METODO Y COMPOSICION NOVEDOSOS PARA LA INHIBICION DE ANGIOGENESIS Y CRECIMIENTO TUMORAL USANDO COMPUESTOS BASADOS
EN UNA SECUENCIA DENTRO DE MPM-2 APOYO DEL GOBIERNO Esta invención se hizo con apoyo del gobierno bajo el contrato No. R29CA74132-01 por el Instituto Nacional de Cáncer. CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona generalmente con el campo de medicina, y se relaciona específicamente con métodos y composiciones para inhibir el crecimiento tumoral y angiogénesis en un tejido o detectar angiogénesis y crecimiento tumoral usando compuestos basados en una secuencia especifica encontrada dentro de MMP-2. ANTECEDENTES La angiogénesis es el proceso fundamental mediante el cual nuevos vasos sanguíneos son formados y es esencial para una variedad de actividades del cuerpo normal (tal como reproducción, desarrollo y sanación de heridas) . Aunque el proceso no es completamente entendido, se cree que involucra un interacción compleja de moléculas que tanto estimulan como inhiben el crecimiento de células endoteliales, las células primarias de los vasos sanguíneos capilares- Bajo condiciones normales, estas moléculas aparecen para mantener la microvasculatura en un estado quiescente (es decir, uno de no crecimiento capilar) durante periodos prolongados que pueden durar tanto como semanas o en algunos casos, décadas. Cuando es necesario, sin embargo (tal como durante la sanación de heridas) estas mismas células pueden someterse a la proliferación y productividad rápida dentro de un periodo de 5 dias (Folkman, J. y Shing, Y-, The Journal of Biological Che istry, 267 {16): 10931-10934, y Folkman, J. y Klagsbrun, M., Science, 235:442-447 (1987)). Aunque la angiogénesis es un proceso altamente regulado bajo condiciones normales, muchas enfermedades (caracterizadas como "enfermedades angiogénicas" ) son impulsadas por la angiogénesis no regulada persistente. Mencionado de otra manera, la angiogénesis no regulada puede causar ya sea una enfermedad particular directamente o exacerbar una condición patológica existente. Por ejemplo, la neovascularización ocular se ha implicado como la causa más común de ceguera y predomina sobre aproximadamente 20 enfermedades del ojo. En ciertas condiciones existentes tales como artritis, vasos sanguíneos capilares recién formados invaden las articulaciones y destruyen «1 cartílago. En diabetes, nuevos capilares formados en la retina invaden el humor vitreo, sangran y ocasionan ceguera. El crecimiento y la metástasis de tumores sólidos también son dependientes de la angiogénesis (Folkman, J., Cáncer Research, 46:467-473 (1986), .Folkman, J., Journal of the National Cáncer Institute, 82:4-6 (1989)}. Se ha mostrado, por ejemplo, que los tumores que se agrandan a mayor que 2 mm, deben obtener su propio suministro de sangre y lo hacen al inducir el crecimiento de nuevos vasos sanguineos capilares . Una vez que estos nuevos vasos sanguineos llegan a ser incrustados en el tumor, ellos proporcionan un medio para que las células del tumor entren a la circulación y se extiendan por metástasis a sitios distantes, tal como el hígado, pulmón o hueso (Weidner, N. , y colaboradores, The New England Jounal of Medicine, 324 (1) :l-8 (1991) ) . Debido a que el crecimiento tumoral y la metástasis impactan un gran número de gentes cada año (es estimado que muy por arriba de 600, 000 nuevos casos de cáncer serán diagnosticados en el año entrante en los Estados Unidos solamente. Varner, J.A., Brooks, P.C., y Cheresh, D.A. (1995) Cell Adh. Cowa n. 3,367-374) , las composiciones y métodos de tratamiento para tratar estas enfermedades tienen gran utilidad- A partir de lo anterior es claro que el bloqueo de la angiogénesis puede ser eficaz en hacer lento el crecimiento tumoral y tratar otras diversas enfermedades. De hecho, hay amplia evidencia que apoya el argumento de que el bloqueo de la neovascularización tumoral pu3de inhibir el crecimiento tumoral en varios modelos de animales, y datos clínicos humanos están comenzando apoyar este argumento también (Varner, J.A. , Brooks, P.C. y Cheresh, D.A. (1995) Cell Adh. Commun. 3, 367-374) . Aunque varios inhibidores de angiogénesis están actualmente bajo desarrollo para el uso en l tratamiento de enfermedades angiogénicas (Gasparini, G y Ha ris, A.L., J Clin Oncol 13 (3) :765-782, (1995)), existen desventajas asociadas con varios de estos compuestos. Por ejemplo, suramin es un potente inhibidor de angiogénesis, pero ocasiona (a dosis requeridas para alcanzar la actividad antitumoral) severa toxicidad sistémica en humanos. Otros compuestos, tales como retinoides, Ínterferonas y antiestrógenos son seguros para el uso humano pero tienen solamente un débil efecto antiangiogénico. Todavia otros compuestos pueden ser difíciles o- costosos de preparar. De manera similar, aunque muchos investigadores se han enfocado a los factores de crecimiento y las citocinas que inician la angiogénesis (Varner y colaboradores 1995; Blood y Zetter 1990; Weidrier y colaboradores 1992; Weidner y colaboradores 1992; Brooks y colaboradores 1995; Brooks y colaboradores 1994; Brooks y colaboradores 1997), existe una redundancia en el número de distintos factores de crecimiento y citocinas que tienen capacidad para estimular la * angiogénesis. Por lo tanto, el beneficio terapéutico del bloqueo de una sola citocina puede tener sólo beneficio limitado debido a esta redundancia . Por consiguiente, lo que se necesita es la invención de otros objetivos antiangiogénicos y métodos para inhibir la angiogénesis . Los péptidos cortos son relativamente simples de hacer y representan un método efectivo en costo para tratar estados de enfermedad en los cuales la angiogénesis desempeña una función y en diseñar inhibidores dirigidos de angiogénesis. BREVE DESCRIPCION La presente invención proporciona métodos y composiciones para inhibir la angiogénesis y el crecimiento tumoral utilizando metaloproteinasas de matriz (MMP) que desempeñan una función en la reconstrucción proteolitica de la matriz extracelular (EC ) . Específicamente, la presente invención proporciona una composición y métodos novedosos para inhibir la angiogénesis basada en un fragmento de MMP-2. Un aspecto particular de la invención proporciona composiciones para inhibir la angiogénesis que comprende un péptido que contiene una secuencia de aminoácidos especifica de MMP-2. En su modalidad principal, la presente invención proporciona un péptido, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: SEQ.ID-NO. : 1 - Ile-Phe-Ala-Gly-Asp-Lys-Phe-Trp-Arg Alternativamente, la secuencia anterior puede ser flanqueada por otros aminoácidos. Por ejemplo, la secuencia de 9 aminoácidos puede ser flanqueada por residuos de cisteina en las terminaciones amino y carboxi como se muestra enseguida: SEQ. ID. NO.: 2 - Cys-Ile-Phe-Ala-Gly-Asp-Lys-Phe-Trp-Arg-Cys Adicionalmente, la invención proporciona composiciones para inhibir la angiogénesis o crecimiento tumoral, que comprenden miméticos orgánicos y no peptidicos basados en la secuencia de aminoácidos anterior asi como secuencias optimizadas que flanquean la región de MMP-2 dentro de la cual se encuentra la secuencia. Otro aspecto de esta invención proporciona composiciones para inhibir la angiogénesis que comprenden agonistas de un sitio definido por una secuencia de aminoácidos especifica de MMP-2. Además, la invención proporciona antagonistas para inhibir la angiogénesis dirigida específicamente a un sitio especifico dentro de MMP— 2. Tales antagonistas pueden incluir miméticos orgánicos y péptidicos o no peptidicos del epitope. Todavía en otra modalidad, la presente invención proporciona una composición para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de cáncer, artritis, psoriasis, angiogénesis del ojo asociada con infección o la intervención quirúrgica, degeneración macular y retinopatia diabética que comprende un péptido como se define en lo anterior en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Todavía otro aspecto de la invención implica métodos para inhibir la angiogénesis que comprenden poner en contacto un tejido con las composiciones ¿interiores. El tejido a ser tratado puede ser cualquier tejido en el cual es deseable la inhibición de la angiogénesis, tal como un tejido enfermo donde está ocurriendo neovascularización. Tejidos ejemplares incluyen tejido inflamado, tumores sólidos, metástasis, tejidos sometidos a restenosis