JP5053435B2 - Ｖｗｆプロペプチドから成熟ｖｗｆを産生するための方法。 - Google Patents

Description

この出願は、２００７年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／９３０，８９１号（これは、参考としてその全体が本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。

発明の分野
本発明は、成熟フォンビルブラント因子をフォンビルブラント因子プロペプチドから産生する方法に関する。

細胞内でのタンパク質成熟の間に、成熟させられるタンパク質は翻訳後修飾を受ける。これらの修飾としては、とりわけ、アセチル化、メチル化、グリコシル化およびタンパク質切断が含まれる。これらの修飾は多くの場合、タンパク質機能および活性にとって必要であり、これらの修飾はまた、タンパク質、特に酵素の効率に影響することがある。

プロタンパク質（またはタンパク質前駆物質）は、これらの翻訳後修飾のうちの１つ以上によって、特にプロタンパク質からのプロペプチドの切断によって活性型に変えられる不活性タンパク質である。プロタンパク質の例としては、例えば、プロインスリン、プロトロンビン等が含まれる。

活性化タンパク質の産生は、臨床面および診断面での重要性が高い。例えば、活性化または成熟タンパク質は、血液凝固を制御するために用いることができる。

活性タンパク質は通常、生きた生物体において非常に低い量で利用可能である。従って、それらのプロタンパク質およびプロ酵素は、好ましくは、それらを活性化酵素（例えば、プロテアーゼ）と接触させることによってｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化される。

プロタンパク質から成熟タンパク質を産生する現行の方法は、固定化プロテアーゼを用いるか、または遊離溶液中で実行される。両方の方法とも欠点がある。これらの欠点の中には、処理の後でプロテアーゼが固定されるという要件がある。

フォンビルブラント因子（ＶＷＦ：Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ）は、サイズが約５００〜２０，０００ｋＤの範囲の一連の多量体として血漿中を循環する糖タンパク質である。ＶＷＦの多量体型は、ジスルフィド結合により一緒に連結された２５０ｋＤポリペプチドサブユニットで構成されている。ＶＷＦは、損傷血管壁の内皮下層への初期血小板付着を仲介し；より大きな多量体だけが止血活性も示すと考えられている。大きな分子量を有する多量体は、内皮細胞のバイベル・パラーデ小体中に保存され、刺激を受けて放出される。放出されたＶＷＦは次に、血漿プロテアーゼによってさらに処理されて、ＶＷＦの低分子量型という結果になる。

ＶＷＦは、内皮細胞および巨核球によって、大部分が繰り返しドメインからなるプレプロペプチド−ＶＷＦ（「ｐｐ−ＶＷＦ」）として合成される。シグナルペプチドの開裂時に、ＶＷＦプロペプチドは、そのＣ−末端領域においてジスルフィド結合を介して二量化する。二量体は、遊離末端間のジスルフィド結合により支配される多量体化のためのプロトマーとして働く。多量体への組み立てに続き、プロペプチドのタンパク質分解除去が行われる（非特許文献１）。

ＶＷＦプロペプチドの生理学的役割は、ＶＷＦプロペプチド分子からの切断の前か後における、ＶＷＦ多量体の組み立ての支配にあると仮定される。（非特許文献２）。ヒトにおいてプロペプチドの除去がほとんど完全なのに対して、このプロセスは、哺乳動物細胞株におけるＶＷＦの組み換え高レベル発現の場合にはあまり効率的ではない。そのような改変された細胞株由来の細胞培養上清は一般に、成熟ＶＷＦおよびＶＷＦプロペプチドのようなＶＷＦ前駆物質の混合物を含む。成熟ＶＷＦを得るために、従って、ＶＷＦ前駆物質、特にＶＷＦプロペプチドを成熟ＶＷＦに変換することが必要である。例えば、特許文献１において、この成熟は、フリンと達成される。特に、特許文献１において、ＶＷＦの成熟がｉｎ ｓｉｔｕで生じるようにフリンおよびＶＷＦを組み換え的に同時発現させることが提案されている。特許文献２においては、トロンビンを用いて成熟ＶＷＦを産生する方法が記載されており、成熟は、溶液中でまたは固体支持体上に結合されたトロンビンを用いて実行される。

欧州特許出願公開第０７７５７５０号明細書 国際公開第００／４９０４７号パンフレット

Ｌｅｙｔｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７４（１９９１），２５７−２６１ Ｔａｋａｇｉら、ＪＢＣ ２６４（１８）（１９８９），１０４２５−１０４３０

本発明は、成熟フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）をＶＷＦプロペプチドから産生するための効率的な方法を提供する。本発明は、ＶＷＦプロペプチドをイオン交換樹脂上に固定し、続いて、固定されたＶＷＦプロペプチドをフリンと成熟させ、成熟ＶＷＦをイオン交換樹脂から溶出させることにより、成熟ＶＷＦを産生する新規な方法を提供する。本発明の方法は、ＶＷＦプロペプチドからのＶＷＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟に特に適している。この方法により、高い比活性および純度を有する成熟ＶＷＦの産生が可能になる。

