PT99562B - Metodo para o diagnostico de tumores malignos atraves da deteccao de estromelis ina-3 - Google Patents

Description

CAMPO DO INVENTO

O presente invento está relacionado com marcas enzimáticas associadas a tumores.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Utilizando as sequências de DNA codificadoras de estromelisina-3, são anticorpos capazes de se ligar a estromelisina-3, o presente invento proporciona métodos de diagnóstico do cancro, especificamente cancro maligno da mama.

número de mortes a nível mundial provocadas pelo cancro anualmente, continua a causar uma grande preocupação, com apenas alguns tratamentos disponíveis para tipos específicos de cancro e estes não tendo garantia absoluta de sucesso. A maior parte dos tratamentos baseiam-se numa abordagem shotgun”, morte imediata das células em crescimento na esperança de gue as células cancerosas em crescimento rápido sucumbam ao tratamento ou pelo menos reduzam de número para permitir ao sistema do corpo eliminar as restantes.

A procura de curas tem sido travada pela descoberta de gue diferentes formas de cancro requerem diferentes tratamentos . Dado que virtualmente qualquer parte do corpo pode ser afectada por cancro o objectivo é demasiado vasto.

No entanto, apesar das suas diferenças, os cancros partilham uma série de semelhanças. Entre estas encontra-se o crescimento de tecido não diferenciado. No entanto, mesmo isto não é 100% preciso, em certos cancros as células apresentam um

certo grau de diferenciação e isto verifica-se em cancros ligados ao sexo, tais como os da mama e dos testículos, onde os tumores podem ser positivos ou negativos para receptores de hormonas. O tratamento destes tumores depende do estado hormonal e pode ser tão simples como a administração do antagonista da hormona TM importante, como seja tamoxifen

Um outro factor gue a maior parte dos cancros partilha é que para serem fatais devem metastizar. Até ocorrerem as metástases, um tumor, se bem que maligno, está confinado a uma área do corpo. Isto pode causar desconforto e/ou dor, ou mesmo conduzir a sintomas mais graves, mas se puder ser localizado, pode ser removido cirurgicamente e, se realizado com o cuidado necessário, pode não voltar a causar problemas.

No entanto, uma vez estabelecidas as metástases, a intervenção cirúrgica pode retirar o tumor parental, mas as células cancerosas invadiram o corpo e apenas a quimioterapia ou alguma forma particular de terapia direcionada pode ter alguma probabilidade de sucesso.

Assim, a capacidade para invadir localmente e para metastizar em orgãos distantes do tumor primário (progressão do tumor) é o acontecimento letal no decurso da maior parte dos cancros. Sabe-se que a alteração/degradação da matrix extracelular (ECM) envolvendo o tumor primário e as modificações das propriedades de aderência das células tumorais são cruciais para a dissociação das células das metástases das células do tumor primário (Liotta, Câncer Res. 46: 1-7 (1986); Hart et al.. Biochim. Biophvs. Aota 989: 65-84 (1989)).

A angiogénese dos tumores é essencial para a expansão dos tumores primários e alastramento dos tumores com metástases e

X ' a própria angiógenese requere degradação de ECM (Blood, et al.. Biochem. Biophvs. Acta 1032:89-118 (1990)). Assim, o tumor maligno é uma doença sistémica em que as interacções entre as células neoplãsicas e o seu ambiente desempenham um papel crucial durante a evolução do processo patológico (Fidler, I. J., Câncer Matastasis Rev. 5:29-49 (1989)).

A identificação das alterações na expressão de genes que estão associadas a tumores malignos, incluindo os envolvidos na progressão de tumores, é claramente um pré-requesito não só para a compreensão total do cancro, como também para o desenvolvimento de novas terapias racionais contra o cancro. Mostrou-se que mutações e/ou controle anormal da expressão de dois grupos de genes celulares (os proto-oncogenes e os genes supressores de tumores) conduzem num processo de vários passos â perda do controle de crescimento normal e à aquisição do fenótipo do fenótipo de célula transformada (Weinberg, R.A., Câncer Res. 49:3713-3721 (1989)). No entanto, os mecanismos moleculares que conduzem à progressão de tumores são muito menos claros (Nowell, P.C., câncer Res. 46d:2203-2207 (1986); Fidler, I.J., cvtometrv 10673-680 (1989)).

Assim, surge um outro problema devido ao facto dos genes característicos das células cancerosas serem muitas vezes genes do hospedeiro anormalmente expressos. Acontece muitas vezes que uma marca proteica particular para um dado cancro ê sobre-expressa nesse cancro, mas é também expressa algures noutras partes do corpo, ainda que a níveis reduzidos.

Algumas das proteínas associadas aos cancros são enzimas que destroem a matrix extracelular, a qual ê importante para a manutenção das células numa relação adequada umas comn as outras. Uma dessas classes são as metaloproteinases (MMPs)

por se ligarem ao zinco. No entanto, não se encontrou nenhuma que servisse de diagnóstico do cancro ou de quaisquer tumores particulares, se bem que a presença de algumas possa ser indicativo.

As MMPs estão envolvidas numa série de processos fisiológicos e patológicos em que a remodelação de ECM e a migração celular estão implicadas, e.g. morfogénese e desenvolvimento embrionário, artrite reumatóide e invasão de tumores e metástases. Sabe-se que os inibidores de MMP são capazes de bloquear a invasão de tumores e a angiogénese, as quais são cruciais para a progressão dos tumores em modelos experimentais.

Todos os membros da família das metaloproteinases de matrix são proteinases que degradam pelo menos um componente de ECM, são secretadas numa forma latente e requerem activação, como seja por proteólise (e.g. por plasmina) para se tornarem activas. As colagenases intersticiais atacam especificamente oo colagénios do tecido conjuntivo (I a III), enquanto que as colagenases do tipo IV (72KD e 92 KD) degradam os colagénios presentes na membrana de pavimentação e fibronectina. As estromelisinas (transinas) -1 e -2 e também bomba-1 têm uma especificidade de substrato muito mais larga, degradando proteoglicanos, laminina, fibronectina e colagénios (III a V).

No homem, a maior parte dos tumores malignos são carcinomas e entre os não fumadores, o cancro da mama é a principal causa de mortalidade pelo cancro em mulheres (Willett, W., Nature 338:389-394 (1989)). A expressão de vários oncogenes foi descrita como estando alterada nas células e tumores da mama malignos, mas nenhum padrão particular de expressão de oncogene/gene supressor pode ser consistentemente associado ao cancro da mama (Gullick, W.J., Prog. Growth Factor Res. 2:1-13 (1990)).

muitas vezes embebidas em estroma adiposo mesenquimatoso, o qual pode ser também importante no controle da sua proliferação e na sua capacidade para formar metástases. De facto, sabe-se que as células do estroma podem modular, tanto positiva como negativamente, o crescimento de epitélio mamário normal (Salomon etal.. em Breast Câncer: Cellular and Molecular Biology (eds., Lippman, M.E. e Dickson, R.B.), pp. 363-389 (Kluwer, Boston, (1988)), e que as interacções entre os componentes epiteliais e do estroma podem influenciar a carcinogése epitelial na glândula mamária (DeOme et al. . Câncer Res. 38.:2103-2111 (1978)).

A existência de fibroblastos activados (Tremblay,G. Exp. Mol. Pathol, .31:248-260 (1979)) e/ou anormais (Grey et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2438-2442 (1989)) em tumores malignos da mama foi postulado e foi proposto que o cancro da mama poderá representar um escape parcial da dependência de um requesito do estroma ou uma resposta anormalmente forte a um componente do estroma.

Devido à natureza do tecido canceroso, é geralmente relativamente fácil estabelecer uma cultura contínua ou linha celular de um determinado cancro, um processo que torna fácil estudar os efeitos de um determinado regime de tratamento. Uma desvantagen significativa de tais sistemas reside na sua natureza - se bem que o tratamento a testar estabeleça se pode actuar directamente sobre as células, não é de modo algum certo que efeito o tratamento terá in vivo e a análise bioquímica de tais linhas é inevitavelmente na ausência do tecido que normalmente rodeia o tumor in vivo.

SUMÁRIO DO INVENTO

Constitui um objectivo do invento identificar genes cuja expressão seja aumentada nos carcinomas da mama, pelo que os carcinomas da mama são considerados como células epiteliais malignas interactuando com o seu estroma envolvente.

Encontramos agora que uma proteína anteriormente não caracterizada é diagnóstico de certos cancros invasivos, especialmente carcinomas da mama, carcinomas das células escamosas da cabeça e pescoço e carcinomas da pele (tipos escamoso e das células basais). A proteína aparentemente pertence ao grupo das metaloproteinases e é referida como estromelisina-3.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Análise de transferências Northern de RNA total de carcinoma da mama Cl e de Fíbroadenoma

RNA total de células de carcinoma da mama Cl e de fíbroadenoma foi despistado usando quatro sondas de cDNA isoladas independentemente como descrito no exemplo 1.

Figura 2. Sequência de nucleótidos do cDNA da estromelisina-3

Está apresentada a sequência de nucleótidos do cDNA e a sequência de aminoácidos deduzida do cDNA da estromelisina-3. Começando no extremo 5', as sequências de nucleótidos sobjacentes correspondema: peptídeo sinal putativo; a sequência PRCGBPD característica da prometaloproteinase, os resíduos conservados de histidina do domínio de ligação ao zinco e a sequência sinal de poli(A⁺).

Figura 3. Comparação das Sequências das Metaloproteinases

As sequências de aminoácidos estão alinhadas e comparadas para estromelisina-3, estromelisina-2, estromelisina-1 e colagenase-1, todas metaloproteinases putativas, como descrito no exemplo 3.

Figura 4. Análise de Transferências Northern da Metaloproteinase Humana

Preparou-se RNA total a partir de quatro carcinomas da mama negativos para receptores de oestrogénio (Cl, grau II; C2, C3 e C4, grau III), seis carcinomas da mama positivos para o receptor do oestrogénio (C5, C8 e C9, grau II; C6 e C7, grau III; Cio, grau I) e quatro fibroadenomas da mama (F2-F5).

RNA foi despistado com (a) RNA de estromelisina-3, (b)RNA de colagenase tipo 1 (COI) (c) RNA de colagenase tipo 4 de 92 KD (COIV 92K) (d) RNA de colagenase tipo 4 de 72 Kd (COIV 72K) (e) RNA de estromelisina-1 e 2 (ST1/2) e RNA da bomba-1 (PUI), como descrito no exemplo 4.

Figura 5. Análise de Transferências Northern do RNA de

Estromelisina-3 Derivado de Várias Linhas Celulares e

Tecidos.