y similares . La invención también proporciona un método de tratamiento para una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de cáncer, artritis, degeneración macular y retinopatia diabética que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido como se define en lo anterior . También se proporcionan métodos para detectar angiogénesis, tejido tumoroso, metástasis e invasión de tumor en un tejido al poner en contacto una coirposición de la invención con un tejido. La invención también proporcionéi métodos para detectar composiciones de la invención. Por toda la especificación de patente, 1. SEQ.ID.NO. :1 es la siguiente secuencia: Ile-Phe-Ala-Gly-Asp-Lys-Phe-Trp-Arg 2. Pextatin o SEQ.ID.NO.:2 se refiere a un péptido, que tiene la secuencia: Cys-Ile-Phe-Ala-Gly-Asp-Lys-Phe-Trp-Arg-Cys -BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 muestra los efectos de la administración sistémica de Pexstatin en el crecimiento del tumor de melanoma en el embrión de pollo. La FIGURA 2 muestra los efectos de la administración sistémica de Pexstatin en el crecimiento del tumor de melanoma en ratones desnudos . La FIGURA 3 muestra los efectos de la administración sistémica de Pexstatin en la angiogénesis in vivo. La FIGURA 4 es un diagrama de barras del Índice de angiogénesis para experimentos que examinaron los efectos de la administración sistémica de Pexstatin en la angiogénesis ín vivo. La FIGURA 5 muestra los efectos de Pexstatin en la metástasis del tumor de melanoma' B16 in vivo. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En el estado fisiológico, la síntesis de tejidos conectivos está en equilibrio dinámico con la degradación de la matriz extracelular . Esa degradación es debido, en parte, a las metaloproteasas de matriz, una familxa de proteasas (enzimas) implicadas en la degradación y reconstrucción de los tejidos conectivos. Los miembros de esta familia de enzimas de endopeptidasa son secretados como proenzimas de varios tipos de células que residen en o están asociados con el tejido conectivo, tales como fibroblastos, monocitos, macrófagos, células endoteliales y células de tumor invasivas o metastáticas . La expresión de MMP es estimulada por los factores de crecimiento y las citocinas en el medio ambiente del tejido local, donde estas enzimas actúan para degradar específicamente los componentes de proteíria de la matriz extraceluiar, tal como colágeno, proteoglicanos (núcleo de proteínas), fibronectina y laminina. Estos componentes de matriz extraceluiar ubicuos están presentes en los revestimientos de las articulaciones, tejidos conectivos intersticiales, membranas de basamento y cartílago. Las MMPs comparten un número de propiedades, incluyéndose la dependencia al zinc y al calcio, secreción como cimógenos, y 40-50% de homología de secuencia de aminoácidos. La degradación excesiva de la matriz extraceluiar por las MMPs está implicada en la patogénesis de muchas enfermedades de naturaleza tanto crónica como aguda. Por ejemplo, numerosos estudios, como es revisado en Exp. Opin. Invest. Drugs, 5, 323-335, (1996), han establecido que la expresión y la activación de las MMPs son eventos críticos en el crecimiento del tumor, la invasión y la metástasis. Además, la actividad de la MMP se ha encontrado que es requerida para la angiogénesis, que es necesaria para el crecimiento del tumor así como para otras condiciones patológicas . tal como la degeneración macular.
Los miembros de esta familia de enzimas incluyen, pero no están limitados a, colagenasas (MMP-1), gelatinasas o colagenasas de tipo IV (MMP-2, MMP-9), matrilisina (MMP-7, PUMP-1), y estromelisinas (MMP-3) . De interés particular aquí es la gelatinasa MMP-2. Definiciones El término "alquilo" se refiere a un grupo monovalente derivado de un hidrocarburo saturado de cadena recta o ramificada mediante la remoción de un solo átomo de hidrógeno. Los grupos alquilo son ejemplificados por metilo, etilo, n- e iso-propilo, n-, sec-, iso- y ter-butilo, y similares. El término "grupo N-protector" como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo fácilmente removible que es conocido en la técnica para proteger un grupo amino contra la reacción indeseable durante los procedimientos de síntesis y que es selectivamente removible. El uso de grupos N-protectores es bien conocido en la técnica para proteger grupos contra reacciones indeseables durante un procedimiento de síntesis y muchos de tales grupos protectores son conocidos, ver, por ejemplo, T.H. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd edition, John Wiley & Sons, New York (1991) . Ejemplos de grupos N-protectores incluyen, pero no están limitados a, grupos acilo que incluyen acetilo, trifluoroacetilo, acilisotiocianato, aminocaproilo, benzoílo y similares, y grupos aciloxi, incluyéndose t-butiloxicarbonilo (BOC) y carbobenciloxi y similares . Por "sal farmacéuticamente aceptable" se proponen aquellas sales que son, dentro del alcance del juicio médico sondeado, adecuadas para el uso en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y similares, y están proporcionadas con una relación de beneficio/riesgo razonable. Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S.M. Berge y colaboradores describen sales farmacéuticamente aceptables en detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66:1-19. Las sales pueden ser preparadas ín situ durante el aislamiento y la purificación final de los compuestos de la invención, o por separado al hacer reaccionar la función de base libre con un ácido orgánico adecuado. Las sales de adición de ácido representativos incluyen acetato, adipaco, alginato, ascorbato, aspartato, bencensulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canfersulfonato, citrato, ciclopentanopropionato> digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptonato, hexanoato, bromhidratD, clorhidrato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactibionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, oieato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropioanato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartratc,. tiocianato, toluensulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales de metal alcalino o metal alealinotérreo representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, asi como cationes no tóxicos de amonio, amonio cuaternario y amina, incluyéndose, pero no limitados a, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares - Como utiliza en la presente, el término "éster farmacéuticamente aceptable" se refiere a ésteres que se hidrolizan in vivo e incluyen aquellos que se descomponen fácilmente en el cuerpo humano para dejar el compuesto afin o una sal del mismo. Los grupos de éster adecuados incluyen, por ejemplo, aquellos derivados de ácidos carboxilicqs alifáticos farmacéuticamente aceptables, particularmente ácidos alcanoicos, alquenoicos, cic oalcanoicos y alcanodioicos, en los cuales cada porción de alquilo o alquenilo ventajosamente, tienen no más de 6 átomos de carbono. Ejemplos de ésteres particulares incluyen formiatos, acetatos, propionatos, butiratos, acrilatos y tilsuccinatos . A menos que se indique de otra manera por un prefijo -"D", la estereoquímica del I-carbono de los aminoácidos y los residuos de aminoacilo en los péptidos descritos en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas en la configuración natural o "L" . Las designaciones "R" y "S" de Cahn-Ingold-Prelog son utilizadas para especificar la estereoquímica de centros quirales en ciertos de los sustituyentes de acilo del N-terminal de los péptidos de esta invención.. La designación "R, S" se propone para indicar una mezcla racémica de las dos formas enantioméricas . Esta nomenclatura sigue aquella descrita en R.S. Cahn y colaboradores, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 5,385-415(1966). Para la mayor parte, los nombres en los residuos de aminoacilo que surgen de manera natural y que surgen de manera no natural, utilizados en la presente, siguen las convenciones de nombre sugeridas por la Comisión sobre la Nomenclatura de Química . Orgánica de IUPAC y la,Comisión sobre Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB como es expuesta en "Nomenclature of 1-Amino Acids ( ecomendations, 1974)" Bioche istry, 14(2), (1975). Al grado de que los nombres y las abreviaciones de aminoácidos y residuos de aminoacilo empleados en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas difieren de esas sugerencias, ellos serán puestos en claro para el lector mediante lo siguiente. Es bien conocido en la técnica, que se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de un polipéptido sin alterar sustancialmente la función biológica de ese péptido. