを再プローブした（Ｒｉｏら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：９２４３−９２４７（１９８フル。

具体的には、全ＲＮＡを液化窒素中に保存した外科標本から調製しくＣｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８：５２９４−５２９９（１９７９））、オリゴ（ｄＴ）−セルロース・クロマトグラフィーによってポリ（Ａ　”）　ＲＮ　Ａ　ヲ選択した。全細胞集団の約５０％が支質細胞であるエストロゲン受容体−陰性（グレード■）導管癌腫（ＣＩと呼ぶ）から調製したｃＤＮＡを用いて、乳癌−濃縮ｃＤＮＡライブラリーを構築した。

クローニングに先立って、−水路ｃＤＮＡを過剰量の乳線維腺腫（Ｆ　１と呼ぶ）から得たポリ（Ａ”）ＲＮＡを用いて減じ、その−水路濃縮物質をヒドロキシアバタイトクロマトグラフィーで精製した（Ｄａｖｉｓら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１　：２１９４−２１９８（１９８４）　；Ｒｈｙｎｅｒら、　mｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓ、　１６：１６７−１８１（１９８６乃。

この乳癌−濃縮ｃＤＮＡを二本鎖にし、λｇｔｌｏベクターのＥｃ。

Ｒｒ部部位−クローン化した。３百万の組換えファージが得られ、約５０００　ｃ　ＤＮＡクローンを含有するプレートがら得た複製ナイロンフィルター（Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ａ、　Ｐａ１ｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて約５００００を個別にスクリーニングした。

Ｃ１−乳癌ｃＤＮＡおよびＦｌ−乳線維腺腫ｃＤＮＡを用いて、それぞれ（＋）および（−）プローブを作成した。両プローブとも過剰量の全ヒト肝臓ＲＮＡで減じ（Ｄａｖｉｇら、　Ｐｒｏｃ、　Ｖａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ八へ１：２１９４−２１９８（１９８４）　；Ｒｈｙｎｅｒら、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓ、　１６：１６７−１８１（１９８６））、その後ランダムブライミング合成を用いてｆ、ｚｔｐＥ−標識した。

ハイブリッド形成を厳密条件下（５０％ホルムアミド、４２℃）て２日間行い、２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中２２°Ｃで洗浄した後、０．１ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中５５°Ｃて洗浄した。第２スクリーニングのために、弁別的に標識されたプラーク１３０個を選択した。

無作為に取り上げた５個の異なるプラークのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物をＰＣＲ増幅法で精製し、Ｊｚｔｐ］−標識し、関連クローンを同定するためにすべての異なるプラークにハイブリダイズさせた。この操作を無作為に取り上げた異なるプラークで数回繰り返し、最終的にＦｌ−線維腺腫中よりもＣ１−癌腫中でより高レベルな発現を示したＡ〜Ｄと呼ぶ４種の遺伝子を得た。ホルムアルデヒドを含有する１％アガロース中での電気泳動によって分離した全ＲＮＡ（８μｇ）を用いて、Ｃ１−乳癌およびＦ１〜乳線維腺腫に関するノーザンプロットを調製し、）ｆｙｂｏｎｄ−Ｎフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。

このプロ、トをメチレンブルーで染色した後、転移させたＲＮＡの完全性と量を調べるためにプレハイブリッド形成させた。ハイブリ、ド形成（１８時間）および洗浄を、Ａ−Ｄ遺伝子に対応する′Ｌ３ｔＰ１４３識ｃＤＮＡ挿入物を用いて、上述のように標準的条件下で行った。

正常結腸でも発現された（示していない）遺伝子ＡおよびＢはこれ以上側べなかった。

Ｃ遺伝子は結腸で発現した（示していない）が、その高レベルの弁別的発現（図１）ゆえにこの遺伝子を部分的に特徴づけた。これは種々の形質転換上皮細胞株および正常ヒト皮膚中でも発現された（示していない）。１つのＣクローンのｃＤＮＡの配列決定は、対応する遺伝子がケラチン遺伝子スーパーファミリーに属することを示した（データは示していない）。

最後に、Ｄ遺伝子（ここではストコメリシン−３遺伝子とも呼ぶ）の発現はＣ１ −名種およびＦｌ−線維腺騰間で著しく異なり（図１）、またこの遺伝子は正常ヒト結腸および他のいくつかのヒト組織中では発現されなかった（後述）ので、Ｄ遺伝子をさらに調へた。

秩犬ヱＤ　ｃＤＮＡ挿入物をプローブとして用いて数個の別個のクローンを非削減Ｃ１ −乳癌λｇｔｌｏｃＤＮＡライブラリーがら単離し、配列を決定した。図２に全長Ｄ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および対応するタンパク質配列を示す。