(a) Três nódulos linfáticos normais e cinco auxiliares com metástases de doentes com cancro da mama; (b) Quatro linhas de carcinoma da mama negativas para o receptor de oestrogénio (BT-20, MDA-231, SK-BR-3, HBL-100) e quatro positivas para o receptor do oestrogénio (T-47D, BT-474, ZR-75-1, MCF-7); (c) Dez tecidos humanos normais; e (d) HFL-1 Human Foetal Deployed Fibroblasts (ATCC CCL 153) cultivado em meio sem soro (1 e 2), na ausência (1) ou presença (2) de tPA foram cultivados em meio sem soro suplementado com 20 mg/ml de insulina (3-6), na ausência (3) ou na presença (4) de PDGF, (5) de EGF ou (6) de bFGF, foram despistadas com sequências de estromelisina-3, como descrito no exemplo 5.

Ficrura 6. Localizacãode RNA Transcritos de Estromelisina-3 em

Secções de Carcinoma da Mama e Rebentos de Membros

Embrionários

Microfotografias de campo claro de secções de tecido (X 100) coradas com hematoxilina (A,C,E,G,I e K); e imagens de campo escuro das mesmas secções (ainda coradas com hematoxilina) após hibridação in situ com cRNA anti-codão de estromelisina-3 (B,D,F,H,J e L) como descrito no exemplo 6.

Figura 7. Sequência de cDNA de cDNA de St3 de Murganho

Sequência de cDNA do gene ST3 de murganho e comparação com sequências de cDNA de ST3 humano.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Num primeiro aspecto, o presente invento proporciona um processo para o diagnóstico de cancro invasivo, especialmente da mama, cabeça e pescoço e carcinomas da pele, compreendendo a detecção de estromelisina-3 ou uma sequência de nucleótidos codificadora deestremolisina-3.

Num aspecto alternativo, o presente invento proporciona a utilização de um agente para interferir com a síntese ou actividade de estromelisina-3 no tratamento ou profilaxia de cancro invasivo, especialmente da mama, cabeça e pescoço e carcinomas da pele.

Como se poderá observar os tumores metásticos são invasivos, mas os tumores invasivos não são necessariamente metáticos (por exemplo os carcinomas das células basais da pele).

Uma vez que a expressão do gene da estromelisina-3 é específico de regiões de degradação de ECM e aparentemente codifica uma metaloproteinase, assumiu-se que a sua actividade degradadora de ECM é crucial para a progressão do tumor em metátases. A expressão de estromelisina-3 pelas células do estroma é provável que destrua uma parte importante da ECM, permitindo assim que as células cancerosas migrem para longe do tumor parental.

Assim, qualquer agente que possa afectar a actividade de estromelisina-3 terá efeito sobre as metãstases. Tais agentes serão adequadamente os que evitam a síntese da proteína, evitam a meturação da proteína ou alteram a actividade da enzima, quer bloqueando quer alterando a sua actividade.

Encontrou-se que a expressão do gene da estromelisina-3 é em primeiro lugar diagnóstico de cancro da mama na fase de metástases. De facto, este resultado foi conseguido pela detecção de mRNA numa variedade de tumores analisados, o cancro da mama foi escolhido pois é o responsável pela taxa de morte mais elevada na população feminina não fumadora.

A estromelisina-3 é uma nova proteína quase certamente pertencente â família de MMP e estã asssociada a carcinomas invasivos da mama, independentemente do seu estado hormonal.

os membros da família MMP requerem um passo de activação, o qual pode estar associado à remoção de pre e pro-sequências para se tornar activo. A sequência de aminoácidos da pro-estromelisina e da estromelisina-3 madura é notavelmente diferente das MMPs anteriormente caracterizadas e pode apresentar propriedades distintas relativamente à maturação, activaçâo e especificidade para os componentes de ECM.

gene da estromelisina-3 é expresso por todos os carcinomas invasivos primários da mama, por algumas das suas metástases e em tecidos nos quais se sabe ocorrer extensa remodelação de ECM (útero, placenta e rebentos dos membros embrionários) analisados relativamente a tal expressão, mas não em fibroadenomas da mama e tecidos adultos normais, sugerindo que o produto do gene da estromelisina-3 desempenhe um papel importante na progressão do cancro da mama. Também de acordo com este ί' * conceito, ο gene da estromelisina-3 não é expresSò na maior parte dos carcinomas da mama in situ, com excepção dos carcinomas in situ do tipo comedão, os quais são geralmente considerados como lesões pré-invasivas e são muitas vezes associados a microinvasão. Assim, a presença de transcritor RNA de estromelisina-3 noutras concentrações que não as concentrações baixas encontradas no útero ou placenta, é diagnóstico de um cancro metástico ou de um cancro com um elevado risco de se tornar invasivo.

A estromelisina-3 pode estar envolvida nos processos líticos que provavelmente estão associados ao crescimento de tumores invasivos. Como alternativa, é possível que a estromelisina-3 possa também desempenhar um papel na formação de desmoplasia, a qual está associada â maior parte das lesões de cancro invasivo, e pode representar uma reacção do hospedeiro para evitar o alastramento das células malignas (Ahmed, A. Pathol. Annu, 25(Pt2):237-286 (1990)). Em tal caso# o aumento da actividade de estromelisina-3 seria vantajoso.

Ainda, a expressão restringida do gene da estromelisina-3 em fibroblastos de estroma envolvendo imediatamente as ilhas de células neoplásicas é restricta ao contrário da colagenase IV, uma outra metaloproteinase que se sabe estar associada à conversão maligna de algumas células tumorigénicas, e catepsina D, uma aspartil-protease lisossómica cuja expressão é aumentada em carcinomas da mama, ambas são expressas, não em fibroblastos, mas em células epiteliais neoplásicas de cancros da mama (Monteagudo et al.. Am. J. Pathol. 136:585-592 (1990); Garcia et al. Steroid Biochem. 27;439-445 (1987)).

Para identificar a nova marca do cancro da mama, construiu-se uma biblioteca de cDNA e subtraiu-se e subtraiu-se com RNA poli (A+) derivado de fibroadenoma. Por este processo, o cDNA foi enriquecido em sequências características de cancros metásticos.

Uma série de clones foram cultivados e despistados de tumores ligam mais usando sondas derivadas de RNA poli(A ) derivado metásticos e de fibroadenomas. Os clones gue se fortemente às sondas derivadas de RNA poli(A+) de cancro metástico foram então cultivados.

Dos clones gerados desta forma, encontrou-se um expresso diferencialmente no sentido de serem encontradas taxas elevadas de expressão apenas em cancros malignos da mama e da faringe, carcinomas da cabeça, pescoço e pele (do tipo escamoso e das células basais), assim como no útero e placenta, em todos eles havendo destruição de ECM, a qual quando associada com cancro, permite às células cancerosas espalharem-se pelo corpo (metástases) .

No caso do útero e da placenta, a destruição de ECM ocorre naturalmente, enquanto que o mesmo acontecimento noutro sítio é característico de crescimento tumoral.

É também interessante notar que a expressão do gene da estromelisina-3 foi encontrado em diferenciação interdigital durante gemulação dos membros no feto, o gue está associado à destruição de ECM.

A caracterização da sequência de cDNA permitiu ver que existe uma grelha de leitura aberta. A comparação da sequência proteica codificada com uma biblioteca conhecida estabeleceu que a proteína pertence a uma família que se sabe destruir ECM. Se bem que a sequência de estromelisina-3 seja menos semelhante a outros membros da sua família do que qualquer um dos outros

membros uns relação aos outros, no entanto apresenta uma série de regiões características que servem para identificar a natureza da enzima. Assim, a proteína foi designada estromelisina-3, se bem que possa também ser uma colagenase ou possa degradar um constituinte diferente de ECM.

A construção de sondas de oligonucleótidos para estabelecer a ocorrência de mRNA de estromelisina-3 revelou uma distribuição nos tecidos como descrito atrás e também permitiu fazer fotomicrografias para localizar exactamente as áreas de expressão do gene da estromelisina-3 por marcação.

Uma análise das fotomicrografia obtidas por este método mostrou, surpreendentemente, que o gene da estromelisina-3 não ê expresso nas próprias células cancerosas mas no estroma envolvente. Ainda, o estroma não apresentava qualquer evidência de mRNA de estromelisina-3 quando a membrana de aderência do tumor ainda estava intacta (ver Figura 6). O gene da estromelisina-3 é expresso por todos os carcinomas invasivos primários da mama, por alguns dos nódulos das suas metástases e em tecidos nos quais se sabe ocorrer extensa remodelação de ECM (útero, placenta e rebentos dos membros embrionários) analisados relativamente a tal expressão, mas não em fibroadenomas da mama e tecidos adultos normais, sugerindo que o produto do gene da estromelisina-3 desempenha um papel importante na progressão do cancro da mama. Também de acordo com este conceito, o gene da estromelisina-3 não é expresso na maior parte dos carcinomas da mama in situ. com excepção dos carcinomas in situ do tipo comedão, geralmente considerados como lesões pré-invasivas vezes associados a microinvasão. A estromelisina-3 ocorre no estroma de cancros metásticos e não ocorre no estroma de tumores primários iri situ (tumores tendo ainda uma membrana de aderência e que são não invasivos). Assim, a presença de transcritos de RNA os quais são e são muitas /

χ de estromelisina-3 em concentrações que não sejam as concentrações baixas encontradas algures no corpo, que não seja o útero ou a placenta, é diagnóstico de um cancro metástico ou de um cancro com um elevado risco de se tornar invasivo.

Ainda, a expressão do gene da estromelisina não foi detectada em qualquer uma das linhas celulares de cancro da mama positivas ou negativas para ER, mesmo que alguns deles secretem e possuam receptores para EGF/TGF-α e TGF (factores que estão implicados na expressão do gene da estromelisina-3).

Assim, as técnicas de detecção convencionais aplicadas â estromelisina-3, seus precursores ou suas sequências de nucleótidos codificadoras podem ser usadas para diagnosticar um cancro metástico ou para confirmar que um tumor primário não atingiu ainda a fase fatal metástica.

Tais técnicas podem incluir a detecção com sondas de nucleótidos, como descrito atrás ou podem compreender a detecção da proteína estromelisina-3 por exemplo por anticorpos ou seus equivalentes.

As sondas de nucleótidos podem ser quaisquer umas que hibridem mais fortemente com a sequência mostrada na Figura 2 junta do que outras sequências naturais. Tipos de sonda incluem cDNA, ribo-sondas, oligonucleótidos sintéticos e sondas genómicas. 0 tipo de sonda usada será normalmente ditada pela situação particular, como sejam por exemplo ribossondas para hibridação in situ e o cDNA para transferências Northern. As sondas mais preferidas são as que correspondem á cadeia negativa do cDNA da Figura 2. É também possível proporcionar sondas que reconhecem intrões situados dentro do gene da estromelisina, mas isto não é necessariamente tão fiável como detectar transcritos de RNA.