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en un polipéptido dado sin ninguna pérdida apreciable de la función, ftl hacer tales cambios, las sustituciones de residuos de aminoácidos similares se pueden hacer en la base de la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral, por ejemplo, su tamaño, ~ carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad y similares . Como es detallado en la patente norteamericana No, 4,554,101/ incorporada en la presente por referencia, los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a los residuos de aminoácido: Arg (+3.0); Lys (+3.0); Asp (+3.0); Glu (+3.0); Ser (+3.0); Asn (+0.2); Gln (+0.2); Gly (0); Pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8), lie (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); y Trp (-3.4). Se entiende que un residuo de aminoácido puede ser sustituido por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar (por ejemplo, dentro de un valor de mas o menos de 2.0) y aun obtener un polipéptido biológicamente equivalente. De una manera similar, se pueden hacer sustituciones en la base de la similitud en el Índice hidropático. Cada residuo de aminoácido se ha asignado con un índice hidropático en la base de su hidrofobicidad y características de carga. Estos valores de índice hidropático son: lie (+4.5); Val (+4.2); Leu (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9) y Arg (-4.5). Al hacer una sustitución basada en el índice hidropático, se prefiere un valor dentro de más o menos 2.0. COMPUESTOS DS LA INVENCION: PEPTIDOS De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que una región especifica de la metaloproteínasa-2 de matriz (MMP-2) definida por las posiciones de aminoácidos 582-590 potentemente inhibe la angiogénesis y el crecimiento tumoral. Basado en el descubrimiento anterior, la invención proporciona un péptido novedoso con la SEQ ID NO:l y un péptido de once aminoácidos novedoso, Pexstatin, con la SEQ ID NO:2 para inhibir la angiogénesis y el crecimiento tumoral. Como los ejemplos después demuestran, estos péptidos potentemente inhiben la angiogénesis y el crecimiento tumoral in vivo. Así, los compuestos de la invención, incluyéndose, pero no limitados a aquellos especificados en los ejemplos, poseen actividad antiangiogénicá. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser sintetizados mediante cualquiera de las técnicas que son conocidas para aquellos expertos en la técnica. Para la síntesis de péptido en fase sólida, un resumen de las muchas técnicas puede ser encontrado en J.M. Stewart>y D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 y J. Meinhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1973. Para la síntesis en solución clásica ver G. Schroder y K. Lupke, The Peptides, vol. 1, Academic Press (New York), 1965. En general, estos métodos comprenden la adición secuencial de uno o más aminoácidos o aminoácidos adecuadamente protegidos a una cadena de péptido en crecimiento. Normalmente, ya sea el grupo amino o carboxilo del primer aminoácido es protegido por un grupo protector adecuado. El aminoácido protegido o derivado puede ser ya sea unido a u soporte sólido inerte o utilizado en solución al adicionar el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido, bajo condiciones adecuadas para formar el enlace de amida. El grupo protector luego es removido de este residuo de aminoácido recientemente adicionado y el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido) luego es adicionado y asi sucesivamente. Después de que todos los aminoácidos deseados se han enlazado' en la secuencia apropiada, cualquiera de los grupos protectores restantes (y cualquier soporte sólido) son' removidos secuencialmente o concurrentemente, para dar el polipéptido final. Mediante la modificación simple de este procedimiento general, es posible adicionar más de un aminoácido a la vez a una cadena en crecimiento, por ejemplo al acoplar (bajo condiciones que no racemizan centros quirales) un tripéptido protegido con un dipéptido apropiadamente protegido para formar,, después de la desprotección, un pentapéptido. Un método para preparar compuestos de la presente invención implica la síntesis de péptido en fase sólida. En este método, la función alfa-amino es protegida por un grupo sensible al ácido o a la base. Tales grupos protectores pueden tener las propiedades de ser ' estables a las condiciones de la formación de enlace de péptido, mientras que son fácilmente removibles sin destrucción de la cadena de péptido de crecimiento o la racemización de cualquiera de los centros quirales contenidos en la misma. Los grupos protectores adecuados son 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), t-butiloxicarbonilo (Boc) , benciloxicarbonilo (Cbz), bifenilisopropiloxicarbonilo, t-amiloxicarbonilo, isobor-niloxicarbonilo, (I/D dimetil-3, 5-dirietoxibenciloxi-carbonilo, o-nitrofenilsulfenilo, 2-ciano-t-butiloxicarbonilo y similares. El grupo protector 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) es preferido. Los grupos protectores de cadena lateral particularmente preferidos son, para grupos amino de cadena lateral como lisina y arginina: 2, 2, 5, 7, 8-pentametilcroman-6-sulfonilo (pmc), nitro, p-toluensulfonilo, 4-metoxiberícensulfonilo, CBZ, Boc y adamantiloxicarbonilo; para tirosina: bencilo, o-bromobenciloxicarbonilo, 2,6-diclorobencilo/ isopropilo, t-butiio (t-Bu) , ciclohexilo, ciclofenilo y acetilo (Ac) ; para serina: t-butilo, bencilo y tetrahidropirañilo; para histidina: tritilo, .bencilo, Cbz, p-toluensulfonilo y 2 , -dinitrofenilo; para triptofano: formilo. En el método de síntesis de péptido en fase sólida el aminoácido C-terminal es unido a un soporte sólido o resina adecuada- Los soportes sólidos adecuados útiles para la síntesis anterior son aquellos materiales que- son inertes a los reactivos y las condiciones de reacción de las reacciones de condensación-desprotección escalonada, así como insolubles en el medio utilizado. El soporte sólido preferido para la síntesis de péptido de carboxi C-terminal es 4-hidroximetilfenoximetil-copoli (estireno-1% divinilbenceno) . El soporte sólido preferido para los péptidos de amida C-terminal es la resina 4- (2' , ' -dimetoxifenil-Fmoc-aminometil) fenoxiacetamidoetilo disponible de Applied Biosystems. El aminoácido C-terminal es acoplado a la resina por medio de N, N' -diciclohexilcarbodiimida (DCC), ?,?'-disopropilcarbodiimida (DIC) u O-benzotriazol-l-il-N, N, N' , N' -tetrametiluroniohexafluorofosfato (HBTU) , con o sin 4-dimetilaminopiridina (DMAP) , 1-hidroxibenzotriazol (HOBT), benzotriazol-l-iloxi-tris (dimetilamino) fosfoniohexafluoro-fosfato (BOP) o cloruro de bis (2-oxo-3-oxazolidinil) fosfina (BOPCl), acoplamiento mediado por aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas a una temperatura de entre 100 y 50°C en un solvente tal como diclorometano o DMF. Cuando el soporte sólido es la resina 4- (2' , 4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil) fenoxiacetamidoetilo, el grupo Fmoc es segmentado con una amina secundaria, de preferencia piperidina, antes del acopiamiento con el aminoácido C-terminal como es descrito en lo anterior. El método preferido para el acoplamiento a la resina de 4- (2' , 4' -dimetoxifenil-Fmoc-aminometil) fenoxiacetamidoetilo desprotegido es o-benzotriazol-l-il-N, , N' , N' -tetrametiluroniohexafluorofosfato (HBTU, 1 equivalente) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, 1 equivalente) en DMF. El acoplamiento de aminoácidos protegidos sucesivos se puede llevar a cabo en un sintetizador de polipéptido automático como es bien conocido en la técnica. En una modalidad, la función a-amino en los aminoácidos de la cadena de péptido en crecimiento es protegida con Emoc. La remoción del grupo protector Emoc del N-terminal lateral del péptido en crecimiento es llevada a cabo mediante el tratamiento con una amina secundaria, de preferencia piperidina. Cada aminoácido protegido luego es introducido en un exceso molar de aproximadamente 3 veces y el acoplamiento es de preferencia llevada a cabo en DMF. El agente de