本発明は、成熟ＶＷＦをＶＷＦプロペプチドから産生する方法に関し、この方法は、
− ＶＷＦプロペプチドをイオン交換樹脂上に固定するステップと、
− 固定された成熟ＶＷＦを得るために固定されたＶＷＦプロペプチドとフリンを含む溶液とをインキュベートするステップと、
− 成熟ＶＷＦを溶出によりイオン交換樹脂から単離するステップとを含む。
本発明は、例えば以下を提供する：
（項目１）
成熟フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）をフォンビルブラント因子プロペプチドから産生する方法であって、該方法は：
− ＶＷＦプロペプチドをイオン交換樹脂上に固定するステップと、
− 固定された成熟ＶＷＦを得るために該固定されたＶＷＦプロペプチドとフリンとをインキュベートするステップと、
− 成熟ＶＷＦを溶出により該イオン交換樹脂から単離するステップと、
を含む、方法。
（項目２）
前記ＶＷＦプロペプチドが、組み換え起源である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記イオン交換樹脂が、トリメチルアミノエチル基（ＴＭＡＥ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記イオン交換樹脂が、クロマトグラフィーカラムに充填される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ＶＷＦプロペプチドが、前記イオン交換樹脂上に固定され、フリンと、２５℃で測定される２５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率でインキュベートされる、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記導電率が、２０ｍＳ／ｃｍ未満である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記導電率が、１６ｍＳ／ｃｍ未満である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ＶＷＦが、前記イオン交換樹脂から２５℃で測定される少なくとも４０ｍＳ／ｃｍの導電率で溶出される、項目３に記載の方法。
（項目９）
前記導電率が、少なくとも６０ｍＳ／ｃｍである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記導電率が、少なくとも８０ｍＳ／ｃｍである、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記フリンが、ＣａＣｌ _２ を０．０１〜１０ｍＭの濃度でさらに含む溶液中に含まれる、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＣａＣｌ _２ が、０．１〜５ｍＭの濃度である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＣａＣｌ _２ が、０．２〜２ｍＭの濃度である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記インキュベーションが、１分間〜４８時間実行される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記インキュベーションが、１０分間〜４２時間実行される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記インキュベーションが、２０分間〜３６時間実行される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記インキュベーションが、３０分間〜２４時間実行される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記インキュベーションが、２〜４０℃の温度で実行される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記インキュベーションが、４〜３７℃の温度で実行される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
フォンビルブラント疾患（ＶＷＤ）の処置用の医薬の製造のための、項目１に従って調製された成熟フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）の使用。
（項目２１）
哺乳動物におけるフォンビルブラント疾患を処置するための方法であって、項目１に従って調製された成熟フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）を該哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
（項目２２）
前記フリンが、組み換え起源である、項目１に記載の方法。