４８８アミノ酸長のタンパク質をコードしているｃＤＮＡ読み取り枠の後ろには、そのＲＮＡの３°−末端がら１４塩基上流に位置するポリ（Ａ）付加シグナルを含む７１４塩基の３′−非翻訳頭載が続いている。推定される開始メチオニンはヌクレオチド位置１０〜１２に位置する。対応するＡＵＧはＫｏｚａｋ共通モチーフに一致する配列を伴っておらず、その中にも位置していないが、この配列は予期される性質である（後述）疎水性先導ペプチドの配列のすぐ下流に対応しているので、翻訳はおそらくこのＡＵＧから開始されるのであろう。

ストロメリ／ン−３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図２において、ヌクレオチド残基は５゛から３°に同かって番号か付与されており、読み取り枠中の推定アミノ酸は、その１文字コートで指定されでいる。下線を付したヌクレオチド配列は５°−末端から順に：推定シグナルベブチド（２つの潜在的切断部位を矢印で示している）、プロ金属プロティナーセ類に特有のＰＲＣＧＶＰＤ配列、亜鉛結合ドメインの保存されたヒスチジン残基（Ｍａｔｒｉｓｉａｎ、　Ｌ、　Ｍ、　、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、　６：２ｌ−１２５（１９９０））　；およびポリ（Ａ）付加シグナル配列に対応している。

具体的には、ＤｃＤＮＡの３′一部分に対応するｃＤＮＡ挿入物Ｕ１９ｂｐのポリ（ＡＴ）領域を含む２５０ｂｐ］をランダムブライミング合成によってＥ”Ｐ］−１識し、これを用いて、Ｃ１−乳腫瘍ポリ（Ａ゛）ＲＮＡから作成した非削減λｇｔｌＯｃＤＮＡライブラリーをＧｕｂｌ　ｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎｎの方法（Ｇｅｎｅ　２５：２６２−２６９（１９８３ルでスクリーニングした。数個の別個のクローンを同定し、Ｍｌ　３シークエンシングベクター中にサブクローニングした。ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｉｉｃａｌ製のデアザ−ｄＧＴＰ試薬キットおよびシークエナーゼを用いるジデオキシ法でＤＮＡ配列を決定した。この配列をＰ　Ｃ７０Ｅ　Ｎ　Ｅソフトウニアバ。

ケーンを用いて分析した。

図３にヒト・ストロノリシン類とヒトＩ型コラーゲナーゼの予想アミノ酸配列の比較を示す。

（ａ）多数整列（ｍｕｌｔｉａｌｉｇｎｍｅｎｔ）プログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｇｅｎｅ　７３：２３７−２４４（１９８８乃を用いてアミノ酸配列を並べた。４つの配列のすべてで一致するアミノ酸残基に星印を付けである。矢印はストロメリシン−３の推定上のシグナルペプチド切断部位を表す。矢じりはＩ型プロコラ−ゲナーゼおよびプロストロノリシン類の活性化に際して起こる切断を示す。この切断部位のレベルでストロメリシンー３に特異的な１０アミノ酸残基を囲んである。ＰＲＣＧＶＰＤ配列および推定上の亜鉛結合ドメインの保存残基に下線を付しである。

（ｂ）左、ストロメリシン−３、ストロメリシン−１（Ｓ　Ｔ　１　、　ｆｈｉｔｈａｍら、　Ｂｉｏｃｈｅｌｌ、　Ｊ、　２４０：９Ｈ−９１６（１９８６））、ストロメリシン−２（Ｓｒ１゜ｋｌｕｌｌｅｒら、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｊ、　２５３：１８７ｌ８７−１９２（１９８およびＴ型コラーゲナ−ゼ（Ｃｏ　Ｉ、　ｆｈｉｔｈａｍら、　ＢｉｏｃｈｅＩＩｌ、　Ｊ、　２４０：９１３−９１６（１９８６））間の類似性（アミノ酸一致率（％））領域。

（１））右：ＳＴ１、ＳＴ２およびｃｏｒ間の類似性領域；Ｐはシグナルペプチドおよびプロドメインを示す、ＥＮＺは成熟活性酵素に対応するドメインを示ス。

このように推定タンパク質配列と５ｖｉｓｓｐｒｏｔデータライブラリー（１４版）との比較は、この新しいタンパク質が分泌されるマトリックス金属プロテイナーゼ（ＭＭＰ）類に属することを示した（図３ａ）。

