HU215165B - Analitikai indikátorok rák, főleg rosszindulatú mellrák kimutatására - Google Patents

Abstract

Eljárást ismertetnek rősszindűlatú tűmőr diagnősztizálására, amelyneksőrán egy új peptidet, a sztrőmelizin–3-at vagy a sztrőmelizin–3peptidet kódőló nűkleőtid-szekvenciát műtatják ki egy biőlógiaimintában in vitrő. Ismertetik tővábbá a sztrőmelizin–3 peptidet kódőlógén, az ezt tartalmazó vektőr, a vektőrral transzfőrmált gazdasejt ésaz általa expresszált peptid, és a peptidre specifikűs antitestekelőállításá , valamint hatóanyagként a sztőmelizin–3 gén expressziójátvagy aktivitását befőlyásőló hatónyagőkat tartalmazó, rák kezelésérevagy megelőzésére szőlgáló gyógyszerkészítmények, tővábbáhatóanyagként sztrőmelizin–3 peptidet vagy az azt kódőló nűkleőtid-szekvenciát hőrdőzó vírűst tartalmazó vakcinák előállítását. ŕ

Description

A találmány tumorhoz kapcsolódó enzimatikus markerekre vonatkozik.

A sztromelizin-3 fehérjét kódoló DNS-szekvenciák, valamint a sztromelizin-3-hoz kapcsolódni képes antitestek felhasználásával a jelen találmány tárgya rák diagnosztikai eljárás, pontosabban rosszindulatú emlőrákot diagnosztizáló eljárás.

A rák által évente okozott halálesetek száma a világban továbbra is nagy problémát okoz, csak néhány kezelési mód áll rendelkezésre néhány speciális ráktípus kezelésére, és ezek sem jelentenek garanciát a sikerre. A legtöbb kezelés a „shotgun” (véletlen találat) elvén alapszik, a gyorsan növő sejteket roncsolják el abban a reményben, hogy a gyorsan növekvő rákos sejtek elpusztulnak vagy a kezelés következtében, vagy legalább a számukat csökkentik le, és ezzel lehetővé teszik a szervezet számára, hogy a maradékot eliminálja.

A gyógyszerek kutatását megnehezítette az a felfedezés, hogy a rák különböző fajtái különböző kezelést tesznek szükségessé. Mivel a testnek gyakorlatilag minden részét érintheti a rák, ezért a feladat óriási.

Mindazonáltal, a különbségek ellenére a rákok számos hasonlósággal rendelkeznek. Ezek közül az egyik a differenciálatlan szövet növekedése. Azonban még ez sem igaz száz százalékig abban az értelemben, hogy bizonyos rákos sejtek bizonyos mértékű differenciálódást mutatnak, például ez az eset a szexuális szervek rákos megbetegedései esetében, úgymint az emlő és a here esetében, míg a tumorok lehetnek pozitívak vagy negatívak a hormon-receptorokon. Ezeknek a tumoroknak a kezelése a hormonális állapottól függ, és lehet olyan egyszerű is, mint egy megfelelő hormon antagonista (például a Tamoxifen) adagolása.

Egy másik, a legtöbb rák esetében közös faktor, hogy a tumornak ahhoz, hogy halálos legyen, áttéteket kell képeznie. Egészen addig a pillanatig, amíg egy áttétet nem képez egy tumor, annak ellenére, hogy rosszindulatú lehet, a test egyik részére korlátozódik. Jóllehet provokálhat betegséget és/vagy fájdalmat, vagy még súlyosabb tüneteket is előidézhet, de mivel lokalizálható, ezért sebészeti úton eltávolítható, és ha az eltávolítást megfelelő gondossággal végzik, nem okoz további problémákat.

Mindazonáltal, ha egyszer egy metasztázis létrejött, akkor a sebészeti beavatkozás eltávolíthatja a kiindulási daganatot, de a rákos sejtek elözönlik a testet, és csak a kemoterápia vagy az irányított terápiák bizonyos formái rendelkeznek a siker valamelyes reményével.

Eképpen a tumor azon képessége, hogy elözönli a környezetet, és áttéteket okoz a távoli szervekben (a tumor teijedése), halálos esemény a legtöbb rákos beteg esetében. Az elsődleges tumort körülvevő extracelluláris anyag (MEC) egy módosításáról/degradálásáról, valamint a tumorsejtek tapadási képességeinek módosításáról ismert, hogy meghatározó szerepet játszik az áttéti sejteknek a primer tumor sejtjeiről való disszociálásában [Liotta, Cancer Rés., 46, 1-7 (1986); Hart et al., Biochim. Biophys. Acta, 989, 65-84 (1989)].

A tumor angiogenezise egyszerre lényeges a primer tumor tovaterjedése és az áttétes tumor ütemezése szempontjából, és az angiogenezis maga is szükségessé teszi a MEC degradálását [Blood et al, Biochim. Biophys. Acta, 1032, 89-118 (1990)]. Ennek folytán a malignitás (rosszindulatú tulajdonság) egy szisztémás betegség, amelyben a neoplasztikus sejtek és a környezetük közötti kölcsönhatások meghatározó szerepet játszanak a patológiás folyamat kifejlődése során [Fidler,

I. J., Cancer Metastasis Rév., 5, 29-49 (1986)].

A rosszindulatú tumorokkal kapcsolatban álló gének expressziójában való módosítások azonosítása, beleértve azokat a sejteket, amelyeket működésbe hoznak a tumor fejlődése során, világosan egy előzetes feltétel, nemcsak a rák teljes megismerése szempontjából, hanem ugyanígy a rák elleni harcban használható ésszerű új terápiák kidolgozása szempontjából. A sejtek két csoportba tartozó génjeinek (a protoonkogének és a tumorszuppresszor gének) mutációiról és expressziójuk abnormális szabályozásáról igazolták, hogy egy többlépéses folyamatban oda vezetnek, hogy a sejtek elveszítik a normális növekedésszabályozást, és a transzformáit sejtek fenő típusát veszik fel [Weinberg, R. A., Cancer. Rés., 49, 3713-3721 (1989)]. Eközben azok a molekuláris mechanizmusok, amelyek a tumor progressziójához vezetnek, sokkal kevésbé tisztázottak [Nowell, P. C., Cancer. Rés., 46, 2203-2207 (1986); Fodler, I. J., Cytometry, 10, 673-680 (1989)].

Emellett van még egy kiegészítő probléma, amennyiben a rákos sejtek jellemző génjei nagyon gyakran olyan génjei a gazdaszervezetnek, amelyek abnormális módon expresszálódnak. Nagyon gyakran az az eset történik, hogy egy adott rákra jellemző fehéijemarker túlexpresszálódik az adott rákban, de ugyanúgy expresszálódik még a testben máshol is, jóllehet jóval alacsonyabb szinten.

A rákokhoz kapcsolódó fehéijék között vannak enzimek, amelyek elroncsolják az extracelluláris mátrixot, amely fontos abból a szempontból, hogy a setjek egymáshoz viszonyítva a megfelelő helyen maradjanak. Ezek közül az egyik osztályt a metalloproteinázok képezik (MMP) [Matrisian, L. M., Trends Génét., 6, 121-125 (1990)], ezeket azért hívják így, mert megkötik a cinket. Azonban egyiket sem találták rákdiagnosztikai jellegűnek vagy bármely tumorra jellemzőnek, bár néhánynak a jelenléte indikatív jellegű.

Az MMP-k számos fiziológiás és patológiás folyamatban játszanak szerepet, amelyekben a MEC átalakulása és a sejtvándorlás vesz részt, például a morfogenezis és az embrionális fejlődés, a reumatoid artrítisz, valamint a tumorinvázió és a metasztázis. Az MMP inhibitorokról ismert, hogy képesek gátolni a tumor invázióját és angiogenezisét, amelyeknek meghatározó jelentőségük van a tumor fejlődésében, a kísérleti modellek szerint.

A mátrix metalloproteinázok családjának minden tagja olyan proteináz, amely a MEC-nek legalább egy komponensét lebontja, amelyek egy látens formában képesek szekretálódni, és aktiválásra van szükségük, mondjuk proteolízisre (például plazminnal) ahhoz, hogy aktívak legyenek. A szövetközi kollagenázok a specifikusan kötőszöveti kollagéneket támadják meg (I2

HU 215 165 Β tői III-ig), míg a IV-es típusú kollagenázok (72 kD és 92 kD) az alapmembránban és a fibronektinben lévő kollagéneket bontják le. A sztromelizinek (transinok), az 1-es és 2-es, valamint a pump-1 szélesebb szubsztrát-specifitással rendelkeznek, lebontják a proteoglikánokat, a laminint, a fibronektint és a kollagéneket (III-tól V-ig).

A férfiaknál a legtöbb rosszindulatú daganat karcinóma, és nemdohányzó nőknél az emlőrák okozza a legtöbb halálesetet a rákos megbetegedések közül [Willett, W., Natúré, 338, 389-394 (1989)]. Számos onkogén módosított működését írták le az emlőrák sejtjeiben, de az onkogén/szuppresszor expresszió egyetlen mintázata sem rendelhető logikusan az emlőrákhoz [Gullick, W. J., Prog. Growth Factor Rés., 2, 1-13 (1990)].

Az emlőrákok neoplasztikus sejtjei azonban gyakran beágyazódnak egy zsírszöveti és mezenchimás kötőszöveti vázba, amelyek szintén fontosak lehetnek szaporodásuk szabályozásában, valamint a metasztázisképző képességükben. Az természetesen ismert, hogy a kötőszöveti váz sejtjei modulálhatják - mind pozitív, mind negatív irányban — a normál emlős laphám növekedését [Salomon et al., Breast Cancer: Cellular and Molecular Biology (szerk. Lippman, M. E. és Dickson, R. B.) 363-389 (Kluver, Boston) (1988)], és a kötőszöveti laphám komponensei közötti kölcsönhatások befolyásolhatják az emlőmirigyek laphámos karcinogenezisét [DeOme et al., Cancer Rés., 28, 2103-2111 (1978)].

Az „aktivált” fibroblasztok létezését [Tremblay, G., Exp. Mól. Pathol., 31, 248-260 (1979)] és/vagy abnormális fibroblasztok létezését [Grey et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 68, 2438-2442 (1989)] tételezik fel az emlő rosszindulatú daganataiban, és felvetik azt, hogy az emlőrák egy kötőszöveti feltételtől való részleges szabadulást vagy egy kötőszöveti komponensre adott abnormálisán erős választ jelent.

A rákos sejtek természetének következtében viszonylag könnyű egy folyamatos tenyészetet vagy sejtvonalat készíteni egy adott rákból, és ez az eljárás könnyűvé teszi egy adott kezelési mód hatásainak tanulmányozását. Az ilyen rendszereknek egy lényeges hátránya a természetükben magában rejlik - míg a tesztkezelésből kiderül, hogy közvetlenül hat-e a sejtekkel szemben, az egyáltalán nem biztos, hogy a kezelésnek milyen hatása lesz in vivő, és ezeknek a sejtvonalaknak a biokémiai elemzése elkerülhetetlenül a rákot in vivő körülmények között körülvevő normál szövetek nélkül folyik le.

A találmány tárgya azoknak a géneknek az azonosítása, amelyeknek az expressziója megnövekszik az emlő karcinómákban, mimellett az emlő karcinómákat rosszindulatú laphám sejteknek tekintjük, amelyek kölcsönhatásba lépnek a kötőszöveti környezetükkel.

Azt a felfedezést tettük, hogy egy ezidáig nem azonosított fehérje lehetővé teheti bizonyos invazív rákok diagnosztizálását, főleg az emlőrákokat, a fej és a nyak pikkelyes bőrén lévő sejtek karcinómáit, és a bőr karcinómáit (a pikkelyes típusú sejtekét és a bazális típus sejtekét). A fehérje láthatólag a metalloproteinázok csoportjába tartozik, és az alábbiakban sztromelizin-3 néven említjük.

Az ábrákat röviden az alábbiakban ismertetjük.

1. ábra: A Cl emlőkarcinómáböl és a fibroadenómából származó össz-DNS elemzése Northern blottal

A Cl emlőkarcinóma-sejtekből és fibroadenómából származó RNS-bolátot az 1. példában leírt módon négy függetlenül izolált cDNS szondával vizsgáljuk meg.

2. ábra: A sztromelizin-3 cDNS nukleotid-szekvenciája

A sztromelizin-3 cDNS nukleotid-szekvenciáját és az ebből kikövetkeztetett aminosav-szekvenciát mutatjuk be. Az 5’-végtől indulva az aláhúzott nukleotidszekvenciák jelentése az alábbi: a feltételezett szignál-szekvencia; a PRCGBPDszekvencia, amely a prometallo-proteinázokra jellemző, a cinkkötő dómén konzervált hisztidincsoportjai és a poli(A⁺) szignálszekvencia.

3. ábra: A meíalloproteináz-szekvenciák összehasonlítása

A sztromelizin-3, sztromelizin-2, a sztromelizin-1 és a kollagenáz-1 aminosav-szekvenciáit felsorakoztatjuk egymás alatt, ezek mind feltételezett metalloproteinázok, amint azt a 3. példában ismertetjük.