図１は、フリン活性のＣａ^２＋依存性を示す。 図２は、ＶＷＦ濃度に対する成熟効力の依存性を示す。再溶解緩衝液（１００ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐｈ＝７．０）中に溶解させた５ｍｌ ＶＷＦサンプルを、５単位フリン／Ｕ ＶＷＦで添加（ｓｐｉｋｅ）し、３７℃で２２時間インキュベートした。サンプルを、８％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、分離されたポリペプチドを銀染色により視覚化した。レーン１：１Ｕ／ｍｌ ＶＷＦ＋５Ｕ／Ｕフリン０時間、レーン２：５Ｕ／ｍｌ ＶＷＦ＋５Ｕ／Ｕフリン０時間、レーン３：１０Ｕ／ｍｌ ＶＷＦ＋５Ｕ／Ｕフリン０時間、レーン４：１Ｕ／ｍｌ ＶＷＦ＋５Ｕ／Ｕフリン６時間、レーン５：５Ｕ／ｍｌ ＶＷＦ＋５Ｕ／Ｕフリン６時間、レーン６：１０Ｕ／ｍｌ ＶＷＦ＋５Ｕ／Ｕフリン６時間、レーン７：１Ｕ／ｍｌ ＶＷＦ＋５Ｕ／Ｕフリン２４時間、レーン８：５Ｕ／ｍｌ ＶＷＦ＋５Ｕ／Ｕフリン２４時間、レーン９：１０Ｕ／ｍｌ ＶＷＦ＋５Ｕ／Ｕフリン２４時間。 図３は、ＶＷＦ濃度に対する成熟効力の依存性を示す。再溶解緩衝液（１００ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐｈ＝７．０）中に溶解させた５ｍｌ ＶＷＦサンプルを、０．５〜４．０単位フリン／Ｕ ＶＷＦで添加し、３７℃でインキュベートした。サンプルを、Ｔ＝０、２０および２４時間で抜き取った。サンプルを、８％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、分離されたポリペプチドを銀染色により視覚化した。レーン１：ＶＷＦ １０Ｕ／ｍｌ、レーン２：ＶＷＦ＋０．５Ｕ／Ｕフリン０時間、レーン３：ＶＷＦ＋１Ｕ／Ｕフリン０時間、レーン４：ＶＷＦ＋２Ｕ／Ｕフリン０時間、レーン５：ＶＷＦ＋２．５Ｕ／Ｕフリン０時間、レーン６：ＶＷＦ＋４Ｕ／Ｕフリン０時間、レーン７〜１１：上記のとおり、２０時間、レーン１２〜１６：上記のとおり、２４時間。 図４は、オンカラム成熟後のＴＭＡＥ溶出液を示す。ＶＷＦ／ＶＷＦプロペプチドを含有するＭＡＢフロースルー材料を、約１８０〜２２０単位ＶＷＦ Ａｇ／ｍｌ樹脂でカラム上にポンピングした。Ａ 成熟前のＶＷＦプロペプチド／ＶＷＦ、１ ＣＲ２９−Ｅ１＋Ｅ２（２．４Ｕフリン／Ｕ ＶＷＦ；３７℃で３時間；ＦＵＲ２４＿０４＿ＵＦＫ０２；勾配溶出、２ ＣＲ３０−Ｅ１＋Ｅ２（３．２Ｕフリン／Ｕ ＶＷＦ；３７℃で１時間；ＦＵＲ＿ＵＦ０６＿０１（クローン４８８−３）；勾配溶出、３ ＣＲ３６−Ｅ、（７．８Ｕフリン／Ｕ ＶＷＦ；４℃で４時間；ＦＵＲ＿０１５（ＴＭＡＥ上で事前精製）、段階溶出、４ ＣＲ３７−Ｅ、（５．８Ｕフリン／Ｕ ＶＷＦ；４℃で８時間；ＦＵＲ＿ＵＦ０６＿０１（クローン４８８−３）、バッチ溶出、５ ＣＲ３８−Ｅ１＋Ｅ２（４．８Ｕフリン／Ｕ ＶＷＦ；４℃で８時間；ＦＵＲ＿０１８（ＴＭＡＥ上で事前精製）；勾配溶出。

本発明は、成熟フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）をフォンビルブラント因子プロペプチドから産生する方法であって、
− ＶＷＦプロペプチドをイオン交換樹脂上に固定するステップと、
− 固定された成熟ＶＷＦを得るために固定されたＶＷＦプロペプチドをフリンを含む溶液を用いてインキュベートするステップと、
− 成熟ＶＷＦを溶出によりイオン交換樹脂から単離するステップと、を含む方法に関する。

本発明の方法は、ＶＷＦのそのＶＷＦプロペプチド型からのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟に特に適している。現行の従来方法は、ＶＷＦのプロペプチド型を液相中でプロテアーゼを用いてインキュベートし、それによって成熟それ自体（すなわち、プロタンパク質からのプロペプチドの切断）が遊離溶液中で非結合状態で生じるようにするか、または例えば国際公開第００／４９０４７号に記載されるように、プロテアーゼを固体担体上に固定し、これをＶＷＦプロペプチドを含む調製物（例えば、国際公開第００／４９０４７号参照）と接触させかつこれを用いてインキュベートすることによって成熟ＶＷＦを産生する。しかしながら、これらの方法には、本発明による方法と比較して様々な短所がある。

産業的には、ＶＷＦ、特に組み換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）は、遺伝子改変されたＣＨＯ細胞株中のｒＦＶＩＩＩと共に合成および発現される。同時発現されたｒＶＷＦの機能は、細胞培養プロセスにおいてｒＦＶＩＩＩを安定させることである。ｒＶＷＦは、Ｎ−末端に付着された大きいプロペプチドを含有するプロ型として細胞中で合成される。小胞体およびゴルジ体中での成熟時、プロペプチドは、細胞プロテアーゼフリンの作用によって切断され、発現されたタンパク質の二量体からなる同一のサブユニットのホモポリマーとして分泌される。しかしながら、成熟は不完全であり、プロペプチドおよび成熟ＶＷＦの混合物を含む産生物をもたらす。

本発明の方法の高い効力のため、組み換え合成プロセスの間に発現された未成熟ＶＷＦプロペプチドは、成熟したＶＷＦに実質的に完全に変換される。この方法によって入手可能な調製物は、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、なお一層好ましくは少なくとも９９％の成熟ＶＷＦをそのＶＷＦプロペプチド型に対して含み得る。

ＶＷＦプロペプチドが、フリンまたはフリン様プロテアーゼを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ処理により成熟型に変換され得ることが以前の刊行物において示されている（Ｓｃｈｌｏｋａｔ Ｕ．ら（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：２５７−２６７；Ｐｒｅｉｎｉｎｇｅｒ Ａ．ら（１９９９）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０：１−１５）。フリンはプロタンパク質転換酵素のファミリーに属し、Ｃａ^＋＋に依存する。この酵素は、位置−１および−４にアルギニンを含有する特定の配列内のアルギニンのＣ−末端ペプチド結合を特異的に切断する。この配列は、多くのヒトタンパク質において見出すことができ、フリンが多くのヒトプロペプチド−タンパク質の成熟において主要な役割を果たすことを示している。