したがってこの新しいタンパク質は疎水性Ｎ−末端先導配列候補（図２の下線部）を有しており、ＭＭＰ類のプロドメインの特徴である高度に保存された配列ＰＲＣＧＶＰＤ（アミノ酸残基７８〜８４）を示し、またＭＭＰ類の亜鉛結合部位（アミノ酸残基２１２〜２２５：図３ａ）を有する（Ｍａｔｒｉｓｉａｎ、　Ｌ、　Ｍ、　、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、　６：１２１−１２５（１９９０））。

このファミリーの他の構成要素との類似性から、成熟タンパク質のＮ−末端アミノ酸はそのブレープロタンパク質のフェニルアラニン９８に対応すると思われる（Ｔｈｉｔｈａｍら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２４０：９１３−９１６（１９８６））（図３ａ）。最適に並べた後、推定成熟タンパク質との類似性はストロメリシン−１（Ｗｈｉｔｈａｍら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２４０：９１３−９１６（１９８６））と４０％、ストロメリシン−２（Ｍｕｌ　Ｉｅｒら、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｊ、　２５３：１８７−１９７（１９８８））と３８％、■ 型コラーゲナーゼ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６１：６６ｐＯ−６６０５（１９８６乃と３６％である（図３ｂ）。

この新タンパク質の基質特異性はわかっていない。この新タンパク質のストロメリシン−１との類似性（４０％）は明らかにストロメリシン−１とストロメリシン−２との間に存在する類似性（７９％）よりはるかに低く、また■型コラーゲナーゼとストロメリシン−１の間に存在する類似性（５３％）よりさらに低いが、本明細書ではこれをストロメリシン−３と呼ぶことにする。したがってこのタンパク質はＭＭＰの一種であって、“ストロメリシン”という名称は必ずしも厳密に正確ではないが、この名称が便利である。

さらに、ＰＲＣＧＶＰＤ配列の上流域では、ストロメリシン−３と既に比較した他のＭＭＰ類との間に有意な類似性はない（図３）。

しかしストロメリシン−３は、Ｉ型コラ−ゲナーゼおよびストロノリジン類のプロタンパク質切断部位（Ｗｈｉｔｈａｍら７上述）と本質的に正確に対応する位置に独特の短い配列（アミノ酸残基８８〜９７）を有する。さらにストロメリシン−３はＩ型コラーゲナーセおよび他のストロノリシン類の場合と同様に、■型コラーゲナーゼ類に特有のフィブロネクチン様ドメイン（Ｗｉｌｈｅｌｍら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４　：１７２１３−１７２２１（１９８９））を示さない。

実施例４乳癌呻中での過剰発現ストロメリンン−３ＲＮＡ転写物の出現を３０種の乳癌腫および５種の乳線維腺挿の切除試料で調べた。

図４に乳腫病中のヒト金属プロテイナーゼＲＮＡ類のノーザンブロノト分析を示す：（ａ）ストロメリシン−３ＲＮＡ；（ｂ）Ｉ型コラ−ゲナーゼＲＮＡ（ＣＯｒ）。

（Ｃ）９２ｋＤ　Ｉ’Ｖ型コラ−ゲナーゼＲＮＡ（ＣＯＩＶ　９２Ｋ）；（ｄ）７２ｋＤ　Ｉ￥型コラ−ゲナーゼＲＮＡ（ＣＯＩＶ　７２Ｋ）；（ｅ）ストロメワシンー１および−２ＲＮＡ（ＳＴＩ／２）；（ｆ）ポンプ−Ｉ　ＲＮＡ（ＰＵｒ）。

全ＲＮＡを４種のエストロゲン受容体−陰性孔癌腫（Ｃ１，グレードＩＩ；Ｃ２，Ｃ３およびＣ４，グレード■）、６種のエストロゲン受容体−隅性乳癌腫（Ｃ５，Ｃ８およびＣ９，グレード［；Ｃ６およびＣ７，グレード［；　Ｃｏ　ｒ、グレードＴ）および４種の乳腺維腺腫（Ｆ２〜Ｆ５）から調製した。各レーンは８μｇのＲＮＡを含有する。３６Ｂ４／グナルは対照遺伝子のＲＮＡに対応する（図１）。