acoplamiento es normalmente O-benzotriazol-l-il-N, ?,?' ,N-tetrametiluronio-hexafluorofosfato (HBTU, 1 equivalente) y 1-hidroxi-benzotriazol (HOBT, 1 equivalente) . ¦ Al final de la síntesis en fase sólida, el polipéptido es removido de la resina y desprotegido, ya sea sucesivamente o en una sola operación. La remoción del polipéptido y la desprotección se puede realizar en una sola operación al tratar el polipéptido enlazado a la resina, con un reactivo de segmentación, por ejemplo tianisol, agua, etanoditiol y ácido trifluoroacético. En casos en donde el C-terminal del polipéptido es un alquilamida, la resina es segmentada por aminólisis con una alquilamina. Alternativamente, el péptido puede ser removido por transesterificación, por ejemplo, con metanol, seguido por la aminólisis o por la transamidación directa. El péptido protegido puede ser purificado en este punto o tomado al siguiente pasó directamente. La remoción de los grupos protectores de la cadena lateral es realizada utilizando el cóctel de segmentación descrito en lo anterior. El péptido completamente desprotegido es purificado mediante una secuencia de pasos cromatográficos empleando cualquiera o todos de los siguientes tipos: intercambio iónico en una resina débilmente básica en la forma de acetato; cromatografía de adsorción fcidrofóbica o poliestireno-divinilbenceno no derivado (por ejemplo, AMBERLITE.RTM.XAD) ; cromatografía de absorción en gel de sílice; cromatografía de intercambio iónico sobre carboximetilcelulosa; cromatografía de partición, por ejemplo - en SEPHADE . RTM. G-25, LH-20 o distribución de contracorriente; cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , especialmente HPLC de fase inversa en el empaque de columna de fase unida con octil- u octadecilsilil-sílice . ENSAYOS DE ANGIOGENESIS Los compuestos de la invención se pueden analizar por su habilidad para modular la angiogénesis en un tejido. Cualquier ensayo adecuado conocido para un experto en la técnica puede ser utilizado para inspeccionar tales efectos . Varias de tales técnicas son descritas en la presente. Por ejemplo, un ensayo mide la angiogénesis en la membrana coríoalantoica de pollo (CAM) y es referido como el ensayo CAM. El ensayo CAM se ha descrito en detalle por otros, y además se ha utilizado para medir tanto la angiogénesis como la neovascularización de tejidos tumorales. Ver Ausprunk . y colaboradores, Ata. J. Pathol., 79-597- 618(1975) y Ossonski y colaboradores, Cáncer Res., 40:2300- 2309(1980). El ensayo CAM es un modelo de ensayo bien reconocido para la angiogénesis in vivo debido a que está ocurriendo la neovascularización del tejido completo, y los vasos sanguíneos del embrión de pollo actuales están creciendo en la CAM o en el tejido crecido en la CAM.
Como es demostrado en la presente, el ensayo CAM ilustra la inhibición de la neovascularización basado en tanto la cantidad como el grado de nuevo crecimiento del vaso. Además, es fácil de inspeccionar el crecimiento de cualquier tejido transplantado sobre la CAM, tal como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es particularmente útil debido a que hay un control interno para toxicidad en el sistema de ensayo. El embrión de pollo es expuesto a cualquier reactivo de prueba, y por lo tanto la salud del embrión es una indicación de toxicidad. Un segundo ensayo que mide la angiogénesis es el modelo de ojo de conejo ín vivo y es referido como el ensayo de ojo de conejo. El ensayo de ojo de conejo ha sido descrito en detalle por otros, y además se ha utilizado para medir tanto la angiogénesis y la neovascularización en la presencia de inhibidores angiogénicos tal como talidomida. Ver D' mato y colaboradores (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. 92:4082-4085. En ensayo de ojo de conejo es un modelo de ensayo bien reconocido para la angiogénesis in vivo debido a que el proceso de neovascularización, ejemplificado por los vasos sanguíneos de conejo que crecen del borde de la córnea a la córnea, es fácilmente visualizado a través de la córnea naturalmente transparente del ojo. Adiciona-Lnente, tanto el grado como la cantidad de estimulación o inhibición de neovascularización o regresión de necascularización fácilmente puede ser inspeccionados a través del tiempo. Finalmente, el conejo es expuesto a cualquier reactivo de prueba, y por lo tanto la salud del conejo es una indicación de la toxicidad del reactivo de prueba. Un cuarto ensayo mide la angiogénesis en el modelo de ratón quimérico :ratón y humano y es referido como el ensayo de ratón quimérico. El ensayo se ha descrito en detalle por otros para medir la. angiogénesis, neovascularización y regresión de tejidos de tumor. Ver Yan y colaboradores (1993) J. Clin. Invest. 91:986-996. El ensayo de ratón quimérico es un modelo de ensayo útil para la angiogénesis in vivo debido a que los injertos de piel transplantados se asemejan estrechamente a la piel de humano normal histólogicamente y la neovascularización del tejido total está ocurriendo en donde los vasos sanguíneos del humano actual están creciendo de la piel humana injertada en el tejido de tumor humano sobre la superficie de la piel humana injertada. El origen de la neovascularización en injerto puede ser demostrado por el manchado inmunohistoo^uimico de la neovascul u a con marcadores de célula endotelial específicos de humano. En ensayo de ratón quimérico demuestra la regresión de la neovascularización basado tanto en la cantidad como en el grado de regresión del crecimiento de nuevo vaso. Además, es fácil de inspeccionar los efectos sobre el crecimiento de cualquier tejido transplantado sobre la piel injertada, tal como un tejido tumoral. Finalmente, el ensayo es útil debido a que hay un control interno para la toxicidad en el sistema de ensayo. Debido a que el ratón quimérico es expuesto a un reactivo de prueba, la salud del ratón es una indicación de la toxicidad. COMPOSICIONES TERAPEUTICAS Los compuestos de la invención se pueden utilizar en combinación con otras composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, un tumor se puede tratar convencionaliuente con cirugía/ radiación o con quimioterapia combinada con un péptido de la presente invención y luego un péptido de la presente invención puede ser subsecuentemente administrado al paciente para extender la inactividad de la micrometástasis y para estabilizar e inhibir el crecimiento de cualquier tumor primario residual. Adicionalmente, los compuestos de la invención se pueden combinar con excipientes farmacéuticamente aceptables, y -opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar- composiciones terapéuticas . Una matriz de liberación sostenida, como se utiliza en la presente, es una matriz hecha de materiales, usualmente polímeros, que son degradables por la hidrólisis enzimática o con ácido-base o- por disolución. Una vez insertada en el cuerpo, la matriz es influenciada por las enzimas y los fluidos del cuerpo. Una matriz de liberación sostenida deseablemente seleccionada de materiales biocompatibles tales como liposomas, poliláctidos (ácido poliláctico) , poliglicólido (polímero de ácido glicólico), polianhidridos de poliláctido co-'glicólido (copolimeros de ácido láctico y ácido glicólico) poli (orto) ásteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxiclicos, ácidos grasos, fosfolipidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona y silicona. Una matriz biodegradable preferida es una matriz de uno de ya sea poliláctido, poliglicólido o poliláctido co-glicólido (copolimeros de ácido láctico y ácido glicólico) . Cuando se utiliza en los tratamientos anteriores u otros tratamientos, una cantidad terapéuticamente efectiva de uno de los compuestos de la presente invención se puede emplear en forma pura- o, donde tal forma existe, en forma de sal farmacéuticamente aceptable. Por una "cantidad terapéuticamente efectiva" del compuesto de la invención se propone una cantidad suficiente del compuesto para tratar una enfermedad angiogénica, (por ejemplo, para limitar el crecimiento del tumor o para detener o bloquear la metástasis del tumor) a una relación razonable de beneficio/riesgo aplicable a cualquier tratamiento médico. Sin embargo, será entendido que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invención será decidido por el médico asistente dentro del alcance del juicio médico sondeado. El nivel de dosis terapéuticamente efectiva especifico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el desorden que es tratado y la severidad del desorden; La actividad del compuesto especifico empleado; la composición especifica empleada; la edad, peso del cuerpo, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, la ruta de administración y la proporción de expresión del compuesto especifico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto especifico empleado y factores empleados bien conocidos en las técnicas médicas. Eor ejemplo, esta bien dentro del alcance de un experto ¦ en la técnica iniciar con dosis del compuesto a niveles menores que aquellas requeridas para alcanzar el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente en la dosificación hasta que se alcance el efecto deseado . Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar en la forma de sales derivadas de ácidos inorgánicos u orgánicos. Estas sales incluyen, pero no están limitadas a, las siguientes: acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencensulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canforsufonato, digluconato, glicerofosfato, emisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, iodhidrato, 2-hidroxi--etanosulfonato (isetionato) , lactato, maleato, metanosulfonato, nicotinato,
2-naftalensulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato,
3-fenilpropionato> picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, fosfato, glutamato, bicarbonato, p-toluensulfonato y undecanoato. Los productos solubles o dispersables en agua o aceite son obtenidos de esta manera. Ejemplos de ácidos que pueden ser empleados para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico y tales ácidos orgánicos como ácido maleico, ácido succinico y ácido cítrico. Otras sales incluyen sales con metales alcalinos o metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, calcio,- magnesio o con una base orgánica. Las sales preferidas de los compuestos de la invención incluyen fosfato, tris y acetato. Alternativamente, un compuesto de la presente invención se puede administrar como composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto de interés en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables . Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable- se refiere a un rellenador sólido, semisólido o líquido no tóxico, diluyente como material encapsulante o auxiliar de formulación de cualquier tipo. Las composiciones farmacéuticas para inyección parenteral comprenden soluciones acuosa o no acuosas estériles, farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, así como polvos estériles para la reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes del uso. Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados, diluyentes, solventes o vehículos incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) , carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) , y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede ser mantenida por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de surfactantes . Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede ser asegurada por la introducción de varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser originada por la inclusión de agentes que retardan la absorción, tal como monoestearato de aluminio y gelatina. Las formas de depósito inyectables se hacen al formar matrices microencapsuladas del fármaco en polímero biodegradables tales como poliláctido-poliglicólido, poli (ortoésteres) y poli (anhídrido) . Dependiendo de la relación de fármaco a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la proporción de liberación de , fármaco. Las formulaciones inyectables de dépósito también se preparan al atrapar el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos del cuerpo. Las formulaciones inyectables pueden ser esterilizadas, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención bacteriano, o al incorporar agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que pueden ser disueltas o dispersadas en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes del uso. La administración tópica incluye la administración a la piel o mucosa, incluyéndose las superficies del pulmón y el ojo. Las composiciones para la administración tópica, que incluyen aquellas para inhalación, se pueden preparar como un polvo seco que puede ser presurizado o no presurizado. En composiciones de polvo no presurizado, el ingrediente activo en forma finamente dividida puede ser utilizado en mezcla como un portador inerte farmacéuticamente aceptable de tamaño más grande que comprende partículas que tienen un tamaño, por ejemplo, de hasta 100 mieras en diámetro. Los portadores inertes adecuados incluyen azúcares tal como lactosa. En forma deseable, por lo menos 95% en peso de las partículas del ingrediente activo tiene un tamaño de partícula efectivo en el rango de 0.1 a 10 mieras. Alternativamente, la composición puede ser presurizada y contener un gas comprimido, tal como nitrógeno o un impelente de gas licuado. El medio impelente licuado y en realidad la composición total es de preferencia tal que el ingrediente activo no se disuelve en la misma a cualquier grado sustancial. La composición presurizada también puede contener un agente activo en la superficie, tal como un agente activo en la superficie no iónico o líquido o sólido o puede ser un agente activo en la superficie aniónico sólido . Se prefiere utilizar el agente activo en la superficie aniónico sólido en la forma de una sal de sodio. Una forma adicional de administración tópica es al ojo. Un compuesto de la invención es suministrado en un vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable, tal que el compuesto es mantenido en contacto con la superficie ocular durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el compuesto penetre a las regiones de la córnea internas del ojo, por ejemplo, como en la cámara anterior, cámara posterior, cuerpo vitreo, humor acuoso, humor vitreo, córnea, iris/ciliar, cristalino, coroides/retina y esclerótica. El vehículo oftálmico farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, puede ser un ungüento, aceite vegetal o un material de encapsulación. Alternativamente, los compuestos de la invención se pueden inyectar directamente en el humor vitreo y acuoso. Las composiciones para la administración rectal o vaginal son de preferencia supositorios que pueden ser preparados al mezclar los compuestos de esta invención con excipientes o portadores no irritantes, adecuados, tal como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorio que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura del cuerpo y por lo tanto se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberal el compuesto activo. Los compuestos de la presente invención también se pueden administrar en la forma de liposomas. Como es conocido en la., técnica, los liposomas son generalmente derivados de fosfolipidos u otras sustancias de lipido. Las liposomas son formados por cristales líquidos hidratados mono- o multi-laminares que son dispersados en un medio acuoso. Cualquier lipido no tóxico, fisiológicamente aceptable metabolizable para formar liposomas puede ser utilizado. Las presentes composiciones en forma de liposomas pueden contener, además de un compuesto de la presente invención estabilizadores, conservadores, excipientes y similares. Los lipidos preferidos son los fosfolipidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas) tanto naturales y sintético. Los métodos para formar liposomas son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XlVm Academic Pressm New Yorkm N:Y: (1976), p.33* et seq. Mientras que los compuestos de la invención se pueden administrar como el agente farmacéutico activo solo, ellos también se pueden utilizar en combinación con uno o más agentes que son convencionalmente administrados a pacientes para tratar enfermedades angiogénicas . Por ejemplo, los compuestos de la invención son efectivos a través del corto plazo para hacer tumores más sensibles a las terapias Citotóxicas tradicionales tales como sustancias quimicas y radiación. Los compuestos de la invención también mejoran la efectividad de las terapias anticancerigenas adyuvantes, citotóxicas. Los compuestos de la invención también se pueden combinar con otros agentes angiogénicos para mejorar su efectividad, o se pueden combinar con otros agentes antiangiogénicos y administrar conjuntamente con otros agentes citotóxicos. En particular, cuando se utilizan en el tratamiento de tumores sólidos, los compuestos de la invención se pueden administrar con IL-12, retinoides, interferonas, angiostatina, endostatina, talidouiida, trombospondin-1, trombospondin-2, captopril, agentes antineoplásticos tal como alfa interferona, COMP