本発明の方法において用いられるフリンは、好ましくは、組み換え起源である。組み換え的に産生されるプロテアーゼは、大量に産生され得るので、有利に用いられる。

従来方法とは対照的に、ＶＷＦプロペプチドは、固体支持体（すなわち、イオン交換樹脂）上に、成熟タンパク質がその成熟反応後に前記支持体上に固定されたままになるように固定される。これは、当該技術分野において知られている方法と比較していくつかの利点を有する。

本発明の方法は、精製ステップ、好ましくはクロマトグラフィー精製ステップを、ＶＷＦプロペプチドの成熟反応と組み合わせる。従って、プロペプチドまたはプロテアーゼを除去するための別個のプロセスステップは、まったく必要とされない。それとは対照的に、当該技術分野において知られている方法は、成熟タンパク質が、タンパク質／プロテアーゼ／プロペプチド混合物からか、またはタンパク質／プロペプチド混合物からさらに精製されることを常に必要とした。本発明の方法におけるＶＷＦプロペプチドは好ましくは、フロースルー中に含まれる、または少なくとも１つの洗浄ステップにより固体支持体から除去されるのに対し、成熟タンパク質は、このプロセス全体を通して固体支持体に結合されたままである。それゆえ、本発明の方法は、従来技術の方法と比較してプロセス経済性を向上させ、そのプロペプチド型からの成熟タンパク質の産生を促進する。

本発明による方法のさらなる利点は、フリンが、前記プロテアーゼまたは細胞抽出物を分泌する細胞株の粗製細胞培養上清から得ることができることである。従って、イオン交換樹脂上に結合されたプロタンパク質を成熟させるために、プロタンパク質転換酵素の精製は、まったく必要とされない、または部分的精製しか必要とされない。

成熟ＶＷＦへのＶＷＦプロペプチドの成熟後、イオン交換樹脂上に固定された成熟タンパク質は、望ましくない分子を樹脂から除去するために洗浄されてもよい。これらの分子としては、ＶＷＦプロペプチドまたは他のタンパク質およびインキュベーションの間に前記樹脂に付加された化合物が含まれる。

成熟ＶＷＦタンパク質がイオン交換樹脂から溶出されると、本発明の方法は終了される。これにより、さらなるプロセスステップの必要なしで、イオン交換樹脂上の成熟ＶＷＦの精製が可能になるので、このことは特に有利である。また、これにより、例えば、溶出前にＶＷＦプロペプチドを除去するための洗浄ステップの付加も考慮される。従って、本発明の方法における溶出は、ＶＷＦプロペプチドを活性化するために必要とされる緩衝液または溶液によってではなく、所望の特性を有する溶出緩衝液を用いて達成され得る。

ＶＷＦプロペプチドは、組み換え的に大量に産生され得るので、これは、本発明の方法におけるＶＷＦプロペプチドの好ましい供給源である。しかしながら、本発明において用いられるＶＷＦプロペプチドは、組み換え的に得られたものだけに限定されない。本発明の方法は、血漿、血漿画分およびそれらから誘導された溶液を含むがそれらに限定されない任意の供給源から得られたＶＷＦプロペプチドを用いて使用することができる。本発明に従って成熟されるＶＷＦプロペプチドは、様々な供給源を起源とすることができ、それによって、ＶＷＦは、精製された形態、部分的に精製された形態または未精製の形態でさえも提供され得る。もしＶＷＦプロペプチドが部分的に精製された形態または未精製の形態で提供されれば、いくつかの構成要素（不純物）が、成熟プロセスを阻害または部分的に阻害し得ることが考慮されるべきである。

本発明の方法において組み換え起源のＶＷＦプロペプチドを使用することが好ましいので、ＶＷＦプロペプチド含有溶液は、組み換え細胞培養物から調製された培地上清であってもよい。当然、本発明のＶＷＦプロペプチドの供給源が、成熟のために使用され得る部分的に精製された、組み換え的に産生されたＶＷＦプロペプチドを含むことも可能である。

本発明の好ましい実施形態によれば、イオン交換樹脂は、トリメチルアミノエチル基（ＴＭＡＥ）を含む。ＶＷＦプロペプチドと結合することができる当該技術分野において知られている他のイオン交換樹脂も適している。

成熟プロセスを促進しかつ樹脂上で高濃度に固定されたＶＷＦプロペプチドを提供するために、本発明の１つの実施形態において、クロマトグラフィー樹脂がクロマトグラフィーカラム中に充填される。ＶＷＦプロペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟の間のＶＷＦプロペプチド濃度が成熟効率に影響を及ぼすので、クロマトグラフィー樹脂をカラムに充填することが有利である。さらに、クロマトグラフィーカラムの使用により、より再現性のあるやり方で成熟のパラメータを効率的に制御することが可能になり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＷＦの成熟を実行することがより簡単になる。