具体的には、図１の場合と同様に、数個のノーザンブロノトを同一のＲＮＡ試料で同時に調製し、次のｃＤＮＡプローブのいずれかとハイブリダイズさせた：（ａ）ストロン１ノノン−３ｃＤＮＡの３′一部分を覆う１．６ｋｂ挿入物、（ｂ）ＣＯＩ　ｃＤＮＡ、（ｅ）ＳＴ２　ｃＤＮＡ（ＳＴＩ　ＲＮＡと交差ハイブリッド形成するもの）、（ｆ）ＰＵｌ　ｃＤＮＡ（ＣＯＩ、ＳＴ２およびＰＵＩプローブはＲ，Ｂｒｅａｔｈｎａａｈ氏の好意により供与された。　Ｍｕｌｌｅｒら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２５３：１８７−１９２（１９８８乃、または（ｃ）ＣＯＩ　９２Ｋ（ヌクレオチド２１４４〜２２２３　、　ＷｉｌｈｅｌＩｌｌら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６４１ニア２１３−１７２２１（１９８９乃および（ｄ）Ｃ○ＩＶ　７２Ｋ（ヌクレオチド１９３７〜２０１６．　Ｃｏ１１ｉｅｒら、　Ｊ、　ＢｉｏｌＣｈｅｍ、　２６３：６５７９−６５８７（１９８８））に対応する８０マーのアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブ（複数）。

ランダムブライミング合成を用いてこれらのｃＤＮＡプローブを（”Ｐ）−標識しく約５ｘ　１０’ｃｐｍ／μｇ）Ｌ、５゛−末端キナーゼ処理を用いてこれらのオリコヌクレオチドを標識した（約１０８ｃｐｍ／μｇ）。ハイブリッド形成を厳密条件下（４２°Ｃ１５０％ホルムアミド）で約１０’ｃｐｍ／ｍｌを用いて実行した。次にフィルターを２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中２２°Ｃで洗浄した後、０，１ｘＳＳＣＳ０゜１％ＳＤＳ中５５°Ｃで洗浄した。オートラジオグラフィーを（ａ）１８時間、（ｂ）２０時間、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）４日間、（ｆ）２ＥＩ間、−８０°Ｃで増感板を用いて行った。

ストロメリシン−３ｍＲＮＡはすべての乳癌肺中で、その癌腫がエストラジオール受容体（ＥＲ）陽性（Ｃ５〜Ｃｌ０）であるか陰性（ＣＩ−Ｃ４）であるかにかかわらず認められた（図４ａ）が、発現レベルが乳癌、＠中で観測された最低レベルと同等であった１つの例外（Ｆ２）を除いて、線維腺腫試料中では認められなかった。

ＭＶＰ遺伝子ファミ＋７−の他の構成要素のＲＮＡ転写物の出現をも同じ試料中で調べた（図４ｂ−ｆ）。ＭＭＰファミリーのこれらの他の構成要素はそのヒト乳腫瘍中での発現様式に従って明確に２つの種類に分類することができる。第１の種類には７２ｋＤ　ＩＶ型コラーケナーセ（ＣＯＩ　７２Ｋ、図４ｄ）、ストロメリノン−１および−２（ＳＴ　Ｉ／２、図４ｅ）およびポンプ−１（ＰＵＩ、図４ｆ）が含まれ、これらの遺伝子はすべて悪性および良性肺癌の両方で発現された。対照的に、ストロメリ／ンー３（図４ａ）、Ｉ型コラーケナーセ（ＣＯＩ、図４ｂ）および９２ｋＤ　ＩＶ型コラ−ゲナーゼ（ＣＯＩＶ９２Ｋ、図４ｃ）遺伝子を包含する第２の種類は、乳癌肺中でのみ過剰発現を示す。たたし乳癌腫に一貫して伴うのはストロメリシンー３だけである。

発現様式は第２の種類に属する３つの遺伝子間で同一ではなかった。Ｉ型コラ− ゲナーゼＲＮＡ転写物はＣ５、Ｃ６、Ｃ７およびＣ■Ｏ癌腫中では検出されず、９２ｋＤ　１７型コラ−ゲナーゼＲＮＡ転写物はＣ７およびＣＩＯ試料中には認められなかったが、ストロメリシン−３ＲＮＡ転写物はすべての腫瘍中で明瞭に検出された。

したがってストロメリンン−３は浸潤性乳癌騰の症状を示すと思われ、一方ｒ型コラーゲナーゼおよび９２ｋＤ　ＩＶ型コラ−ゲナーゼもまた場合によって乳癌の進行に特異的に関与するのであろう。