A detecção do gene da estromelisina-3, per se, não servirá de um modo geral para fins de diagnóstico, mas outras formas de ensaio para detectar transcritos e outros produtos de expressão serão de um modo geral úteis. As sondas podem tão curtas quanto o necessário para reconhecer diferencialmente transcritos de mRNA de estromelisina-3 e podem ser tão curtas como por exemplo 15 bases.

A forma de marcação das sondas pode ser qualquer uma que seja apropriada como seja a utilização de isótopos radioacti32 35 vos, por exemplo P e S. A marcação com isotopos radioactivos pode ser conseguida, quer a sonda seja sintetizada quimicamente quer biologicamente, pela utilização de bases adequadamente marcadas. Outras formas de marcação podem incluir marcação com enzimas ou com anticorpos como é característico de ELISA, mas a detecção de transcritos de mRNA por sondas marcadas seã de um modo geral por radiografia de raios X.

A detecção de transcritos de RNA pode ser conseguida por transferência Northern, por exemplo, em que uma preparação de RNA corre num gel desnaturante de agarose e é transferida para um suporte adequado, como seja celulose activada, nitrocelulose ou vidro ou membranas de nylon. 0 cDNA ou RNA marcado radioactivamente é então hibridado com a preparação, lavado e analisado por autorradiografia.

A visualização da hibridação in situ pode também ser empregue (Exemplo 6), onde uma sonda de cRNA anticodão marcada com S é hibridada com um corte fino de uma amostra de biópsia, lavado, clivado com RNase e exposto a uma emulsão sensível para autorradiografia. As amostras podem ser coradas hematoxilina para demonstrar a composição histológica da amostra e observação em fundo escuro com um filtro de luz adequado permite observar a emulsão revelada.

A imuno-histoquímica pode ser usada para detectar a expressão de estromelisina-3 numa amostra de biópsia. Um anticorpo adequado é posto em contacto por exemplo com uma camada fina de células, lavado e depois posto em contacto com um segundo anticorpo marcado. A marcação pode ser com uma enzima, como seja peroxidase, avidina ou por marcação radioactiva. São geralmente preferidas as marcas cromogénicas pois podem ser detectadas com um microscópio.

Geralmente mais preferido é detectar a proteína por imunoensaio, por exemplo por ELISA ou RIA, o que pode ser extremamente rápido. Assim, é geralmente preferido usar anticorpos ou equivalentes de anticorpos para detectar estromelisina-3, mas a utilização de um substrato de estromelisina-3 adequadamente marcado pode também ser vantajoso.

Pode não ser necessário marcar o substrato, desde que o produto do processo enzimático seja detectável e característico (como seja peróxido de hidrogénio). No entanto, se for necessário marcar o substrato, então este pode compreender também marcação com enzima, marcação com isótopos radioactivos, marcação com anticorpos, marcação com marcas fluorescentes ou qualquer outra forma adequada que seja facilmente aparente para os familiarizados com a matéria.

Para a detecção da expressão de estromelisina-3 prefere-se a utilização de anticorpos. Os anticorpos podem ser preparados como descrito abaixo e usados de qualquer forma adequada para detectar a expressão de estromelisina-3.

As técnicas baseadas em anticorpos incluem ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima) e RIA (radioimunoensaio).

Para tais imunoensaios podem ser usados quaisquer processos convencionais. Os processos podem adequadamente ser conduzidos de forma a que: um padrão de estromelisina-3 é marcado com um . . 125 35 isótopo radioactivo tal como I ou S ou uma enzima testãvel, como seja peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina e juntamente com a amostra não marcada, é colocado em contacto com o anticorpo correspondente, sendo então usado um segundo anticorpo para se ligar ao primeiro ou testada a enzima imobilizada (ensaio competitivo); como alternativa, a estromelisina-3 na amostra fica a reagir com o anticorpo imobilizado, anticorpo correspondente anti-estromelisina-3 marcado com isótopo radioactivo ou com enzima ê deixado a reagir com o sistema e a radioactividade ou a enzima testada (ensaio ELISA tipo sanduíche). Outros métodos convencionais podem também ser empregues conforme adequado.

As técnicas acima podem ser realizadas essencialmente como um ensaio de ’'um passo” ou de dois passos. 0 ensaio de um passo envolve o contacto do antigénio com o anticorpo imobilizado e, sem lavagem, contacto da mistura com marcado. O ensaio de dois passos envolve a contacto da mistura com o anticorpo marcado, empregues outros métodos convencionais conforme adequado.

com o anticorpo lavagem antes do Podem também ser

A marcação enzimática e radioactiva de estromelisina-3 e/ou os anticorpos podem ser realizado por meios convencionais. Tais meios incluirão de um modo geral ligação covalente da enzima ao antigénio ou ao anticorpo em questão, como seja através de glutaraldeído, especificamente de forma a não afectar adversamente a actividade da enzima, pelo que se pretende significar que a enzima deve ainda ser capaz de interactuar com o seu substrato, se bem que possa não ser necessário que toda a enzima esteja activa, desde que permaneça activa a suficiente para permitir que o ensaio se efectue. De facto, algumas técnicas para a ligação de enzimas são inespecíficas (tais como a utilização de formaldeído) e darão apenas uma fracção de enzima activa.

É geralmente desejável imobilizar um componente do sistema de ensaio num suporte, permitindo assim aos outros componentes do sistema entrarem em contacto com o componente e serem facilmente removidos sem muito esforço e demora. É possível durante uma segunda fase imobilizar mas uma fase é geralmente suficiente.

É possível imobilizar a própria enzima num suporte, mas se for necessário a enzima na fase sólida, então isto é geralmente melhor conseguido através da ligação ao anticorpo r fixação do anticorpo a um suporte, os modelos e sistemas as quais são bem conhecidos na área. Simples polietileno pode proporcionar um suporte adequado.

As enzimas empregues para a marcação não estão particularmente limitadas mas podem por exemplo ser seleccionadas de entre os membros do grupo oxidase. Esta catalizam a produção de peróxido de hidrogénio por reacção com os seus substratos e a glucose oxidase é muitas vezes usada devido à sua boa estabilidade, disponibilidade e custo baixo, assim como disponibilidade do seu substrato (glucose). A actividade da oxidase pode ser testada medindo a concentração do peróxido de hidrogénio formado apôs reacção do anticorpo marcado com enzima com o substrato sob condições controladas bem conhecidas.

Podem ser usadas outras técnicas para detectar estromelisina-3 conforme se preferir. Uma delas é a ttrnasferência

Western (Towbin et al.. Proc. Nat. Acad. Sei. 76:4350 (1979)), em que uma amostra adequadamente tratada migra num gel de SDS PAGE antes de ser transferida paras um suporte sólido, como seja filtro de nitrocelulose. Os anticorpos anti-estromelisina-3 (não marcados) foram então colocados em contacto com o suporte e testados através de um reagente imunológico secundário, como seja proteína A marcada ou anti-imunoglobulina (marcas adequadas . . 125 incluindo I, peroxidase de rabano silvestre e fosfatase alcalina).

As amostras para fins de diagnóstico podem ser obtidas de qualquer local relevante. Uma amostra obtida directamente do tumor, como seja estroma ou citossol, pode ser ideal, mas pode também ser adequado obter a amostra por exemplo do sangue. No entanto, se a amostra derivar do sangue, pode ser necessário ensaios altamente sensíveis uma vez que a quantidade de estromelisina-3 seria então diluida na corrente sanguínea. Tal diagnóstico pode ser de particular importância no controle do progresso do doente, como seja depois da cirúrgia para remover um tumor. Se se tirar uma leitura de referência após a operação, depois outras com intervalos regulares, qualquer subida poderá indicar uma recaída ou possivelmente uma metástase. A tomada de tais leituras pode necessitar de ter em conta por exemplo a actividade no útero.

os anticorpos anti-estromelisina podem ser também usados para a fins de visualização. Para além de enzimas, outras 125 marcas adequadas incluem isótopos radioactivos, iodo ( I,

121_T. , ,14C) , enxofre (35„. .__,3_TT. . .. ,112_T .

I), carbono ( ' S), tntio ( Η), índio ( In),

Q ΟτΠ e tecnécio ( Tc), marcas fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina e biotina.

No entanto, para fins de visualização in vivo, a posição torna-se mais restrictiva, uma vez que os anticorpos não são detectáveis, como tal de fora do corpo e portanto devem ser marcados ou de outra forma modificados para permitir a detecção.

As marcas para este fim podem ser quaisquer desde que não interfiram com a ligação do anticorpo, mas que permitam a detecção externa. Marcas adequadas podem incluir as que podem ser detectadas por radiografia de raios X, NMR ou ESR. Para técnicas de radiografia de raios X, marcas adequadas incluem radioisótopo que emita radiação detectãvel mas não seja ciai para o doente, tais como bário ou césio. Marcas para NMR e ESR geralmente incluem característico detectãvel tais como incorporado no anticorpo por marcação adequada de nutrientes para o anticorpo com interesse.

qualquer prejudiadequadas as que possuem um spin deutêrio, o qual pode ser

No caso de métodos de formação de imagens in vivo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo que tenha sido marcado com um grupo que dê imagens detectáveis adequadas, como seja um radiosótopo (por exemplo, I, In, Tc) , uma substância radio-opaca ou um material detectãvel por ressonância magnética nuclear, é introduzido (por exemplo, parenteralmente, subcutaneamente ou intraperitonealmente) no indivíduo (por exemplo um humano) a ser examinado.

O tamanho do indíviduo e o sistema de visualização usado, determinará a quantidade de fraeção formadora de imagens necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma fraeção de radioisótopo, para um humano, a quantidade de radioactividade injectada variará normalmente entre cerca de 5 e cerca de 20 milicuries de tecnécio-99m. O anticorpo marcado ou fragmento de anticorpo acumular-se-à então preferencialmente nas células que contêm estromelisina. 0 anticorpo marcado ou fragmento de anticorpo pode então ser detectado usando técnicas conhecidas.

para uma discussão geral desta área tecnológica, ver S. W. Burchiel et al.. Immunopharmaceutics of Radiolabelled Antibodies and their Fragments (Capítulo 13 em Tumor Imagino; The Radiochemical Detection of câncer eds. S.W. Buschiel and B.A. Rhodes, Masson Publishing Inc. (1982)).

I Os anticorpos podem ser induzidos contra um peptídeo de “ estromelisina-3 ou toda a molécula. Tal peptídeo pode estar presente juntamente com uma proteína veículo, como seja albumina, para um sistema animal, ou se for suficientemente grande, ou seja pelo menos 25 resíduos de aminoácidos, sem um veículo. Os anticorpos humanos provavelmente serão incapazes de reconhecer a estromelisina-3, uma vez que esta proteína representará ela própria uma auto-proteína.