もしＶＷＦプロペプチドが陰イオン交換樹脂上に固定され、ＶＷＦプロペプチド転換酵素活性を示す溶液によってインキュベートされれば、２５℃で測定される導電率は、本発明の１つの実施形態においては２５ｍＳ／ｃｍ未満、本発明の別の実施形態においては２０ｍＳ／ｃｍ未満、および本発明の別の実施形態においては１６ｍＳ／ｃｍ未満である。

ＶＷＦプロペプチドならびにＶＷＦは、これらの導電率レベルにおいて陰イオン交換樹脂上に効率的に固定され得る。その結果、本発明の方法の間に適用される緩衝液は、それに応じて適合される必要がある。

成熟ＶＷＦは陰イオン交換樹脂から、本発明の１つの実施形態においては少なくとも４０ｍＳ／ｃｍ、本発明の別の実施形態においては少なくとも６０ｍＳ／ｃｍ、および本発明の別の実施形態においては少なくとも８０ｍＳ／ｃｍの、２５℃で測定される導電率において溶出される。

当然、成熟ＶＷＦが陰イオン交換樹脂から溶出される前に、さらなる洗浄ステップを適用することが可能である。

本発明の１つの実施形態によれば、フリンは、ＣａＣｌ_２を０．０１〜１０ｍＭの濃度で、別の実施形態によれば、０．１〜５ｍＭの濃度で、そして別の実施形態によれば、０．２〜２ｍＭの濃度でさらに含む。

それらのタンパク質分解活性のために、多くのプロテアーゼは、二価金属イオンのような補因子を必要とする。フリンはその活性のために、カルシウムイオンを必要とする。従って、ＶＷＦをｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化するためにフリンが使用されるのであれば、カルシウム塩が使用される。最も好ましいカルシウム塩は、塩化カルシウムである。

固定されたＶＷＦプロペプチドを用いたフリンのインキュベーション時間は、用いるシステムに応じて変わり得る。また、温度、緩衝液等の要因は、成熟プロセスの効率に影響を及ぼす。しかしながら、当業者は、最も適切なインキュベート時間を識別し、これを選ぶことができる。一般に、成熟プロセスは、４８時間未満で終了され、すでに１分以下が成熟ＶＷＦをそのプロフォームから産生するのに十分であり得る。フリンの高い特異性のため、ＶＷＦの「過活性化」（さらなるタンパク質分解）は、長期のインキュベーション時間の後でさえも生じない。

本発明の１つの実施形態によれば、インキュベーションは、１分間未満〜４８時間、別の実施形態においては１０分間〜４２時間、別の実施形態においては２０分間〜３６時間、さらに別の実施形態においては３０分間〜２４時間にわたり実行される。

成熟プロセスはまた、インキュベーションの間に選ばれる温度に依存する。フリンの最適酵素活性は、温度によって変わる。

本発明の１つの実施形態によれば、インキュベーションは、２〜４０℃の温度で実行され、別の実施形態においては４〜３７℃で実行される。フリンは、２℃のような低温ですでに効率的に活性であり得る。非特異的なタンパク質分解がまったくまたは実質的にまったく生じないように、最高温度を選ぶように注意が払われるべきである。本発明の１つの実施形態において、使用される最高温度が５０℃より低い場合、別の実施形態おいて４５℃より低い場合に、これは一般に達成される。

本発明のさらに別の態様は、本発明による方法によってＶＷＦプロペプチドから入手可能なＶＷＦ調製物に関する。本発明の方法は、高いプロセス効率のためにＶＷＦプロペプチドを実質的に含まないＶＷＦを提供する。

本発明の別の態様は、本発明によるＶＷＦ調製物を含む薬学的調製物に関する。この薬学的調製物は、特に血液凝固疾患を処置するために使用することができ、他の血液凝固因子のような他の活性成分と組み合わせることができる。さらに、この調製物は、薬学的に許容される賦形剤、担体および希釈剤も含み得る。

本発明のさらなる態様は、フォンビルブラント疾患（ＶＷＤ：ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ）の処置のための医薬を製造するために本発明によるＶＷＦ調製物を使用することに関する。