4. ábra: Az emberi metalloproteináz elemzése

Northern blottal

Négy, ösztrogén receptort nem tartalmazó emlőrákból össz-RNS-t izolálunk (Cl, II fokozat; C2, C3 és C4, III fokozat), majd ugyanezt tesszük hat, ösztrogén receptort tartalmazó emlőkarcinómával (C5, C8 és C9, II fokozat; C7, III fokozat; Cio, I fokozat), és négy emlőfibroadenómával (F2-F5).

Az RNS-t a következő próbákkal vizsgáljuk meg: (a) sztromelizin-3 RNS, (b) 1es típusú kollagenáz (COI) RNS, (c) 4-es típusú, 92 kD-os kollagenáz (COIV 92 k) RNS, (d) 4-es típusú 72 kD-os kollagenáz (COIV 72 k), (e) sztromelizin-1 és -2 RNS, valamint a pump-1 (PÚI) RNS, amint azt a 4. példában ismertetjük.

5. ábra: A különböző sejtvonalakból és szövetekből származó sztromelizin-3 RNS Northern blotjának elemzése (a) Három normális kisegítő nyirokmirigy és három metasztázisos nyirokmirigy, amelyek olyan betegekből származnak, akiket emlőrák támadott meg; (b) négy olyan emlőrák karcinóma sejtvonal, amelyek az ösztrogén receptorokra negatívak (BT-20, MDA-232, SK-BR-3,

HU 215 165 Β

HBL-100), és négy olyan emlőrák karcinóma, amelyek az ösztrogén receptorokra pozitívak (T—47D, BT^474, ZR-75-1, MCF-7); (c) tíz normál emberi szövet; (d) humán HFL-1 magzatból származó fibroblasztok (ATCC CCL 153), szérummentes közegben tenyésztve (1 és 2); tPA távollétében (1) vagy jelenlétében (2), szérummentes közegben tenyésztve, amely 20 mg/ml inzulinnal van kiegészítve (3-6) PDGF távollétében (3) vagy PDGF (4), EGF (5) vagy bFGF (6) jelenlétében, ezeket vizsgáljuk a sztromelizinszekvenciát tartalmazó próbával, amint azt a 3. példában ismertetjük.

6. ábra: A sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékeinek lokalizálása az emlőrák metszeteiben és az embrionális végtagok kitüremkedéseiben

Szövetek metszeteinek világos hátterű mikrográfiái (X 100) hematoxilinnel színezve (A, C, E, G, I és K); ugyanezeknek a metszeteknek sötét hátterű mikrográfiái (még hematoxilinnel színezve) a sztromelizin-3 anti-sense RNS-sel végzett in situ hibridizálás után (B, D, F, H, J és L), a 6. példában leírtak alapján.

7. ábra: Egér ST3 cDNS-szekvenciája

Az egér ST3 génjének cDNS-szekvenciája és ennek összehasonlítása az emberi ST3 cDNS szekvenciájával.

A jelen találmány tárgya eljárás egy invazív rák, főleg emlőrák, valamint a fej a nyak és a bőr karcinómáinak diagnosztizálására, azzaljellemezve, hogy vagy a sztromelizin-3-at, vagy a sztromelizin-3-at kódoló nukleotid-szekvenciát mutatjuk ki.

A találmány tárgya továbbá egy olyan hatóanyag alkalmazása, amely képes megzavarni a sztromelizin-3 szintézisét vagy aktivitását egy invazív rák, főleg emlőrák, illetve a fej, a nyak és a bőr karcinómáinak kezelése vagy megelőzése során.

Az nyilvánvaló, hogy az áttétes tumorok invazívak, de az invazív tumorok nem szükségszerűen áttétesek (például a bőr bazális sejtjeinek karcinómái).

Mivel a sztromelizin-3 gén expressziója a MEC lebomlásának régiójára specifikus, és láthatólag egy metalloproteinázt kódol, azt feltételezzük, hogy ennek a MEC lebontási aktivitása elsődleges fontossággal rendelkezik a tumorok áttétekben való fejlődésében. A kötőszöveti sejtek által expresszált sztromelizin-3 valószínűleg a MEC-nek egy fontos részét bontja le, és ezzel lehetővé teszi, hogy a rákos sejtek elvándoroljanak a kiindulási tumortól.

Ennek az a következménye, hogy minden olyan hatóanyag, amely befolyásolhatja a sztromelizin-3 aktivitását, hatással lesz az áttétekre. Ezek azok az alkalmas hatóanyagok lesznek, amelyek gátolják a fehéije szintézisét, gátolják a fehérje érését, vagy módosítják az enzim aktivitását, az aktivitás blokkolásával vagy módosításával.

A sztromelízín-3 gén expressziójáról azt találták, hogy az első esetben diagnosztikai jelleggel bír az áttétes fázisban lévő emlőrák esetében. Ezt az eredményt valójában az mRNS kimutatásával értük el különböző kimetszett tumorokban. Az emlőrákot választottuk, mivel ennek van a legmagasabb halálozási aránya a nemdohányzó nők rákjai között.

A sztromelizin-3 egy új fehéije, amely majdnem teljes bizonyossággal az MMP-k közé tartozik, és az invazív karcinómákkal áll kapcsolatban, függetlenül azok hormonális állapotától.

Az MMP család tagjainak egy aktiválási lépésre van szükségük, amely kapcsolatban állhat a pre- és proszekvenciák eliminálásával, ami ahhoz lehet szükséges, hogy aktívak legyenek. A pro-sztromelizin-3 aminosav-szekvenciája és a sztromelizin-3 aminosav-szekvenciája nagyon különböző a korábban leírt MMP-k aminosav-szekvenciájától, és különböző tulajdonságokat mutathat az érést, aktivitást és az ECM-komponensek iránti specificitást illetően.

A sztromelizin-3 gént minden primer invazív emlőrák expresszálja, valamint néhány áttétjük, és olyan szövetek, amelyekről tudott, hogy bennük az ECM extenzív átrendeződése zajlik le (méh, méhlepény, végtagok buijánzása), és amelyeket az ilyen expresszió szempontjából megvizsgáltunk, de az emlőfibroadenómáiban és a normális felnőtt szövetekben nem expresszálódik, és ez azt sugallja, hogy a sztromelizin-3 gén fontos szerepet játszik az emlőrák fejlődésében. Ezzel a koncepcióval összhangban a sztromelizin-3 gén nem expresszálódik a legtöbb in situ karcinómában, a comedo típusú in situ karcinómák kivételével, amelyeket általában invázió előtti lézióknak tekintenek, és gyakran egy mikro-invázióval állnak kapcsolatban. Tehát a sztromelizin-3 mRNS transzkripciós termékeinek jelenléte a test egyéb részeiben mért alacsony koncentrációtól eltérő koncentrációban, kivéve a méhben vagy a placentában, lehetővé teszi egy metasztatikus rák diagnosztizálását, vagy egy olyan rák diagnosztizálását, amelynél megvan annak a veszélye, hogy invazíwá váljon.

A sztromelizin-3 részt vehet a lítikus folyamatokban, amelyek valószínűleg kapcsolódnak az invazív tumomövekedéshez. Egy másik változat szerint az is lehetséges, hogy a sztromelizin-3 szerepet játszik a dezmoplázia kialakulásában, amely a legtöbb invazív emlőrák lézióival kapcsolatban áll, és a gazdaszervezet egy reakcióját képviselheti, aminek az a célja, hogy leállítsa a rosszindulatú sejtek elterjedését [Ahmed, A., Pathol. Annu., 25 (Pt2), 237-238 (1990)]. Egy ilyen esetben a sztromelizin-3 aktivitásának megnövekedése előnyös lehet.

Továbbá, a sztromelizin-3 gén korlátozotott expressziója a daganatos sejtek szigetecskéjét közvetlenül körülvevő kötőszöveti fibroblasztokban jelentős ellentétben áll a kollagenáz IV-gyel, egy másik metalloproteinázzal, amelyről ismert, hogy kapcsolatban áll néhány rákosodásra hajlamos sejt rosszindulatú átalakulásával, és a katepszin D-vel, egy lizoszomális aszpragin proteázzal, amelynek az expressziója megnő az emlő4

HU 215 165 Β karcinómákban, és ez a kettő nem a fibroblasztokban expresszál, hanem az emlőrák rákosodásra hajlamos laphám sejtjeiben [Monteagudo et al., Am. J. Pathol., 136, 585-592 (1990); Garcia et al., Steroid Biochem., 27,439Ή45 (1987)].

Az emlőrák új markerének azonosítására egy cDNS könyvtárat készítettünk, amelynek forrása egy fibroadenómából kivont poli(A⁺) RNS volt. Ezzel a módszerrel a cDNS könyvtárat feldúsítottuk az áttétes rákokra jellemző szekvenciákban.

Bizonyos számú kiónt állítottunk elő, és metasztázisos tumorokból, valamint fibroadenómákból származó poli(A⁺) RNS-sel mint próbákkal vizsgáljuk át. Azokat a kiónokat, amelyek a legerősebben kötődtek a metasztázisos rákból származó poli(A⁺) RNS-hez, újra kinövesztjük.

Az ily módon előállított kiónok közül egy olyat találtunk, amely differenciált módon expresszálódik abból a szempontból, hogy magas szintű expresszió csak rosszindulatú emlő- és garatrákban, a fej, a nyak és a bőr rosszindulatú rákos megbetegedéseiben (a pikkelyes típusú és bazális típusú bőrsejtekben) található ugyanúgy, mint a méhben és a placentában, és amelyekben mindegyikben a MEC lebomlása tapasztalható, ami ha rákhoz kapcsolódik, akkor lehetővé teszi a rákos sejteknek, hogy az egész testben elszaporodjanak (áttétek).

A méh és a placenta esetében a MEC lebomlása természetes, míg mindenhol máshol valószínű, hogy egy rákos növekedéshez kapcsolódik.

Azt is érdemes megjegyezni, hogy a sztromelizin-3 gén expresszióját a magzatban, a végtagok formálódása során, az ujjak közötti differenciálódásban is felfedezték, ami a MEC lebomlásával van kapcsolatban.

A cDNS-szekvencia jellemzése során kiderült, hogy egy nyitott leolvasási keretet tartalmaz. A fehérje-szekvenciának egy ismert könyvtárhoz való hasonlítása során kiderült, hogy a fehérje egy olyan családhoz tartozik, amelyről ismert, hogy lebontja a MEC-et. Jóllehet a sztromelizin-3 szekvenciája kevesebb analógiát mutat a család többi tagjához, mint bármelyik másik tag mutat a többihez, mégis tartalmaz számos jellemző régiót, amelyek elősegítik az enzim természetének azonosítását. Ennek következtében a fehéije a sztromelizin-3 nevet kapta, jóllehet lehetne egy másik kollagenáz is, vagy lebonthatná a MEC egy másik alkotóelemét is.

A nukleotid-próbák alkalmazása a sztromelizin-3 mRNS jelenlétének igazolására demonstrálta a fentiekben ismertetett szöveteloszlást, valamint lehetővé tette, hogy a fotomikrográfiákon jelzéssel pontosan lokalizáljuk a sztromelizin-3 gén expressziójának területeit.

Az ily módon előállított fotomikrográfíák elemzése bizonyos mértékig meglepő módon kimutatta, hogy a sztromelizin-3 gén nem magukban a rákos sejtekben expresszálódik, hanem a körülöttük lévő kötőszöveti sejtekben. Továbbá a kötőszövet nem mutatta a sztromelizin-3 jelenlétének semmilyen bizonyítékát, ha a tumor bazális membránja még érintetlen volt (6. ábra). A sztromelizin-3 gén az összes primer invazív emlőkarcinómában expresszálódik, néhány áttétes mirigyen keresztül, valamint azokban a sejtekben, amelyekben tudott, hogy a MEC extenzív átalakulása folyik (méh, méhlepény és végtag-növekedés helye), és az említett expresszió szempontjából elemezték, de az emlő-fibroadenómáiban és a normális felnőtt szövetekben nem expresszálódik, és ez azt sugallja, hogy a sztromelizin-3 gén fontos szerepet játszik az emlőrák fejlődésében. Ezzel a koncepcióval összhangban a sztromelizin-3 gén nem expresszálódik a legtöbb in situ karcinómában, a comedo típusú in situ karcinómák kivételével, amelyeket általában invázió előtti lézióknak tekintenek, és gyakran egy mikroinvázióval állnak kapcsolatban. A sztromelizin-3 mindig jelen van az áttétes rákok kötőszövetében, de nincs jelen a primer tumorok kötőszövetében in situ (olyan tumorok, amelyek rendelkeznek még egy bazális membránnal, és nem invazívak). Tehát a sztromelizin-3 mRNS transzkripciós termékeinek jelenléte a test egyéb részeiben mért alacsony koncentrációtól eltérő koncentrációban, kivéve a méhben vagy a placentában, lehetővé teszi egy metasztatikus rák diagnosztizálását vagy egy olyan rák diagnosztizálását, amelynél megvan annak a veszélye, hogy invazíwá váljon.

Továbbá, a sztromelizin-3 gén expresszióját nem mutatták ki az összes olyan emlőráksejtvonalban, amelyek az RO (ösztrogén receptorok) szempontjából pozitívak vagy negatívak, jóllehet ezek némelyikéről ismert, hogy szekretálják és tartalmazzák az EGF/TGFa és az FGF receptorait (ezek olyan faktorok, amelyek részt vesznek a sztromelizin-3 gén expressziójában.