(cliclofosfamida, viscristina, metotrexato y prednisona) etopósito, mBACOD (metortrexato, bleomicina, dexorubicina, ciclofosfamida, viscritina y dexametasona) , PRO-MACE/MOPP
(prednisona, metotrexato (p/leucovin rescue) , doxorubicina, ciclofosfamida, taxol, etoposido/mecloretamina, vincristina, prednisona y procarbazina) , vincristina, vinblastina, angioinibinas, TNP-470, polisulfato de pentosan, factor 4 de plaqueta, angiostatina, LM-609, SU-101, CM-101, Techgalan, talidomida, SP-PG y similares asi como con radiación. Será entendido que los agentes que pueden ser combinados con el compuesto de la presente invención para la inhibición, el tratamiento o profilaxis de enfermedades angiogénicas no están limitados aquellos listados en lo anterior, pero incluyen en principio cualquiera de los agentes útiles para el tratamiento o profilaxis de enfermedades angiogénicas. METODOS PARA INHIBICION DE ANGIOGENESIS Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD La invención proporciona un método para la inhibición de angiogénesis en un tejido, y de esta manera inhibir los eventos en el tejido que depende de la angiogénesis . Generalmente el método comprende administrar al tejido una composición que comprende una cantidad de inhibición de angiogénesis de un compuesto de la invención, por ejemplo, Pextatin. Como es descrito en lo anterior, la angiogénesis incluye una variedad de procesos que implican la neovasculárización de un tejido incluyendo el "brote", vasculogénesis o agrandamiento del vaso, todos estos procesos de angiogénesis que involucran la interrupción del colágeno de matriz extracelular en los vasos sanguíneos. Con la excepción de la sanación de heridas traumáticas, la formación de cuerpo lúteo y la embriogénesis, se cree que la mayor parte de los procesos de angiogénesis están asociados con los procesos de enfermedad y por lo tanto los presentes métodos terapéuticos so útiles para tratar enfermedades. Como inhibidores de angiogénesis, los compuestos de la invención, tal cómo Pextatin, son útiles en el tratamiento de tumores sólidos tanto primarios como metastáticos, incluyéndose carcinomas de pecho, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y ductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (incluyéndose riñón, vejiga y urotelio) tracto genital femenino (incluyéndose cuello del útero, útero y ovarios así como coriocarcinoma y enfermedad trofoblástica gestacional) , tracto genital masculino (incluyéndose próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de células germinales) glándulas endocrinas (incluyéndose las glándulas tiroides, suprarenal y pituitaria) y piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyéndose aquellos que surgen del hueso y los tejidos blandos así como el sarcoma de carposi) y tumores del cerebro, nervios, ojos y meninges (incluyéndose astrocitomas, gliomas, glioblas ornas, retinoblastomas, neuronas, neuroblastonas, Schwanomas y meningiomas) - Tales compuestos también pueden ser útiles en el tratamiento de tumores sólidos que surgen de malignidades hematopoyéticas tales como leucemia (es decir, clo ornas, plasmacitomas y las placas y tumores de micosis fungoides y linfoma/leucemia de célula T cutánea) así como en el tratamiento de linfornas (tanto de Hodgkin y no de Hodgkin) . Además, estos compuestos pueden ser útiles en la prevención de metástasis de los tumores descritos anteriormente ya sea cuando se utilizan solos o en combinación con radioterapia y/u otros agentes quimioterapéuticos . Usos · adicionales incluyen el tratamiento y profilaxis de enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, inmune y degenerativa; varias enfermedades oculares tal como retinopatía diabética, retinopatía de calidad prematura, rechazo de injerto corneal, fibroplasia retrolental, . glaucoma neovascular, rübeosis, neovascularización retinal debido a la degeneración macular, hipoxia, angiogénesis en el ojo asociado con la infección o intervención quirúrgica, y otras condiciones de neovascularización anormales del ojo; enfermedades de la piel tal como psoriasis; enfermedades de vasos sanguíneos tales como hemagiomas y proliferación capilar dentro de placas ateroescleróticas; síndrome de Osler- ebber; angiogénesis miocardíaca; neovascularización de placa; telangiectasia; articulaciones hemofilíacas; angiofibroma; y granulación de heridas . Otros usos incluyen el tratamiento de enfermedades caracterizadas por la estimulación excesiva o anormal de células endoteliales, que incluyen, pero no limitadas a adhesiones intestinales, enfermedad de Crohn, ateroesclerosis, escleroderma y cicatrices hipertróficas, es decir queloides. Otro uso es como un agente de control natal, al inhibir la ovulación en el establecimiento de la placenta. Los compuestos de la invención también son útiles en el tratamiento de enfermedades que tienen angiogénesis como una consecuencia patológica tal como la enfermedad de rasguño de gato (Róchele nimalia quintosa) y úlceras (Helicobacter pylori) . Los compuestos de la invención también son útiles para reducir el sangrado mediante la administración antes de la cirugía, especialmente para el tratamiento de tumores reseccionables . Los métodos de la presente invención son efectivos en parte debido a que la terapia exactamente selectiva para la angiogénesis y no para otros procesos biológicos. Además, los compuestos de la invención son altamente potentes sugiriendo que ellos pueden tener beneficias terapéuticos a bajas concentraciones. Cualquiera de una variedad de tejidos, u órganos comprendidos de tejidos organizados, pueden soportar la angiogénesis en condiciones de enfermedad incluyéndose la piel, músculo, intestino, tejido conectivo, articulaciones, huesos y tejido similar en la cual los' vasos sanguíneos pueden invadir en los estímulos angiogénicos. Tejido, como se utiliza en la presente, también incluye todos los fluidos corporales, secreciones y similares, tales como suero, sangre, fluido cerebroespinal, plasma, orina, fluido sinovial, humor vitreo. Asi, en una modalidad, un tejido a ser tratado es un tejido inflamado y la angiogénesis a ser inhibida es la angiogénesis de tejido inflamado donde hay neovascularización del tejido inflamado. En esta clase, el método contempla la actividad de angiogénesis en tejidos artríticas, tal como en un paciente con reumatismo articular crónico, en tejidos inflamados inmunes y no inmunes, en tejido psoriático y similares. El paciente tratado por las muchas modalidades de la presente invención es deseablemente un paciente humano, aunque sé va a entender que los principios de la invención indican que la invención es efectiva como respecto a todos los mamíferos, que se proponen que son incluidos en el término "paciente". En este contexto, un mamífero se entiende que incluye cualquier especie de mamífero en el cual el tratamiento de las enfermedades asociadas con la angiogénesis es deseable, particularmente especies de mamíferos agrícolas y domésticos. Tal paciente puede ser, por ejemplo, un cerdo, una vaca, un caballo, una cabra, una oveja, una muía, un burro, un perro, un gato, un conejo, un ratón y una rata. En otra modalidad relacionada, un tejido a ser tratado es un tejido retinal de un paciente con retinopatia diabética, degeneración macular o glaucoma neovascular y la angiogénesis a ser inhibida es la angiogénesis de tejido retinal, donde hay neovascularización del tejido retinal. En una modalidad relacionada adicional, un tejido a ser tratado es un tejido de tumor de un paciente, con un tumor sólido, una metástasis, un cáncer de pielf un cáncer de pecho, un hemangiona o angiofibroma y cáncer similar, y la angiogénesis a ser inhibida es la angiogénesis del tejido de tumor donde hay neovascularización de un tejido de tumor. Los tejidos de tumor sólidos típicos, tratables per los presentes métodos incluyen pulmón, páncreas, pecho, colon, laringe, ovárico, Sarcoma de Kaposi y tejidos similares. La angiogénesis de tejido tumoral ejemplar y la inhibición de la misma, es descrita en los Ejemplos.