Tal como aqui é usado o termo peptídeo significa qualquer molécula compreendendo 2 ou mais aminoácidos ligados por uma ligação peptídica. Como tal, o termo inclui oligopeptídeos, polipeptídeos e proteínas.

)

Os anticorpos policlonais gerados pela técnica acima podem ser usados directamente ou células produtoras de anticorpos adequadas podem ser isoaldas a partir do animal e usadas para formar um hibridoma por meios conhecidos (Kohler and Milstein, Nature 256:795 et seq. (1975)). A selecçâo de um hibridoma adequado também será aparente para os familiarizados com a matéria e o anticorpo resultante poderá ser usado num ensaio adequado para identificar estromelisina-3.

Anticorpos ou seus equivalentes podem também ser usados de acordo com o presente invento para o tratamento ou profilaxia de cancros metásticos. A administração de uma dose adequada do anticorpo pode servir para bloquear a produção ou para bloquear a actividade efectiva da estromelisina-3 e isto pode proporcionar uma período de tempo crucial no qual se trata o crescimento maligno.

A profilaxia pode ser adequada mesmo em estados muito precoces da doença, uma vez que não se sabe o que de facto conduz às formação de metástases em qualquer caso. Assim, a administração dos anticorpos, seus equivalentes ou factores, tais como TIMPs (compostos naturais que regulam os inibidores de tecido TIMPs das metaloproteinases), os quais interferem com a actividade da estromelisina-3, pode ser realizada logo que o cancro seja diagnosticado e o tratamento pode continuar durante o tempo necessário, de preferência até a ameaça de doença ter sido removida.

Uma forma preferida de tratamento é empregar a técnica da chamada bala mágica, pela qual uma toxina adequada é ligada aos anticorpos que têm como alvo a área do tumor. Tais toxinas são bem conhecidas e podem compreender radioisótopos tóxicos, metais pesados, enzimas e activadores do complemento, assim como toxinas naturais tais como o rícino que são cpaazes de actuar ao nível de apenas uma ou duas moléculas por célula. Pode também ser possível usar tal técnica pata libertar doses localizadas de antagonistas de hormonas ou quaisquer compostos adequados fisiologicamente activos, os quais podem ser usados por exemplo para tratar cancros.

Será apreciado que os anticorpos para usar de acordo com o presente invento, quer seja para diagnóstico quer seja para aplicações terapêuticas, pode ser monoclonal ou policlonal conforme adequado. Os equivalentes de anticorpo podem compreender por exemplo: os fragmentos Fab' dos anticorpos, tais como Fab, Fab', F(ab')_ e Fv; idiotipos; ou os resultados de enxerto alotopo (onde a região de reconhecimento de um anticorpo animal foi enxertada na região adequada de um anticorpo humano para evitar uma resposta imune no doente). Outras modificações e/ou agentes adequados serão aparentes para os familiarizados com a matéria.

Para além da utilização de anticorpos para inibir ou remover estromelisina-3, pode também ser possível usar outras formas de inibidor. Tais inibidores podem ser gerais (para enzimas degradoras de ECM, por exemplo) ou específicos de estromelisina-3 . Sabe-se que existem os inibidores de tecidos de metaloproteinases (TIMPs) e é extremamente improvável que haja um TIMP específico para a estromelisina-3. Tal TIMP é facilmente identificável por técnicas convencionais.

Os inibidores sintéticos da estromelisina-3 podem ser também produzidos e estes geralmente correspondem à área do substrato afectada pela actividade enzimática. é geralmente preferido que tais inibidores correspondam a um intermediário congelado entre o substrato e os produtos de clivagem, mas é também possível proporcionar uma versão espacialmente bloqueada do sítio de ligação ou uma versão do sítio de ligação que por si só se liga irreversivelmente à estromelisina-3. Outros inibidores adequados serão aparentes para os familiarizados com a matéria.

Podem também ser empregues outros métodos para bloquear a actividade de estromelisina-3. Estes podem constituir agentes desnaturantes, por exemplo, se bem que estes tendam a ser inespecíficos e possam ser adequadamente empregues se puderem ser ·\ dirigidos, como seja pela utilização de anticorpos. Outras formas de actividade bloqueadora de estromelisina-3 poderão ser conseguidas bloqueando o progresso da forma de pre-proproteína para dar proteína. Este processo proporciona várias fases do alvo e é necessário apenas para identificar uma fase que pode ser independentemente bloqueada de forma a não afectar outras enzimas vitaisou que pode novamente ser tornado alvo.

Pode também ser possível usar peptídeos ou outras moléculas pequenas para reconhecer selectivamente uma estrutura terciária na estromelisina-3, bloqueando assim a sua actividade enzimática. Tal bloqueador de actividade não necessita necessariamente de se ligar ao sítio activo, mas pode servir para alterar ou congelar a estrutura terciária da estromelisina-3, destruindo, suspendendo ou alterando a sua actividade. 0 bloqueador também não necessita necessariamente de actuar por si só, mas pode estar ligado a uma outra molécula para este fim ou pode servir como sítio de reconhecimento para um agente inactivador adequado.

Outros estudos demonstraram que a ocorrência de mRNAs da colagenase tipo I e da colagenase tipo IV de 92 KD está exclusivamente associada a tumores malignos, se bem que o contrário nem sempre seja verdadeiro (i.e. os tumores não estão sempre associados a estas proteínas).

Existe aparentemente um paralelo entre a expressão do gene da estromelisina-3 e a do gene da tenascina, nos carcinomas invasivos da mama. A glicoproteina ECM tenascina (Chiquet-Ehrismann et al. Cell 47:131-139 (1986)) parece desempenhar um papel essencial nas interaeções das células do mesênquima epitelial e na migração celular durante o desenvolvimento normal, incluindo o da glândula mamária durante a erganogénese.

Tem sido consistentemente encontrado que a tenascina é sobre-expressa no estrome fibroso dos tumores malignos da mama e parece ser induzida de forma semelhate à estromelisina-3. Quando comparada com a fibronectina a tenascina é um substrato fraco para ligaçaão de células epiteliais de tumor mamário sugerindo que pode permitir gue elas se tornem evasivas.

Assim, a estromelisina-3 pode actuar em concordância com a tenascina durante a fase invasiva do cancro da mama. A estromelisina-3 e a tenascina podem também ser co-expressas durante a embriogénese nas regiões onde se sabe que as interacções epitélio-mesenquima desempenham um papel importante e onde a migração celular tem lugar.

Assim, o presente invento também proporciona um processo para o diagnóstico de cancro raetástico conforme definido atrás, compreendendo ainda a detecção de qualquer uma das proteínas anteriores ou uma sequência de nucleótidos que as codifique.

invento também proporciona uma utilização no tratamento ou profilaxia de cancro metástico, compreendendo ainda a utilização de um agente para se ligar a qualquer uma das proteínas anteriores.

presente invento proporciona ainda uma sequência de nucleótidos codificadora de toda ou parte da estromelisina-3. A sequência da estromelisina-3 é de preferência a apresentada na Figura 2 dos desenhos juntos, enquanto que a sequência de nucleótidos seja preferencialmente a mostrada na Figura 2. No entanto será apreciado que a sequência de nucleótidos pode ser substancialmente diferente da mostrada na Figura, devido à degeneração do código genético, desde que ainda codifique pelo menos parte da estromelisina-3.

A sequência necessária pode variar ainda mais de acordo com a utilização que se lhe pretende dar. Caso se destine a ser usada para detectar transcritos de RNA em amostras biológicas então será geralmente preferido corresponda muito de perto à sequência dada na Figura 2. No entanto, a sequência pode ainda variar, desde que a hibridação seja possível nas condições de restringência seleccionadas.

Uma sonda pode ser conseguida a partir da sequência de peptxdeos da Figura 2. No entanto a utilização de tais sondas pode ser limitada pois uma dada sequência obtida a partir da proteína não tem necessariamente de hibridar bem ou mesmo hibridar com qualquer sequência complementar obtida por engenharia genética a partir do mesmo peptídeo devido à degeneração do código genético. Este é um factor comum nos cálculos dos familiarizados com a matéria e a degenerescência de qualquer sequência é frequentemente tão larga que se deve ter um grande número de sondas para qualquer sequência.

Se a sequência de nucleótidos for necessária para a expressão de um peptídeo de estromelisina-3 ou de toda a enzima, então pode haver uma considerável margem de acção, ambas descritas atrás relativamente ao código genético e também o facto de alguma sequência de aminoácidos da estromelisina-3 poder ser variada sem efeito significativo na estrutura ou função da enzima.

Se tais diferenças na sequência forem contempladas então deve-se ter em mente que haverá áreas críticas na molécula que determinam a actividade. Tais áreas geralmente compreenderão resíduos que entram no sítio de ligação. Em geral, é possível substituir resíduos que formam a estrutura terciária, desde que os resíduos que desempenham uma função semelhante sejam usados. Noutros casos, o tipo de resíduo pode ser irrelevante.

Assim, o presente invento também inclui quaisquer variantes e mutantes na sequência que ainda apresentem substancial actividade estromelisina-3 ou que apresentem regiões características da estromelisina-3 para usar na geração de anticorpos, por exemplo. Tais variantes e mutantes incluem deleções, adições, inserções, inversões repetições e substituições tipo (por exemplo, substituição de um resíduo hidrofilico por outro mas não fortemente hidrofilico por fortemente hidrófobo como regra). Pequenas alterações terão de um modo geral pouco efeito na actividade, a menos que sejam parte essencial da molécula e possam ser um subproduto da manipulação genética, por exemplo quando se geram sítios de restrição extra.A modificação pode também incluir substituição de um ou mais resíduos e tal substituição pode ser de 1:1 ou qualquer proporção adequada, maior ou menor que a unidade.

Mutações pontuais e outras alterações na sequência codificadora podem ser efectuadas para adicionar ou eliminar sítios de restrição, por exemplo para ajudar a manipulação genética/expressão ou para aumentar ou de outra forma modificar convenientemente a molécula de estromelisína-3.

Será também apreciado que um equivalente da estromelisina-3 será encontrado em outros animais especialmente mamíferos e a informação da sequência pode ser de particular importância para elucidar as regiões conservadas da molécula de estromelisina-3. Por exemplo, a sequência correspondente no murganho é «80% conservada, incluindo por exemplo a sequência de 10 aminoácidos no prodomínio característicoda estromelisina-3. também será apreciado que as sequências animais correspondendo às sequências da estromelisina-3 humana serão facilmente detectãveis por métodos conhecidos e descritos abaixo e tais sequências e seus peptídeos assim como seus mutantes e variantes formam parte do invento.

As sequências do invento podem também ser manipuladas para proporcionar sítios de restrição caso se pretenda. Isto pode ser feito de forma a não interferir com a sequência peptídica codificadora da estromelisina-3 ou pode interferir até certo ponto caso se pretenda ou seja necessário, desde que o produto final tenha as propriedades desejadas.