実施例５図５に種々の細胞株および組織中のストロメリシン−３ＲＮＡのノーザンブロｙト分析を示す。

（ａ）乳癌の患者から得た５種の転移性腋窩リンパ節および３種の正常な腋窩リンパ節；（ｂ）４種のエストロゲン受容体−陰性（ＢＴ−２０，ＭＤＡ−２３１，５Ｋ− ＢＲ−３、ＨＢＬ−１００）および４種のエストロゲン−陽性（Ｔ−４７Ｄ、ＢＴ−４７４、ＺＲ−７５−１、ＭＣＦ−７）乳癌株化細胞；（ｃ）１０種の正常ヒト組織；（ｄ）血清非含培地（１および２）中Ｔ　Ｐ　Ａ　（１０ｎｇ／ａ＋１）の非存在下（１）または存在下（２）で培養した、あるいは２０μｇ／ｍｌインシュリンを補足した血清非含培地（３〜６）中Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　（２０ｎｇ／＋Ｌ　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の非存在下（３）または存在下（４）、またはＥＧ　Ｆ　（２０ｎｇ／　ｍｌ、　Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）の存在下（５）、またはｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（１０ｎｇ／＋＊１．　Ｐｅｔｔｍａｎｎ氏の好意により供与された（ＦＥＢＳＬｅｆｔ、　１８９：１０２−１０８（１９８５）））の存在下（６）で培養した、ＨＦＬ−１ヒト胎児二倍体線維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　１５３）。

（ａ）では、レーン５（２μｇ）およびレーン６（２０μｇ）を除いて各レーンは１０μｇの全ＲＮＡを含有する。（ｂ）および（Ｃ）では、各レーンとも８μ ｇの全ＲＮＡを含有し、（ｄ）では各レーンは５μｇの細胞質ＲＮＡを含有する。

具体的には、（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）については図４でストロメリシン−３について示したようにプロットを調製し、加工した。（ｄ）では、全面成長ＨＦＬ−１線維芽細胞を血清非含ＤＭＥＭ培養培地中に維持した。２４時間後、新鮮な培地を加え、ＴＰＡまたは成長因子を上記のように補足するか、もしくは補足しなかった。２４時間の培養後、細胞を回収し、細胞質ＲＮＡを調製した（Ｇｏｕｇｈ、　Ｎ、　Ｍ、　。

Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　１７３：９３−９３−９５（１９８゜次に図４でストロメリシン−３について示したようにプロットを調製し、加工したが、オートラジオグラフィーを３日間とした。

９２ｋＤ　コラ−ゲナーゼＩＶ　ＲＮＡ転写物は３種の正常および５種の乳癌転移性リンパ節中に認められたか、ストコメリシン−３ＲＮＡ転写物は転移性筒中でのみ検出された（図５３および開示していないデータ）。

一次悪性乳腫瘍および転移性リンパ節で得た結果とは対照的に。

８種のヒト乳癌細胞株中ではそれらのＥＲ状態にかがわらず、類似の条件下でストロメリシン−３ＲＮＡ転写物を検出できながった（図５ｂ）。同様にストロメリシンー３　ＲＮＡ転写物は、子宮および胎盤という顕著な２つの例外を除いて、いくつかの正常ヒト成人組織中でも検出できなかった。

ストロメリシン−３はすべての癌に明らかに伴うわけではなく、結腸、卵巣、腎臓および肺癌から得たＲＮＡ試料中では低レベルのストロメリシンー３　ＲＡＮ転写物が認められるに過ぎない。しかし、乳癌中に認められるレベルと同等に高いレベルの発現が喉頭癌ＲＮＡ試料中に観測された（非開示データ）。

実施例６浸潤性腫瘍の支質細胞中での特異的発現原始乳癌肺中でストロメリンンー３遺伝子が発現され、いくつかの確立された乳癌株化細胞中では発現されないことは、この遺伝子か新生物細胞そのものではなく、むしろその腫瘍を取り巻く支質細胞中で発現されたことを示唆している。

Ｃ３５Ｓ　７−標識ストコメリシン−３アンチセンスリボプローブを用いる原位置ハイブリッド形成実験を６種の癌腫（図４に関して命名した腫瘍Ｃ１、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ９、ｃｉｏおよび図４には示さながったＥＲ−陽性癌腫である腫瘍Ｃ１１）から得た切片を用いて行った。

具体的には、原位置ハイブリッド形成をＣｏｘらが記述したように行った（Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１０１　：４８５−５０２（１９８４））。脱パラフイン化酸処理切片（６ｔｔｙｒ厚）をブロティナーゼにで処理し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローニングしたストロメリシン −３ｃＤＮＡ挿入Ｆ’ｌ（ヌクレオチド１１２８から１５９４までの４６７ｂｐ）から得た［”Ｓツー標識アンチセンス転写物を用いて終夜ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成の後、ＲＮａｓｅ処理（２０ａｇ／ｌｘｌ、　３０分間、３７℃）を行い、厳密に洗浄（２ｘＳＳＣ１５０％ホルムアミド、６０°Ｃ１２時間）した後、ＮＴＢ２乳剤（Ｋｏｄａｋ）を用いてオートラジオグラフィーにかけた。オートラジオグラフィーを１５日間行った。センスリホブローブを用いる類似の条件下でバックグラウンド以上の有意な標識化は観測されなかった（示していない）。