La inhibición de la angiogénesis del tejido tumoral es una modalidad particularmente preferida, debido a la función importante que la vascularización desempeña en el crecimiento del tumor . En la ausencia de neovascularización del tejido tumoral, el tejido tumoral no tiene los nutrientes requeridos, se hace lento el crecimiento, cesa el crecimiento adicional, regresa y finalmente llega a ser necrótico dando por resultado la exterminación del tumor. Por su habilidad para inhibir la neovascularización, los métodos de la invención también son efectivos contra la formación de metástasis debido a que (1) su formación requiere la vascularización de un tumor primario de modo que las células dé cáncer metastáticas pueden salir del tumor primario y (2) su establecimiento es un sitio secundario requiere la neovascularización para soportar el crecimiento de las metástasis . En una modalidad relacionada, la invención contempla la práctica del método en conjunción con otras terapias tal como la quimioterapia convencional dirigida contra- umores sólidos y para el control del establecimiento en la metástasis. La administración del inhibidor de angiogénesis es tipicamente conducida durante o después de la quimioterapia, aunque es preferible inhibir la angiogénesis después de un régimen de quimioterapia en tiempos donde el tejido tumoral será respondiente al ataque tóxico al inducir la angiogénesis para la recuperación mediante la prohibición de un suministro de sangre y nutrientes al tejido tumoral. Además, se prefiere administrar los métodos de inhibición de angiogénesis después de la cirugía, donde los tumores sólidos se han removido como una profilaxis contra la metástasis, La restenosis es un proceso de migración de las células del músculo liso (SMC) y la proliferación en el sitio de la angioplastia coronaria transluminal percutánea que obstaculiza el éxito de la angioplastia. La migración y proliferación de las SMCs asociadas con los vasos sanguíneos durante la restenosis está relacionada con el proceso de angiogénesis que es inhibido por los presentes métodos . Por lo tanto, la invención también contempla la inhibición de restenosis al inhibir los procesos relacionados angiogénicos de acuerdo con los presentes métodos en un paciente después de los procedimientos de angioplastia. Para la inhibición de la restenosis, los compuestos de la invención son típicamente administrados después del procedimiento de angioplastia durante aproximadamente 2 a aproximadamente 28 di s, y más típicamente durante aproximadamente los primeros 14 dias después del procedimiento. Los compuestos de la invención pueden ser administrados parenteralmente mediante la inyección o mediante la infusión gradual a través del tiempo. Aunque el tejido a ser tratado típicamente puede ser accesado en el cuerpo por la administración sistémica y por lo tanto la mayor parte frecuentemente tratado por la administración intravenosa de composiciones terapéuticas, otros tejidos y medios de suministro son contemplados donde hay una probabilidad de que el tejido dirigido contenga la molécula objetivo. Asi, los compuestos de la invención que incluyen polipéptidos y derivados de los mismos, se pueden administrar intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente, intracavidad, transdérmicamente, tópicamente, intraocularmente, oralmente, int anasalmente y pueden ser suministrados por medios peristálticos. Los compuestos de la invención se pueden administrar mediante la invención de un gen sintético que codifica los compuestos de la invención, en donde los compuestos de la invención son producidos cuando el gen genético es expresado. Las composiciones terapéuticas de esta invención son convencionalmente administradas en forma intravenosa, por ejemplo, - mediante la inyección de una dosis unitaria. El término "dosis unitaria" cuando se utiliza en referencia a una composición terapéutica de la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto, cada unidad que contiene una cantidad determinada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en una asociación con el diluyente requerido; es decir, portador, o vehículo . Los rangos de dosificación para la administración de un compuesto de la invención dependen de la forma del compuesto, y su potencia, como es descrito adicionalmente en la presente, y son cantidades bastante grandes para producir el efecto deseado en el cual la angiogénesis y los síntomas de enfermedad mediados por la angiogénesis son mejorados. La dosificación no debe ser tan grande para - ocasionar efectos secundarios adversos, tales como síndrome de iperviscosidad, edema pulmonar, falla de corazón congestivo y similares. Generalmente, la dosificación variará con la edad, condición, sexo, y grado de la enfermedad en el paciente y puede ser determinada por un experto en la técnica. La dosificación también se puede detectar por el médico individual en el caso de cualquier complicación. La dosis diaria total de las composiciones de la invención a ser administradas a un humano u otro huésped mamífero en dosis individuales y divididas puede ser en cantidades, por ejemplo, de 0.0001 a 300 mg/Jg de peso del cuerpo al día y más usualmente de 1 a 300 mg/kg del peso del cuerpo . METODOS DE DETECCION Los compuestos de la invención también son adecuados- para la detección de angiogénesis en tejidos. Los compuestos de la invención una vez enlazados al tejido objetivo pueden ser detectados ya sea directamente e indirectamente, la detección directa puede ser realizada en compuestos que comprenden una marca detectable tal como un fluorócromo, una etiqueta radioactiva, metal pasado paramagnético o tinte de diagnóstico. Alternativamente, la detección puede ocurrir a través de una interacción secundaria. Por ejemplo, un anticuerpo detectablemente marcado que reconoce el compuesto puede ser utilizado para visualizar la localización del compuesto . Un experto en la técnica puede determinar anticuerpos secundarios adecuados para el uso con varios compuestos . Para la detección in vivo, es preferible utilizar un detectablemente marcado. El compuesto marcado es administrado a un paciente intravenosamente, intramuscularmente, etc. Las marcas adecuadas para la detección dentro de un paciente son particularmente preferidas. Por ejemplo, los compuestos paramagnéticamente marcados pueden ser detectados mediante la formación de imagen de resonancia magnética. Los compuestos radioactivamente etiquetados también p eden ser detectados. Ejemplos de modalidades especificas de la invención adecuadas para la detección son como sigue. En una modalidad, la invención es un método para detectar la angiogenesis en un tejido al poner en contacto el tejido con un compuesto de la invención, por ejemplo, Pexstatin con el tejido. En este método, por ejemplo, el tejido está ex vivo o el tejido está ín vivo y el compuesto es administrado intravenosamente, transdérmicamente, intrasinovialmente, intramuscularmente, intratumoralmente, intraocularmente, intranasalmente, intratecalmente, tópicamente u oralmente. De manera alternativa, en este método el' compuesto es conjugado con un fluorocromo, etiqueta radioactiva, metal pesado paramagnético, tinte o enzima de diagnóstico. En otra modalidad de este método, el paso de poner en contacto el péptido con el tejido comprende la administración de un gen sintético que codifica el péptido al tejido, en donde el péptido es. producido en el tejido cuando el gen sintético es expresado en el mismo. OTRAS APLICACIONES La invención también proporciona métodos para la detección de los compuestos de la invención. En una modalidad, la invención proporciona un método para detectar un péptido de la invención en una muestra, que comprende pone en contacta la muestra con un compuesto que se enlaza y forma un complejo con el péptido durante un periodo suficiente para formar ün complejo; y detectar el complejo, de modo que si un complejo es detectado un péptido de la invención es detectado. En tales modalidades, el compuesto que se enlaza con el péptido de la invención puede ser un anticuerpo . Adicionalmente, los péptidos de la invención pueden ser utilizados para el desarrollo de columnas de afinidad para el aislamiento de receptores relevantes a la actividad antiangiogénica del péptido de la invención. Como es conocido en la técnica, el aislamiento y purificación de un receptor puede ser seguido por la secuenciación de aminoácidos para identificar y aislar polinucleótidos que codifican el receptor. Esto permite el uso de la expresión recombinante del receptor para producir grandes cantidades de receptor, por ejemplo, para el uso en ensayos de detección de alto rendimiento para identificar otros inhibidores de angiogénesis . Los péptidos de la presente invención pueden ser químicamente acoplados a isótopos, enzimas, proteínas portadoras, agentes citotóxicos, moléculas fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, biolumInicentes y otros compuestos para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, un péptido puede ser marcado para facilitar la prueba de su habilidad para enlazar antisuero para detectar tipos de células que poseen un receptor relevante. La técnica de acoplamiento es generalmente seleccionada en la base de los grupos funcionales disponibles en los aminoácidos del péptido que incluyen, pero no limitados a grupos amino,, sulfihidral, carboxilo, amida, fenol e imidazol. Varios reactivos utilizados para efectuar tales acoplamientos incluyen entre otros, glutaraldehido, bencidina dizolizada, carbodimida y benzoquinona. La eficiencia de la reacción de acoplamiento es determinada