Tehát a sztromelizin-3-ra, prekkurzoraira vagy a kódoló nukleotid-szekvenciákra használt standard detektálási technikák alkalmazhatók áttétes rákok diagnosztizálására, vagy annak megerősítésére, hogy egy primer tumor még nem került a halálos áttétes fázisba.

Az ilyen technikák közé tartozik például a nukleotidpróbákkal való kimutatás, az előzőekben leírt módon, vagy a sztromelizin-3 fehéije kimutatása például antitestekkel vagy ezeknek megfelelő anyagokkal.

A nukleotid-próba bármely olyan próba lehet, amely erősebben hibridizál a 2. ábrán látható szekvenciával, mint más, a természetben előforduló szekvenciával. A próbák közé tartoznak a cDNS-ek, riboszondák, szintetikus oligonukleotidok és genomiális próbák. Az alkalmazott próba az adott szituációtól függ, például ribopróba az in situ hibridizációban, cDNS a Northern biot analizálásához. A legelőnyösebb próbák azok, amelyek a 2. ábrán látható cDNS negatív szálával hibridizálódnak. Hasonlóképpen lehetséges olyan próbák alkalmazása, amelyek a sztromelizin-3 gén belsejében található intronokkal hibridizálódnak, de nem szükségszerű, hogy ez ugyanolyan megbízható legyen, mint az RNS transzkriptumok kimutatása.

A sztromelizin-3-at kódoló gén azonosításának önmagában nincs diagnosztikai jelentősége, de más vizsgálati formák, amelyek a transzkripciós termékek és más expressziós termékek kimutatását szolgálják, általában hasznosak. A próbák olyan rövidek lehetnek, amelyek csak ahhoz szükségesek, hogy differenciált módon felismerjék a sztromelizin-3 mRNS transzkrip5

HU215 165Β ciós termékeit, azaz lehetnek például 15 bázispár hosszúak.

A próbák jelzése bármely olyan lehet, ami megfelelő, például a ³²P és ³⁵S radioaktív izotópokat használhatjuk. A radioaktív izotópokkal való jelzést úgy érhetjük el, hogy a próbákat kémiai vagy biológiai úton szintetizáljuk, a megfelelően jelzett bázisok alkalmazásával. A jelzés egyéb módja lehet például az enzimekkel vagy antitestekkel való jelzés, ami az ELISA-ra jellemző, de az mRNS transzkripciós termékeinek kimutatása a jelzett próbákkal általában röntgen radiográfiával történik.

Az RNS transzkripciós termékeinek kimutatása Northern blottal történhet, például úgy, hogy egy RNSpróbát egy denaturáló agaróz gélre visszük, majd egy megfelelő hordozóra visszük át, például aktivált cellulózra vagy aktivált nitrocellulózra, illetve üveg- vagy nylon-membránra. A jelzett cDNS-t vagy RNS-t a preparátumhoz hibridizáljuk, mossuk, majd autoradiográfiával analizáljuk.

In situ hibridizálással végzett láthatóvá tételt is alkalmazhatunk (6. példa), amelyben egy ³⁵ S izotóppal jelzett antisense cRNS-próbát hibridizálunk egy vékony biopsziamintához, mossuk, RN-ázzal hasítjuk, majd autoradiografálás céljából egy érzékeny emulzióra tesszük. A mintákat hematoxilinnel színezhetjük a minta hisztológiai összetételének igazolására, és egy sötét látóterű mikrográfia készíthető a megfelelő színszűrővel az előhívott emulzióról.

Immunhisztokémiát is használhatunk a sztromelizin-3 expressziójának kimutatására egy biopsziás mintában. Egy megfelelő antitestet érintkezésbe hozhatunk egy megfelelő sejtréteggel, mossuk, majd egy másik, megfelelően jelzett antitesttel hozzuk érintkezésbe. A jelzés lehet egy enzim, például peroxidáz, avidin, illetve lehet radioaktív izotóp. A kromogén jelzések általában előnyösek, mivel mikroszkópos úton kimutathatók.

Egy általánosabb megvalósítási mód szerint a fehérjét immunológiai módszerekkel mutatjuk ki, például ELISA-val, RIA-val, amely rendkívül gyors lehet. Tehát általában az antitesteket használjuk, vagy azok ekvivalenseit a sztromelizin-3 kimutatására, de a sztromelizin-3 egy megfelelően jelzett szubsztrátjának alkalmazása is előnyös lehet.

Esetleg nem szükséges a szubsztrátot jelezni olyan körülmények között, amikor az enzimatikus eljárás terméke önmagában is kimutatható (például a hidrogénperoxid). Mégis, ha a szubsztrátot jelezni kell, akkor ez lehet enzimatikus jelzés, radioizotópokkal végzett jelzés, antitestekkel végzett jelzés vagy fluoreszcens markerekkel végzett jelzés, illetve minden olyan megfelelő módon végzett jelzés, amely a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló.

A sztromelizin-3 expressziójának kimutatására legelőnyösebb az antitestek használata. Az antitesteket az alábbiakban ismertetett módon állíthatjuk elő, és bármely módon használhatjuk a sztromelizin-3 expressziójának kimutatására.

Az antitestek alkalmazására használt módszerek közé tartozik az ELISA (egy enzimhez kötött immunszorbenssel végzett vizsgálat - Enzime Linked

Immunosorbent Assay) és a RIA (radioimmunológiai vizsgálat - RadiolmmunAssay). Bármely szokásos módszer használható az ilyen immunológiai vizsgálatokhoz. A szokásos módszereket a következőképpen hajthatjuk végre: egy sztromelizin-3 standardot ^l25I-vel vagy ³⁵S-sel jelzünk, vagy egy vizsgálható enzimet, például torma-peroxidázt vagy alkalikus foszfatázt egy jelzetlen mintával együtt érintkezésbe hozzuk a megfelelő antitesttel; amely antitesthez egy második antitestet viszünk fel, hogy hozzákössük a radioaktivitást vagy a vizsgált immobilizált enzimet (kompetíciós vizsgálat); egy másik variáció szerint a mintában lévő sztromelizin-3-at egy megfelelő immobilizált antitesttel reagáltatjuk, a rendszert hagyjuk izotóppal vagy más enzimmel jelzett anti-sztromelizin-3 antitestekkel reagálni, és a radioaktivitást vagy az enzimet mérjük (szendvics ELISA). Más klasszikus módszerek is használhatók, ha azok a megfelelők.

A fenti technikákat lényegében „egylépéses” vagy „többlépéses” vizsgálatokban hajthatjuk végre. Az „egylépéses” vizsgálat azt jelenti, hogy az antigént egy immobilizált antitesttel hozzuk érintkezésbe, majd az elegyet mosás nélkül jelzett antitestekkel hozzuk érintkezésbe. A „kétlépéses” vizsgálat azt jelenti, hogy mielőtt az elegyet egy jelzett antitesttel hozzuk érintkezésbe, beiktatunk egy mosást. Más klasszikus módszerek is alkalmazhatók, ha azok a megfelelők.

A sztromelizin-3 és/vagy az antitestek enzimatikus vagy radioaktivitással való jelzését klasszikus módszerekkel végezhetjük. Az ilyen klasszikus módszerek általában az enzimnek a kérdéses antigénhez vagy antitesthez való kovalens kötését jelentik, például glutáraldehiddel, specifikusan oly módon, hogy az enzim aktivitását ne érintse hátrányosan, ami alatt azt értjük, hogy az enzim képes marad a szubsztráttal való kölcsönhatásra, de nem szükségszerűen jelenti azt, hogy az összes enzim aktív marad, feltéve, hogy elég aktivitás megmarad ahhoz, hogy a vizsgálatot végrehajthassuk. Természetesen az enzimek kapcsolására szolgáló bizonyos technikák nem specifikusak (ilyen például a formaldehid alkalmazása), és csak részleges enzimaktivitást eredményeznek.

Általában kívánatos, hogy a vizsgált rendszer egyik komponensét egy hordozóhoz immobilizáljuk, ami lehetővé teszi, hogy a rendszer egyéb komponenseit is érintkezésbe hozzuk az immobilizált komponenssel, majd eltávolítsuk anélkül, hogy ez sok munkát vagy időt igényelne. Az is lehetséges, hogy az első fázistól távolabb egy második fázist is immobilizáljunk, de általában egyetlen fázis is elegendő.

Az is lehetséges, hogy az enzimet magát immobilizáljuk egy hordozóra, de ha immobilizált enzimre van szükség, akkor ezt általában úgy érjük el legelőnyösebben, ha antitesthez kötjük, és az antitestet fixáljuk egy hordozóra, amihez a modellek és a rendszerek jól ismertek a szakterületen. Egyszerű polietilén is lehet egy alkalmas hordozó.

A jelzéshez használt enzimek köre nem különösebben korlátozott, de például az oxidázok csoportjából választhatók. Ezek a szubsztrátjaikkal való reakció so6

HU 215 165 Β rán a hidrogén-peroxid képződését katalizálják, és gyakran a glükóz-oxidázt használják megfelelő stabilitása, könnyű hozzáférhetősége, alacsony ára, és szubsztrátjának (glükóz) könnyű hozzáférhetősége miatt. Az oxidáz aktivitását úgy lehet meghatározni, hogy mérjük a keletkezett hidrogén-peroxid koncentrációját, miután az enzimmel jelzett antitest a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvalóan ismert, ellenőrzött körülmények között reagál a szubsztráttal.

Más technikák is használhatók a sztromelizin-3 kimutatására. Az egyik ilyen típusú technika a Western biot analízis [Towbin et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76,4350 (1979)], amelyben egy megfelelően kezelt mintát futtatunk SDS-poli(akrilamid) gélen, majd egy szilárd hordozóra, például egy nitrocellulóz szűrőlapra átvisszük. A sztromelizin-3 antitesteket (jelzetlen!) ezután érintkezésbe hozzuk a hordozóval és egy szekunder immunológiai reagenssel, például jelzett protein A-val vagy egy jelzett anti-immunoglobulinnal. (A megfelelő jelzések közé tartozik például a ¹²⁵I, a torma-peroxidáz és az alkalikus foszfatáz.)

A diagnosztikai célú mintákat bármely alkalmas helyről vehetjük. A közvetlenül a tumorból, azaz a kötőszövetből vagy a citoszolból vett minta ideális lehet, de ugyanilyen jó lehet például a vérből vett minta is. Ha a mintát azonban a vérből vesszük, akkor nagyon érzékeny viszgálatokra van szükség, mivel a sztromelizin-3 a véráramban felhígul. Egy ilyen diagnózis nagyon fontos lehet egy beteg sorsának követésében, például egy tumor sebészeti úton való eltávolítását követően. Ha az operáció után egy referenciamérést végzünk, akkor a szabályos időközökben végzett további mérésekkel megállapítható a visszaesés vagy esetleg az áttét. Az ilyen mérések végrehajtása ahhoz szükséges például, hogy a méh aktivitását figyelembe vegyük.

Az anti-sztromelizin-3 antitestek képalkotási célokra is használhatók. Az enzimeken kívül más megfelelő jelzések is használhatók, például a radioaktív izotópok, a jód (^l251,¹²¹I), a szén (¹⁴C), a kén (³⁵S), atrícium (³H), az indium (¹¹²In) és a technécium (^99mTc); a fluoreszcens markerek, azaz a fluoreszcein és a rodamín, valamint a biotin.

Az in vivő végzett képalkotási eljárásoknál azonban a helyzet sokkal szigorúbb, például mivel az antitestek önmagukban nem detektálhatok a testben kívülről, ezért jelezni vagy másképpen módosítani kell ezeket, hogy lehetővé tegyük a detektálást.

Az erre a célra használt jelzések bármelyek lehetnek, de olyannak kell lenniük, hogy ne zavarják jelentősen az antitestek kötődését, viszont kívülről kimutathatók. A megfelelő jelzés az lehet, amely lehetővé teszi a radiográfiával, NMR-rel (magmágneses rezonancia), ESR-rel (elektron spin rezonancia) való kimutatást. A röntgen radiográfiás technikákhoz használható jelzés lehet bármely olyan izotóp, amely kimutatható sugárzást bocsát ki, de nyíltan nem zavaró a beteg számára. Ilyen például a bárium vagy a cézium. Az NMR vagy ESR vizsgálatok számára megfelelő jelzések általában azok, amelyek egy kimutatható jellegzetes spinnel rendelkeznek. Ilyen például a deutérium, amelyet az antitestekbe a termelő hibridóma táptalajának megfelelő jelölésével lehet például beépíteni.

Az in vivő körülmények között végzett leképezési eljárások során egy antitestet vagy egy antitest fragmentet, amelyet egy megfelelő kimutatható jelzéssel láttunk el - azaz például radioaktív izotóppal (például ¹³¹1,¹¹²In, ^99raTc) vagy radioaktív sugárzások számára átjárhatatlan anyaggal vagy magmágneses rezonancia alapján kimutatható anyaggal - bejuttatjuk (például parenterálisan, szubkután vagy intraperitonálisan) a vizsgálandó alanyba (például emberbe).