図６に乳癌腫および胚肢芽の切片中のストロメリシン−３ＲＮＡ転写物の存在を示す。ａＳＣｓ　ｅｘ　ｇｚ　ｌおよびに、ヘマトキンリンで染色した組織切片の明視野（ｘ　１００）；　ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊおよび１：アンチセンス・ストロメリシン−３ｃＲＮＡ７’ローブとの原位置ハイブリッド形成および暗視野画像化後の同切片（やはりへマドキシリンで染色したもの）。

ａおよびｂ、グレード■導管孔癌腫（腫瘍ｃ１、図４参照のこと）°浸潤性癌細胞（Ｃ）が紡錘状細胞（Ｓ）の豊富な支質に取り巻かれている；ストロメリシンー３　ＲＮＡ転写物は新生物上皮細胞のすぐ周囲の支質細胞中にもっとも豊富である。Ｃおよびｄ、グレード■導管孔癌腫（腫瘍Ｃ３、図４参照のこと）：浸潤性乳癌細胞（Ｃ）の複数の島が支質細胞によって取り巻かれている：スト口メリシン−３遺伝子の発現はほとんどの支質小柱（Ｓ）の中心部（即ち、新生物細胞から最も遠い領域）で、より弱い。ｅおよび置導管癌腫（腫瘍Ｃ３、図４番照のこと）および２つの正常小葉（Ｎ）、ストロメリ／ンー３ＲＮＡ転写物は、リンパ球（矢印）が豊富な小領域を例外として、浸潤性癌細胞（Ｃ）を並置させている支質中で独占的に検出された。ｇおよびｈ１導管癌腫（腫瘍Ｃ１０、図４参照のこと）；ストロメリ／ン−３ＲＮＡ転写物は浸潤性乳癌細胞を取り巻く支質細胞（右上角）中てバックグラウンド以上に検出できたが、原位置（星印）乳癌細胞では検出できなかった。ｉおよびｊ、導管癌腫（腫瘍Ｃ１ｌ、ＥＲ−陽性、グレード■、癌腫）；左：原位置の癌腫（星印）、支質細胞中でストロメリシン− ３ＲＮＡ転写物を検出できなかった；右：ストロメリンンー３遺伝子を発現している支質細胞によって取り巻かれている浸潤性新生物。ｋおよびＩ、８適齢ヒト胚肢芽の指間領域：ストロメリンン−３ＲＮＡ転写物が原始表皮の基礎をなす生肝葉中で検出され、指間領域（Ｍ）中で最も顕著である：原始表皮（矢印）、形成中の軟骨（ＰＣ）、および周辺生肝葉は標識されないことに注目のこと。

すべての場合においてストロメリ／ン−３ＲＮＡ転写物は、腫瘍の浸潤性成分を形成している悪性上皮細胞の島を取り巻く支質細胞中でのみ検出された（図６．パネルａおよびｂ（腫瘍Ｃ１について）；パネルｃ、ｄ、ｅおよびｆ（腫瘍Ｃ３について）；パネルｇおよびｈ（腫瘍ＣＩＯについて）、パネル１およびｊ１右側（腫瘍Ｃ１ｌについて）；腫瘍Ｃ５およびＣ９についてのデータは示していない）。

転移性リンパ節（Ｃ５と同じ供給源）でも、ストコメリシン−３遺伝子の発現がその転移性上皮細胞を取り巻く支質細胞に限定されていた（データは示していない）。

すべての場合において、悪性上皮細胞そのものは標識されなかったこと、ならびに最も高レベルの発現が悪性細胞に並列している支質細胞中で観測されたことが特に注目に値する。著しく対照的に、また基底膜によって取り巻かれている原位置癌腫病巣を取り巻く支質細胞中では有意な発現を検出できず（パネルｇおよびｈ（腫瘍Ｃ１Ｏについて、パネルｉおよびｊ１左側（腫ＩＣＩＩについて乃、一方間し呻瘍の浸潤性成分中では支質細胞の標識化を明確に観測することができた（パネルｇおよびｈ（Ｉ瘍ＣＩＯについて）；パネルｉおよびｊ、右側（腫瘍Ｃ１ｌについて））。

また、癌細胞から離れて位置する支質細胞および正常導管および小管を取り巻く支質細胞中では有意な発現を検出できなかった（例えばパネルｅおよびｆ）。ストコメリシン−３転写物の分離した焦点は、ノーザンプロットでストロメリシン −３ＲＮＡに関して弱く陽性であるＦ２線維腺腫の切片中で検出されなかった（図４ａおよび非開示データ）。