Conforme estabelecido atrás, se bem que a hibridação possa ser uma indicação fiável da homologia de sequências, sequências preferidas serão geralmente as que apresentem um excesso de 50%, de preferência de 70% e mais preferencialmente de 80% de homologia com a sequência da Figura 2.

Tal como com outras metaloproteinases, a estromelisina-3 é originalmente expressa como uma pre-proenzima. Assim, observam-se duas fases da clivagem in vivo♦ A clivagem não é necessariamente um requesito para a expressão in vitro e pode ser possível por exemplo para E. coli expressar a proteína madura.

Caso se pretenda expressar a estromelisina-3 ou um seu peptídeo característico, pode ser usado qualquer sistema adequado. A natureza geral dos vectores adequados, vectores de expressão e construções serão parentes para os familiarizados com a matéria.

Por '•característico” pretende-se significar qualquer peptídeo que tenha uma sequência única da estromelisina-3. Tal sequência pode ser importante para a actividade de x'.

estromelisina-3 ou pode ser apenas uma sequência não encontrada noutros peptídeos. No entanto, as sequências importantes para a actividade de estromelisina-3 são geralmente preferidas uma vez que são provavelmente as mais conservadas dentro da população.

, Os vectores de expressão adequados podem ser baseados em fagos ou plasmídeos, ambos sendo geralmente específicos de hospedeiro, se bem que possam muitas vezes ser manipulados para outros hospedeiros. Outros vectores adequados incluem cosmídeos e k retrovirus e quaisquer outros veículos os quais podem ou não ser específicos de um dado sistema. Novamente, as sequências de controle como sejam de reconhecimento, promotor, operador, indutor, terminador e outras sequências essenciais e/ou úteis na regulação da expressão, será facilmente aparente para os familiarizados com a matéria e podem estar associados à sequência natural da estromelisina-3 ou ao vector usado ou podem derivar de qualquer outra fonte adequada. Os vectores podem ser modificados ou manipulados de qualquer forma adequada.

A preparação correcta de sequências de nucleótidos pode ser confirmada por exemplo pelo método de Sanger et al. (Proc. Nat. Acad, Sei.USA 74:5463-7 (1977)).

Um fragmento de cDNA codificador da estromelisina-3 do invento pode ser facilmente inserido num vector adequado. Idealmente o vector recipiente tem sítios de restrição adequados para facilidade de inserção, mas por exemplo também pode ser feita a ι ligação de extremos cegos, se bem que isto conduza a incertezas relativamente à grelha de leitura e direcção da inserção. Em tais casos é uma questão de testar transformantes relativamente à expressão, 1 em 6 dos quais tem a grelha de leitura correcta.Vectores adequados podem ser seleccionados pelos familiarizados com a matéria de acordo com o sistema de expressão pretendido.

Através da transformação de um organismo adequado, ou preferencialmente linha celular eucariótica, como seja HeLa, com o plasmideo obtido, selecção do transformante com ampicilina ou por outros meios adequados caso seja necessário e adição de triptofano ou outro indutor de promotor adequado (como seja o ácido indolacrílico) se necessário, pode ser expressa a estromelisina-3 pretendida. 0 grau de expressão pode ser analisado por electroforese em gel de SDS poliacrilamida - SDS-PAGE (Laemmli, Nature 227:680-685 (1970)).

Métodos adequados para o crescimento e transformação de culturas etc. estão bem ilustrados por exemplo em Maniatis (Molecular Cloning. A Laboratory Manual Maniatis et al.. (eds.), Cold Spring Harbor Labs, NY (1989)).

As culturas úteis para a produção de estromelisina-3 ou um seu peptídeo podem ser adequadamente culturas de quaisquer células vivas e podem variar entre sistemas de expressão procarió ticos e sistemas de expressão eucarióticos. Um sistema procariótico preferido é o de E. coli. devido à facilidade de manipulação. No entanto é também possível usar um sistema superior, como seja uma linha celular de mamífero, para expressão de uma proteína eucariótica. Normalmente as linhas celulares preferidas para a expressão transitória são as linhas celulares HeLa e Cos. Outros sistemas de expressão incluem a linha celular de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

Um sistema importante é o sistema de baculovírus pelo qual células de borboleta são cotransfectadas com um DNA vector codificador de estromelisina-3 ou de um peptídeo adequado e DNA de baculovírus. A recombinação ocorre dentro da célula e recombinantes de baculovírus adequados podem ser seleccionados por técnicas convencionais. Em seguida, o recombinante pode ser usado para infectar a linha celularsendo expresso quando da infecção estromelisina-3 ou peptídeo conforme pretendido. Uma vantagem particular deste sistema é a quantidade de proteína produzida a qual pode ser na gama entre cerca de 1 e cerca de 500 mg/litro.

Se bem que tal sistema não seja tão fácil de usar quanto o sistema de E. coli. a vantagem baseia-se no processamento da proteína após a síntese primária. E. coli por exemplo não emprega o mesmo sistema para o processamento de pre-proproteínas que as células de mamífero.

Outros sistemas de expressão que podem ser empregues incluem estreptomicetes, por exemplo e leveduras, tais como Saccheromyces spp., especialmente S. cerevisiae. Qualquer sistema pode ser usado caso dependendo da necessidade do operador. Podem também ser usados sistemas adequados para amplificar o material genético, mas é geralmente conveniente usar E. colid para este fim onde apenas a proliferação do DNA é necessária.

Pode ser vantajoso produzir apenas a enzima madura, com a finalidade de induzir anticorpos pois a sequência da enzima madura é comum âs pro e preprosequências. No entanto, a clivagem das fracções pro e prepro pode alterar a configuração terciária da molécula e portanto é possível que um anticorpo induzido contra a enzima madura não detecte a proenzima por exemplo. Os anticorpos induzidos contra a enzima em qualquer uma das suas fases e/ou contra os pre e propeptídeos que são clivados podem igualmente mostrar-se úteis.

A sequência peptídica ou de nucleótidos pode ser qualquer uma que seja característica da estromelisina-3, tendo em consideração a finalidade pretendida. Idealmente, as sequências seriam completamente características da estromelisina-3, mas o comprimento de tais sequências pode variar de acordo com a região da molécula de estromelisina-3. As regiões mais preferidas são as que são altamente conservadas e que não são partilhadas com outras proteínas, se bem que possa ser vantajoso se a sequência for característica das MMPs ou, mais particularmente, as MMPs associadas a tumores invasivos.

O invento inclui e está relacionado com equivalentes de sequências peptídicas e de nucleótidos, o termo equivalente sendo usado no sentido da descrição anterior, ou seja equivalentes no sentido das sequências terem substituições nos terminais C ou N, ou noutro sítio.

invento também inclui mutantes das sequências, o termo mutantes sendo usado com referência a deleções, adições, inserções, inversões e substituição de resíduos de aminoácidos ou bases na sequência sujeita às restrições descritas atras.

presente invento ainda inclui variantes das sequências, cujo termo é usado em relação a outra estromelisina-3 natural que podem ser descobertas de tempos a tempos e que partilham essencialmente a mesma sequência mostrada na Figura 2, mas que varia numa forma esperada dentro de uma larga população. Dentro desta definição está a variação alélica e os peptídeos de outras espécies mostrando um tipo semelhante de actividade e tendo uma sequência relacionada. Também estão incluídas, se bem que menos preferidas, sequências animais.

Também descobrimos que a expressão de estromelisina-3 pode ser estimulada por exemplo por factores de crescimento e promotores de tumores. São exemplos típicos de tais factores EGF, FGF e PDGF é TPA. Assim, econjuntamente com os processos anteriores, a detecção de qualquer um destes factores numa amostra de tumor pode também ajudar a diagnosticar a condição metãstica de uma cancro.

Assim, o invento também proporciona o tratamento de um cancro metástico pela alteração da expressão do gene da estromelisina-3. Isto pode ser efectuado interferindo com o factor necessário para estimular a produção de estromelisina-3, como seja pelo direcionamento de anticorpos específicos contra o factor, anticorpos esses que podem ser ainda modificados para se conseguir o resultado pretendido. Pode também ser possível bloquear o receptor para o factor, algo que pode ser mais facilmente conseguido pela localização do agente de ligação necessário, o qual pode ser por exemplo um anticorpo ou peptídeo sintético.

Pode-se conseguir afectar a expressão do gene da estromelisina-3 mais directamente, como seja pelo bloqueio de um sítio, como seja o promotor no DNA genómico.

Sempre que o presente invento proporciona a administração por exemplo de anticorpos a um doente, então esta pode ser por qualquer via adequada. Se se pensa ou se diagnosticou que o tumor está localizado, então um método adequado pode ser por injecção directa no local. Se o alvo for o cancro da mama então pode ser suficiente uma injecção na mama ou usar um implante. Se se administrar por exemplo TIMPs então pode ser possível empregar um implante dérmico para administração prolongada.

Se o cancro for na faringe, então uma outra opção pode ser administração oral, por exemplo por meio de gargarejos.

Em qualquer um dos casos a administração pode ser também por injecção, incluindo injecções subcutâneas, intramusculares, intravenosas e intradêrmicas.

As formulações podem ser quaisquer que sejam adequadas à via de administração e serão aparentes para os familiarizados com a matéria. As formulações podem conter um veículo adequado, como seja soro fisiológico e pode também compreender agentes de enchimento, outras preparações medicinais, adjuvantes e quaisquer outros ingredientes farmacêuticos adequados.

Preparações adequadas podem também incluir vacinas compreendendo estromelisina-3 ou um seu peptídeo característico. Tais vacinas podem ser activas ou passivas, mas a passiva é geralmente preferida pois a expressão de estromelisina-3 ocorre no útero e a exposição indefinida a anticorpos anti-estromelisina-3 pode ter efeitos indesejáveis. No entanto a vacinação activa pode ser vantajosa, espeçialmente sempre que o doente tenha sofrido histerectomia, poie nenhuns tecidos expressarão normalmente a estromelisina-3. Outras vacinas adequadas incluem vírus recombinantes contendo uma sequência de nucleótidos codificadora de uma estromelisina-3 ou um seu peptídeo característico. Um desses vírus adequados é o vírus da vacina.

Os Exemplos que se seguem servem para ilustrar o presente invento e não se destinam a limitar de forma alguma o invento.

Clonagem de um cDNA especifico do cancro da mama

EXEMPLO 1

Construiu-se uma biblioteca de cDNA de cancro da mama no vector lambda gtlO usando RNA poli(A⁺) derivado de uma amostra retirada cirurgicamente (referido como tumor Cl) de um cancro primário da mama. 50000 placas foram diferencialmente despistadas usando sondas (+) e (-) correspondendo a cDNAs derivados de RNA poli(A⁺) Cl e dde RNA poli(A⁺) de um fibroadenoma da mama, (referido como Fl) respectivamente, sujeitos a transcrição reversa.

