JPS63503514A - タンパク質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７Ｒ／）　（７）Ｌ Ｐ園唐 本発明は、タンパク質、特に組換えＤＮＡ法によるメタロプロテアーゼの製法に 関する。本発明は、特定のタンパク質、ＤＮＡ配列、ベクター、宿主生物及び薬 学的組成物にも関する。

光凱生宜景 メタロプロテアーゼは、哺乳類の組織で生産される一群の酵素で、結合組織の細 胞外間質の再・吸収において重要な役割を演じていると信じられている。

メタロプロテアーゼの群には、協同して相乗的に、細胞外間質を構成する主要な 巨大分子のすべてを分泌するコラ−ゲナーゼ、ゼラチナーゼ、及びストロメリシ ン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ　）が含まれる。これらの酵素は、トリプシン又は ４−アミノフェニル第２水銀アセテート（ＡＰＭＡ）のより活性化できるプロ酵 素の状態で見出される。メタロプロテアーゼは、その活性部位に亜鉛原子を有し 、完全に活性化するにはカルシウムを必要とする。

通常、組織メタロプロテアーゼは同調合成されるが、多くの組織では合成を誘導 するのに特定の刺激が必要である（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｊ、Ｂｒ１ｔ、Ｄｅｒｖ ａｔｏｌｏｇｙ　（１９８５）　１１２．　７１５−７２３）　、メタロプロテ アーゼは通常低濃度で存在し、哺乳類の組織から大量に抽出することはできない 。

ストロメリシンは特に興味深く、これは、結合組織の多くの成分、例えば、プロ テオグリカン・コアタンパク質、ＩＶ型コラーゲンの非へリックス域、ラミニン 、フィブロネクチン、エラスチン、ゼラチン及び？、ＩＩ及び■型のプロコラー ゲンを分解するものとして知られ、創傷の治癒のような生物学的プロセスにおい て役割を果たすものである。ストロメリシンは、皮膚潰瘍の挫滅壊死組織切除、 火傷や壊死のような創傷の治癒から生じる廠痕組織の改質のごときプロセスで治 療上有用である可能性がある。ストロメリシンは、椎間板ヘルニアの治療に用い てヌクレアス・パルボサス（ｎｕｃｌｅｕｓ　ｐｕｌｐｏｓｕｓ）の分離を起こ させることができる。ストロメリシンをこのように使用するには、大規模に商業 的に実用的なコストで製造されなければならない。

私たちは、本発明により、組換えＤＮＡ技術を用いて製造することにより、哺乳 類ストロメリシンをこのような商業的に価値のある量で提供するものである。

プレプロストロメリシンは、ストロメリシンの大分子量態で、分泌時にプロセス されて低分子量のプロストロメリシンを生じる。プロストロメリシンの、例えば ４−アミノフェニル第２水銀アセテートによる処理による活性化によって成熟し た生物学的に活性なストロメリシンが生じる。

光里夏！丘 本発明によると、哺乳類ストロメリシンの製法であって、該ストロメリシンをコ ードする［ＩＮＡ配列で形質転換された宿主さいぼうを培養することを含む方法 が提供される。

ここで用いられる語、哺乳類ストロメリシンは、真正の哺乳類ストロメリシンの アミノ酸配列を有する哺乳類ストロメリシン、その類似体、又はこれらのいずれ かの生物学的に活性なペプチドフラグメントであって、真正な哺乳類ストロメリ シンに伴う生物学的活性を存するものを意味する。

好ましい実施態様では、本発明は、ヒトストロメリシンをコードするＤＮＡ配列 で形質転換された宿主細胞を培養することを含むヒトストロメリシンの製法を提 供する。

この方法は、比較的大量のストロメリシンの生産を可能にし、そして初めて該タ ンパク質の構造及び薬理学的性質の完全特徴づけを促す。

ストロメリシンは、好ましくは、添付図面の図４に示すヒトプレブロストロメリ シンのアミノ酸１〜４７７の配列と、９０％（共通するアミノ酸／全アミノ酸） を超える相同性を有するアミノ酸配列を有するものである。より好ましくは、相 同性は９８％より大で、最も好ましくはヒトプレブロストロメリシンが実質的に 図４に示されたアミノ酸配列を有する。

完全な哺乳類ストロメリシンタンパク質のほかに、このようなタンパク質の比較 的小さいペプチドフラグメント、例えば、ストロメリシンのペプチドフラグメン トがメタロプロテアーゼとして有用であると考えられる。即ち、本発明の第１様 相の特定実施態様では、また本発明の後述の様相でも適当である場合には、スト ロメリシンの語にはストロメリシンタンパク質のペプチドフラグメントを含まれ る。

哺乳類ストロメリシンは、好適には、メチオニンーストロメリシン又はメチオニ ンープロストロメリシンである。ＤＮＡ配列の発現を得るためには、そのＤＮＡ 配列は５’ＡＴＧコドンを有しなければならず、したがって対応するポリペプチ ドはＮ−末端メチオニンアミノ酸を有する。ここで使用するように、「メチオニ ンーストロメリシン」及び「メチオニンープロストロメリシン」の語は、真正の 哺乳類ストロメリシン又はプロストロメリシン（あるいは、機能的に同等のタン パク質を得るために修飾又は置換された、真正の哺乳類ストロメリシン又はプロ ストロメリシン）であって、Ｎ−末端メチオニン残基を有するものを意味する。

好ましくは、メチオニン残基がストロメリシン又はプロストロメリシンのＮ−末 端アミノ酸に隣接していることであるが、タンパク質がストロメリシン又はプロ ストロメリシンの機能的活性を有するならば、１又は２以上のアミノ酸によって それから分離されていてもよい。

本発明の第２の様相においては、哺乳類ストロメリシンの製法であって、ストロ メリシン前駆体をコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養するこ とによりストロメリシン前駆体を製造し；該前駆体を切断してストロメリシンを 生産させることを含む方法が提供される。

本発明の第２様相の好ましい実施態様においては、ヒト・ストロメリシンの製法 であって、ヒトストロメリシン前駆体をコードするＤＮＡ配列で形質転換された 宿主細胞を培養することにより、ヒトストロメリシン前駆体を製造し；該前駆体 を切断してヒトストロメリシンを製造することを含む方法が提供される。

前駆体タンパク質は、メチオニンーストロメリシンでも、メチオニンープロスト ロメリシンでもよい。

前駆体タンパク質は、アミノ末端シグナル配列を有する哺乳類ストロメリシン又 はプロストロメリシンでもよい。シグナル配列は、ＤＮＡ配列が発現された宿主 細胞からの発現産物輸送を押し進める効果を有する配列でよい。例えば、ヒトス トロメリシンの場合、図４のアミノ酸１〜１７により描かられるようなアミノ酸 のシグナル配列がアミノ末端アミノ酸に結合して、プレプロストロメリシンを形 成する。このシグナル配列は産物の真核生物宿主細胞からの輸出を助け、それ自 身は細胞膜を通過する輸送中に産物から切断される。

前駆体タンパク質は、異種タンパク質と、哺乳類ストロメリシン又はプロストロ メリシンタンパク質との融合タンパク質でもよい。異種タンパク質は、宿主生物 中に、好ましくは高濃度で生産され得るあるタンパク質の全部又は一部でもよい 。このような異種タンパク質としては、β−ガラクトシダｉゼ、クロラムフェニ コール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）及び圧Ｅ遺伝子の産物が含まれ る。融合タンパク質は、好ましくはストロメリシンもしくはプロストロメリシン タンパク質と異種タンパク質との間に、選択的な化学的又は酵素的な切断に感応 する部位を有する。異種タンパク質はイースト・シグナル配列でよく、宿主生物 はイーストでよい。この好ましい実施態様では、イースト宿主生物が融合タンパ ク質を切断して成熟したストロメリシン叉とプロストロメリシンを産出し有利で ある。