A vizsgálandó alany mérete, valamint a használt képalkotási eljárás határozza meg a diagnosztikai jelentőségű képek létrehozásában szerepet játszó képalkotó anyag mennyiségét. Egy radioaktív izotópot emberben alkalmazva a beinjekciózott radioaktivitás mennyisége általában normális körülmények között 5-20 millicurie ^99mTc. A jelzett antitestek vagy antitest fragmentek főleg azoknak a sejteknek a környezetében gyűlnek össze, amelyek sztromelizin-3-at tartalmaznak. A jelzett antitesteket vagy antitest fragmenteket ismert módszerekkel lehet kimutatni.

Ennek a technológiai területnek az általános tárgyalását lásd S. W. et al., „Immunopharmacokinetics of Radiobelled Antibodies and Their Fragmenst” (Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer 13. fejezet), szerk. S. W. Burchiel és B. A. Rhodes, Masson Publishing Inc. (1982).

Az antitesteket készíthetjük egy sztromelizin-3 peptiddel szemben vagy a teljes molekulával szemben. Egy ilyen peptidet egy állatban használhatunk egy fehéijehordozóval, például albuminnal együtt, vagy ha elég hosszú, mondjuk 25 aminosavat tartalmaz, akkor hordozó nélkül. Valószínűtlen, hogy az emberi antitestek képesek felismerni a sztromelizin-3-at, mivel ez a fehérje egy úgynevezett saját fehérje.

A továbbiakban a „peptid” szakkifejezés jelentése bármely olyan molekula, amely 2 vagy több, peptidkötéssel összekötött aminosav-molekulát tartalmaz. Tehát a szakkifejezés tartalmazza az oligopeptideket, polipeptideket és fehérjéket.

Az alábbiakban ismertetett technikák alkalmazásával kapott poliklonális antitesteket használhatjuk közvetlenül, vagy a megfelelő antitesteket termelő sejteket izolálhatjuk az állatból, és ismert módszerekkel hibridómát állíthatunk elő belőlük [Kohler és Milstein, Natúré, 256, 795 (1975)]. A megfelelő hibridóma kiválasztása a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel történik, és a kapott antitestek használhatók egy megfelelő vizsgálatban a sztromelizin-3 azonosítására.

Az antitesteket vagy a megfelelő molekulákat a jelen találmány szerint egyformán használhatjuk áttétes rákok kezelésére vagy megelőzésére. Egy megfelelő dózisú antitest adagolásával gátolhatjuk a sztromelizin-3 termelődését, vagy hatékonyan gátolhatjuk az aktivitását, és ez nagyon fontos, mivel időt hagy arra, hogy a rákos növekedést gátoljuk.

A megelőzés a betegségnek még a nagyon korai stádiumában lehet megfelelő, mivel egy adott esetben

HU 215 165 Β az nem ismert, hogy mi okozza az áttéteket. Tehát az antitestek, a nekik megfelelő molekulák vagy faktorok, például a TIMP-ek (a természetben előforduló anyagok, amelyek az MMP-ket szabályozzák - a metalloproteinázok szöveti inhibitorai), amelyek zavarják a sztromelizin-3 aktivitását, adagolhatok, amint a tumort diagnosztizálták, és a kezelést addig lehet folytatni, ameddig szükséges, előnyösen addig, ameddig a betegség veszélye meg nem szűnik.

A kezelés egyik előnyös formája a „varázsgolyó” technika alkalmazása, amelyben egy megfelelő toxint antitestekhez kötünk, amely antitestek a tumor területére vándorolnak. Ezek a toxinok a szakterületen jól ismertek, ilyenek például a toxikus radioaktív izotópok, a nehézfémek, az enzimek és komplement aktivátorok, valamint a természetes toxinok, például a ricin, amelyek olyan alacsony szinten is képesek hatni, hogy csak egy-két molekula van jelen. Egy olyan technika is használható, amelyben hormon-antagonisták vagy bármely más fiziológiailag aktív hatóanyagok lokalizált dózisait alkalmazzuk a rákok kezelésére.

Az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerint felhasználandó antitestek, amelyeket diagnosztikai vagy terápiás célra használunk, lehetnek monoklonálisak vagy poliklonálisak, amint arra szükség van. Az antitest ekvivalensek lehetnek például: az antitestek Fab’ fragmentjei, azaz a Fab, Fab’, F(ab)₂ és az Fv; az idiotípusok vagy az allotóp graftolásból származó termékek (ahol egy állati antitest felismerő régióját egy humán antitest megfelelő régiójába graftoljuk, hogy elkerüljük a betegben egy immunválasz kialakulását). Más módosítások és/vagy hatóanyagok a szakterületen jártas szakember számára ismertek.

A sztromelizin-3 gátlása vagy eliminálása céljából használt antitestek mellett más inhibitorfonnák is használhatók. Ezek az inhibitorok lehetnek általánosak (például a MEC lebontását végző enzimek számára), vagy a sztromelizin-3-ra specifikusak. Ismert, hogy a szöveti metalloproteinázok (TIMP-ek) inhibitorai léteznek, és ezért nagyon valószínű, hogy a sztromelizin-3-ra specifikus TIMP-ek is léteznek. Egy ilyen TIMP standard módszerekkel könnyen azonosítható.

A sztromelizin-3 szintézisét gátló inhibitorok szintetikus úton is előállíthatok, és ezek általában a szubsztrát enzim által befolyásolt részének felelnek meg. Általában az az előnyös, ha egy ilyen inhibitor a szubsztrát és a hasítási termék közötti átmenet befagyasztott állapotának felel meg, de az is lehetséges, hogy a kötőhelynek egy sztérikusan gátolt változatát állítják elő, vagy a kötőhelynek egy olyan változatát állítják elő, amely önmagában is irreverzibilisen gátolja a sztromelizin-3-at. Más megfelelő inhibitorok a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvalóan ismertek.

Más módszerek is használhatók a sztromelizin-3 aktivitásának blokkolására. Ezek lehetnek például denaturáló ágensek, jóllehet ezek lehet, hogy nem specifikusak, és csak akkor használhatók, ha irányíthatók, például specifikus antitestek alkalmazásával. A sztromelizin-3-at blokkoló aktivitás más formája lehet, amikor a pre-pro-protein - proteinátalakuklást gátoljuk. Ennek az eljárásnak számos célponti lépése lehet, csak arra van szükség, hogy egy olyan lépést jelöljünk ki, amely más életfontosságú enzimek blokkolása nélkül blokkolható vagy amely irányítható.

Az is lehetséges, hogy peptideket vagy más kis molekulákat használunk arra, hogy szelektíven felismerjenek egy tercier szerkezetet a sztromelizin-3-on, és ezzel blokkolják az enzimatikus aktivitását. Egy ilyen aktivitást blokkoló ágens nem szükségszerűen az aktív helyhez kötődik, hanem módosíthatja, rögzítheti a sztromelizin-3 szerkezetét, ezzel elrontva, felfüggesztve vagy módosítva az aktivitását. A blokkoló ágensnek nem kell szükségszerűen egyedül hatnia, hanem ebből a célból kötődhet egy másik molekulához, vagy egy megfelelő inaktiváló szer felismerő helyéül szolgálhat.

Vizsgálataink igazolták, hogy az I-es típusú kollagenáz mRNS és a 92 kD méretű ΙΙ-es típusú kollagenáz mRNS jelenléte kizárólag a rosszindulatú daganatok jelenlétéhez kötődik, jóllehet az ellenkezője nem mindig igaz (másszóval a daganatok nem mindig kapcsolódnak ezekhez a fehérjékhez).

Látszólag az invazív emlőrákok esetében van egy párhuzamosság a sztromelizin-3 gén és a tenascin gén expressziója között. A MEC glikoprotein tenascinról [Chiquet-Ehrismann et al., Cell, 47, 131-139 (1986)] úgy tűnik, hogy lényeges szerepet játszik az epiteliális sejtek és a mezenchima sejtek közötti kölcsönhatásban és a sejtek vándorlásában a normális fejlődés során, beleértve az emlőmirigyekét is az organogenezis során.

Azt találták, hogy a tenascin következetesen túlexpresszálódik a rosszindulatú tumorok szálas kötőszöveti részében, és a sztromelizin-3-hoz hasonló módon indukálódik. Ha a fibronektinnel hasonlítjuk össze, akkor a tenascinról kiderül, hogy gyenge szubsztrátja az emlőtumorok epiteliális sejtjei rögzítésének, sugallva ezzel, hogy megengedi azt, hogy invazívak legyenek.

Tehát a sztromelizin-3 összehangoltan működhet a tenascinnal az emlőrák inváziós fázisában. A sztromelizin-3 és a tenascin egyszerre expresszálódhatnak az embriogenezis során azokban a régiókban, amelyekről ismert, hogy az epitélium-mezenchima kölcsönhatások fontos szerepet játszanak bennük, és amelyekben a sejtvándorlás lejátszódik.

A jelen találmány tárgya tehát eljárás az előzőkben leírt áttétes rák diagnosztizálására szolgáló eljárás, tárgya továbbá az ahhoz kapcsolódó fehérjék kimutatása, illetve az ezeket a fehéijéket kódoló nukleotid-szekvenciák kimutatása.

A találmány tárgya továbbá az áttétes rák kezelésében vagy megelőzésében való alkalmazás, valamint egy olyan ágensnek az alkalmazása, amely az előzőekben említett fehérjékhez kapcsolódik.

A találmány tárgya továbbá egy nukleotid-szekvencia, amely a sztromelizin-3-at vagy annak egy részét kódolja. A sztromelizin-3 szekvenciája előnyösen az, amit a mellékelt rajzok között a 2. ábrán adunk meg, és a nukleotid-szekvencia is előnyösen az, amit a 2. ábrán adunk meg. Az azonban nyilvánvaló, hogy a nukleotidszekvencia lényegesen eltérhet attól, amit az ábrán lát8

HU 215 165 Β hatunk, a genetikai kód degenerációjának következtében, azzal a feltétellel, hogy a sztromelizin-3-at vagy annak egy részét kódolja.

A szükséges szekvencia még tovább is változhat, a felhasználás céljától függően. Ha az a cél, hogy a biológiai mintákban kimutassuk vele az RNS transzkripció termékeit, akkor sokkal előnyösebb, ha jobban hasonlít a 2. ábrán megadott szekvenciához. A szekvencia azonban még változhat, ha a hibridizáció lehetséges a választott erősségű feltételek között.

Egy próbát a 2. ábrán szereplő aminosav-szekvencia alapján lehet előállítani, a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló módszerekkel. Az ilyen próbák alkalmazása azonban korlátozott lehet, mivel az nyilvánvaló, hogy bármely, a fehérje-szekvencia visszafordításával kapott nukleotid-szekvencia nem fog jól hibridizálódni, vagy egyáltalán nem fog hibridizálódni az ugyanerről a fehérje-szekvenciáról visszafejtett bármely komplementer-szekvenciával, a genetikai kód degeneráltsága következtében. Ez a tényező a szakterületen jártas szakember számára egy figyelembe veendő tényező, és egy adott fehérje aminosav-szekvenciája gyakran olyan nagy degeneráltsági fokkal rendelkezik, hogy nagyszámú próbát kell előállítani hozzá.

Ha a nukleotid-szekvencia azért kell, hogy egy sztromelizin-3 peptidet expresszáljunk róla, vagy a teljes sztromelizin-3 enzimet expresszáljuk, akkor az előzőekben leírtaknál jóval nagyobb eltérés is lehetséges mind a genetikai kód miatt, mind azért, mert a sztromelizin-3 néhány aminosava változtatható anélkül, hogy ennek jelentős hatása lenne az enzim szerkezetére vagy funkciójára.

Ha a szekvenciában ilyen típusú változtatásokat akarunk végrehajtani, akkor figyelembe kell vennünk, hogy a molekulán vannak kritikus zónák, amelyek meghatározzák az aktivitást. Az ilyen zónák általában azokat a csoportokat tartalmazzák, amelyek a kötőhelyet képezik, illetve azokat a csoportokat, amelyek a kötési helyet érintő harmadlagos szerkezet kialakításában vesznek részt. Az általában lehetséges, hogy a harmadlagos szerkezetet képező csoportokat kicseréljük, azzal a feltétellel, hogy analóg funkciót ellátó csoportokat használunk. A többi esetben a csoportok típusa teljesen lényegtelen.

Tehát a jelen találmány tárgyát képezi a szekvencia összes olyan variánsa vagy mutánsa, amely még rendelkezik a lényeges sztromelizin-3 aktivitással, vagy amelyek a sztromelizin-3-nak azokat a jellemző régióit tartalmazzák, amelyeket például az antitestek készítésében lehet felhasználni. Az ilyen variánsok vagy mutánsok tartalmazhatnak deléciókat, addíciókat, inszerciókat vagy inverziókat, ismétlődéseket és típus-helyettesítéseket (ez jelenti például egy hidrofil csoport helyettesítését egy másik hidrofil csoporttal, de nem jelenti azt, hogy egy erősen hidrofil csoportot egy erősen hidrofil csoporttal kell helyettesíteni). A kis módosítások általában csekély hatással vannak az aktivitásra, hacsak nem a molekulának egy lényeges részén történik a módosítás, és a genetikai manipulációnak másodlagos termékei lehetnek, például ha szükséges, akkor új restrikciós hasítási hely kialakítása. Egy ilyen módosítás jelentheti egy vagy több csoport helyettesítését bármely más megfelelő csoporttal, a helyettesítés lehet 1:1 arányú, vagy bármely más megfelelő arányú, az egységnél kisebb vagy nagyobb.