A Figura 1 mostra uma análise de transferências Northern do RNA total de carcinoma da mama Cl e de fibroadenoma Fl usando sondas de cDNA de quatro genes (A-D) apresentando níveis de expressão mais elevados no carcinoma do que no fibroadenoma. Cada uma das faixas continha 8 gg de RNA total. Os filtros foram sondados novamente usando a sonda 36B4 que corresponde a um gene expresso ubiquamente (Rio et al., Proc. Nat, Acad. Sei. USA) 84:9243-9247 (1987)).

Especificamente preparou-se RNA total (Chirgwin et al.. Biochemistrv 18:5294-5299 (1979)) derivado de espécies cirúrgicas guardadas em azoto líquido e seleccionou-se RNA poli(A⁺)por cromatografia em oligo(dT)-celulose. Construiu-se uma biblioteca de cDNA enriquecida em cancro da mama usando cDNA preparado a partir de carcinoma ductal, grau II, negativo para os receptores de oestrogénio (referido como Cl), no qual as células do estroma representavam aproximadamente 50% da população celular total.

Antes da clonagem, o cDNA de cadeia simples foi subtraído com um excesso de RNA poli(A ) derivado de fibroadenoma da mama (referido como Fl), e o material de cadeia simples enriquecido foi purificado por cromatografia em hidroxilapatite (Davis et al. , Proc. Nat. Acad. Sei. USA 83.:2194-2198 (1984) ; Rhyner et al.. Neuroscience Res. 16:167-181 (1986)).

cDNA enriquecido de cancro da mama foi tornado em cadeia dupla e clonado no sítio EcoRI do vector lambda gtlO. Obtiveram-se três milhões de fagos recombinantes e «50000 foram diferencialmente despistados usando filtros de nylon para as réplicas (Biodyne A, Pall Corporation) a partir das placas contendo «5000 clones de cDNA.

As sondas (+) e (-) foram feitas usando cDNA de cancro da mama Cl e cDNA de fibroadenoma da mama Fl, respectivamente.

Ambas as sondas foram subtraídas (Davis et al.. Proc. Nat. Acad.

Sei. USA 81:2194-2198 (1984); Rhyner et al.. Neuroscience Res.

16:167-181 (1986)) com um excesso de RNA de fígado humano total 32 antes da marcação com P usando síntese com iniciadores ao acaso.

As hibridações foram feitas durante dois dias em condiçõs restringentes (50% de formamida, 42°C) e a lavagem foi com 2xSSC, 0,1% SDS a 22°C, seguido de O,1%SSC, 0,l%SDS a 55°C. Seleccionaram-se 130 placas marcadas distintamente num segundo despiste.

As inserções de cDNA de cinco placas distintas escolhidas ao acaso foram purificadas por amplificação de PCR, marcadas com P e hibridadas com todas as identidades distintas para identificar' clones relacionados, este processo foi repetido várias vezes com placas distintas tiradas ao acaso, finalmente dando quatro genes referidos como A a D, os quais apresentaram níveis mais altos de expressão em carcinoma Cl do que em fibroadenoma Fl. As transferências Northern para o cancro da mama Cl e fibroadenoma da mama Fl foram preparadas usando RNA total (8 separado por electroforese em géis de 1% de agarose contendo formaldeído e transferido para filtros Hybond-N (Amersham).

As transferências foram coradas com azul de metileno antes da pré-hibridação para testar a integridade e quantidades de RNA transferido. A hibridação (18 h) e lavagem foram realizadas em condições convencionais, como descrito atrás,m usando . _ 32 inserções de cDNA marcadas com P correspondendo aos genes A-D.

Os genes A e B, os quais foram também expressos em colon normal (não apresentado) não foram mais examinados.

Ainda que expresso no colon (não apresentado), o gene C foi parciamente caracterizado devido ao seu elevado nível de expressão diferenciada (Fig.l). Ele foi também expresso numa variedade de linhas de células epiteliais transformadas e em pele humana normal (não apresentado). A sequenciação do cDNA de um clone c indicou que o correspondente gene pertence à superfamília de geens da queratina (dados não apresentados).

Finalmente o gene D (também referido aqui como gene da estromelisina-3)foi ainda estudado devido à sua marcada expressão diferencial entre carcinoma Cl e fibroadenoma Fl (Fig. 1) e também devido a não ser expresso em cólon humano normal e numa série de outros tecidos humanos (infra).

EXEMPLO 2

Secruenciação do Gene da Estromelisina-3 e da Proteína Codificada

Isolaram-se vários clones independentes a partir de uma biblioteca não subtraída de cDNA em lambda gtlO de cancro da mama Cl usando como sonda uma inserção de cDNA D e sequenciaram-se. A Figura 2 mostra a sequência de nucleótidos do cDNA D de tamanho completo e a correspondente sequência proteica.

A grelha de leitura aberta do cDNA, codificadora de uma proteína de 488 aminoácidos de comprimento é seguida de uma região 3' não traduzida de 714 bases contendo um sinal de adição de poli(A) situado 14 bases a montante do extremo 3' do RNA. Uma presumível metionina de iniciação está situada na posição de nucleótidos 10-12. Se bem que o correspondente AUG não esteja associado e localizado numa sequência de acordo com o motivo consensus Kozak, a tradução é provavelmente iniciada neste AUG, uma vez que a sequência imediatamente a montante corresponde à de um peptídeo líder hidrofóbico, uma característica inesperada (infra).

Na Figura 2, que mostra a sequência de nucleótidos do cDNA da estromelisina-3 e a sequência de aminoácidos deduzida, os resíduos de nucleótidos estão numerados na direcção 5' para 3' e os aminoácidos deduzidos na grelha de leitura aberta estão designados por códigos de uma só letra. Começando no extremo 5', as sequências de nucleótidos sublinhadas correspondem a: peptídeo sinal putativo (dois potenciais sítios de clivagem estão marcados com setas); a sequência PRCGVPD característica de prometaloprotei nases; os resíduos histidina conservados do domínio de ligação ao zinco (Matrisian, L.M. Trends in Genet. 6:21-125 (1990)), e a sequência sinal de adição de poli (A).

Especificamente, uma inserção de cDNA correspondendo â parte 3'do cDNA D [250 pb incluindo uma região poli(AT) de 19 pb] foi marcada ao acsaso com P por síntese com iniciação ao acaso e usada no despiste de uma biblioteca de cDNA não subtraída em lambda gtlO obtida a partir de RNA poli(A ) de tumor da mama Cl pelo método de Gubler e Hoffmann (Gene 25:262-269 (1983)).

Identificaram-se vários clones independentes e subclonaram-se no vector de sequenciação M13. A sequência de DNA foi determinada pelo método didesoxi usando Sequenase e o kit de reagentes deaza-dGTP da US Biochemical.A sequência foi analisada usando o software PC/GENE.

EXEMPLO 3

Estromelisina-3, uma metaloproteinase putativa

A Figura 3 mostra uma comparação das sequências de aminoácidos previstas das estromelisinas humanas e da colagenase tipo I.

(a) As sequências de aminoácidos foram alinhadas usando um programa de multialinhamento (Higgins et al.. Gene 73:237-244 (1988)). Os resíduos de aminoácidos idênticos nas quatro sequências estão marcadas por estrelas. As setas indicam sítios de clivagem do peptídeo sinal piutativo da estromelisina-3. As cabeças de setas apontam apontam para a clivagem que ocorre quando da activação da procolagenase tipo I e prostromelisinas. Os 10 resíduos de aminoácidos específicos da estromelisina-3 ao

nível do seu sítio de clivagem estão dentro de caixas. A sequência PRCGVPD e os resíduos conservados do omínio putativo de ligação ao zinco estão sublinhados.

(b) Esquerda, regiões de semelhança (em percentagem de identidade de aminoácidos) entre estromelisina-3, estromelisina-1 (ST1, Whitham et al. Biochem. J. 240:913-916 (1986)), estromelisina-2 (ST2, Muller et al.. Biochem. J. 253:187-192 (1988)) e a colagenase tipo I (COI, Whitham et al., et al.. Biochem. J. 240:913-916 (1986));

(b) Direita, regiões de semelhança entre ST1, ST2 e COI; P indica o peptídeo sinal e o pro-domínio; ENZ indica o domínio correspondente às enzimas activas maduras.

Assim, a comparação da sequência da proteína derivada com a biblioteca de dados Swissprot (saída 14) mostrou que a nova proteína pertence à família de metaloproteinases secretadas da matrix (MMPs) (Fig. 3a). Assim, a nova proteína possui um candidato a sequência líder N-terminal hidrofóbica (sublinhado na Fig. 2) e apresenta a sequência altamente conservada PRCGVPD (resíduos de aminoácidos 78-84), que é característico do prodomínio das MMPs, assim como tendo o sítio de ligação ao zinco das MMPs (resíduos de aminoácidos 212-225 - Fig. 3a) (Matrisianm, L.M., Trends Genet. 6:121-125 (1990)).

Por analogia com os outros membros da família, o aminoácido N-terminal da proteína madura provavelmente corresponde à fenilalanina 98 dapre-proproteína (Whitham et al. Biochem. J. 240:913-916 (1986)) (Fig. 3a). Após alinhamentos óptimos, a semelhança entre a proteína madura putativa é de 40% com estromelisina-1 (Whitham et al. Biochem. J. 240:913-916 (1986)), 38% com a estromelisina-2 (Muller et al.. Biochem. J. 253:187-192 (1988)) e 36% com a colagenase tipo I (Goldberg et al.. J. Biol. Chem» 261:6600-6605 (1986)) (Fig. 3b).

Desconhece-se a especificidade do substrato da nova proteína. Aqui é referida como estromelisina-3, se bem que a sua semelhança com a estromelisina-1 (40%) esteja claramente muito abaixo da existente entre a estromelisina-1 e a estromelisina-2 (79%) e mesmo mais baixo do que a semelhança existente entre a colagenase tipo I e a estromelisina-1 (53%) (Fig. 3b). Assim, se bem que a proteína seja uma MMP, a designação estromelisina” não é necessariamente estrictamente precisa mas é adequada.

Em adição, a montante da sequência PRCGVPD, não existe semelhança significativa entre estromelisina-3 e as outras MMPs com as quais foi comparada (Fig.3). No entanto, a estromelisina-3 tem uma sequência curta única (resíduos de aminoácidos 88-97) numa posição correspondendo substancialmente precisamente ao sítio de clivagem da proproteína da colagenase tipo I e das estromelisinas (Whitham et al. . supra). Ainda, a estromelisina-3, tal como acontece com a colagenase tipo e as outras estromelsinas caracteristicas, não apresenta o domínio tipo fibronectina característico das colagenases tipo I (Wilhelm et al., J. Biol. Chem. 264:17213-17221 (1989)).