本発明の方法により、本質的に純粋なヒト・ストロメリシン、プロストロメリシ ン又はプレプロストロメリシンの製造が可能である。本質的に純粋の用語は、ヒ ト由来の他のタンパク質が本質的に存在しないストロメリシンを示すのに用いら れる。

本発明の第３の様相においては、したがって、本質的に純粋な哺乳類のストロメ リシン、プロストロメリシン又はプレブロストロメリシンにおいて、特に該哺乳 類のストロメリシン、プロストロメリシン又はプレプロストロメリシンがヒトの ストロメリシン、プロストロメリシン又はプレプロストロメリシンであることを 特徴とするものが提供される。

第３様相の好ましい実施態様においては、本質的に純粋なヒト・ストロメリシン は添付図面の図４に示した１００〜４７７のアミノ酸配列を実質的に有し、本質 的に純粋なヒト・プロストロメリシンは図４に示した１８〜４７７のアミノ酸配 列を有し、そして本質的に純粋なヒト・プレプロストロメリシンは、図４に示す １〜４７７のアミノ酸配列を有する。

本発明の第４様相においては、本発明の第１様相の方法により製造される哺乳類 ストロメリシンもしくはプロストロメリシン、又は中間体化合物として製造され る、哺乳類のストロメリシンもしくはプロストロメリシンの前駆体タンパク質が 提供される。

第４様相の好ましい実施態様においては、ストロメリシンは、ヒトのストロメリ シン又はプロストロメリシン又はその前駆体である。

本発明の第５の様相においては、異種タンパク質と、哺乳類のストロメリシン又 はプロストロメリシンとを含有する融合タンパク質が提供される。

第５様相の好ましい実施態様においては、融合タンパク質は異種タンパク質と、 ヒトのストロメリシン又はプロストロメリシンとを含有してなる。

本発明の第６の様相においては、哺乳類のストロメリシンもしくはプロストロメ リシンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、又はそれらの前駆体が提供され る。但し、ＤＮＡ配列がラットのストロメリシンをコードする場合は、そのＤＮ Ａ配列はＭａｔｒｉｓｉａｎほか（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　４　、１４３５０ −１４４０（１９８５））により記載されたｐＴＲｌ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａではない 。好ましくは、図４に示したヌクレオチド配列５１〜１４８４　（ｉｉを含む） を実質的に有するヒト・プレプロストロメリシンをコードするＤＮＡ配列が提案 される。好ましくは、図４に示したヌクレオチド配列１０２〜１４８４（端を含 む）を実質的に有するヒト・プロストロメリシンをコードするＤＮＡ配列が提供 される。好ましくは、図４に示したヌクレオチド配列３４８〜１４８４　（端を 含む）を実質的に有するヒト・ストロメリシンをコードするヌクレオチド配列を 実質的に有するＤＮＡ配列が提供される。

本発明の第７の様相において、私達は、哺乳類のストロメリシン、プロストロメ リシン又はその前駆体をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供する。

該ベクターは、適当な選択マーカー、プロモーター及び他の制御域を適切に設け ることにより、所定の宿主細胞内での使用に適合される。

第７の様相の好ましい実施態様では、ベクターは、ヒト・ストロメリシン又はプ ロストロメリシン又はその前駆体をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。

本発明の第８の様相において、本発明の第７の様相によるベクターで形質転換さ れた宿主細胞が提供される。宿主細胞は、哺乳類のストロメリシン又はその前駆 体をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換して、１ＤＮＡ配列の発現 が起こるようにすることができるいかなる宿主生物でもよい。適切な宿主細胞と しては、イースト（例えば、サツカロミセス・セレビシアエ）及び組織培養中の 哺乳類細胞（例えば、ハムスター卵巣もしくはマウス乳腫瘍の細胞）が挙げられ る。好ましくは、宿主細胞がバクテリア又はイーストである場合には、ベクター はメチオニンーストロメリシン又はメチオニンープロストロメリシン又はストロ メリシンもしくはプロストロメリシンを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ 配列を含んでおり、また宿主細胞が組織培養中の哺乳類の細胞であるときは、ベ クターはプレストロメリシン又はプロストロメリシンをコードするＤＮＡ配列を 含むことが好ましい。

本発明の第７の様相において、哺乳類ストロメリシン、好ましくはヒト・ストロ メリシンと、薬学的に許容される賦形剤とを含んでなる薬学的組成物が提供され る。薬学的組成物は、例えば、注入可能な溶液の形でも、局部投与に適した形で もよい。

薬学的組成物は、イン・ビトロ又はイン・ビボで活性化されて生物学的に活性な ストロメリシンを与えることができるストロメリシン又はプロストロメリ′シン 、好ましくはヒト・ストロメリシン又はヒト・プロストロメリシンを含有しても よい。

第７の様相の好ましい実施態様では、皮膚腫瘍の挫滅壊死組織切除、火傷や壊死 のような創傷の治癒から生じる廐痕組織形成の改質、及び椎間板ヘルニアの治療 に使用するための、哺乳類のストロメリシン又はプロストロメリシンを有効量含 有する薬学的組成物が提供される。

本発明の第１０の様相においては、哺乳類のストロメリシン又はプロストロメリ シン、好ましくはヒトのストロメリシン又はプロストロメリシンを、薬学的に許 容される担体と組合わせることを含む、薬学的組成物の製法が提供される。

本発明の第１１の様相においては、例えば、皮膚腫瘍の挫滅壊死組織切除、火傷 や壊死のような創傷の治癒から生じる廠痕組織形成の改質、及び椎間板ヘルニア の治療のために、患者を、有効量の哺乳類ストロメリシン、好ましくはヒト・ス トロメリシンで処理することを含む、治療方法が提供される。

好ましいことに、本発明により製造されるストロメリシンは、免疫系と目立った 抗原反応を起こさずに有用な薬理学的効果を有する。特に、該化合物は皮膚腫瘍 の挫滅壊死組織切除、火傷や壊死のような創傷の治癒から生じる廠痕＆ｌＩ織形 成の改質、及び椎間板ヘルニアの治療に使用することができる。

図４に示したヒト・ストロメリシンをコードするＤＮＡ配列は、結合組織の病的 状態を暗示するストロメリシンの過剰発現を確認するのに使用されるＤＮＡプロ ーブの設計に使用でき、本発明はこのようなりＮＡプローブにも及ぶ。

第１２の様相において、本発明は、図４に示したヌクレオチド配列１〜１８１０ から選ばれるヌクレオチド配列を含むＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを 提供する。

別の様相において、本発明は、哺乳類ストロメリシンの抗原性決定子（ｄｅｔｅ ｒ＋ｍ１ｎａｔｏｒ）に対し特異性を有する抗体を提供する。この抗体はポリク ローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。抗体は、検出可能な標識でラベ ルしてもよい。

ストロメリシンは、例えばトリプシン又はＡＰＭＡによる活性化後コラーゲナー ゼの活性を高めることができることが示され、本発明はストロメリシンをかかる 用途に使用することにも及ぶ。