A pontmutációk és a kódoló szekvencia egyéb módosításai azt a célt szolgálhatják, hogy például restrikciós hasítási helyeket alakítsunk ki vagy távolítsunk el, vagy másképpen vegyen részt a genetikai manipulációban, illetve javítsa vagy alkalmas módon befolyásolja a sztromelizin-3 molekulát.

Az nyilvánvaló, hogy a sztromelizin-3-nak megfelelő molekula megtalálható más állatoknál, főleg az emlősöknél, és az ezekből a forrásokból származó szekvenciáknak különös jelentőségük lehet a sztromelizin-3 molekula konzervált régióinak meghatározásában. Az egérben például a megfelelő szekvencia 80%ban konzervált, beleértve például egy 10 aminosavból álló szekvenciát a sztromelizin-3 prodomén régiójában. Az is nyilvánvaló, hogy az emberi sztromelizin-3-szekvenciának megfelelő állati szekvenciák könnyen kimutathatók a szakterületen jártas szakember számára ismert, illetve az előzőkben leírt módszerekkel, és hogy az ilyen szekvenciák, valamint a nekik megfelelő peptidek, illetve ezeknek a mutánsai és variánsai a találmány oltalmi körébe tartoznak.

A találmány szerinti szekvenciák módosíthatók úgy is, hogy ha szükséges, akkor restrikciós hasítási helyeket hozzunk létre bennük. Ezt végrehajthatjuk úgy, hogy nem változtatjuk meg a kódolt sztromelizin-3 aminosav-szekvenciáját, illetve úgy, hogy a kevésbé fontos vagy lényeges régiókban hajtjuk végre, azzal a feltétellel, hogy a végtermék még a kívánt tulajdonságokkal rendelkezik.

Amint az előzőkben említettük, jóllehet a hibridizáció nem alkalmas indikátora a szekvenciák homológiájának, az előnyös szekvenciák általában azok, amelyek 50%-osnál nagyobb, még előnyösebben 70%-osnál nagyobb, legelőnyösebben 80%-os homológiát mutatnak a 2. ábrán bemutatott szekvenciával.

Csakúgy, mint a többi metalloproteináz, a sztromelizin-3 először egy pre-proenzim formájában expresszálódik. Azaz in vivő kétlépéses hasítás figyelhető meg. A hasítás nem szükséges feltétlenül az in vitro expresszióhoz, úgyhogy lehetséges, hogy például Escherichia coli expresszálja az érett fehérjét.

A sztromelizin-3 vagy az ennek a jellemzőivel rendelkező fehérje expressziójához bármely rendszer alkalmazható. A megfelelő vektorok általános tulajdonságai, az expressziós vektorok, valamint ezek előállítása a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló.

A Jellemző” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy minden olyan peptid ide tartozik, amely a sztromelizin-3-ra jellemző szekvenciát tartalmaz. Egy ilyen szekvencia fontos lehet a sztromelizin-3 aktivitása szempontjából, de lehet egyszerűen egy olyan szekvencia is, amely nem található meg más peptidekben. Azonban általában azok a szekvenciák előnyösek, amelyek fontosak a sztromelizin-3 aktivitása szempontjából, mivel valószínűbb, hogy ezek megőrződtek egy populációban.

HU 215 165 Β

A megfelelő expressziós vektorok lehetnek fág vagy plazmid alapúak, mindkettő általában specifikus a gazdaszervezetre, de génmanipulációs módszerekkel megváltoztathatók úgy, hogy más gazdaszervezetekhez is alkalmasak legyenek. Más alkalmas vektorok lehetnek a kozmidok és a retrovírusok, és minden más hordozó, amely vagy specifikus, vagy nem egy adott rendszerre. A szabályozó szekvenciák, például a felismerő szekvenciák, a promoterek, az operátorok, az induktorok, a terminátorok és más, az expresszió szabályozásában lényeges és/vagy hasznos szekvenciák ismét ismertek a szakterületen jártas szakember számára, és kapcsolódhatnak a természetes sztromelizin-3-szekvenciához vagy a használt vektorhoz, és bármely alkalmas forrásból származhatnak. A vektorok genetikai módszerekkel megfelelő módon módosíthatók.

A megfelelő nukleotid-szekvenciák például Sanger és munkatársai módszerével ellenőrizhetők [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463-5467 (1977)].

Egy, a sztromelizin-3-at kódoló cDNS fragment könnyen beilleszthető egy megfelelő vektorba. Ideális esetben a befogadó vektor megfelelő restrikciós hasítási helyekkel rendelkezik a könnyű beépítés céljából, de például tompavég ligálás is alkalmazható, de ez bizonytalanságot jelenthet a leolvasási keretben és a beillsztés irányában. Ilyen esetben teljesen természetes, hogy a transzformánsok expresszióját megvizsgáljuk, és 6 közül 1 a helyes leolvasási kerettel kell, hogy rendelkezzen. A megfelelő vektorok a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló módon, a kiválasztott expressziós rendszer működése alapján választhatók ki.

Egy megfelelő szervezetnek, vagy előnyösen egy eukarióta sejtvonalnak, például HeLa-nak a kapott plazmiddal való transzformálásával, az ampicillin-rezisztencia vagy szükség esetén más megfelelő módszer alkalmazásával a transzformáns kiválasztásával, és szükség esetén a triptofán vagy más megfelelő promoter-induktor (például az indol-akrilsav) hozzáadásával a kiválasztott sztromelizin-3 expresszálható. Az expresszió mértéke elektroforézissel elemezhető SDS poli(akril-amid) gélen [Laemmli, Natúré, 227,680-685 (1970)].

A tenyészetek transzformálására és növesztésére alkalmas módszer megtalálható például a Maniatis kézikönyvben [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Notebook, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)].

A sztromelizin-3 vagy ennek egy peptidje előállítására használható tenyészetek alkalmas módon bármely élő sejtből származhatnak, és változhatnak prokarióta expressziós rendszerektől az eukarióta expressziós rendszerekig. Egy előnyös prokarióta rendszer az Escherichia coli rendszer, azért, mert a manipulációk könnyen végrehajthatók benne. Azonban az is lehetséges, hogy egy magasabbrendű szervezetet használjunk, például egy emlős sejtvonalat, egy eukarióta fehérje expressziójára. A tranziens expresszióhoz jelenleg használt sejtvonalak a HeLa és a COS. Más expressziós rendszer lehet az aranyhörcsög petefészek-sejtvonal (CHO).

Egy értékes rendszer a bakulovírus rendszer, amelyben a lepkesejteket ko-transzfektáljuk egy sztromelizin-3-at vagy egy megfelelő peptidet kódoló vektorral, valamint bakulovírus DNS-sel. A rekombináció a sejtekben játszódik le, és a megfelelő bakulovírus rekombinánsokat standard módszerekkel választjuk ki. Ezután a rekombinánst a kiválasztott sejtvonal transzfektálására használhatjuk, és a sztromelizin-3 vagy a peptid ennek az infekciónak a hatására expresszálódik. Egy különös előnye a rendszernek a termelt fehérje mennyisége, ami elérheti az 500 mg/1 mennyiséget is.

Jóllehet ezeket a rendszereket nem olyan könnyű használni, mint az Escherichia coli rendszereket, az előnyük az, hogy a fehéije primer szintézise után a fehérje processzálása is lejátszódik. Az Escherichia coli például nem használja ugyanazt a rendszert a pre-proproteinek processzálására, mint az emlős sejtek.

Más, expresszióra használható sejtek lehetnek például a Streptomyces-ek, az élesztők, például a Saccharomyces-ek, főleg a Saccharomyces cerevisiae. Bármely rendszer használható, attól függően, hogy az operátornak mik a szándékai. A megfelelő rendszerek használhatók lehetnek a genetikai anyag megsokszorozására, de arra a célra, amikor csak a DNS mennyiségének megsokszorozása a cél, általában az Escherichia coli rendszer használata a kényelmes.

Előnyös lehet, ha csak az érett enzimet állítjuk elő, például antitestek előállítása céljából, mivel az érett enzim szekvenciája azonos a pro- és prepro-szekvenciák megfelelő részével. Az azonban elképzelhető, hogy a pro- és prepro-részek lehasítása módosíthatja a molekula tercier struktúráját, és az is lehetséges, hogy egy, az érett enzim ellen készített antitest például nem lenne képes detektálni a proenzimet. Azok az antitestek is hasznosnak bizonyulhatnak, amelyek az enzim korai állapota ellen irányulnak, és/vagy a lehasított pre- vagy pro-peptidek ellen irányulnak.

A peptid- vagy nukleotid-szekvencia bármely olyan lehet, amely a sztromelizin-3-ra jellemző, figyelembe véve, hogy milyen célokra expresszáljuk. Ideális esetben a szekvenciáknak teljes mértékben a sztromelizin-3-ra jellemzőknek kell lenniük, de ezen szekvenciák hossza változhat a sztromelizin-3 molekula régiójától függően. A leginkább előnyben részesítettek azok a szekvenciák, amelyek a legjobban megőrződtek, és amelyek nem közösek más fehérjék részeivel, jóllehet előnyös lehet, ha a szekvencia az MMP-kre jellemző, illetve még pontosabban azokra az MMP-kre, amelyek az invazív tumorokkal állnak kapcsolatban.

A találmány tárgyát képezik az előzőkben leírt peptid- és nukleotid-szekvenciák ekvivalensei is, az „ekvivalens” szakkifejezést az előzőkben leírtak alapján értelmezve, azaz olyan ekvivalensei a szekvenciáknak, amelyek az N- vagy C-terminálison, illetve bárhol máshol szubsztitúciókat tartalmaznak.

A találmány tárgyát képezik továbbá a szekvenciák mutánsai, ahol a „mutáns” szakkifejezés a fentiekben leírt korlátozásoknak megfelelő szekvenciákban az aminosavak deléciójára, addíciójára, inszerciójára, inverziójára és helyettesítésére vonatkozik.

HU 215 165 Β

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a szekvenciák variánsai, amely szakkifejezést más, a természetben időről-időre előforduló más sztromelizin-3 szekvenciával kapcsolatban használunk, és amelyeknek a szekvenciája lényegében ugyanaz, mint amit a 2. ábrán láthatunk, de amelyek oly módon különböznek tőle, ahogyan az egy nagy populáción belül elvárható. Ezen meghatározás magában foglalja az allélikus variációkat, valamint azokat a más fajokból származó peptideket, amelyek hasonló típusú aktivitást mutatnak, és rokon szekvenciával rendelkeznek. Idetartoznak, jóllehet kevésbé előnyösek az állati szekvenciák.

Felfedeztük azt is, hogy a sztromelizin-3 expressziója serkenthető, például a növekedési faktorokkal és a tumorok promotereivel. Az ilyen faktorok közé tartozik például az EGF, FGF és PDGF, valamint a TPA. Tehát az előzőkben említettek alapján ezeknek a faktoroknak a kimutatása egy tumormintában szintén segítheti egy rák áttétes állapotának igazolását.

A találmány tárgyát képezi továbbá az áttétes rák kezelése a sztromelizin-3 gén expressziójának módosításával. Ez végrehajtható úgy, hogy a sztromelizin-3 termelésének serkentéséhez szükséges faktorokkal lépünk kölcsönhatásba, például antitestet alkalmazva a faktorral szemben, amely antitestek tovább módosíthatók a kívánt eredmény eléréséig. Az is lehetséges, hogy a faktor receptorát blokkoljuk, ami könnyebben elérhető a megfelelő kapcsoló anyagnak a lokalizálásával, ami lehet például egy antitest vagy egy szintetikus peptid.

A sztromelizin-3 gén expressziójának blokkolását elérhetjük közvetlenebbül is, például egy helynek, a promotemek a blokkolásával a genomiális DNS-en.

Amikor a jelen találmány értelmében például antitestek adagolását javasoljuk egy betegnek, akkor ezt bármely megfelelő módon elvégezhetjük. Ha a tumorról úgy gondoljuk vagy úgy diagnosztizáljuk, hogy lokalizált, akkor az adagolás egyik megfelelő módszere lehet a tumor helyére történő injekciózás. Ha a célpont egy emlőrák, akkor egy emlőbe adott injekció elegendő lehet, vagy egy beültetett adagolót használhatunk. Ha például TIMP-eket kell beadagolnunk, akkor az is lehetséges, hogy egy bőrtapaszt használunk a hosszabb ideig tartó adagoláshoz.

Ha a rák egy faringeális rák, akkor egy másik lehetőség a szájon át történő adagolás, például gargalizálás útján.

Bármely esetben az adagolás ehelyett vagy emellett lehet injekciózás, beleértve a szubkután injekciózást, az intramuszkuláris, intravénás és intradermális injekciózást is.

A készítmények kiszerelése bármely megfelelő kiszerelés lehet, amely alkalmas az adagolásra, és a szakterületen jártas szakember számára ismert. A készítmények tartalmazhatnak egy megfelelő hordozót, például fiziológiás sóoldatot, töltőanyagokat, más gyógyászati hatóanyagokat, adjuvánsokat és bármely más gyógyászati segédanyagot.