utilizando diferentes técnicas apropiadas para la reacción especifica. Por ejemplo, la radiomarcación del péptido con I125 puede ser realizado utilizando cloramina T y Nal125 de alta actividad especifica- La reacción es terminada con metabisulfito de sodio y la mezcla es desalificada sobre columnas desechables. El péptido marcado es eluido de la columna y las fracciones son recolectadas. Las alícuotas son retiradas de cada fracción y la radioactividad medida en un contador gama. De esta manera, se puede obtener un péptido marcado que está libre de Nal125 sin. reaccionar. Los kits para la medición de los compuestos de la ' invención también son contemplados como parte de la presente invención. El antisuero que posee el más alto, título y especificidad y puede detectar los péptidos de la invención en extracto de plasma, orina, tejidos y en medio de cultivo de célula pueden ser utilizado para establecer kits de ensayo para la medición rápida, confiable, sensible y específica y la localización de péptidos de la invención. Estos kits de ensayo pueden emplear (pero no están limitados a) las siguientes técnicas: ensayos competitivos y no competitivos, radioinmunoensayo (RIA) , ensayos de b o uminiscencia y quimioluminiscencia, ensayos flúorornétrieos, ensayos de intercalación, ensayos inmunorradiométri os , manchas de puntos, ensayos de enlace de enzima incluyéndose ELISA, placas de microtítulo, tiras o adherencias recubiertas con anticuerpo para la inspección rápida de orina o sangre, e inmunocitoquimica . Para cada kit, el rango, sensibilidad, precisión, confiabilidad, especificidad y reproductividad del ensayo son establecidos por medios bién conocidos para aquellos expertos en la técnica. El kit de ensayo descrito en lo anterior proporcionaría instrucciones, antisuero, uno o más péptidos de la invención, y péptidos posiblemente radiomarcados de la invención y/o reactivos para la precipitación de complejos enlazados de péptido/anticuerpo. Tal kit seria útil para la medición del péptido de la invención en fluidos biológicos y extractos de tejido de animales y humanos con y sin tumores, como es bien conocido en la técnica. También se contempla un kit que puede ser utilizado para visualizar o localizar el péptido de la invención en tejidos y células. Las técnicas de inmunohistoquímica y los kits, por ejemplo, que emplean tales técnicas son bien conocidos para aquellos expertos ordinarios en la técnica. Un kit de tal clase proporciona antisuero al péptido de la invención, y posiblemente bloquea el suero y el antisuero secundario en la molécula fluorescente tal como isotiocianato de fluoresceina, o algún otro reactivo utilizado para visualizar el antisuero primario. Utilizando esta metodología, los tumores de biopsia pueden ser examinados para sitios de producción de péptido para sitios del receptor de péptido. Alternativamente, un kit puede suministrar ácidos nucleicos radiomarcados para el uso en hibridización in situ para sondear el RNA mensajero que codifica los compuestos de la invención. Todas las referencias, citadas en la presente son incorporadas en la presente en su totalidad. EJEMPLOS
EJEMPLO 1 Efectós de la Administración Sistámica del Péptido Pexstatin en el Crecimiento del Tumor de Melanoma en el Embrión de Pollo. Células de tumor de melanoma CS-1 (5xl06) se inocularon en las Membranas Corioalantoicas (CAMs) de embriones de pollo de 10 dias. Veinticuatro horas r después, los embriones recibieron una inyección intravenosa individual de 50 \ig del péptido Pexstatin o control de PBS . Al final de un periodo de incubación de 7 dias los tumores resultantes se reseccionaron y se determinaron los pesos húmedos. Los resultados son mostrados en la Figura 1. Las barras de datos representan el promedio ± los errores estándar del peso de tumor de 5 a 10 embriones por condición. Conclusiones: Como se puede observar en la Figura 1, la administración Sistémica de Pexstatin inhibió el crecimiento del tumor de melanoma CSl por aproximadamente 60% dentro de 7 " días comparado con los controles. Estos experimentos se repitieron 2 a 3 veces con resultados similares. Además, no se observaron efectos secundarios tóxicos durante el periodo de ensayo. Estos descubrimientos sugieren que el Pexstatin es un potente péptido antitumoral en este modelo de animal. EJEMPLO 2 Efectos de la Adminisración Sistémica del Péptido Pexstatin en el Crecimiento de Tumor de Melanoma en Ratones Desnudos Células de tumor de melanoma humano M21 (2xl06) se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos hembra. 24 horas después, los ratones se trataron diariamente con inyecciones de 100 ]ig del péptido MMP-2 Pexstatin o controles de PBS . Los tamaños de tumor se inspeccionaron diariamente por mediciones de espesor. Los resultados de los experimentos son mostrados en la Figura 2. Las barras de datos representan el volumen del tumor promedio + los errores estándares en cada plinto en el tiempo . Los volúmenes del tumor se estimaron utilizando la fórmula V=L2 x W/2, V=volumen, L=longitud y W=ancho . Conclusiones: La Figura 2 muestra que la administración sistémica de Pexstatin inhibió potentemente el crecimiento del tumor de melanoma M21 humano por aproximadamente 80 a 90% como es comparado con los controles- Estos experimentos se repitieron 2 veces con resultados similares. Además, no se observaron efectos secundarios tóxicos durante el periodo de ensayo. Estos descubrimientos sugieren que el Pexstatin es un potente péptido antitumoral en este modelo de animal . EJEMPLO 3 Efectos de la Administración Sistémica de Pexstatin en la Angiogénesis In Vivo A) . Discos de filtro saturados con [3FGF se colocaron en la CAMs de embriones de pollo de 10 dias. Veinticuatro horas después, los embriones recibieron una sola inyección intravenosa con 50 g de Pexstatin, péptido de control o PBS. Al final de un periodo de incubación de 3 dias los discos de filtro y el tejido de CAM circundante se retiraron y la angiogénesis se cuantificó al contar el número de puntos de ramificación de vasos sanguíneos dentro del área de disco de filtro. La Figura 3 muestra ejemplos del tejido de CAM de un experimento típico. B) La Figura 4 ilustra la cuantificación del experimento de angiogénesis con Pexstatin. Las barras de datos representan el promedio + errores estándares de 5 a 10 embriones por condición. El Indice de angiogénesis es igual a el número de puntos de ramificación de embriones experimentalmente tratados menos el número de puntos de ramificación de las CAMs en la ausencia de pFGF. Conclusiones: Como es mostrado en la Figura 4, la administración sistémica de 50 µg de Pexstatin inhibió la angiogénesis inducida por PFGF por aproximadamente 90% comparado con los controles. De manera importante, no se observaron efectos tóxicos secundarios en los embriones durante el periodo de ensayo. Además, poco efecto, si lo hay, de este fragmento de péptido de MMP-2 se observó en los vasos sanguíneos quiescentes normales. EJEMPLO 4 Efectos del Pexstatin en la Metástasis de Tumor de Melanoma B16 In vivo. Para examinar los efectos del Pexstatin en la metástasis del tumor de melanoma in vivo se utilizó el modelo de metástasis experimental en embrión de pollo. Brevemente, células del tumor de melanoma B16 (2.5xl04) se inocularon intravenosamente con Pexstatin (10 µg/embrión) o un péptido de control en embriones de pollo de 12 dias. Además, también se adicionó un control de no tratamiento (NT) . Los embriones se dejaron incubar durante, un total de 7 dias. Al final de un periodo de incubación de 7 dias los embriones se sacrificaron y los pulmones se retiraron para el análisis. El número de lesiones del pulmón por melanoma se contaron para cada lóbulo del pulmón. Los resultados son mostrados en la Figura 5. L'as barras de. datos representan el promedio + los errores estándares de las lesiones del pulmón metastáticas de 5 a 10 embriones por condició . Conclusiones: La Figura 5 muestra que el Pexstatin inhibió la metástasis de melanoma B16 experimental por aproximadamente 80% comparado con los controles. De hecho, en algunos .de los embriones, poco tumor, si lo hay podría ser detectado- Puesto que la metástasis experimental es ¦ improbable que implique angiogénesis, estos resultados indican que el Pexstatin puede tener un efecto en la invasión de la célula del tumor asi como la invasión de la célula endotelial. Tomados conjuntamente, estos descubrimientos demuestran un efecto potentemente anti-metastático del Pexstatin ín vivo, proporcionando evidencia adicional para la utilidad del péptido Pexstatin en aplicaciones clínicas humanas . · EJEMPLO 5 Representación Esquemática de la Localización Relativa del Pexstatin dentro de la MMP-2 Intacta. El cristal estructural de la MMP-2 intacta ha sido determinado. La Figura 6 muestra la localización relativa del Pexstatin (aminoácidos 582-590) dentro de las estructuras similares de espiral del dominio de hemopexina de MMP-2. El Pexstatin es indicado como el articulo 1 en la Figura. Todas las publicaciones que son citadas en todo el conjunto de la presente especificación son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. También se va a apreciar que la descripción anterior de la invención se ha- presentado para propósitos de ilustraciones y explicación, y no se propone para limitar la invención a la manera precisa de la práctica en la presente. Por lo tanto, se va a apreciar que cambios pueden ser hechos por aquellos expertos en la técnica sin apartarse del espíritu de la invención y que el alcance de la invención debe ser interpretado con respecto s. las siguientes reivindicaciones .