皿皿立固単笈説凱 本発明を、添付図面の図１〜９及び表１及び２を参照しつつ非限定的な下記の実 施例によって、さらに説明する。図及び表の内容を簡単に下記に示す。

図１　ウサギのＡＰＭＡ活性化ストロメリシンノＮ末端アミノ酸配列（ａ）及び この配列に基づくオリゴヌクレオチドを示す。この５０塩基オリゴヌクレオチド プローブは、２つの２５塩基からなる半分（ｂとＣ）とされ、相補的２６・マー （２６ｍｅｒ）（ｄ）がこれらをリガーゼで結合するのを助長するために合成さ れた。アミノ酸の番号付けは、ｃＤＮＡから予想されるウサギ・ストロメリシン 配列におけるそれらの位置を示す（図２参照）。

図２　ウサギ・ストロメリシンの部分的なヌクレオチド配列及び予想されるアミ ノ酸配列を示す。

図３　３つのヒト・ストロメリシンｃＤＮＡの制限地図を示す。

図４　ヒト・ストロメリシンｃＤＮＡの制限地図及びヌクレオチド配列、並びに 予想されるアミノ酸配列を示す。

図５　下記から精製されたストロメリシンの活性化産物の電気泳動分析を示す。

パネルＡ−ヒト歯肉繊維芽細胞培地 パネルＢ−ストロメリシン含有ベクターでトランスフェクションされたＣｌ２７ 細胞により分泌されたもの。

ハ蛮止旦−ストロメリシン含有ベクターでトランスフェクションされたＣＯ８細 胞により分泌されたもの。

図６　Ｃ１２７細胞分泌プロスト口メリシンを種々の濃度のトリプシン又はＡＰ ＭＡで活性化した際の活性化の時間経過のグラフを示す。

図７　Ｃｌ２７プロストロメリシンのＡＰＭＡによる活性化の産物の電気泳動分 析を示す。

図８　Ａ）トランスフェクションされたＣ１２７細胞により分泌されたプロコラ −ゲナーゼ、及び Ｂ）ヒト歯肉繊維芽細胞培養物のトリプシンによる活性化に対する、種々の量の 精製ヒト繊維芽細胞プロストロメリシン又はＣ１２７細胞により分泌されたプロ ストロメリシンの効果のグラフを示す。

図９　ＡＰＭＡ、ＡＰＭＡ＋ストロメリシン、トリプシン又はトリプシン＋スト ロメリシンにより活性化された、ヒト歯肉繊維芽細胞培地からのプロコラ−ゲナ ーゼの電気泳動分析を示す。

表１　ヒト・プロストロメリシンのアミノ酸組成表２　ヒト・ストロメリシンの アミノ酸組成能　の蕾　なｉ゛Ｈ 下記の実施例では、プロストロメリシンは４−アミノフェニル第２水銀アセテー トで処理して活性化され成熟ストロメリシンを生成する。しかし、酵素消化のよ うなプロ酵素を切断する別の方法を使用して別の形態のストロメリシンをつくる ことができ、これらは本発明の範囲内であることは理解されよう。

１．１ストロメ１シン　コー゛　る　ギｃＤＮＡの４−アミノフェニル第２水銀 アセテート（ＡＰＭＡ）で活性化された（Ｃａｗｓ　ｔｏｎとＭｕｒｐｈｙ　： 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋　８０巻、７１１−７２２頁 （１９８１）　）ウサギ繊維芽細胞ストロメリシンをカルヴアリエ（ｃａｌｖａ ｒｉａｅ　）の培地（Ｇａｌｌｏｗａｙ、　Ｗ、　Ａ、ほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、跋五７４１−７５２　（１９８３）　）から精製した。それを還元し、カル ボメチル化し、アプライド・バイオシステムズ社の気相配列決定装置で自動化エ ドマン分解法によるＮ−末端配列決定に供した。ウサギ・ストロメリシンとコラ −ゲナーゼｃＤＮＡの両方に理論上ハイブリッド形成することができるように、 既に記載されているルールに従って、５０塩基オリゴヌクレオチドプローブを設 計した（Ｇｒａｎｔｈａｍ　Ｒ，ほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１５　Ｒｅｓ、　 ９＋ｒ４３−ｒ４７　（１９８１）及びＬａｔｈｅ、　Ｒ，Ｊ、　１ｌｏｌｅｃ 、　Ｂｉｏｌ、　１８３＋１２２５２−１２２５８　（１９８３）　）。それは ２つの連続した２５マー（ｂとＣ１図１）として自動化固相ｐｈｏｓｐｈｏｔｒ ｉｅｓｔｅｒ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにより合成した後、ＨＰＬＣで精製した（Ｐ ａｔｅｌ、Ｔ、　Ｐ、ほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０　５ ６０５−５６１９　（１９８２））。相補的な２６マー（ｄ　”）もつくった（ 図１参照）。

正常な溝膜の外殖片由来のウサギ繊維芽細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２　） 添加ダルベツコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）で全面成長させた。洗浄後、そ れらの細胞を、５０−２００　ｎｇ　ｄ！−’の１２−〇−テトラデカノイルフ ォルポルー存在下で無血清培地中に４８時間保持した。ｍＲＮＡを、グアニジニ ウム・イソチオシアナート／熱フェノール法により、約５。

１０７の細胞から分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ほか、１９８２　ｉｎ。

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ；　Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ）後、オリゴ（ｄＴ）−セルロース・カラムクロマトグラフィーを 行った（ＡｖｉνとＬｅｄｅｒ，　１９７２ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　６９　１４０８ −１４１２　）　、標準的な方法を用いて、ｃＤＮＡを合成しくＧｕｂｌｅｒと Ｈｏｆｆｍａｎ，　１９８３　Ｇｅｎｅ　２５　２６３−２６９）　、７５。

０００プラークのライブラリーを、ＨｕｙｎｈほかによりＤＮＡＣＩｏｎｉｎｇ νｏｆ　１　ｅｄ．　Ｄ．　Ｍ．　Ｇｌｏｖｅｒ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ｐ４ ９−７８に記載されているのと本質的に同様にして、ＥｃｏＲｌ　リンカ−を使 用してｃＤＮＡをλｇｔｌＯの中にリガーゼで結合した。

オリゴヌクレオチドプローブは、図１で（ｃ）と標識された２５マーをキナーゼ 反応に供し、次にそれを（ｂ）と標識された２５マーに、相補的な２６マー（ｄ ）の存在下でリガーゼで結合した。リガーゼによる結合により生じた５０塩基オ リゴヌクレオチドプローブを、変性ポリアクリルアミドゲルより精製しくＭａｘ ａｍ八．Ｍ＆　Ｇｉｌｂｅｒｔ　Ｗ．、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ＋　６５巻，　４９９−５６０真（１９８０）　、次にキナーゼで処理 して比活性的３．１０”　Ｃｅ　ｃｐｒＨｔｇ−’にした。

プラークをニトロセルロースフィルターに移し、変性し、次いで５ｘｓｓｃ　（ 標準食塩−クエン酸緩衝液）、５×デンハート液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏ ｌｕｔｉｏｎ　）　、５０ｍＭ　ＮａＨｚＰＯａ、１００　８ｇ　ｄの変性され たサケ精子ＤＮＡ中で、６０°Ｃで６時間、ブリハイブリッド形成を行った。次 に、０．１％ＳＯＳと約４ｎｇ　ｄ−’濃度のプローブＤＮＡが添加された同じ 緩衝液中、４０°Ｃで１６時間、ハイブリッド形成を行った。次に、フィルター を６　Ｘ　ＳＳＣ中で洗浄した後、最後に厳密な洗浄（　ｌｘｓｓｃ．　０．１ ％ＳＤＳ．　５０℃で１５分）を行い、次に強化スクリーンを用いて１６時間オ ートラジオグラフィーを行った。陽性と推定される１０プラーグを同定したとこ ろ：そのうち１つが上述と同様に行った２回目のスクリーニング後陽性シグナル を示した。ＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡ挿入断片をプラスミドｐＳＰ６４中にサブ クローニングした（Ｍｅｌｔｏｎ　Ｄ．Ａ．ほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ 　Ｒｅｓ．　１２．　７０３５−７０５６（１９８４））、　ｃＤＮＡの完全な ヌクレオチド配列を、制限フラグメントをＭ１３中にサブクローニングし、ＪＭ ＩＯＩ（Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ．　＆　Ｖｉｅｉｒａ，　Ｊ．　Ｇｅｎｅ　旦。