Alkalmas készítmények lehetnek például a sztromelizin-3-at vagy ennek jellemző peptidjeit tartalmazó vakcinák is. Ezek a vakcinák lehetnek aktívak vagy passzívak, de általában a passzív vakcinák az előnyösek, mivel a sztromelizin-3 expresszi ója a méhben játszódik le, és az anti-sztromelizin-3 antitestekkel való meghatározatlan érintkezés káros hatásokat eredményezhet. Az aktív vakcina akkor lehet előnyös, ha a betegnek hiszterektómiája van, mivel akkor nincs olyan szövet, amely normális körülmények között sztromelizin-3-at expresszál. Megfelelő vakcina lehet még egy rekombináns vírus, amely egy sztromelizin-3 vagy erre jellemző peptid-szekvenciát kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmaz. Egy erre a célra megfelelő vírus a vaccinia vírus.

Az alábbi példák célja a jelen találmány illusztrálása, de nem céljuk a találmány oltalmi körének korlátozása.

1. példa

Egy emlőrákra specifikus cDNS klónozása

Egy emlőrák cDNS könyvtárat készítünk lambda gtlO vektorban, egy sebészeti úton kimetszett primer emlőrák minta (a továbbiakban C1 tumorként hivatkozunk rá) poli(A⁺) RNS-ének felhasználásával. 50000 tarfoltot vizsgálunk át oly módon, hogy differenciáltan hibridizáltatjuk (+) és (-) próbákhoz. A (+) próbát a Cl poli(A⁺) RNS-ének reverz transzkripciójával állítjuk elő, míg a (-) próbát emlő-fibroadenóma (a továbbiakban a jele FI) poli(A⁺) RNS-ének reverz transzkripciójával állítjuk elő.

Az 1. ábrán a C1 emlőkarcinómából és az F1 fibroadenómából származó össz-RNS Northern biot elemzésének eredményét láthatjuk, annak a négy génnek (A-D) a cDNS-ét használva próbaként, amelyek magasabb expressziós szintet mutatnak a karcinómában, mint a fibroadenómában. Mindegyik sáv 8 pg össz-RNS-t tartalmaz. A szűrőlapokat a 36B4-próba segítségével újra vizsgáljuk, amely egy olyan génnek felel meg, amely általában mindig expresszál [Rio et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 9243-9247 (1987)].

Pontosabban, az össz-RNS-t [Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)] folyékony nitrogénben tárolt sebészeti mintákból állítjuk elő, és a poli(A⁺) RNS-t oligo-dT-cellulózon végzett kromatográfiával állítjuk elő. Emlőrákra dúsított cDNS könyvtárat egy olyan cDNS segítségével állítunk elő, amelyet ösztrogén receptor mínusz, Il-es fokozatú duktális karcinómából állítunk elő (Cl-nek nevezzük), amelyben a kötőszöveti sejtek a teljes sejtpopulációnak körülbelül az 50%-át képezik.

A klónozás előtt az egyszálú cDNS-t egy emlőfibroadenóma (a továbbiakban FI) segítségével kivonjuk a rendszerből, és az egyszálú cDNS-ben feldúsított minta anyagát hidroxil-apatit kromatográfíával tisztítjuk [Davis et al., Proceedings of the National Academy ofSciences, USA, 81, 2194-2198 (1984); Rhyneretal., Neuroscience Rés., 16, 167-181 (1986)].

Az emlőrákra dúsított cDNS-t kétszálúvá tesszük, majd a lambda gtlO vektor EcoRI hasítási helyére klónozzuk. Hárommillió rekombináns fágot kapunk ily módon, majd ezek közül 50 000-et vizsgálunk át differenciált módon Nylon replika szűrőlapok alkalmazásával

HU 215 165 Β (Biodyne A, Pali Corporation), körülbelül 5000 cDNS kiónt tartalmazó lemezek felhasználásával.

A (+) és (-) próbákat a Cl emlőrák és az FI emlőfibroadenóma cDNS-ébőI állítjuk elő. Mindkét próbát kivonatoljuk [Davis et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81, 2194—2198 (1984); Rhyner et al., Neuroscience Rés., 16, 167-181 (1986)] fölöslegben lévő humán máj RNS alkalmazásával, mielőtt a random priming módszerrel [³²P] izotóppal jelezzük.

A hibridizálásokat két napon át végezzük szigorú körülmények között (50%-os formamid, 42 °C), a mosást 2*SSC, 0,1% SDS, 22 °C körülmények között végezzük, majd az ezt követő mosást 0,l*SSC, 0,1% SDS, 55 °C körülmények között végezzük. A második szűrővizsgálatra 130 olyan tarfoltot választunk ki, amelyek eltérő módon hibridizálódtak.

Öt eltérő módon hibridizálódó tarfolt cDNS inszertjét PCR módszerrel tisztítjuk, [³²P]-vel jelezzük, majd az összes differenciáltan hibridizálódó tarfolthoz hibridizáljuk, hogy a rokon kiónokat azonosítsuk. Ezt a műveletet többször megismételjük véletlenszerűen kiválasztott, differenciáltan hibridizálódó tarfoltokkal, és végül négy olyan gént kapunk (A-D), amelyeknek az expressziós szintje magasabb a Cl karcinómában, mint az FI fibroadenómában. A Cl emlőrák és az FI emlőfibroadenóma Northern biot elemzését az össz-RNS segítségével végezzük (8 pg), amelyet formaldehid tartalmú 1%-os agaróz gélen választunk el elektroforézissel, és Hybond-N szűrőlapokra viszünk át (Amersham).

A biottokat metilénkékkel kékre festjük, hogy ellenőrizzük az átvitt RNS integritását és mennyiségét. A hibridizálást (18 óra hosszat) és a mosást standard körülmények között végezzük az előzőekben leírt módon, az (A-D) géneknek megfelelő, [³²P]-vel jelzett cDNS fragmentek alkalmazásával.

Az A és B géneket, amelyek normál vastagbélben is expresszálódnak (nem mutatjuk) a továbbiakban nem vizsgáljuk.

Jóllehet a vastagbélben expresszálódik (nem mutatjuk), a C gént magas szintű differenciált expressziója miatt részlegesen jellemezzük (1. ábra). Egyformán expresszálódik különböző transzformált epiteliális sejtekben és a normál emberi bőrben (nem mutatjuk). Az egyik C kiónnak a szekvenálásából kiderült, hogy a gén a keratin gén szupercsaládba tartozik (az adatokat nem mutatjuk be).

Végezetül a D gént (a továbbiakban sztromelizin-3 génként is említjük) vizsgáljuk a továbbiakban, egyrészt mivel jellegzetesen eltérő módon expresszálódik a Cl karcinómában és az FI fibroadenómában (1. ábra), másrészt pedig azért, mert nem expresszálódik a normál emberi vastagbélben és még néhány más emberi szövetben (infra).

2. példa

A sztromelizin-3 gén és a kódolt fehérje szekvenálása

Számos független kiónt izoláltunk egy nem kivont Cl rákból készült lambda gtlO cDNS könyvtárból, próbaként a D cDNS fragmentjét használva, és szekvenáljuk. A 2. ábrán a D gén cDNS-ének teljes nukleotid-szekvenciája látható, valamint a megfelelő fehérje-szekvenciája.

A cDNS nyitott leolvasási keretét, amely egy 488 aminosavat tartalmazó fehéijét kódol, egy 714 bázisból álló 3’ nem transzálódó régió követi, amely egy poli(A) addíciós jelet tartalmaz, az RNS 3’-végétől számított 14 bázis távolságban. Egy feltételezett iniciációs metionin található a 10-12. nukleotid pozícióban. Jóllehet a megfelelő AUG nincs kapcsolatban, illetve nem található egy olyan szekvenciában, mely megfelel a konszenzus Kozak-szekvenciának, a transzláció feltételezhetően erről az AUG-ről indul, mivel a közvetlenül utána álló szekvencia megfelel egy hidrofób leader pepiidnek, ami egy várható jellemző (infra).

A 2. ábrán - amelyen a sztromelizin-3 cDNS nukleotid-szekvenciája látható, valamint az ebből származtatott aminosav-szekvencia - a nukleotid-csoportok 5’-3’ irányban vannak számozva, és a nyitott leolvasási keretben lévő, a nukleotid-szekvenciából származtatott aminosavakat az egybetűs kódjukkal jelezzük. Az 5’végtől kiindulva az aláhúzott nukleotid-szekvenciák jelentése az alábbi: a feltételezett szignálpeptid (a két potenciális hasítási helyet nyilakkal jelöljük); a PRCGVPD, a prometalloproteinázokra jellemző szekvencia; a cinkkötő dómén konzervált hisztidin csoportjai [Matrisian, L. M., Trends Génét., 6, 21-125 (1990)], és a poli(A) hozzáadás szingálja.

Pontosabban, a D gén cDNS-e 3’ részének megfelelő cDNS inszertet [250 bázispár, amely 19 bázispár hosszúságú poli(AT) régiót tartalmaz] [³²P]-vel jelezzük a random primer módszerrel, hogy egy nem kivonatolt lambda gtlO cDNS könyvtárat átvizsgáljunk vele, amelyet a Cl emlőtumor poli(A⁺) RNS-ével állítunk elő Gubler és Hoffmann módszerével [Gene, 25, 262-269 (1983)]. Számos független kiónt azonosítunk, és az M13 szekvenáló vektorban szubklónozzuk. A DNS-szekvenciát a didezoxi-módszerrel határozzuk meg, az US Biochemical-tól származó szekvenáz és deaza-dGTP kit alkalmazásával. A szekvenciát a PC/GENE programcsomaggal elemezzük.

3. példa

A sztromelizin-3 egy feltételezett metalloproteináz

A 3. ábrán a humán sztromelizin-3 származtatott aminosav-szekvenciái és az I-es típusú humán kollagenáz aminosav-szekvenciájának összehasonlítása látható.

(a) Az aminosav-szekvenciákat egy többszörösen illesztő programmal hasonlítjuk össze [Higgins et al., Gene, 73, 237-244 (1988)]. Azokat az aminosavakat, amelyek a négy szekvenciában azonosak, csillaggal jelöljük. A nyilak a sztromelizin-3 feltételezett szignálpeptid szekvenciájának a két hasítási helyét mutatják. A nyilak hegye arra a hasítási pontra mutat, amelyet a prokollagenáz I és a pro-sztromelizinek aktiválnak. Azt a 10 aminosavat, amelyet a sztromelizin-3-ban erre a hasításra specifikusak, bekereteztük. A PRCGVPD-szekvenciát és a cinkkötés doménjével kapcsolatban álló konzervált csoportokat aláhúztuk.

HU 215 165 Β (b) Balra, az analógia régiói (az aminosav azonosság százalékában) a sztromelizin-3, a sztromelizin-1 [STI, Whitham et al., Biochemical Journal., 240, 913-916 (1986)], a sztromelizin-2 (ST2, Muller et al., Biochemical Journal, 253, 187-192 (1988)], és az I-es típusú kollagenáz (COI, Whitham et al., Biochemical Journal, 240, 913-916 (1986)].

c) Jobbra, az analógia régiói az STI, ST2 és a COI között; P jelzi a szignálpeptidet és a pro-domént; ENZ jelzi az érett, aktív enzimnek megfelelő domént.

A származtatott fehéij e-szekvencia összehasonlítása a Swissprot adatbank adataival (14. változat) azt mutatja, hogy az új fehéije a szekretált mátrix metalloproteinázok közé tartozik (MMP-k) (3a ábra). Ennek következtében az új fehérje egy N-terminális hidrofób szekvenciajelöltet tartalmaz (a 2. ábrán aláhúzva), valamint tartalmazza a nagyon erősen konzervált PRCGVPDszekvenciát (a 78-84-es aminosavak), ami az MMP-k prodoménjére jellemző, és az MMP-k cinkkötő helyét (212-225-ös aminosavak, 3.a ábra) [Matrisian, L. M., Trends Génét., 6, 21-125 (1990)].

A család egyéb tagjaival való analógia alapján az érett fehérje N-terminális aminosava valószínűleg a preprofehérje 98-as fenilalaninja [Whitham et al., Biochemical Journal, 240, 913-916 (1986)] (3a ábra). Az optimális illesztés után a feltételezett érett fehéije és a sztromelizin-1 [Whitham et al., Biochemical Journal, 240, 913-916 (1986)] közötti analógia 40%-os, a sztromelizin-2-vei [Muller et al., Biochemical Journal, 253, 187-192 (1988)] való analógia 38%-os, és az I-es típusú kollagenázzal [Goldberg et al., Journal of Biological Chemistry, 261, 6600-6605 (1980)] 36%-os (3b ábra).

Az új fehérje szubsztrát-specificitása nem ismert. A továbbiakban sztromelizin—3 néven említjük, jóllehet a sztromelizin-1-gyei való analógiája (40%) sokkal alacsonyabb annál, ami a sztromelizin-1 és a sztromelizin-1 között van (79%), sőt még annál is alacsonyabb, mint ami az I-es típusú kollagenáz és a sztromelizin-1 között áll fenn (53%) (3b ábra). Azaz, jóllehet a fehérje egy MMP, a „sztromelizin” elnevezés nem teljesen pontos, de elfogadható.