線維芽細胞と筋線維芽細胞が共に浸潤性癌細胞ッることが知られている（Ａｂｍｅｄ、　Ａ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ａｎｎｕ、　２５（Ｐｔ２）　：２３７−２８６（１９９０））。本発明者らの原位置ハイブリッド形成技術では、これらの細胞型のうち１つだけがストコメリシン−３遺伝子を発現したのか、を決定することは不可能であった。

成長因子による刺激上記の結果は、支質細胞中でのストロノリフン−３遺伝子の発現が新生物細胞が分泌する拡散性因子によって誘導されているらしいことを示している。ＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦなどの成長因子およびい（つかのサイトカイン類（ＩＬ− １α、β、およびＴＮＦ−α）、および腫瘍プロモーター類（例：ＴＰＡ）がＭＶＰ遺伝子類の転写を活性化することが知られている（Ｋｅｒｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：１４２４−１４２７（１，１８８））。数種の供給源から得られた腫瘍細胞がヒト線維芽細胞によるコラ−ゲナーゼＩの生産を刺激する因子（単数もしくは複数）を生産することも報告されている（Ｌｉｐｐｍａｎら、Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇ、ＨｏｒｍｏｎｅＲｅｓ、　４５：３８３−４４０（１９９０））。乳癌細胞がインビトロでＰＤＧＦＳＦＧＦおよびＴＧＦ−α活性を分泌することが知られている（Ｓａｌｏｍｏｎら。

“Ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ：ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ″（Ｌｉｐｐｍａｎ、　Ｍ、　Ｅ。

およびＤｉｃｋｓｏｎ、　Ｒ，Ｂ、編）、　３６３〜３８９頁（Ｋｌｕｗｅｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　（１９８８）））。

ストロノリジン−３遺伝子の発現を外因性の刺激物質で変調させ得るかどうかを調べるために、ヒト胎児二倍体線維芽細胞をＰＤＧＦ、ｂＦＧＦおよびＥＧＦならびに腫瘍プロモーターＴＰＡの存在下または非存在下で成長させた。これらの成長因子のいずれか、もしくはＴＰＡの添加が線維芽細胞におけるストロメ（ノンンー３　ＲＮ八へ写物の増大をもたらし、最も強い刺激がｂＦＧＦで観測された（図５ｄ）。

実施例８胚におけるストロメリシン−３の発現ストコメリシン−３遺伝子が成長因子の刺激に応答して胎児線維芽細胞中で発現されたので、本発明者らはこの遺伝子が胚発育中に通常に発現されるかどうかを調べた。

ストロタワシン−３転写物が８週齢ヒト胚の数個の別個の領域で検出され、胚形成のこの段階で予定された細胞の死を伴うことが知られている領域（Ｍｉｌａｉｒｅ、　Ｊ、　、“Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ”（Ｄｅ　Ｈａａｎ、　Ｒ，Ｌ、およびＵｒｓｐｒｕｎｇ、　Ｈ，編）、　２８３〜３００頁（Ｈｏｌｔ、Ｒｉｎｅｈａｒｔ　ａｎｄ　Ｖｉｎｓｔｏｎ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９６５））である肢芽の指間領域で顕著であった（図６、パネルにおよびｌ、ならびに非開示データ）漂識化は、標識されずに残った原始表皮の基礎をなす胚の生肝葉で観測された。

エビブラストから離れて位置する開票細胞もｍＲＮＡ−陰性であったことは注目に値する。

このように正常な胚生育中に組織改造が十分証明されている領域でストロメリンンー３遺伝子が発現するという発見は、乳腫瘍におけるストロメリシン−３の発現が癌の進行に関連するＥＣＭ改造過程においである役割を果すことを示唆している。

Ｓｒ１をコードするヒトｃＤＮＡを含有するプローブを用いて、マウス胎盤ｃＤＮＡライブラリーを標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ″（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（Ｌ９８９）））でスクリーニングした。

このスクリーニングの結果、Ｓｒ１をコードする全長マウスｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが得られた（図７）。

これら２つの配列の分析によって成熟型ＳＴ３のアミノ酸配列には８９％、ブレおよびプロドメインには５５％の相同性が存在することか明らかになった（図７）。

実施例４〜８に記述した方法を用いて、種々のマウス細胞中ての発現様式を決定した。

マウスにおけるＳｒ１の発現様式は組織特異性に関してヒト組織に認められた様式と同一であることがわかった。最も高い発現レヘルは胎盤および子宮組繊に認められた。

ｎＧ、ＩＣＩＰｌＣＩＦｌＣＩＦＩ　ＣＩＦ１ＦＩＧ−２（Ｓｕｉｔ、ｅ）門：Ｇ、３ａビニＧ−３ａ　（Ｓｕｉｔｅ）シミＦ工Ｇ、４癌腫　腺腫 ’　ＣＩＣ２Ｃ３（，４Ｃ５Ｃ６Ｃ７ＣａＣ９ＣＩＯＦ２Ｆ３Ｆ４Ｆ５”５−Ｗ −Ｎ−−曽＠Ｉｌｌ＠ｌ１ｗ１ｌ　−ｐｕ＋ＴＧ−５要約書本発明は、浸潤性乳癌に特異的に伴うことがわかった金属プロテイナーゼファミリーの新規構成要素をコードする遺伝子、およびこの標識またはそのヌクレオチド配列の検出からなるこのような癌の診断法、およびこの標識の活性を阻害または変化させるか、もしくはこの標識を結合するか、あるいはその合成を妨害することによる治療または予防に関する。