２６９−２７６（１９８２））に形質転換した後に、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅ ｎ　Ｆ．。

Ｎｉｃｋｌｅｎ　Ｓ．及びＣｏｕｌｓｏｎ　Ａ．、Ｒ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ 。

Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　［ＩＳＡ　７４．５４６３−５４６７（１９７７））で 決定した。

図２に示すように、このｃＤＮＡは５３２ヌクレオチドの長さで、ポリＡ域（ｔ ｒａｃｔ）を欠くにも拘わらず、１７０アミノ酸をコードするオープンな読み枠 を有する。残基１０１−１２７はウサギストロメリシン（図１）のＮ−末端アミ ノ酸配列と同じであり、したがってこのｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配 列はウサギストロメリシンのＮ−末端側３番目を表す。したがって、このｃＤＮ Ａを、ヒトストロメリシンｃＤＮＡを同定するプローブとして使用した。これは 、〔α−”Ｐ）ｄＡＴＰ及びクレノー・フラグメントで、ランダム・ヘキサヌク レオチド法（ＦｅｉｎｂｅｒｇとＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９８３，　Ａｎａｌ ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ＋　３２＋６−１３）を使用してラベルして、比活性２．１ ０’　Ｃｅ　ｃｐｓ　ｐｇ−’とした。

１、２　ヒトｃＤＮＡがコードするストコメ１シンの　−歯肉の外殖片（継代３ 〜６）由来のヒト繊維芽細胞を、０．２％ラクトアルブミン加水分解物及び５％ 部分精製ブタＩＬ−１添加ＤＭＥＭ中で培養した。４８時間後、ｍＲＮＡを、約 ５Ｘ１０”細胞からグアニジウムイソチオシアネートｌＣｓＣｌ法により単離し た（Ｍａｎｉａｔｉｓほか，　１９８２，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ　：　Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　；　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

ニューヨーク）。このｍＲＮＡを使用して、本質的に上述したようにして、λｇ ｔｌｏで２００，　０００のＮｉ換えプラークのライブラリーを発生させた。こ れらのプラークをニトロセルロースに写し、変性し、５　ＸＳＳＣ　、　５０％ ホルムアミド、５　ＸＤｅｎｈａｒｄＬ溶液、１００μｇｒｎｌ−’変性サケ精 子ＤＮＡの溶液中で４２°Ｃ１６時間プレハイブリッド形成させた。次いで、こ れらを、０．１％ｓＤｓと最終濃度で約１７ｎｇ　ｍｆｌ−’のウサギストロメ リシン・プローブｃＤＮＡとが添加された同じ緩衝液中で４２”Ｃ、４８時間ハ イブリッド形成を行わせた。次にフィルターを２　ＸＳＳＣ　、　０．１％ＳＤ Ｓで最高に厳格に４２゛Ｃ、３０分間洗浄した後、強化スクリーンを用いて４８ 時間オートラジオグラフィーを行った。陽性と推定される２１プラークを同定し たところ、そのうち１６が上述のように行った２回目のスクリーニングの後明確 な陽性シグナルを示した。代表的なプラークのｃＤＮＡ挿入フラグメントを単離 し、プラスミドｐＳＰ６４中にサブクローニングした（Ｍｅｌｔｏｎ　Ｄ．Ａ． はが、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２．７０３５−７０５６（１ ９８４））　、最大の挿入セグメント　（複数）の制限地図作成によって、これ らが関連したオーバーラツプするＤＮＡセグメントであることが確認された（図 ３）。制限フラグメントをＭ１３にサブクローニングし、ＪＭＩＯＩに形質転換 した（Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ．とＶｉｅｉｒａ，　Ｊ．　Ｇｅｎｅ　ｌｆｉ＋２６ ９−２７６　（１９８２）　）後に、これらのヌクレオチド配列をジデオキシ法 　（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ．、　Ｎｉｃｋｌｅｎ　Ｓ，及びＣｏｕｌｓｏｎ　Ａ．Ｒ ．、Ｒｒｏｃ．　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ，　Ｓｃｉ．ｌＩＳＡ　７４，５４６３−５４６７（１９７７））で決 定した。この情報を図４に示す。図４で、実線の矢印はジデオキシ配列決定の方 向を示し、破線の矢印はマクサム・アンド・ギルバート法（Ｍａｘａｍ，　Ａ． Ｍ．とＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８ ０）　６５＋４９９−５６０）による配列決定の方向を示す。

１、３　−・トｃＤＮＡくコー゛するス　コメ１シンの６私達は、ウサギ・スト ロメリシンと、ラットｃ　ＤＮＡ　（ｐＴＲｌと称される。）　（Ｍａｔｒｉｓ ａｎ　Ｌ．Ｍ．ほか、ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　４　。

１４３５−１４４０（１９８５））から予想される別のアミノ酸配列との間に高 度の相同性を発見した。このｃＤＮＡは、ポリオーマウィルスもしくはラウス肉 腫ウィルスのいずれかを感染させた後の、又はミドルｔオンコジーン（Ｉｌｌ瘍 遺伝子）もしくは細胞オンコジーンＨーラスのいずれかでトランスフェクション したのちの正常な繊維芽細胞に非常に冨んでいるｍＲＮＡに対応する。同じｍＲ ＮＡが繊維芽細胞をＥＧＦにさらした後に明確に誘導されることも報告された（ Ｍａｔｒｉｓｉａｎ　Ｌ．Ｍ．ほか、ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ↓。

１４３５−１４４０（１９８５））。ｐＴＲｌでコードされるラットのタンパク 質の予想されるＭｒは、約５３０００で、ウサギ・ストロメリシンｍＲＮＡのイ ンビトロにおける翻訳産物とよく一致する（Ｆｒｉｓｃｈ　Ｓ。

Ｍ、、　Ｃｈｉｎ　Ｊ、Ｒ，と―ｅｒｂ　Ｚ、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、９７ ．（２，Ｐｔ、５）：　４３０ａ（Ａｂｓｔｒ、）　（１９８３））　、データ は示されていない。〕。そこで、私達は、ｐＴＲｌによりコードされるタンパク 質はラット・ストロメリシンであると結論する。ｐＴＲｌをラット・ストロメリ シンであると同定できたので初めて、組換えＤＮＡ技術を使用するラット・スト ロメリシンの製造が可能となった。

２、ヒ　・ストロン１シンｃＤＮＡのヌ　レオチ′　ｌと　只ｉｓラーＬム酸配 Ｊ４ このｃＤＮＡは１８２５ヌクレオチ・ドの長さであり、ポリアデニル化（ｐｏｌ ｙａｄｎｙｌａｔｉｏｎ）シグナルＡＡＴＡＡＡ　（ＰｒｏｕｄｆｏｏｔとＢｒ ｏＩ４１ｅｅ。