Azonkívül, a PRCGVPD-szekvencia előtt nincs jelentős analógia a sztromelizin-3 és a többi MMP között, amelyekkel összehasonlítottuk (3. ábra). De a sztromelizin-3-bán van egy rövid, egyedi szekvencia (a 88-97-es aminosavak), amelynek a pozíciója gyakorlatilag pontosan megfelel az I-es típusú kollagenáz proproteinje hasítási helyének és a sztromelizineknek [Whitham et al., Biochemical Journal, 240, 913-916 (1986)]. Emellett, a sztromelizin-3, az I-es típusú kollagenázhoz és a többi sztromelizinhez hasonlóan nem mutatja a IV-es típusú kollagenázok fibronektin jellemzőkkel rendelkező doménjét [Wilhelm et al., Journal of Biological Chemistry, 264, 17213-17221 (1989)].

4. példa

Túlexpresszió az emlőkarcinómákban

A sztromelizin-3-bán a transzkripció eredményeképpen megjelenőp RNS-eket vizsgáltuk 30 emlőkarcinómából és 5 emlő-fibroadenómából kivágott mintában.

A 4. ábrán az emlőrákokban található humán metalloproteinázok Northern biot vizsgálatának eredményei láthatók:

(a) a sztromelizin-3 RNS-e;

(b) az I-es típusú kollagenáz (COI) RNS-e;

(c) a IV-es típusú, 92 kD-os kollagenáz (COIV 92K) RNE-e;

(d) a IV-es típusú, 72 kD-os kollagenáz (COIV 72K) RNS-e;

(e) a sztromelizin-1 és a sztromelizin-2 RNS-eí (ST1/2); és (f) a pump-1 (PÚI) RNS-e.

Össz-RNS-t tisztítunk négy olyan karcinómából, amelyek az ösztrogén receptorra negatívak (Cl, Il-es fázis; C2, C3 és C4, III-as fázis), hat olyan emlőkarcinómából, amelyek pozitívak az ösztrogén receptorra (C5, C8 és C9, ΙΙ-es fázis; C6 és C7, III-as fázis; COI, I-es fázis) és négy emlő-fibroadenómából (F2-F5). Mindegyik csík 8 μg RNS-t tartalmaz. A 36B4 jel egy szabályozó gén RNS-ének felel meg (1. ábra).

Pontosabban, számos Northern biot elemzést végzünk azonos RNS mintákkal, mint például az 1. ábra esetében, és az alábbi cDNS-próbák egyikével hibridizáltatjuk:

(a) egy 1,6 kb-os inszert, amely a sztromelizin-3 cDNS-e 3’ részét tartalmazza;

(b) a COI cDNS-e;

(e) az ST2 cDNS-e (kereszthibridizációt mutat az STI RNS-ével);

(f) PÚI cDNS [COI-, ST2- és PUI-próbák, R. Breathnach, Muller és munkatársai szívességéből, Biochem. J., 253, 187-192 (1988)], vagy 80 tagú antisense oligonukleotid-próbákkal, amelyek megfelelnek a (c) COIV 92K-nak [2144—2223-as oligonukleotidok, Wilhelm et al., Journal of Biological Chemistry, 264, 17 213-17221 (1989)], és (d) COIV 72K-nak [1937-2016-os nukleotidok, Collier et al., Journal of Biological Chemistry, 263, 6579-6587(1988)].

A cDNS-próbákat [³²P]-vel jelezzük a random priming módszer alkalmazásával (körülbelül 5*1O^{4 5} cpm^tg), az oligonukleotidokat polinukleotid kinázzal jelezzük (körülbelül 10⁸ cpm/pg). A hibridizációkat szigorú körülmények között végezzük (42 °C, 50%-os formamid) 10^{6 *} cpm/ml aktivitással. A szűrőlapokat ezután 2*SSC, 0,1% SDS összetételű oldatban mossuk, majd újból mossuk O,1^XSSC, 0,1% SDS összetételű oldatban 55 °C-on. Autoradiográfiát végzünk (a) 18 óra elteltével, (b) 20 óra elteltével, (c), (d) és (e) 4 óra elteltével, (f) 2 nap elteltével; -80 °C-on, erősítő fólia alkalmazásával.

A sztromelizin-3 RNS-t megtaláltuk az emlőkarcinóma össz-RNS-ében, függetlenül attól, hogy az ösztradiol receptorokra (RO) pozitívak (C5-C10) vagy negatívak voltak (C1-C4) (4. ábra), de nem találtuk meg a fibroadenómák mintáiban, egy kivétellel (F2), amelyben az expresszió szintje megfelelt az emlőkarcinómákban megfigyelt legalacsonyabb szintnek.

Ugyanezekben a mintákban az MMP géncsalád többi tagja RNS transzkripciós termékeinek jelenlétét is

HU215 165 Β vizsgáltuk (4b-f ábra). Az MMP család ezen többi tagját világosan két csoportba lehetett osztani, azon az alapon, hogy miképpen expresszálódnak a humán emlőtumorokban. Az első osztályba tartozik a IV-es típusú 72 kd (COIV 72K, 4d ábra), a sztromelizin-1 és -2 (ST1/2, 4e ábra), és a pump-1 (PÚI, 4f ábra), ezek a gének mind a rosszindulatú tumorokban, mind a jóindulatúakban expresszálódnak. Ezzel szemben a második osztály, amelybe a sztromelizin-3 (4a ábra) és az I-es típusú kollagenáz (COI, 4.b ábra), és a IV-es típusú 92 kD-os kollagenáz (COIV 92K, 4c ábra) génjei tartoznak, csak az emlőrákokban mutatnak túlexpressziót, jóllehet csak a sztromelizin-3 kapcsolódott következetesen ehhez.

Az expressziós motívumok nem azonosak a második osztály három génjénél. Az I-es típusú kollagenáz RNS-transzkripciós termékeit nem lehet kimutatni a C5, C6, C7 és CIO karcinómákban, és a 96 kD-os IV-es típusú kollagenáz transzkripciós termékeit nem lehet megfigyelni a C7 és CIO mintákban, de a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékeit mindegyik tumorban tisztán ki lehet mutatni.

Tehát a sztromelizin-3 az emlő invazív rákjainak jó diagnosztizáló anyaga, míg az I-es típusú és IV-es típusú (92 kD) kollagenáz specifikusan részt vesz néhány esetben az emlőrák progressziójában.

5. példa

Expresszió különböző forrásból származó sejtkeben

Az 5. ábrán különböző sejtvonalakban és szövetekben lévő sztromelizin-3 RNS Northern blot-jának elemzését látjuk.

(a) Három normális és öt áttétes nyirokmirigy emlőrákos betegekből;

(b) négy sejtvonal ösztrogén receptorokra negatív emlőrákból (BT-20, MDA-231, SK-BR-3, HBL-100), és négy ösztrogén receptorokra pozitív sejtvonal (T-47D, BT-474, ZR-75-1, MCF-7);

(c) 10 normál emberi szövet;

(d) a humán HFL-1 (ATCC CCL 153) magzati fibroblaszt diploidok, szérummentes közegben növesztve (1 és 2), TPA (10 ng/ml) távollétében (1) vagy jelenlétében, vagy szérummentes közegben tenyésztve, 20 pg/ml inzulinnal kiegészítve (3-6), PDGF (20 ng/ml), British Biotechnology) távollétében (3) vagy jelenlétében (4), EGF (20 ng/ml, Collaborative Research) jelenlétében (5), vagy bFGF (10 ng/ml, Pettmann szívességéből [FEBS Lett., 189, 102-108(1985)].

Az (a) esetben mindegyik csík 10 pg össz-RNS-t tartalmaz, az 5-ös csík (2 pg) és a 6-os csík (20 pg) kivételével. A (b) és (c) esetekben mindegyik csík 8 pg össz-RNS-t tartalmaz, a (d) esetben mindegyik csík 5 pg citoplazmatikus RNS-t tartalmaz.

Specifikus módon az (a), (b) és (c) esetben a biottokat a 4. ábrán a sztromelizin-3-ra leírt módon állítjuk elő és kezeljük. A (d) esetben az egybefolyó

HFL-1 fibroblaszt réteget szérummentes DMEM táptalajban tartjuk. 24 óra elteltével friss táptalajt adunk hozzá, és TPA-val vagy növekedési faktorokkal kiegészítjük vagy nem, az előzőekben leírt módon. 24 órás tenyésztés után a sejteket kinyerjük, és citoplazmatikus RNS-t állítunk elő [Gough, N. M., Analyt. Biochem., 173, 93-95 (1988)].

A biottokat a 4. ábrán a sztromelizin-3-ra leírt módon állítjuk elő és kezeljük, de az autoradiográfiát három napon át végezzük.

A IV-es típusú, 82 kD-os kollagenáz RNS transzkripciós termékeit 3 normál nyirokmirigyben és 5 áttétes emlőrák nyirokmirigyében lehet megtalálni, míg a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékeit csak az áttétes mirigyekben lehet megtalálni (5a ábra, valamint olyan adatok, amelyeket nem mutatunk be).

A primer rosszindulatú tumorokkal és áttétes nyirokmirigyekkel kapott eredményekkel ellentétben a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékeit nem lehetett kimutatni analóg körülmények között nyolc emberi emlőrák sejtjeiben, függetlenül attól, hogy az RO-ra pozitívak vagy negatívak voltak (5b ábra). Hasonló módon a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékeit nem lehetett kimutatni számos normál felnőtt emberi szövetben (5c ábra), két kivétellel, az egyik a méh, a másik a placenta.

A sztromelizin-3 láthatóan nem kapcsolatos az összes rákkal, és a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékeinek gyenge szintjét lehet felfedezni a vastagbél, a petefészek, a vese és a tüdő rákjaiból vett mintákban. De a két emlőrákban találthoz viszonyítva magas expressziós szint figyelhető meg a gégerákból vett RNS-mintákban (nem közölt adatok).

6. példa

Specifikus expresszió az invazív tumorok kötőszöveti sejtjeiben

A sztromelizin-3 gén primitív emlőkarcióma-sejtekben való expressziója, valamint az a tény, hogy bizonyos számú megállapodott emlőráksejtvonalban nem expresszálódik, azt sugallja, hogy a gén a tumort körülvevő kötőszöveti sejtekben expresszálódik, sokkal inkább, mint magukban a neopláziás sejtekben.

In situ hibridizációs kísérleteket végzünk [³⁵S]-sel jelzett sztromelizin-3 antisense ribopróbával három karcinómából vett mintán [Cl, C3, C5, C9 és CIO, a 4. ábrán leírt módon, valamint a Cll tumoron, ami egy RO pozitív karcinóma (a 4. ábrán nincs jelölve)].

Pontosabban, egy in situ hibridizálást Cox és munkatársai által leírt módon hajtunk végre [Dev. Bioi., 101,485-502 (1984)]. Paraffinmentesített és savval kezelt metszeteket kezelünk proteináz K-val, és egy éjszakán át hibridizáltatjuk a [³⁵S]-sel jelzett antisense transzkripciós termékekkel, amelyek egy Bluescript IIben szubklónozott sztromelizin-3 cDNS inszertről származnak (467 bázispár, a 1128-1594-es nukleotidokat tartalmazza). A hibridizálást RN-áz kezelés követi (20 pg/ml, 30 perc, 37 °C), valamint szigorú körülmények között végzett mosás (2*SSC, 50%-os formamid, 60 °C, 2 óra), majd autoradiográfiát végzünk

HU 215 165 Β

NTB2 emulzió (Kodak) felhasználásával. Az autoradiográfia időtartama 15 nap. Hasonló körülmények között nem figyelhető meg a háttérnél erősebb hibridizálás, ha értelmes (sense) ribopróbát használunk (nem közölt adatok).

A 6. ábrán a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékek jelenlétét láthatjuk emlőkarcinóma metszeteiben és az embrionális végtagok növekedése helyén.

a, c, e, g, i és k: hematoxilinnel festett szövetmetszetek világos részei (^x 100);

b, d, f, h, j és 1: ugyanezek a metszetek (még hematoxilinnel festve), antisense sztromelizin-3 cRNS-sel végzett próbával való hibridizálás után, sötét hátteres megjelenítéssel.

a és b, ΙΙ-es fázisú duktális emlőkarcinóma (Cl tumor, lásd a 4. ábrát): a beszűrődő ráksejteket (C) orsó alakú sejtekben (S) gazdag kötőszövet vesz körül; a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékei fordulnak elő a legnagyobb mennyiségben a neopláziás epiteliális sejteket közvetlenül körülvevő kötőszöveti sejtekben.

c és d, III-as fázisú duktális emlőkarcinóma (C3 tumor, lásd a 4. ábrát): a beszűrődő emlőráksejtek (C) több szigetét kötőszöveti sejtek veszik körül; a sztromelizin-3 gén expressziója sokkal gyengébb a kötőszövet (S) legtöbb szálának a központi részében, azaz abban a régióban, amely a legtávolabb esik a neopláziás sejtektől.

e és f, duktális karcinóma (C3-as tumor, lásd a 4. ábrát), két normális lebennyel együtt (N); a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékeit kizárólag a beszűrődő ráksejtek szomszédságában lévő kötőszövetben mutattuk ki (C), egy kicsi, limfocitában gazdag zóna kivételével (nyíl).

g és h, duktális karcinóma (CIO-es tumor, lásd a 4. ábrát): a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékeit a háttér előtt lehet kimutatni, a beszűrődő emlőráksejteket körülvevő sejtekben a háttér előtt lehet kimutatni (felső sarok, jobbra), de nem lehet kimutatni az emlőrák sejtjeiben in situ (csillag).

i és j, duktális karcinóma (Cl 1-es karcinóma, az RO-ra pozitív, ΙΙ-es fázis, karcinóma); balra: karcinóma in situ (csillagok), a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékeit nem lehetett kimutatni a kötőszöveti sejtekben; jobbra: beszűrődő neopláziás sejtek, olyan kötőszöveti sejtekkel körülvéve, amelyek a sztromelizin-3 gént expresszálják.

k és 1, nyolchetes humán embrió végtag-burjánzási területének interdigitális régiója: a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékeit kimutattuk a primitív epidermisz alatt lévő mezodermában, legnagyobb mértékben az interdigitális zónában (M); megjegyezzük, hogy a primitív epidermisz (nyíl), a formálódó ízület (PC) és a körülvevő mezoderma nem jelzettek.