EXEMPLO 4

Sobre-expressão em Carcinomas da Mama

 ocorrência de RNA transcritos de estromelisina-3 foi estudada em amostras retiradas de 30 carcinomas da mama e cinco fibroadenomas da mama.

A Figura 4 mostra as análises de transferências Northern de RNAs de metaloproteinases humanas em tumores da mama:

(a) RNA de estromelisina-3;

(b) RNA de colagenase tipo I (COI);

(c) RNA de colagenase tipo IV de 92-KD (COIV 92K);

(d) RNA de colagenase tipo IV de 72-KD (COIV 72K);

(e) RNAs de estromelisina-1 e -2 (ST1/2); e (f) RNA de bomba-1 (PUI).

Preparou-se RNA total a partir de quatro carcinomas da mama negativos para receptores de oestrogénio (Cl, grau II; C2, C3 e C4, grau III), seis carcinomas da mama positivos para o receptor de oestrogénio (C5, C8 e C9, grau II; C6 e C7 grau III; CIO, grau I) e quatro fibroadenomas da mama (F2-F5). Cada uma das faixas continha 8 yg de RNA. 0 sinal de 36B4 corresponde ao RNA de um gene testemunha (Fig. 1).

Especificamente, prepararam-se várias transferências Northern paralelamente com amostras de RNA idênticas, como para a Fig. 1, e hibridou-se com cada uma das sondas de cDNA que se seguem: (a) inserção de 1,6 Kb cobrindo a parte 3' do cDNA de estromelisina-3, (b) cDNA de COI, (e) cDNA de ST2 (que dá hibridação cruzada com RNA de STI), (f) cDNA de PUI (as sondas de COI, ST2 e PUI foram gentilmente cedidas por R. Breathnach, Muller et al.. Biochem. J. 253:187-192 (1988)) ou sondas de oligonucleótidos anticodão de SOmeros correspondendo a (c) COIV 92K (nucleótidos 2144-2223, Wilhelm et al.. Biol. Chem 2641:7213-17221 (1989)) e (d) COIV 72K (nucleótidos 1937-2016, Collier et al.. J. Biol. Chem. 263:6579-6587 (1988)).

As sondas de cDNA foram marcadas com P usando síntese

Q com iniciação ao acaso (« 5x10 cpm/^g) e os oligonucleótidos

Q foram marcados usando fosforilação dos extremos 5' «10 cpm//xg).

As hibridações foram realizadas em condições restringentes (42°C, 50% formamida) com « 10 cpm/ml. Os filtros foram então lavados em 2xSSC, 0,1% SDS, a 22°C, seguido de 0,lxSSC, 0,1% SDS a 55°C. A autorradiografia foi durante (a) , 18h, (to), 20h, (c), (d) e (e), 4 dias, (f), 2 dias, a -80°C com um ecran intensificador.

O mRNA de estromelisina-3 foi encontrado em todos os carcinomas da mama independentemente de serem positivos para o receptor de oestradiol (ER) (C5-C10) ou negativos (C1-C4) (Fig. 4a), mas não nas amostras de fibroadenoma, com uma excepção (F2) onde o nível de expressão foi semelhante ao nível mais baixo observado nos carcinomas da mama.

A ocorrência de transcritos de RNA dos outros membros da família de genes MMP foi também investigado nas mesmas amostras (Fig. 4b-f).Estes outros membros da família MMP podem ser claramente separados em duas classes, de acordo com o seu padrão de expressão em tumores da mama humanos. A primeira classe inclui colagenase tipo IV 72KD (COIV 72K, F-ig.· 4d) , estromelisina-1 e -2 (ST1/2, Fig.4e) e bomba-1 (PUI, Fig. 4f), todos esses genes foram expressos em tumores malignos e benignos. Pelo contrário, a segunda classe que inclui genes da estromelisina-3 (Fig. 4a), colagenase tipo I (COI, fig. 4b) e colagenase tipo IV 92KD (COIV 92K, Fig. 4c) apresentam sobre-expressão apenas em carcinomas da mama, se bem que apenas estromelisina-3 estivesse consistentemente associada a eles.

Os padrões de expressão não foram idênticos para os três genes da segunda classe. Os transcritos de RNA da colagenase tipo I não foram detectados nos carcinomas C5, C6, C7 e CIO e os transcritos de RNA da colagenase tipo IV 92KD não foram observados nas amostras C7 e CIO, mas os transcritos de RNA da estromelisina-3 foram claramente detectados em todos os tumores.

Assim, a estromelisina-3 parece ser diagnóstico de carcinomas invasivos da mama, enquanto que a colagenase tipo I e a colagenase tipo IV 92KD também pode estar especificamente envolvida na progressão do cancro da mama nalguns casos.

EXEMPLO 5

Expressão em Células de Várias Fontes >

A Figura 5 mostra análises de transferências northern do RNA de estromelisina-3 em várias linhas celulares e tecidos.

(a) Três nódulos linfáticos auxiliares normais e cinco metásticos de doentes com cancros da mama;

(b) quatro linhas celulares de cancro da mama negativas para receptores do oestrogénio (BT-20, MDA-231, SK-BR-3, HBL-100) e positivas para o receptor do oestrogénio (T-47D, BT-474,

ZR-75-1, MCF-7);

(c) 10 tecidos humanos normais;

(d) fibroblastos diplóides fetais humanos HFL-1 (ATCC CCL 153) cultivados em meio sem soro (1 e 2), na ausência (1) ou presença (2) de TPA (10 ng/ml) ou meio sem soro suplementado com 20 gg/ml de insulina (3 a 6) , na ausência (3) ou presença (4) de PDGF (20 ng/ml, British Biotechnology), (5) de EGF (20 ng/ml, Collaborative Research) ou (6) de bFGF (10 ng/ml, gentilmente cedido por Pettmann (FEBS Lett. 189:102-108 (1985))).

Em (a)_t cada uma das faixas continha 10 gg de RNA total com excepção das faixas 5 (2gg) e faixa 6 (20 gg). Em (b) e (c) cada uma das faixas continha 8 gg de RNA total e em (d) cada uma das faixas continha 5 gg de RNA citoplasmático.

Especificamente, em (a), (b) e (c) as transferências foram feitas e processadas como indicado na Fig. 4 para estromelisina-3. Em (d), fibroblastos HFL-1 confluentes foram mantidos em meio DMEM sem soro. Após 24 horas adicionou-se meio fresco e suplementou-se ou não com TPA ou factores de crescimento como indicado atrás. Após 24 horas de cultura, as células foram colhidas e preparado RNA citoplasmático (Gough, N.M., Analvt. Biochem. 173:93-95 (1988).

As transferências foram então preparadas e processadas como indicado na Figura 4 relativamente a estromelisina-3, mas a autorradiografia foi durante três dias.

Os transcritos de RNA da colagenase IV 92KD foram encontrados em 3 nódulos linfáticos normais e 5 de cancro da mama, enquanto que os transcritos de RNA de estromelisina-3 foram detectados apenas nos nódulos metásticos (Fig. 5a e dados não apresentados).

Ao contrário dos resultados obtidos com tumores primários malignos da mama e nódulos linfáticos metásticos, não se conseguiu detectar transcritos de RNA de estromelisina-3 em condições semelhantes em oito linhas celulares humanas de cancro da mama, independentemente do seu estado ER (Fig.5b). De forma semelhante, os transcritos de estromelisina-3 não foram detectados numa série de de tecidos humanos adultos normais (Fig.5c), com duas excepções notáveis, útero e placenta.

Estromelisina-3 não está aparentemente associada a todos os cancros e encontraram-se apenas níveis baixos de transcritos de RNA da estromelisina-3 em amostras de RNA derivadas de cancros do cólon, ovário, rim e pulmão. No entanto, níveis elevados de expressão, comparáveis aos encontrados em cancros da mama, foram observados em amostras de RNA de cancro da laringe (resultados não apresentados).

EXEMPLO 6

Expressão Específica em Células do Esrtroma de Tumores Invasivos

A expressão do gene da estromelisina-3 em carcinomas primitivos da mama, mas não numa série de linhas celulares estabelecidas de de cancro da mama, sugere que o gene foi expresso nas células do estroma envolvente do tumor, em vez das próprias células neoplãsicas.

Realizaram-se experiências de hibridação in situ usando 35 ribossonda anti-codão de estromelisina-3 marcada com [ S] usando secções de seis carcinomas (tumores Cl, C3, C5, C9, CIO, referido como na Figura 4 e o tumor Cll, um carcinoma positivo para ER não apresentado na Fig.4).

Especificamente, a hibridação in situ foi realizada como descrito por Cox et al. (dev. Biol. 101:485-502 (1984)).

Secções pesparafinadas e tratadas comácido (6 gm de espessura) foram tratadas com proteinase K e hibridadas durante a noite com . . _ 35 transcritos anti-codao marcados com [ S] derivados de uma inserção de cDNS de estromelisina-3 (467 pb estendendo-se desde os nucleótidos 1128 até 1594) subclonados em Bluescript II (Stratagene). A hibridação foi seguida de tratamento com RNase (20 Mg/ml, 30 min., 37°C e lavagem restringente (2xSSC, 50% formamida, 60°C, 2h), antes da autorradiografia usando a emulsão NTB2 (Kodak). A autorradiografia foi durante 15 dias. Não se observou marcação significativa acima do fundo em condições semelhantes usando uma ribossonda de codões (não apresentado).

A Figura 6 mostra a presença de transcritos de RNA da estromelisina-3em secções de carcinomas da mama e rebentamento dos membros nos embriões, a, c, e, g, ie k: campos claros de secções de tecido (xlOO) corado com heamatoxilina; b, d, f, h, j ei: as mesmas secções (ainda coradas com hematoxilina) após hibridação in situ com uma sonda de cRNA anti-codão da estromelisina-3 e imagens em campo escuro.

a e b, carcinoma da mama ductal grau II (tumor Cl, ver Fig.4): células de cancro infiltrantes (C) estão rodeadas por um estroma rico em células fusiformes (S); transcritos de RNA de estromelisina-3 são mais abundantes nas células do estroma que rodeiam imediatamente as células epiteliais neoplásicas. c e d, carcinoma ductal da mama grau III (tumor C3, ver fig.4): ilhas múltiplas de células de cancro da mama infiltrantes (C) estão rodeadas por células do estroma; a expressão do gene da estromelisina-3 é mais fraca na parte central da maior parte das trabécu las do estroma (S) i.e. na região que está mais longe das células neoplásicas. e e f: carcinoma ductal, (tumor C3, ver Fig.4) juntamente com dois lóbulos normais (N); trasncritos de RNA de estromelisina-3 foram detectados exclusivamente no estroma aposto âs células de cancro infiltrantes (C), com excepção de uma pequena ãrea rica em linfócitos (seta). g e h, carcinoma ductal (tumor CIO, ver Fig.4): transcritos de RNA da estromelisina-.3 foram detectados acima do fundo nas células de estroma rodeando as células de cancro da mama infiltrantes (canto superior, direito) mas não as células de cancro da mama in situ (estrela). i e j, carcinoma ductal (tumor Cll, positivo para ER, grau II, carcinoma); esquerda: carcinoma in situ (estrelas), não se detectou transcritos de RNA de estromelisina-3 em células de estroma; direita: células neoplásicas infiltrantes rodeadas por células do estroma expressando o gene da estromelisina-3. k e 1, região interdigital de um rebento de membros de embrião humano de oito semanas de idade: transcritos de RNA da estromelisina-3 foram detectados na mesoderme sobjacente à epiderme primitiva, mais abundantes na área interdigital (M) ; note-se que a epiderme primitiva (setas), a cartilagem em formação (PC) e a mesoderme circundante não estão marcadas.