１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２５２．３５９−３６２）が先行するポリＡテールを 有するので３′末端が完全であるようである。これは、４７７アミノ酸からなる ポリペプチドに翻訳されるオープン読み枠（ヌクレオチド５１から１４８１まで ）を含んでいる。このｃＤＮＡがストロメリシンをコードする証拠は、ヌクレオ チド３４８〜４２８によってコードされる２７のアミノ酸の２４個が、ＡＰＭ＾ 活性化ウサギ・ストロメリシンをＮ−末端配列決定する（図１ａ、図４）ことに より同定された２７個のアミノ酸と同一であり、かつ同じ位置にあることの発見 に基づいている。さらに、その分子のＮ−末端側３番目にあるアミノ酸（複数） のほとんどは、ウサギの部分的ストロメリシンｃＤＮＡから予想されるアミノ酸 （複数）と同じあり、かつ同じ位置にある。

疎水性プロットにより、ヒト・ストロメリシンは、１７アミノ酸からなる疎水性 Ｎ−末端配列を除いて、がなり水溶性であることが示唆される。このことは、こ れらのアミノ酸が成熟タンパク質を解放する分泌の際に切断されるシグナル配列 の疎水性コアであることと一致する。メタロプロテアーゼはプロ酵素として分泌 される（Ｈａｒｒｉｓ＋Ｅ、Ｄ、ほか、　ＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｒｅｌ　Ｒｅｓ　 ４゜４３９−５１２（１９８４））と考えられるので、私達は、該シグナル配列 と、ＡＰＭＡ活性化状態のウサギストロメリシン（ヒト・ストロメリシン配列中 の残基１００）のＮ末端にあるフェニルアラニン（Ｆ）との間に見出されるアミ ノ酸（複数）が、活性化中に切り取られると結論する。したがって、プレプロス トロメリシンはアミノ酸１〜４７７から構成されると考えられ、プロストロメリ シンはアミノ酸１８〜４７７から構成されると考えられ、そしてストロメリシン はアミノ酸１００〜４７７から構成されると考えられる。プロストロメリシン及 びストロメリシンのアミノ酸組成を、コアタンパク質の分子量とともに、それぞ れ表１及び２に示す。この配列中には潜在的なグリコジル化（糖形成）部位が存 在するので、適当な細胞（下記参照）内でこれらのタンパク質が発現すると、グ リコジル化産物が生成する可能性があると想像される。

３、ストコメ１シンの翻ｉ′告 ３．１人１１０３λ灸現 ＮＨ，−末端メチオニン残基を追加したストロメリシン又はプロストロメリシン （ｍｅｔ−ストロメリシン又はｍｅｔ−プロストロメリシン）の大腸菌内での発 現は、オリゴヌクレオチドリンカーを使用して上の２項に記載し図４に示した成 熟ストロメリシンもしくはプロストロメリシンをコードする配列に、プロモータ ー、シャインダルガノ配列及び開始ＡＴＧコドジを結合することにより、達成す ることができる。大腸菌の旦ＬＥプロモーター及びシャインダルガノ配列を使用 することができる。

表１ ヒト・プロストコメ１シンのアミノ　１八亙　Ｉ！Ｌ　ｘｔｓ Ｆ　３２　６．９６　４７０４　９．０２Ｌ　３Ｂ　８．２６　４２９４　Ｂ、 ２３１　２０　４．３５　２２６０　４．３３Ｍ　６　１．３０　？８６　１． ５１ Ｖ　２８　６．０９　２７７２　５．３１Ｓ　２７　５．８７　２３４９　４． ５０Ｐ　３６　７．８３　３４９２　６．６９Ｔ　２７　５．８７　２７２７　 ５．２３Ａ　２７　５．８？　１９１７　３．６８Ｙ　１７　３．７０　２７７ １　５．３１Ｈ１３２，８３１７８１３，４１ Ｑ　９　１．９６　１１５２　２．２１Ｎ　１６　３．４８　１８２４　３．５ ０Ｋ　３２　６．９６　４０９６　７．８５Ｄ　３６　７．８３　４１４０　７ ．９４Ｂ　３０　６．５２　３８７０　７．４２Ｃ３０，６５３０９０，５９ Ｗ　８　１．７４　１４８８　２．８５Ｒ２３５，００３５８８６，８８ Ｇ　３２　６．９６　１８２４　３．５０合計　４６０　５２１６２ 表２ ヒト・ストコメ１シンのア）ノｆｆｉ 歿基　数−ｙｉ　量　、笈 Ｆ　３０　７．９４　４４１０　ｌ０１３ＬＬ　３０　７．９４　３３９０　７ ．９２１　１９　５．０３　２１４７　５．０２Ｍ　３　０．７９　３９３　０ ．９２ Ｖ　１９　５．０３　１８８１　４．４Ｏ３２４６，３５２０８８４，８８ Ｐ　３２　８．４７　３１０４　７．２５Ｔ　２４　６．３５　２４２４　５． ６７Ａ　２５　６．６１　１？７５　４．１５Ｙ　１３　３．４４　２１１９　 ４．９５Ｈ１２３，１７１６４４３，８４ Ｑ　６　１．５９　７６８　１．７９ Ｎ　１４　３．７０　１５９６　３．７３Ｋ　２２　５．８２　２８１６　６． ５８Ｄ　２８　７．４１　３２２０　？、５３Ｅ　２５　６．６１　３２２５　 ７．５４Ｃ２０，５３２０６０，４８ Ｗ　８　２．１２　１４８８　３．４８Ｒ１７４，５０２６５２６，２０ Ｇ　２５　６．６１　１４２５　３．３３合計　３７８　４２７８９ これらの配列は例えばプロスミドｐＣＴ５４上に存在し、その中に関心のあるタ ンパク質をコードするＤＮＡ配列をＣ１ａ一部位に挿入することができる（Ｅｉ ｔａｇｅほか、（１９８３）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　８０．３６７１−３６７５）。しかし、これら又は他の プロモーター及びシャインダルガルノ配列をやはり収容するが、増やすことがで き、それからの発現をしっかりと［ｉｆｆすることができる他のプロスミドも使 用できる（例えば、ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ２−０１２１３８６参照）、。

シグナルをコードする配列は有しないが追加のＮ−末端メチオニンコドンは有す る、ストロメリシンもしくはプロストロメリシンをコードする配列を、大腸菌発 現ベクターｐ？ｌＧ１９６の中に挿入してもよい。これは、標準の組換えＤＮＡ 技術により達成できる（Ｍａｎｉａｔｉｓほか、　（１９８２）　、　Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、３９０ −４３３）　ｏストロメリシン又はプロストロメリシンの発現は、ヨーロッパ特 許出願に８６３０００４２゜８に、ＴＩＭＰの発現に関して記載された技術に類 似する技術を使用しても達成することができる。

３．２　１；のス　ロ　！シンの　り 上述のように構成されたブロスミドを収容する大腸菌細胞は、最適発現条件で増 殖させると、ｍｅｔ−ストロメリシン又は５ｅｔ−プロストロメリシンを全細胞 タンパク質の１０％までの濃度で生産する。

粗大臆面抽出物からの可溶性タンパク質百分を、Ｇａｌａｗａｙほか、（１９８ ３）（Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　Ｊ、、２０９．７４１−７５２）により本質的に記 載されているようにして、ストロメリシン活性について分析する。