実施例１
フリンのカルシウム依存性
フリンに関する酵素的研究（Ｍｏｌｌｏｙ Ｓ．Ｅ．ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６３９６−１６４０２）は、その活性がＣａ^２＋に依存することを明らかにしており、結晶構造の評価（Ｔｈａｎ ら（２００５）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６１：５０５−５１２）は、分子がＣａ^２＋のための２つの結合部位を有することを示している。Ｃａｍｅｒｏｎら（Ｃａｍｅｒｏｎ Ａ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３６７４１−３６７４９９）は、Ｃａ^２＋濃度が５０ｍＭに増大された場合に、活性において差がない全活性について少なくとも１ｍＭのカルシウム濃度をフリンが必要とすることを記載した。第１の一連の実験において、社内開発された組み換えフリンのカルシウム依存性を試験および定量化した。フリンを、実験用ＣＨＯクローンＣＨＯ２５７／１ ６３８−２５から発現させ、Ｃ−末端にＨｉｓ−標識を含有する可溶性酵素として細胞培地中に分泌した。Ｎｉ−キレートクロマトグラフィーによって事前精製したフリンの調製物を、合成ペプチドＢｏｃ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣを基質として用いて活性決定にかけた。ＶＷＦプロペプチド成熟反応を、Ｃａ^２＋を０〜４０ｍＭの範囲で含有するアッセイ緩衝液中で実行した。図１に示される結果は、ＣＨＯ細胞株から発現された組み換え可溶性フリンが、明らかなカルシウム依存性を示し、０．５〜１ｍＭのＣａ^２＋濃度において最大活性が見られるだけでなく、５ｍＭより高い濃度においてカルシウムによる有意な阻害も見られるという文献データを立証している。ｒＶＷＦの原料がかなりの量のＣａ^２＋を含有する場合、カルシウムのこの阻害可能性を考慮に入れる必要がある。

実施例２
ＶＷＦ濃度に対する依存性
古典的な酵素動態から推論されるように、より高い基質濃度によって、より少ないフリン消費量またはより短い成熟時間でのＶＷＦ成熟を可能にする酵素のより高い代謝回転速度がもたらされる可能性があることが考慮された。従って、ＶＷＦ成熟実験は、基準化インキュベート容量中で５単位フリン／Ｕ ＶＷＦ Ａｇを用いて、１、５および１０単位／ｍｌのＶＷＦ濃度において実施した。３７℃での０、６および２４時間のインキュベーションの時点で抜き取ったサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図２に示される結果は、ＶＷＦ濃度がより高いほどＶＷＦ成熟がより速くなり、この酵素ステップのためのインキュベーション時間の低減を可能にするであろうことを立証している。

同様に、濃縮したＶＷＦ調製物を使用し、０．５〜４．０単位フリン／単位ＶＷＦ Ａｇによって３７℃で成熟反応を行った場合、結果は、９５％超のＶＷＦ成熟グレードが、５単位未満のフリン／単位ＶＷＦ Ａｇによって２４時間以内のインキュベーションで達成され得ることを示している（図３参照）。

この実施例によって示されるように、本発明は、カラム上の基質ＶＷＦプロペプチドの局所的濃度が非常に高い場合に、フリン成熟効力をさらに向上させる。ＶＷＦプロペプチドのより高い濃度も、成熟速度を増大させることが示された。

実施例３
ＶＷＦ成熟
この実施例では、フリンを用いたＶＷＦプロペプチド成熟を示す。フリンを、クロマトグラフィーカラム上に結合されたＶＷＦプロペプチドと接触させる。クロマトグラフィーステップは、ＴＭＡＥ陰イオン交換樹脂上で実行した。ＴＭＡＥ精製ステップの詳細は表１に記載してあり、緩衝液処方は表２にまとめてある。この設定を適用して、結合ＶＷＦプロペプチドのオンカラム成熟のための種々の手順を調べたが、これには、パラメータ、すなわち温度、接触時間、ＮａＣｌ含有量および比フリン量を同時に変えての、フリンの循環ポンピングまたは順流ポンピングが含まれる。溶出液プール中で見出されるＶＷＦを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＶＷＦプロペプチド／ＶＷＦ比の目視評価（例えば、図４参照）により成熟グレードについて調べた。

成熟効力に影響を及ぼすさらなるパラメータは、フリン試薬の品質であった。フリンは、Ｈｉｓ−標識フリン（実験用ＣＨＯ２５７／１ ６３８−２５）を低発現レベルで発現するクローンおよび／または標識のない可溶性フリンを高発現レベルで発現するクローンの細胞培養上清から調達された。表３にまとめてある結果は、３７℃（１時間の接触時間）での効率的な成熟が、２．４単位フリン／単位ＶＷＦ Ａｇ（カラム上に結合）と同じくらい低い比フリン量で達成できるかもしれないことを示している。２〜８℃で、９５％超の成熟が、４時間の接触時間で３．３単位／単位ＶＷＦ Ａｇの比フリン量で得られるかもしれない。１５０ｍＭ ＮａＣｌのイオン強度において、オンカラム成熟の全効力は、これらの条件でフリンをイオン交換樹脂に結合されないままにしておくことによって、９０ｍＭ ＮａＣｌと比較して良好であった。