Mindegyik esetben a sztromelizin-3 RNS transzkripciós termékei csak a malignus epitéliumsejtek alkotta szigeteket (amelyek a rákok invazív komponenseit képezik) körülvevő kötőszöveti sejtekben mutathatók ki [6. ábra: a és b táblázat a Cl tumorhoz; c, d, e és f táblázatok a C3 tumorokhoz; g és h táblázatok a CIO tumorokhoz, i és j táblázatok (jobboldalt) a Cll tumorhoz; a C5 és C9 tumorokra vonatkozó adatokat nem közöljük].

Az áttérés nyirokmirigyekben (ugyanaz a forrás, mint a C5 tumoré) a sztromelizin-3 gén expressziója szintén az áttétes epiteliális sejteket körülvevő kötőszöveti sejtekre korlátozódik (nem közölt adatok).

Különösen fontos megjegyezni, hogy maguk a rosszindulatú epiteliális sejtek egyik esetben sem jelzettek, és a legmagasabb expressziós szinteket a rosszindulatú sejtek mellett lévő kötőszöveti sejtekben lehet megfigyelni. Ezzel szöges ellentétben jelentős expresszió nem mutatható ki azokban a kötőszöveti sejtekben, amelyek azokat a karcinóma léziókat veszik körül, amelyeket in situ egy bazális membrán vesz körül (g és h táblázat a CIO tumorra, i és j, baloldalt, a Cl 1 tumorra), míg a kötőszöveti sejtek jelzettsége tisztán megfigyelhető ugyanezen tumorok invazív komponenseiben (g és h táblázat a CIO tumorra, i és j táblázatjobbra, a Cl 1 tumorra).

Hasonló módon, nem lehetett jelentős expressziót kimutatni azokban a kötőszöveti sejtekben, amelyek a rákos sejtektől távol találhatók, sem azokban a kötőszöveti sejtekben, amelyek a normál csöveket és csövecskéket veszik körül (például az e és f táblázat). A sztromelizin-3 transzkriptumainak diszkrét gócait nem lehetett kimutatni a Northern biot alapján sztromelizin-3 RNS-re enyhén pozitív F2 fibroadenómában (4. ábra és nem közölt adatok).

Mind a fibroblasztokról, mind a miofibroblasztokról ismert, hogy az invazív emlőkarcinóma kötőszövetében jelen vannak [Ahmed, A., Pathol. Annu., 25(Pt2), 237-286 (1990)]. A mi hibridizációs technikánkat in situ alkalmazva nem lehetett meghatározni, hogy csak az egyik vagy mindkét említett sejttípus expresszálja a sztromelizin-3 gént.

7. példa

Serkentés növekedési faktorokkal

Az említett eredmények azt mutatják, hogy a sztromelizin-3 gén expressziója a kötőszöveti sejtekben indukálható egy diffundáló faktorral, amelyet a neopláziás sejtek választanak ki. A növekedési faktorokról, úgymint az EGF-ről, FGF-ről és a PDFG-ről, csakúgy, mint bizonyos citokinekről (IL-Ια,β és TNF-α) és a tumor promoterekről (például a TPA) ismert, hogy az MMP gének transzkripcióját aktiválják [Kerr et al., Science, 242, 1424-1427 (1988)]. Azt is leírták, hogy a különböző forrásokból származó tumorsejtek olyan faktor(oka)t termelnek, amely(ek) serkentek) a kollagenáz I termelését, például a humán fibroblasztokban [Lippman et al., Recent Prog. Hormoné Rés., 45, 383-440 (1990)]. A PDGF, FGF és TGF-a aktivitásokról ismert, hogy in vitro az emlőrák sejtek választják ki őket [Salomon et al., Breast cancer; Cellular and Molecular Biology (szerk. Lippmann, M. E. és Dickson, R. B.) 363-389 (Kluwer, Boston, 1988)].

Annak vizsgálatára, hogy a sztromelizin-3 gén expresszióját külső tényezők módosíthatják-e, a humán magzat diploid fibroblasztjait növesztjük PDGF, bFGF és EGF, valamint a TPA tumor promoter jelenlétében

HU 215 165 Β vagy távollétében. Egyik vagy másik említett növekedési faktor vagy a TPA hozzáadása azt eredményezte, hogy a sztromelizin-3 RNS transzkriptumok mennyisége megnőtt a fibroblasztokban, a legerősebb serkentést a bFGF jelenlétében lehetett megfigyelni (5d ábra).

8. ábra

A sztromelizin-3 expressziója embrióban

Mivel az embrionális fibroblasztokban a sztromelizin-3 növekedési faktorokkal adott serkentés hatására expresszált, azt vizsgáltuk, hogy a gén normálisan expresszál-e az embrió fejlődése során vagy sem.

A sztromelizin-3 transzkripciós termékeit egy nyolchetes emberi embrió különböző diszkrét régióiban ki tudtuk mutatni, főleg a végtagok növekedése helyén, az ujjak közötti régióban (6. ábra, k és 1 táblázat, valamint nem közölt adatok), ez egy olyan régió, amelyről ismert, hogy az embriogenezisnek ebben a stádiumában a programozott sejthalállal áll kapcsolatban [Milaire, J., Organogenesis (szerk. De Haan, R. L. és Ursprung, H.), 283-300 (Holt, Rinehart és Winston, New York, 1965)].

A jelzést az embrionális mezodermában figyeltük meg, a primitív epidermisz alatt, amely jelöletlen maradt. Érdemes megjegyezni, hogy azok a mezenchimás sejtek, amelyek az epiblaszttól bizonyos távolságra voltak, szintén negatívak voltak az mRNS szempontjából.

Emellett, az a felfedezés, hogy a sztromelizin-3 gén a normális embrionális fejlődés során egy olyan zónában expresszálódik, ahol a szövetek átmodellezése jól dokumentált, azt sugallja, hogy a sztromelizin-3 expressziója az emlótumorban szerepet játszik a MEC remodellezési folyamatában, amely a rák fejlődésével áll kapcsolatban.

9. példa

Az ST3-at kódoló egér cDNS klónozása

Egy ST3-at kódoló humán cDNS-próbát használunk egér placentából cDNS könyvtár átvizsgálására standard módszerekkel [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. A vizsgálat eredménye egy teljes, az ST3-at kódoló egér cDNS (7. ábra).

A két szerkvencia elemzése felfedi, hogy az érett sztromelizin-3 aminosav-szekvenciájában 89%-os homológia van, míg a pre- és pro-doménekben a homológia mértéke 55% (7. ábra).

A különböző egérsejtekben meghatározzuk az expresszió mintázatát, a 4—8. példában leírtak alapján.

A sztromelizin-3 expressziós mintázatát egérben azonosnak találtuk azzal, ami az emberi szövetekben található. A legmagasabb szintű expressziót a placentában és a méh szövetében találtuk.

Claims (30)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás rosszindulatú tumor diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy a sztromelizin-3 peptidet vagy a sztromelizin-3 peptidet kódoló nukleotid-szekvenciát kimutatjuk egy biológiai mintában in vitro.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás emlő- vagy gégetumor, valamint fej-, nyak- és bőrkarcinóma, mint rosszindulatú tumor diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy a biológiai mintában in vitro kimutatjuk a sztromelizin-3 peptidet vagy a sztromelizin-3 peptidet kódoló nukleotid-szekvenciát.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sztromelizin-3 pepiidre specifikus antitestet vagy antitest ekvivalenst érintkezésbe hozzuk a mintával, vagy egy abból készített preparátummal, és vizsgáljuk a kötődést.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitestet vagy antitest ekvivalenst jelöljük.
5. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleotid-szekvenciát mutatjuk ki egy nukleotid-próbával, és a hibridizálást vizsgáljuk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a próba vagy annak komplementer szála a sztromelizin-3 peptidet vagy annak egy jellemző részét kódolja.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a próba vagy annak komplmeneter szála a sztromelizin-3 peptidet pre- és pro-peptid-szekvencia nélkül kódolja.
8. 8. Az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a próba vagy annak komplementer szála a sztromelizin-3 peptidet kódoló cDNS-szekvencia, vagy annak egy része, illetve megfelel annak a genetikai kód degenerációja alapján, vagy a vizsgálati körülmények között hibridizálódik hozzá.
9. 9. Az 5-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a próbát radioaktív izotóppal jelezzük.
10. 10. Az 5-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a próba egy ribopróba.
11. 11. Eljárás a pre-pro-sztromelizin-3 peptid vagy annak mutánsa, variánsa vagy fragmentje előállítására, azzal jellemezve, hogy

    a) a pre-pro-sztromelizin-3 peptidet vagy annak fragmentjét, mutánsát vagy variánsát kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-fragmentet expresszáltatunk, és az expresszálódott peptidet kinyerjük, vagy

    b) a pre-pro-sztromelizin-3 peptid vagy annak fragmentje, mutánsa vagy variánsa aminosav-szekvenciájának megfelelő aminosavakat a megfelelő sorrendben összekapcsoljuk.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás emberi vagy egér eredetű pre-pro-sztromelizin—3-szekvenciák előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNSfragmenteket vagy aminosavakat alkalmazzuk.
13. 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás prosztromelizin-3 előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-fragmenteket vagy aminosavakat alkalmazzuk.
14. 14. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás érett sztromelizin-3 előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-fragmenteket vagy aminosavakat alkalmazzuk.
15. 15. Eljárás a pre-pro-sztromelizin-3 peptidet vagy annak mutánsát, variánsát vagy fragmentjét kódoló

    HU 215 165 Β cDNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát szintetikus vagy enzimatikus úton előállítjuk.
16. 16. Eljárás a pre-pro-sztromelizin-3 peptidet vagy annak mutánsát, variánsát vagy fragmentjét kódoló cDNS-szekvenciát tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a 15. igénypont szerinti eljárással előállított cDNS-szekvenciát vektorba építjük.
17. 17. Eljárás pre-pro-sztromelizin-3 peptid vagy annak mutánsa, variánsa vagy fragmentje előállítására, azzal jellemezve, hogy aló. igénypont szerinti eljárással előállított expressziós vektort gazdasejtbe juttatjuk.
18. 18. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a peptidet egy 17. igénypont szerinti eljárással előállított expressziós rendszerben expresszáljuk, majd izoláljuk.
19. 19. Eljárás áttétes rákok, például az emlő vagy garat rákjai, a fej, a nyak és a bőr karcinómái kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a sztromelizin-3 gén expresszióját vagy aktivitását befolyásoló hatóanyagot a gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverünk, és gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás emlőrák kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő hatóanyagot alkalmazzuk.
21. 21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként sztromelizin—3-ra specifikus antitestet vagy annak ekvivalensét alkalmazzuk.
22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként mérgező markert hordozó antitestet vagy annak ekvivalensét alkalmazzuk.
23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy markerként egy radioaktív izotópot alkalmazunk.
24. 24. A 19. vagy 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a sztromelizin-3-ra specifikus metalloproteinázok szöveti vagy előnyösen szintetikus inhibitorát alkalmazzuk.
25. 25. A 19. vagy 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a sztromelizin-3 aktivitását módosító anyagot alkalmazunk.
26. 26. A 19. vagy 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a sztromelizin-3 gén expresszióját gátló anyagot alkalmazunk.
27. 27. A 19. vagy 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a sztromelizin-3 prepro-protein érését gátló anyagot alkalmazunk.
28. 28. A 19-27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő hatóanyagot alkalmazzuk.
29. 29. Eljárás a pre-pro-sztromelizin-3 peptidet vagy annak mutánsát, variánsát vagy fragmentjét, vagy egy ezeket kódoló nukleotid-szekvenciát hordozó vírust tartalmazó vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a 11. igénypont szerinti eljárással előállított peptidet, vagy az azt kódoló nukleotid-szekvenciát hordozó vírust megfelelő hordozóanyaggal összekeverjük.
30. 30. Eljárás a sztromelizin-3 pepiidre specifikus antitest vagy annak ekvivalense előállítására, azzal jellemezve, hogy all. igénypont szerinti eljárással előállított sztromelizin-3 pepiiddel vagy annak mutánsával, variánsával vagy ftagmentjével gazdaszervezetet immunizálunk, és a sztromelizin-3 pepiidre specifikus antitestet vagy annak ekvivalensét izoláljuk.