大腸菌内に発現される５ｅｔ−ストロメリシンの一部又は全部が、不溶性の状態 にあり、そのため上記分析では検出されないことがある。このような状況下では 、それは分析及び精製の前に可溶化され、活性化される。メチオニンープロチモ シン生産に関してこれがどのように達成され得るかの一例が、私達の同時に係属 中の国際特許用１ｆＮＰＣ，Ｔ／ＧＢ８３１００１５２　（Ｗ０８３１０４４１ ８として公開）及び公開されたイギリス国特許出＠ＧＢ２１００７３７　Ａに記 載されている。可溶性で活性の部分的に精製されたストロメリシンを得た後に、 例えば、Ｇａｌａｗａｙほか（１９８３）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２０９， ７４１−７５２に記載のように、標準的なタンパク質精製技術を用いてさらに精 製する。

３．３４−ノ」己と（至）Ω１旦 大腸菌中での発現を行わせるのに用いたのと同様に標準的な組換えＤＮＡ技術を 使用して、イースト中でストロメリシンを発現させるのに適するプラスミドベク ターを調製する。その調製は、例えば、同時に係属中の公開されたヨーロッパ特 許出願ＥＰ−Ａ２−００７３６３５に記載のベクターに基づく。これらのベクタ ーは、イースト・ホスホグリセリート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターとＰＧ Ｋ遺伝子の３′非翻訳末端とに挾まれた、ストロメリシン又はプロストロメリシ ンをコードする配列を含んでいる。

ストロメリシン又はプロストロメリシンのｃＤＮＡのＰＧＫプロモーターに対す る方向は、大腸菌内での発現について述べたように追加のＮＯ３−末端メチオニ ン残基を有する成熟ストロメリシン又はプロストロメリシンの発現が確実である ようになっている。あるいは、ストロメリシン又はプロストロメリシンをコード する配列をベクターに、ストロメリシン・シグナル配列が、然るべき場所に残る ように結合することによって、プレストロメリシン又はプロストロメリシンを発 現させてもよい。イースト・シグナル配列（例えば、イーストα−因子シグナル 配列（Ｋｕｒｊａ＋１　とＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）、Ｃｅ１１．３ ０．９３３−９４３）　と、成熟ストロメリシン又はプロストロメリシンとの間 の融合タンパク質の発現は、適当なリンカ−の使用によって達成することができ る。これらのプラスミドＤＮＡは、例えばＢｅｇｇｓの方法（Ｎａｔｕｒｅ。

（１９７８）、匡、１０４−１０９）により細胞中に導入される。

３．４イースト　）°のス　コメ１シンの　１これらのプラスミドを含有するイ ースト細胞は、ストロメリシン発現の最適条件下で増殖させると、全細胞タンパ ク質の５％までの濃度でストロメリシン又はプロストロメリシンを生産する。上 述の代替物によって、ストロメリシン又はプロストロメリシンはイースト細胞か ら分泌されることもあり、されないこともある。発現されたストロメリシンは、 細胞間に生産された場合には、上述したのと本質的に同様に定量され、分析され 、精製される。分泌された場合には、標準のタンパク質精製技術（Ｇａｌａｗａ ｙはか（１９８３）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、２０９，７４１−７５２）によ り細胞上清から精製される。

３．５量立チ　でのストロメ１シンの プレプロストロメリシンをコードするｃＤＮＡを、下記のために具体的に設計さ れた別種の発現ベクターの中に挿入した＝１、　ＣＯ５細胞中での一過性発現（ Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｙ、　（１９８１）　Ｃｅ１ｌ　２３．（７５−１８２）　、 及び２．Ｃｌ２７細胞内での安定な発現（Ｌｏｗｙ、Ｄ、Ｒ，ほか、Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、（１９７８）　２６．２９１−２９８）　、必要なりＮＡ操作には 標準の技術を採用した（Ｍ、＋１ｉａｔｉｓほか、　Ｉｎ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、１９８２．　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｒａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

ニューヨーク）。ベクターへの挿入のために、ｃＤＮＡを、まず、ヌクレオチド １５９１−１５９６　（図４）によってコードされるＱｖａ　１部位をＥｃｏ　 Ｒ１部位に転換して作り変えた。これは、ｃＤＮＡをＡｖａ　Ｉで切断し、Ｔ４ ポリメラーゼで詰めた後、Ｅｃｏ　Ｒ１リンカ−での切断時に、図４におけるヌ クレオチド１−６によりコードされる５　’　Ｅｃｏ　Ｒ１部位から新たに作り 出されたＥｃｏ　Ｒ１部位まで延びている、プレプロストロメリシンをコードす る１６００ｂｐのＥｃｏ　Ｒ１フラグメントが発生する。このフラグメントを１ ％の低ゲル化温度アガロースゲルから精製し、次にｐＢＲ３２２ＣＯＳ細胞ベク ターの“無毒（ｐｏｉｓｏｎ　ｍ１ｎｕｓ）″誘導体中の、ＳＶ４０後期（ｌａ ｔｅ）プロモーターとＳＶ４０初期（ｅａｒｌｙ）ポリアデニル化ｉｌ！節要素 との間にリガーゼで結合した。プレプロストロメリシン配列をＳＶ４０後期プロ モーターに対して適切な方向で含有しているベクターＤＮＡを塩化セシウム勾配 より精製し、ＤＥＡＥデキストランを使用してＣＯ３細胞の中にトランスフェク ションした（Ｌｏｐａｔａ、Ｍ、Ａ、ほか、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ ｓ、、１９８４＋　１２．５７０７−５７１７）。無血清上清を、トランスフェ クション後７２時間で回収した。

Ｃ１２７内での発現のために、初期ＳＶ４０ポリアデニル化調節要素を有するプ レプロストロメリシン配列を、Ｐｓｔ　１〜Ｂａｍ　ＨｌフラグメントとしてＣ Ｏ３細胞ベクターから除去し、マウスメタロチオニン■プロモーターの制御下で ベクターに基づいてウシ乳頭腫ウィルス　（パピローマウィルス）　（ＢＰＶ） 中に入れた。この配置は、メタロプロテアーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ） の発現のために記載されたのと本質的に同様であった（Ｄｏｃｈｅｒｙほか＋Ｎ ａｔｕｒｅ１９８５、　３甘、６６−６９及びイギリス国特許出願ＧＢ２１６９ ２９５Ａ）　、プレプロストロメリシンをコードするＢＰＶベクターをカルシウ ムホスフェート共沈法（Ｗｔｇｌｅｒ、Ｍ、ほか１９７８．　Ｃｅ１１．１４， ７２５−７３１）によってＣ１２７細胞内に導入し、ＣｄＣＩ！　ｚ　（２０ｕ 　Ｍ）−及びＺｎＣ１２ｚ　（２０μＭ）−耐性フォーカスを選択した。ストロ メリシン産生細胞系を２１日後に同定し、無血清培地の発生に使用した。

４、ストコメ１シンゞ　び９＃。

上述のようにして生産されたストロメリシンをトリプシン又はＡＰＭＡで活性化 した。トリプシンを、ストロメリシンと、１：１００〜１：１のような割合でイ ンキュベートしたのち、１０倍過剰のダイズトリプシンインヒビターを添加した 。０．１〜１０μｇｍｌ−’のごときトリプシン濃度を用い、温度とインキュベ ーション時間は下記のようにした。４−アミノフェニル第２水銀アセテート（Ａ ＰＭＡ）での処理は、３７°Ｃにおいて、１〜２０Ｍの濃度で下に示す様な時間 行った。ストロメリシン活性は１４Ｃ−アセチル化カゼインを使用して３５°Ｃ で１又は４時間測定した。１単位のストロメリシンは、３７℃でカゼイン１μｇ ／ｌ１ｌｎ分解する。