表４ａおよび表４ｂに、溶出液プール中のＣＨＯタンパク質およびフリンプロテアーゼ活性についての不純物プロフィールが、ＴＭＡＥ上でのＶＷＦ成熟ステップに適用されたパラメータと関連して示してある。結果は、成熟の間に最も多量の付加的なＣＨＯ細胞培養上清がカラム上にポンピングされた「Ｈｉｓ−標識」実験用クローン（低発現レベル）由来のフリン濃縮物が、最も高いＣＨＯ不純物レベルという結果になったことを示す。ＧＭＰクローン由来のフリンを用いた成熟ステップからのデータは、溶出液プール中の比較的低いＣＨＯ汚染レベルという結果になり、カラム上にポンピングされた付加的なＣＨＯ細胞培養物容量は、ＶＷＦ産物ロードの間にカラム上にロードされた容量の２％未満であった。ＶＷＦプロペプチド成熟のために必要とされる低いフリン細胞培養物容量は、溶出液プール中のＣＨＯ不純物レベルがフリン試薬によって有意に影響されるべきではなくかつ主としてＶＷＦ供給源により引き起こされるはずであることを示唆しているであろう。同様な汚染プロフィールが、「ＣＨＯ不純物」のように振る舞うフリンプロテアーゼ活性について検出できるかもしれない。

オンカラム実験の間に、ステップの性能が、１つのカラム上で行われたバッチの数と共に顕著に減少するのが観察された。特定された理由は、５ＣＶ ０．５Ｍ ＮａＯＨおよび５ＣＶの２Ｍ ＮａＣｌを含有する不十分なカラム再生手順によるカラム付着物であった。洗浄効力を向上させるために３０〜４０℃で事前加熱した塩基を用いたこと以外は、この手順はそのまま維持した。この対策は、カラム付着物およびプロセスステップの性能低下を防止するのに十分であることが分かった。

カラム上のＶＷＦロードは、常に１６０〜１８０抗原単位／ｍｌ樹脂の範囲にあった。表１によるローディングおよび洗浄後、パラメータをこの表に記載されるように適用してフリンＶＷＦプロペプチド成熟を続けた。最後の縦列は、カラムを通してポンピングされた希釈フリン中のＮａＣｌ含有量を記している。

表４ａおよび表４ｂに、カラムに適用されたＶＷＦ／ＶＷＦプロペプチド（ＭＡＢフロースルー）、フリン濃縮物および対応当量の細胞培養上清の容量を含むオンカラム成熟実験の詳細が示してある。溶出液プール中のＣＨＯタンパク質およびフリンプロテアーゼ活性についての汚染プロフィールが示してある。ランＣＲ２４〜２９はＨｉｓ−標識実験用クローン（パイロット規模で製造）のフリン濃縮物を使用し；ＣＲ３０〜ＣＲ３３はＧＭＰクローン（１０リットル発酵槽スケールで製造）のフリン濃縮物を使用し；ＣＲ２３およびＣＲ３５〜ＣＲ３８は実験用およびＧＭＰクローンからの事前精製したフリンをそれぞれ使用した。

溶出液プールはまた、付加的なタンパク質分解の観点からＶＷＦ品質についてアガロースゲル電気泳動により調べた。付加的なタンパク質分解は、ＶＷＦ多量体構造体の主バンドの側面に「サテライト」バンドと呼ばれる微弱な付加的なバンドが配置される２．５％ゲル上でのアガロースゲル電気泳動によりうまく視覚化され得る。いくつかのロットのウェスタンブロット結果は、適用された条件にかかわらず、オンカラム成熟後のＶＷＦ ＴＭＡＥ溶出液プール上での顕著なサテライトバンド形成が皆無であることを示す。

オンカラム成熟の条件下でフリンが正しい切断部位を使っているかどうかをチェックするために、溶出液プール中に見られる成熟ＶＷＦをＮ−末端配列について分析した。バッチＣＲ３３、ＣＲ３５およびＣＲ３６からのＶＷＦを配列決定し、見出されたＮ−末端配列は、成熟ＶＷＦについての予想される未変性の配列（Ｎ−ｔｅｒｍＳＬＳＣＲＰＰＭＶ．．．）と一致し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ処理ステップの品質をさらに裏付けている。

実施例４
オンカラム成熟−パイロット規模実施
フリンを用いたＶＷＦプロペプチドのオンカラム成熟を、１バッチあたり約１６ｇＶＷＦの総ロードを適用して、３０ｃｍ直径の９リットルカラムにおいてパイロット規模で実施した。プロセスを、実験室規模のランＣＲ３５に従って、２〜８℃で、８時間のフリン成熟時間で実行した。パイロット規模用の計画されたＴＭＡＥ捕獲／成熟手順が表５にまとめてある。成熟のため、洗浄２、活性化および洗浄３を、ローディング後、ただし溶出前に導入した。成熟ＶＷＦの溶出のため、段階溶出を適用した。