国静珈審誓失

Claims

【特許請求の範囲】

１．生体内もしくは試験管内における生物学的試料中のストロメリシン−３、もしくはストロメリシン−３をコードするヌクレオチド配列の検出からなる悪性腫瘍の診断方法。
２．悪性腫瘍が、乳癌、咽頭癌、ならびに頭部、首部、および皮膚癌腫からなる群から選択される第１項の方法。
３．ストロメリシン−３に対して特異的な抗体または抗体等価物を試料またはその調製物と接触させて結合を検定するストロメリシン−３の検出からなる第１項または第２項の方法。
４．抗体または抗体等価物が標識されている第３項の方法。
５．第３項または第４項に定義される抗体または抗体等価物。
６．ヌクレオチドプローブを用いてヌクレオチド配列を検出し、ハイブリッド形成を検定する第１項または第２項の方法。
７．プローブまたはその姉妹鎖がストロメリシン−３の特徴的な部分または全体をコードしている第６項の方法。
８．プローブまたはその姉妹鎖がストロメリシン−３のプレーまたはブローペプチドをコードしていない第７項の方法。
９．プローブまたはその姉妹鎖がストロメリシン−３をコードするｃＤＮＡ配列の一部または全体を有するか、もしくは遺伝子コードの縮重によってそれに対応するか、もしくは検定条件下でそれとハイブリッド形成する第６項から第８項までのいずれかの方法。
１０．プローブが放射性標識されている第６項から第９項までのいずれかの方法。
１１．プローブがリボプローブである第６項から第１０項までのいずれかの方法。
１２．プレーブロストロメリシン−３をコードするｃＤＮＡ配列の特徴的な部分または全体に対応するアミノ酸配列、もしくは該アミノ酸配列に対応する動物配列を含む、該ｃＤＮＡ配列の特徴的な部分または全体の変異体、変種または断片に対応するアミノ酸配列からなる合成または発現されたペプチド。
１３．該アミノ酸配列が、マウスおよびヒトのプレーブロストロメリシン−３からなる群から選択される第１２項のペプチド。
１４．該断片がプロストロメリシン−３である第１２項または第１３項のペプチド。
１５．該断片が成熟ストロメリシン−３である第１２項または第１３項のペプチド。
１６．第１２項から第１５項までのいずれかのペプチドをコードするｃＤＮＡ配列。
１７．第１６項の配列を含有するベクター。
１８．適切な宿主細胞および発現ベクターである第１７項のベクターからなる、第１２項のペプチドを産出する発現系。
１９．第１８項の発現系の使用および目的ペプチドの単離からなる、第１２項のペプチドの生産法。
２０．転移性癌、具体的には乳癌、咽頭癌、および頭部、首部および皮膚癌腫の治療または予防用医薬の製造における、ストロメリシン−３遺伝子の発現に影響を及ぼし得るか、もしくはストロメリシン−３活性に影響を及ぼし得る薬剤の使用。
２１．癌が乳癌である第２０項の使用。
２２．薬剤がストロメリシン−３に対して特異的な抗体または抗体等価物である第２０項または第２１項の使用。
２３．抗体または抗体等価物が毒性標識を保持する第２２項の使用。
２４．標識が放射性同位体である第２３項の使用。
２５．薬剤が、ストロメワシン−３に対して特異的な組織金属プロテイナーゼ類阻害因子または他の、好ましくは合成された、金属プロテイナーゼ類阻害因子である第２０項または第２１項の使用。
２６．薬剤がストロメリシン−３の活性を変化させる第２０項または第２１項の使用。
２７．薬剤がストロメリシン−３遺伝子の発現を阻害する第２０項または第２１項の使用。
２８．薬剤がプレープロタンパク質のストロメリシン−３への成熟を阻害する第２０項または第２１項の使用。
２９．第２０項から第２８項までのいずれかに定義された、治療、具体的には癌治療で使用するための薬剤。
３０．第１２項のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するウイルスをそのための適切な担体と共に含有するワクチン。