上に記載しまた下でさらに詳しく説明するような活性化の前後のストロメリシン を２０ｍＭ　ＥＤＴＡで処理し、５００＋ｍＭ　２−メルカプトエタノールで還 元し、ＳＯ５の存在下１０％ポリアクリルアミド・ミニゲルを通した。ゲルをニ トロセルロースに電気移行（ｅｌｅｃｔｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）させ、ヒト・ス トロメリシンを検出できる、ウサギ・ストロメリシンに対する抗血清（Ｍｕｒｐ ｈｙｐ　Ｇ、ほか。

ＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｒｅ１．　Ｒｅｓ、１９８６．６　、３５１−３６４）と、 ペルオキシダーゼ標識第２抗体（Ｈｅｍｂｒｙ、Ｒ，Ｍ、ほか、　Ｊ、　Ｃｅ１ ｌ　Ｓｃｉ、　１９Ｂ５．７３゜１０５−１１９）とを用いて酵素バンドを可視 化した。

図５に示すように、プロストロメリシン調製物Ａ（ヒト歯肉繊維芽細胞培地から 精製したもの）、Ｂ（ストロメリシン含有ベクターでトランスフェクションした Ｃ１２７細胞から分泌されたもの）及びＣ（ストロメリシン含有ベクターでトラ ンスフェクションされたＣＯ３細胞により分泌されたもの）を次のように処理し た。１．　無処理；　２．　Ｉ　ｍＭ　ＡＰＭＡで３７°Ｃ，２時間インキュベ ーション？３．　１０／μｇ／ｄ　トリプシンと３７°Ｃ５３０分間インキュベ ーション、４．３．にダイズトリプシンインヒビターを添加した以外同じで３０ 分間のインキュベーション後、さらに３７°Ｃ２２時間インキュベージジン、　 ５．１００μｇ／Ｉｉ）リブシンで４°Ｃ１１０分間インキュベーション；６． １０μｇ　／　ｍｌ　トリプシンと４°Ｃ５分間インキュベージジン；７．６に ダイズトリプシンインヒビターを添加した以外同じで、５分間のインキュベーシ ョン後、さらに３７°Ｃ１２時間のインキュベーション、試料を、３０３９１０ ％ポリアクリルアミドゲルでかつ還元条件で電気泳動させ、ニトロセルロース上 にエレクトロプロットし、ヒツジ抗つサギストロメリシン抗体及びペルオキシダ ーゼ標識ウサギ抗ヒツジＩｇＧを使用して可視化した。

回６に示すように、ストロメリシン含有ベクターでトランスフェクションしたＣ １２７ｔａ胞により分泌されたプロストロメリシンを、Ａで、（・）　０．１　 ｔｔｇ／ｍｌ　トリプシンと、　（Δ）　１　ｕｇ／ｄ）リブシンと；Ｂで、（ ロ）１０μｇ／Ｉｒ１１トリプシンと；Ｃで、（）１００μｓ／ｄ）リブシンと 、２０μｌの容量で、３７°Ｃ（ぬりつぶした記号の場合）又は４°Ｃ（白ぬき の記号の場合）で、インキュベートした。また、Ｄでは、（◆）　２ｏ＋Ｍ　Ａ ＰＭＡと３７°Ｃでインキュベートした。誘導された活性を、ダイズトリプシン インヒビター添加後、３７°Ｃ，１時間の分析で、１４（−カゼインの分解によ り測定した。トリプシンもＡＰＭＡもなしでインキュベートされたストロメリシ ンは何ら活性を示さなかった。

プロストロメリシンはＡＰＭＡで（図６に示すように）種々の長さの時間の間活 性化された。次に、試料を２０ｍＭ　ＥＤＴＡで処理し、ＳＯＳを含む１０％ポ リアクリルアミドゲル上で還元条件下で電気泳動させ、エレクトロプロットし、 図５及びメソード（Ｍｅｔｈｏｃｌｓ）に記載のように可視化した。図７はＳＯ ５分析を示し、ここで列（Ｔｒａｃｋ）　１　、０分；列２．３０分；列３．一 時間；列４，２時間；列５．４時間−列６．１５時間。

ヒト歯肉繊維芽細胞由来の精製した天然ストロメリシン、又はＣＯ３もしくはＣ １２７細胞により分泌された組換え酵素の一方の前駆体は同じＭｒ５７０００を 有し、少量の６００００の成分（多分、グリコジル化のため（Ｎａｇａｓｅ、　 Ｉ（、ほか（１９８３）、Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、　Ｊ、、　■シ２８１−２８８） 　；図・５で、レーンＡＩ、Ｂｌ、ＣＩ）を伴っていた。

これらの前駆体はカゼインや他の基質に対して完全に不活性であった（Ｇａｌｌ ｏｗａｙ、Ｗ、＾、ほか、（１９８３）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２０９．７ ４１−７５２）が、トリプシンで（例えば、Ｃ１２７ストロメリシン、図６Ａ− Ｃ）　あるいはより低効率ではあるがＡｆｌｌＡで活性化して、これらの基質を 分解することができた（図６Ｄ）。トリプシン活性化は広範囲の濃度にわたって 最適であった。４°Ｃで、限界の低速度で行うことができた（図６Ａ−Ｃ）。非 常に高濃度のトリプシン以外はストロメリシンを不活性化しなかった。八ＰＭＡ による活性化はより低速で、トリプシン値の５８％（ＣＯ３）〜９０％（Ｃ１２ ７及び天然）を達成した。最大のＡＰＭＡ活性化は３７°Ｃ１４〜８時間で得ら れた（図６）が、活性化はストロメリシン濃度に依存することがわかった（５０ 単位／　ｍｌ　ｉＩｉ製の１０倍希釈で最善の７３％であり、１００倍希釈で３ ３％である）。したがって、非常に低濃度の酵素、例えばＣＯＳ細胞培地では、 １５時間のインキュベーション後であっても多分最高には活性化されなかった。

プロストロメリシンに対するこれらの処理の効果をゲル電気泳動及びイムノブロ ッティングにより分析したところ、Ｍｒの減少が起こってＭｒ５００００と４８ ０００の２種の主要な分子種が、ＡＰＭＡの場合には徐々に（例えば、Ｃ１２７ ストロメリシン、図７）、ソシテトリプシンの場合には大変急速に（ＩＤ５．　 Ａ’３　、Ｂ３．　５　。

Ｃ３，５）生じた。ＡＰＭＡとのより長いインキュベーション時間では、ストロ メリシンのＭｒ、２８０００フオームが痕跡量生成した（図７）。プラスミンも 、トリプシンで生産されるものと同じＭｒのバンドを発生させるのに使用するこ とができた（データ示さず）、最適活性化（図６に示したような）には上側ダブ レットを下側ダブレフトに完全に転換する必要がなかった（図５；レーアＡ６． Ａ７　；図３．　レーン４）ことが注目された。コラ−ゲナーゼを使用して、５ ｔｒｉｃｋｌｉｎほか（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２゜６３−６８（１９８ ３））が、Ｍｒ損失前に検出可能な活性に関し類似の観測を報告している。完全 な分子内で配座変化が起こり、次の自己開裂に至ることが提案されている。誘導 されたストロメリシンの活性は３６０単位／ＩＩＩｇであった。

５、　コーー゛　−ゼゞ　の′”　＼　と゛コラーゲナーゼを、ストロメリシン について記載したようにして、また下に詳しく説明するようにして活性化した。

電気泳動分析をストロメリシンについて記載したように行った。ただし、酵素バ ンドは、抗ヒトコラ−ゲナーゼ抗血清を使用した後ペルオキシダーゼ標識第２抗 体を使用して可視化した（Ｈｅｍｂｒｙ。