パイロット規模での１３の捕獲／オンカラム成熟ステップについてのデータが表６にまとめてある。

本発明によれば、非ｒフリンも機能するであろうが、ｒＶＷＦプロペプチドを含有するｒＶＷＦがｒフリンで処理される一方で、これはイオン交換樹脂上に吸着され、これにより、ｒフリン処理の前に他の手段によりｒＶＷＦを濃縮する必要が回避された。適切な希釈後、出発材料をイオン交換樹脂に適用し、これにｒＶＷＦが吸着した。過剰Ｃａ^＋＋イオンを平衡化ステップにより除去し、ｒフリンをカラム上にポンピングし、そこでｒフリンは所与の時間留まった。非結合ｒフリン、ＶＷＦプロペプチドおよび過剰ＣＨＯタンパク質を洗浄ステップにより除去し、イオン強度の増大によりｒＶＷＦをカラムから溶出させた。

表６のデータは、オンカラムでのフリン成熟が効果的であり、ＶＷＦプロペプチド含有量を、ロード材料中の平均５５．４％ＶＷＦプロペプチド抗原から溶出液プール中の総ＶＷＦ Ａｇの平均１．３％のＶＷＦプロペプチド抗原に低減され得ることを示している。平均９８．７％成熟ＶＷＦ Ａｇ／総ＶＷＦ Ａｇという溶出液プール中のＶＷＦ産物の成熟レベルは、表に示される条件下でカラム上にロードされた平均０．９単位フリン／単位ＶＷＦ抗原のフリン使用により達成され得る。非常に低濃度のｒフリン（０．１単位／単位ｒＶＷＦ）において、成熟プロセスは、より多量の残留ＶＷＦプロペプチドという結果になった。

Claims (30)

1. 成熟フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）をフォンビルブラント因子プロペプチドから産生する方法であって、該方法は：
   （ａ）ＶＷＦプロペプチドをイオン交換樹脂上に固定するステップと、
   （ｂ）該固定されたＶＷＦプロペプチドと少なくとも０．２単位フリン／単位ＶＷＦ抗原（Ａｇ）の活性を含むフリンとをインキュベートして、固定された成熟ＶＷＦを得るステップと、
   （ｃ）少なくとも９０％の成熟ＶＷＦを溶出により該イオン交換樹脂から単離するステップと、
   を含む、方法。
2. 前記ＶＷＦプロペプチドが、組み換え起源のものである、請求項１に記載の方法。
3. 前記イオン交換樹脂が、トリメチルアミノエチル基（ＴＭＡＥ）を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記イオン交換樹脂が、クロマトグラフィーカラムに充填される、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＶＷＦプロペプチドが、前記イオン交換樹脂上に固定され、フリンと、２５℃で測定される２５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率でインキュベートされる、請求項３に記載の方法。
6. 前記導電率が、２０ｍＳ／ｃｍ未満である、請求項５に記載の方法。
7. 前記導電率が、１６ｍＳ／ｃｍ未満である、請求項５に記載の方法。
8. 前記成熟ＶＷＦが、前記イオン交換樹脂から２５℃で測定される少なくとも４０ｍＳ／ｃｍの導電率で溶出される、請求項３に記載の方法。
9. 前記導電率が、少なくとも６０ｍＳ／ｃｍである、請求項８に記載の方法。
10. 前記導電率が、少なくとも８０ｍＳ／ｃｍである、請求項８に記載の方法。
11. 前記フリンが、ＣａＣｌ_２を０．０１〜１０ｍＭの濃度でさらに含む溶液中に含まれる、請求項１に記載の方法。
12. 前記ＣａＣｌ_２が、０．１〜５ｍＭの濃度である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＣａＣｌ_２が、０．２〜２ｍＭの濃度である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記インキュベーションが、１分間〜４８時間実行される、請求項１に記載の方法。
15. 前記インキュベーションが、１０分間〜４２時間実行される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記インキュベーションが、２０分間〜３６時間実行される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記インキュベーションが、３０分間〜２４時間実行される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記インキュベーションが、２〜４０℃の温度で実行される、請求項１に記載の方法。
19. 前記インキュベーションが、４〜３７℃の温度で実行される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記フリンが組換え起源のものである、請求項１に記載の方法。
21. 前記フリンが少なくとも０．５単位フリン／単位ＶＷＦ Ａｇの活性を含む、請求項１に記載の方法。
22. 前記フリンが０．５〜４．０単位フリン／単位ＶＷＦ Ａｇの間の活性を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 成熟ＶＷＦが少なくとも９５％成熟ＶＷＦである、請求項２１に記載の方法。
24. 成熟ＶＷＦが少なくとも９８％成熟ＶＷＦである、請求項２１に記載の方法。
25. 成熟ＶＷＦが少なくとも９９％成熟ＶＷＦである、請求項２１に記載の方法。
26. インキュベーションが少なくとも１時間実行される、請求項２２に記載の方法。
27. インキュベーションが２℃〜８℃で実行される、請求項２６に記載の方法。
28. インキュベーションが３７℃で実行される、請求項２６に記載の方法。
29. 平均０．９単位フリン／単位ＶＷＦ Ａｇが少なくとも４時間インキュベートされる、請求項２４に記載の方法。
30. 前記フリンが４時間にわたって０．２〜２．０単位フリン／単位ＶＷＦ Ａｇの間の活性を含む、請求項１に記載の方法。