Em todos os casos, os transcritos de RNA da estromelisina-3 foram detecatados apenas em células do estroma envolvendo as ilhs de células epiteliais malignas que formavam o componente invasivo dos tumores (Fig.6: painéis a e b, para o tumor Cl; painéis c, d, e f para o tumor C3; os painéis g e h para o tumor CIO; painéis i e j, direita , para o tumor Cll; e dados não apresentados para os tumores C5 e C9).

Nos nódulos linfáticos metásticos (mesma fonte de C5) a expressão do gene da estromelisina-3 foi também restringida às células do estroma envolvendo as células epiteliais metáticas (dados não apresentados).

É particularmente notável que, em todos os casos as próprias células epiteliais malignas não foram marcadas e que os níveis mais altos de expressão foram observados nas células do estroma em aposição às células malignas. Pelo contrário, não se detectou expressão significativa nas células do estroma envolvendo as lesões de carcinoma in situ ainda envolvidas por uma membrana de pavimentação (painéis g e h para o tumor CIO; painéis i e j, lado esquerdo, para o tumor Gll), enquanto que a marcação das células do estroma pode ser claramente observada no componente invasivo dos mesmos tumores (painméis g e h para o tumor CIO; painéis i e j, direita para o tumor Cll).

Também, não se detectou expressão significativa em células do estroma situadas a uma distância das células cancerosas nem nas células do estroma envolvendo canais e canalículos normais (e.g. painéis e e f). Não se detectaram foci discretos de transcritos da estromelisina-3 em secções do fibroadenoma F2 fracamente positivo para RNA da estromelisina-3 em transferências Northern (Fig.4a e não apresentado).

Sabe-se que tanto os fibroblastos como os miofibroblastos estão presentes no estroma de carcinomas invasivos da mama (Ahmed, A., Pathol. Annu. 25 (Pf2):237-286 (1990)). Usando a nossa técnica de hibridação in situ, não foi possível determinar se apenas um ou ambos os tipos celulares expressaram o gene da estromelisina-3.

EXEMPLO 7

Estimulação por Factores de Crescimento

Os resultados acima indicam que a expressão do gene da estromelisina-3 em células do estroma é provavelmente induzido por um factor difundivel secretado pelas células neoplãsicas. Sabe-se que factores de crescimento tais como EGF, FGF e PDGF, assim como algumas citocinas (IL-Ία, β e TNF-α) e promotores de tumores (e.g. TPA) activam a transcrição de genes MMP (Kerr et al.. Science 242:1424-1247 (1988)). Foi também descrito que as células tumorais de várias fontes produzem um ou mais factores que estimulam a produção de colagenase I por fibroblastos humanos (Lippman et al. Recent Prog. Hormone Res. 45:383-440 (1990)). Sabe-se que as actividade de PDGF, FGF e TGF-α são secretadas por células de cancro da mama in vitro (Salomon et al.. em Breast

câncer: cellular and molecular bioloqy (eds., Lippman, M.E. e Dickson, R.B.), pp. 363-389 (Kluwer, Boston, (1988)).

Para investigar se a expressão do gene da estromelisina-3 pode ser modulada por estímulos exógenos, fibroblastos diplóides fetais humanos foram cultivados na ausência ou presença de PDGF, bFGF e EGF e também do TPA promotor de tumores. A adição de qualquer um destes factores resultou num aumento dos transcritos de RNA de estromelisina-3 nos fibroblastos, a estimulação mais forte sendo observada com bFGF (Fig.5d).

EXEMPLO 8

Expressão de Estromelisina-3 no Embrião

Uma vez que o gene da estromelisina-3 foi expresso em resposta à estimulação por factores de crescimento em fibroblastos fetais, investigámos se o gene é normalmente expresso durante o desenvolvimento embrionário.

Os transcritos de estromelisina-3 foram detectados em várias regiões discretas de um embrião de 8 semanas de idade, notavelmente na região interdigital dos rebentos de membros (Fig. 6, painéis k e 1, e resultados não apresentados), uma área que se sabe estar associada a morte celular programada nesta fase da embriogénese (Milaire, J., Orqanoqenesis (eds., De Haan, R.L. e Ursprung, H.), pp.283-300 (Holt, Rinehart e Winston, New York, 1965)) .

A marcação foi observada na mesoderme embrionária sobjacente à epiderme primitiva que permaneceu não marcada. É notável que as células do mesênquima situadas a uma distância do epiblasto eram também mRNA-negativas.

Assim, o facto do gene da estromelisina-3 ser expresso apenas durante o desenvolvimento embrionário numa área onde a remodelação de tecido está bem documentada sugere que a expressão da estromelisina-3 em tumores da mama desempenha um papel na processos de remodelação ECM associados à progressão do cancro.

EXEMPLO 9

Clonaqem de cDNA de Murganho Codificador de ST3

Uma sonda contendo cDNA humano codificador de ST3 foi usado para fazer o despiste de uma biblioteca de cDNA de placenta de murganho usando processos convencionais (Sambrook et al., Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Press (1989)). 0 despiste resultou na obtenção de um cDNA de murganho de tamanho completo codificador de ST3 (Pigura 7).

Uma análise das duas sequências revelou uma homologia de 89% na sequência de aminoácidos da forma madura de ST3 e aproximadamente uma homologia de 55% nos pre e prodomínios (Figura 7).

padrão de expressão em várias células de murganho foi determinado usando métodos descritos nos exemplos 4-8.

Encontrou-se que o padrão da expressão de ST3 em murganho é idêntico relativamente â especificidade de tecido ao

encontrado no tecido humano. 0 nível mais elevado de expressão foi encontrado em tecido de placenta e de útero.

Claims (1)

1. Reivindicações:

   13. - Método de diagnóstico de um tumor maligno, caracterizado por compreender a detecção de estromelisina-3 ou de uma sequência codificadora de estromelisina-3 numa amostra biológica, in vivo ou in vitro.

   23. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o tumor maligno ser seleccionado de entre o grupo constituído por cancro da mama ou da faringe e carcinomas da cabeça, pescoço e pele.

   33. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender a detecção de estromelisina-3, em que um anticorpo ou equivalente de anticorpo, específico para a estromelisina-3 é colocado em contacto com a amostra ou uma preparação dela e ensaio da ligação.

   43. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o anticorpo ou equivalente do anticorpo estar marcado.

   53. - Anticorpo ou equivalentes de anticorpo, caracterizado por serem como definido na reivindicação 3 ou 4.

   63. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a sequência de nucleótidos ser detectada por meio de uma sonda de nucleótidos e ensaio da hibridação.

   73. - Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a sonda ou a sua cadeia irmã codificar uma parte característica ou toda a estromelisina-3.

   83. - Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a sonda ou a sua cadeia irmã não codificar os prepeptídeos ou propeptídeos da estromelisina-3.

   93. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado por a sonda ou a sua cadeia irmã, ter uma parte ou toda a sequência de cDNA codificadora da estromelisina-3 ou sequência correspondente pela degenerescência do código genético ou hibridar com ela nas condições do ensaio.

   103. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado por a sonda estar marcada radioactivamente .

   113. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado por a sonda ser uma ribo-sonda.

   123. - Peptídeo sintético ou expresso, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos correspondendo a uma parte característica ou a toda a sequência de cDNA codificadora da prepro-estromelisina-3, ou um seu mutante, variante ou fragmento, incluindo uma sequência animal correspondendo à referida sequência de aminoácidos.

   133. - Peptídeo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a referida sequência de aminoácidos ser seleccionada de entre o grupo constituído por prepro-estromelisina-3 de ratinho e humana.

   143. - Peptídeo de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado por o referido fragmento ser pro-estromelisina-3.

   15â. - Peptídeo de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado por o referido fragmento ser estromelisina-3 madura.

   163. - sequência de cDNA, caracterizado por ser codificadora de um peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-15.

   173. - Vector, caracterizado por compreender uma sequência de acordo com a reivindicação 16.

   183. - Sistema de expressão para a produção de um peptídeo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender uma célula hospedeira adequada e um vector de acordo com a reivindicação 17, em que o vector é um vector de expressão.

   193. - Método para a produção de um peptídeo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender a utilização de um sistema de expressão de acordo com a reivindicação 18 e isolamento do péptido pretendido.

   I

   203. - utilização de um agente capaz de afectar a expressão do gene da estromelisina-3 ou de afectar a actividade estromelisina-3, caracterizada por o referido agente ser empregado na produção de um medicamento para o tratamento ou profiláxia de um cancro que dê metástases, especiàlmente cancro da mama ou da faringe e carcinomas da cabeça, pescoço e pele.

   213. - Utilização de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o cancro ser cancro da mama.

   -X .:

   22â. - utilização de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado por o agente ser um anticorpo ou equivalente do anticorpo, específico da estromelisina-3.

   23a. - Utilização de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o anticorpo ou equivalente do anticorpo, ser portador de uma marca tóxica.

   24S. - Utilização de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a marca ser um isótopo radioactivo.

   25â. - utilização de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado por o agente ser um tecido ou outro inibidor, de preferência sintético, de metaloproteinases específico de estromelisina-3.

   26ã. - Utilização de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado por o agente alterar a actividade da estromelisina-3 .

   27ã, - Utilização de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado por o agente evitar a expressão do gene da estromelisina-3.

   28â. - utilização de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado por o agente evitar a maturação da preproproteína para dar estromelisina-3.

   29â. - Agente, caracterizado por ser como definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 28 para usar em terapia, especialmente na terapia do cancro.

   303. - Vacina, caracterizada por compreender um peptídeo de acordo com a reivindicação 12 ou um vírus contendo uma sequência de nucleótidos codificadora de tal peptídeo, juntamente com um veículo adequado.