Ｒ，Ｍ、ほか、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、　１９８５．７３．１０５−１１９） 　、コラ−ゲナーゼを、３５°Ｃ２４時間、１４Ｃ−アセチル化コラーゲン拡散 繊維測定法Ｃ４Ｃ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｄｉｆｆｕｓｅ 　ｆｉｂｒｉｌ　ａｓｓａｙ）により測定した（Ｗｈｉｔｈａｍ、　Ｓ、　Ｅ、 ほか、Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、　Ｊ、　１９８６．　２４０９１３−９１６）。１ 単位のコラ−ゲナーゼがＩ型コラーゲンを３５°Ｃで１μｇ／ａ＋ｉｎ分解する 。

図８は、プロコラ−ゲナーゼ調製物Ａ（コラ−ゲナーゼ含有ベクターでトランス フェクションされたＣ１２７細胞により分泌されたもの）及びＢ（ヒト歯肉繊維 芽細胞培地から精製されたもの）を、種々の量の（・）精製ヒト繊維芽細胞プロ ストロメリシン、又は（■）ストロメリシン含有ベクターでトランスフェクショ ンされたＣ１２７細胞により分泌されたプロストロメリシンの存在下で、１０μ ｇ／ｄのトリプシンとともに３７°Ｃ１３０分間インキュベートした後、過剰量 のダイズトリプシンインヒビターを添加した時の結果を示す。白ぬきの記号は、 トリプシン不存在下における対応する活性化ストロメリシンの効果を意味する。

活性は、茸４Ｃ暑型コラーゲンを用い、３５°Ｃ１４時間測定した。

結果は、トリプシンだけの場合の活性に対し、ストロメリシンにより誘導された 活性増が何倍であるとして表現した。

図９は、次のようにして処理されたヒト歯肉繊維芽細胞培地から精製したプロコ ラ−ゲナーゼの電気泳動分析を示す。】、無処理；２．　１ｍＭＡＰＭ八と３７ °Ｃ，２時間インキュベーション；３゜精製ストロメリシンの存在下で２．と同 様に；４．１０μｇ　／　ｍｌのトリプシンと３７°Ｃ１３０分間インキュベー ションした後、ダイズトリプシンインヒビターを添加；５．　ストロメリシンの 存在下で４．と同様。

精製された天然プロコラ−ゲナーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 及びコラ−ゲナーゼにたいする特定抗血清を用いるプロッティング（図９；レー ン１）による分析では、Ｍｒ５５０００であり、Ｍｒ５９０００の成分が少量伴 った。このプロコラ−ゲナーゼは、５ｔｒｉｃｋｌｉｎほか（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　２２＋　６３−６８（１９８３））により記載されているように正確 に作用する。ＡＰＭＡ又はトリプシンの処理によって活性化することができ、Ｍ ｒｌｏ。

０００となった（図９．レーン２及び４）。誘導された活性は非常に低く、３２ ０単位／■の域であった。同様の観測がＶａ　ｔｅｒほかによってもウサギ・プ ロコラ−ゲナーゼについて行われた（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　■［，９３７４−９３８２（１９８３））　、しかし 、精製した又組換えヒト・プロストロメリシンを活性化混合物に含めると、コラ −ゲナーゼ活性が８倍まで高まった（図８Ｂ）。組換えＣ１２７細胞由来ヒトコ ラ−ゲナーゼを分子量及び活性に対するストロメリシンの同様の効果も得られた 。組換えコラ−ゲナーゼでは、ストロメリシンは活性を１２倍高めた（図８Ａ） 。トリプシン処理後に予め活性化したストロメリシンをコラ−ゲナーゼに添加す ると、検出される最終コラ−ゲナーゼ活性に対する効果はより小さかった（デー タ示さず）。活性ストロメリシンのみで、トリプシンのみを伴った場合に類似す るコラ−ゲナーゼ活性が誘導された。有効な活性化のためのストロメリシン：コ ラーゲナーゼの比は、コラーゲナーゼ１モル当たりスト０１９９７２モル以上過 剰のオーダーであった。一層高い比活性のストロメリシンがより効果的なアクチ ベーターとなり得る。

これらの処理の間に起こる変化を分析したところ、プロコラ−ゲナーゼが段階的 にＭｒの減少を受け、ＡＰＭＡとトリプシンが約５００００と４５０００の２バ ンドを発生させ（図９．レーン２と４）、この２バンドがストロメリシンの存在 下で４８０００と４３０００のバンドに転換された（図０．レーン３と５）こと がわかった。同じバンドパターンが天然及び組換えストロメリシンのいずれによ っても発生された。活性化ストロメリシンのみが、プロコラ−ゲナーゼにＭｒ約 ５００の非常に小さな変化をもたらし、これには４８０００及び４３０００への 限定的な別の転換が伴う模゛様であった。

Ａ　Ｂ　Ｃ １２”３４５６ ７１０〆リシソの単イ九 国際調査報告 ｗ−、ｍ−＋ｉｉｔｍ−＋＝−ｍ、ＰＣＴ／ＧＢ　８７１００４２０７ｍ１’Ｍ １４Ｍ’Ａ９”１Ｉ１４＋Ｎ＠、　ＰＣＴ、’Ｇｉｌ　Ｂ７１００４：０ＡＮＮ ＥＸ　Ｔｏ　ＴＦ！Ｅ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＳＥ、’、ＲＣ！４　Ｒ ＥＰＣＲＴ　０ＮｒＮＴＥＲＮＡτ：ＣＮＡｒ１．　、ＶＰＩＪＣＡＴＩＯＮ　 Ｎｏ、　ＰＣＴ／Ｃ，Ｂ　８７１００４２０　（ＳＡ　１７５７６）―・昏−一 一―拳−−−・曽陶−＋＋＋―−−−＋−−−−噌−・――−−――＋峻呻−− −−−−＋喝呻−・−響−−―彎

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類のストロメリシンの製造方法であって、該ストロメリシンをコードす るＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養することを含む方法。
2. ２．哺乳類のストロメリシンの製造方法であって；該ストロメリシンの前駆体を コードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養することにより、該スト ロメリシンの前駆体を製造し；該前駆体を切断して前記ストロメリシンを生産す ることを含む方法。
3. ３．本質的に純粋な哺乳類のストロメリシン、プロストロメリシン又はプレプロ ストロメリシンにおいて、該哺乳類のストロメリシン、プロストロメリシン又は プレプロストロメリシンが、ヒトのストロメリシン、プロストロメリシン又はプ レプロストロメリシンであることを特徴とするもの。
4. ４．請求の範囲第１項による方法により製造される哺乳類のストロメリシン又は プロストロメリシン。
5. ５．異種タンパツ質と哺乳類のストロメリシン又はプロストロメリシンとを含有 する融合タンパク質。
6. ６．哺乳類のストロメリシン又はプロストロメリシソ又はその前駆体のアミノ酸 配列をコードするＤＮＡ配列（但し、該ＤＮＡ配列がラット・ストロメリシンを コードする場合は該ＤＮＡ配列はｐＴＲ１　ｃＤＮＡ配列ではない）。
7. ７．哺乳類のストロメリシン、プロストロメリシン又はその前駆体をコードする ＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
8. ８．請求の範囲第７項によるベクターで形質転換された宿主細胞。
9. ９．哺乳類のストロメリシン及び薬学的に許容される賦形剤を含有する桑学的組 成物。
10. １０．患者を有効量の哺乳類のストロメリシンで処理することを含む治療方法。