CN101679496A - 用于由vwf前肽制备成熟vwf的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于由冯威勒布兰特因子前肽制备成熟冯威勒布兰特因子(VWF)的方法，其包括如下步骤：－将VWF前肽固定在离子交换树脂上；－用furin孵育固定化的VWF前肽以获得固定化的成熟VWF，以及－通过洗脱从离子交换树脂上分离成熟VWF。

Description

用于由VWF前肽制备成熟VWF的方法
[0001]本申请要求享有2007年5月18日申请的美国临时专利申请No.60/930,891的优先权，在此将其全部内容引入本文以作参考。
技术领域
[0002]本发明涉及用于由冯威勒布兰特因子(VWF)前肽制备成熟冯威勒布兰特因子的方法。
背景技术
[0003]在细胞内的蛋白质成熟过程中，待成熟的蛋白质经历翻译后修饰。这些修饰包括乙酰化、甲基化、糖基化以及蛋白水解裂解。这些修饰在许多情况中对蛋白质功能及活性是必需的，并且它们还会影响蛋白质尤其是酶的效力。
[0004]前蛋白(或称蛋白质前体)是无活性的蛋白质，其通过这些翻译后修饰中的一个以上、尤其通过来自前蛋白的前肽的裂解而转变为活性形式。前蛋白的例子包括，例如前体胰岛素、凝血酶原等。
[0005]活性化蛋白质的制备具有较高的临床和诊断价值。例如，活性化或熟化蛋白质可用于控制凝血。
[0006]活性蛋白质在活性有机体中的可用量通常很低。因此，它们的前蛋白和前体酶优选通过与活化酶(例如蛋白酶)接触而在体外活性化。
[0007]目前用于由前蛋白制备成熟蛋白质的方法要么使用固定化蛋白酶，要么在游离溶液中进行。这两种方法均有缺点。其中，要求蛋白酶按如下工艺固定化。
[0008]冯威勒布兰特因子(VWF)是一种在血浆中循环的糖蛋白，是大小为约500-20,000kD的一系列多聚体。VWF的多聚体形式由通过二硫键连接在一起的250kD多肽亚基构成。VWF可调节初始血小板对受损血管壁的亚内皮的粘附性；人们认为仅仅较大的多聚体显示出止血活性。具有大分子质量的多聚体被贮藏在内皮细胞的怀布尔-帕拉德(Weibel-Pallade)体中，并在刺激时释放。然后，经释放的VWF会被血浆蛋白酶进一步处理，从而得到低分子量形式的VWF。
[0009]VWF由内皮细胞和巨核细胞合成，其作为预前肽VWF(″pp-VWF″)，较大程度上由重复结构域构成。在信号肽裂解时，VWF前肽经由在其C端区的二硫键发生二聚体化。该二聚体用作用于多体化的原聚体，这受控于在自由端末端之间的二硫键。在组合成多聚体之后进行前肽的蛋白水解去除(Leyte等，Biochem.J.，274(1991)，257-261)。
[0010]假定VWF前肽的生理学角色为在从VWF前肽分子中裂解之前或之后支配VWF多聚体的组合(Takagi等，JBC 264(18)(1989)，10425-10430)。虽然在人体中前肽的去除几乎是完全的，但在哺乳动物细胞系中的VWF的重组体高水平表达的情况中，该过程不是很有效。来自这种基因工程细胞系的细胞孵育上清液通常包括成熟VWF和VWF前体比如VWF前肽的混合物。因此，为获得成熟VWF，需要将VWF前体，特别是VWF前肽转变成成熟VWF。例如，在EP 0 775 750A中，该熟化通过使用弗林蛋白酶(furin)来实现。特别地，在EP 0 775 750A中建议重组法共表达furin和VWF，使得VWF的熟化可原位发生。在WO 00/49047中，描述了一种使用凝血酶制备成熟VWF的方法，其中熟化在溶液中或通过使用结合在固体载体上的凝血酶进行。
发明内容
[0011]本发明提供一种用于由VWF前肽制备成熟冯威勒布兰特因子(VWF)的有效方法。本发明提供一种通过如下步骤制备成熟VWF的新颖方法：将VWF前肽固定在离子交换树脂上，接着用furin熟化被结合的VWF前肽，并从离子交换树脂上洗脱出经熟化的VWF。本发明的方法特别适用于由VWF前肽在体外熟化VWF。该方法允许以较高的比活性和纯度制备成熟VWF。
[0012]本发明涉及一种用于由VWF前肽制备成熟VWF的方法，其包括如下步骤：
-将VWF前肽固定在离子交换树脂上，
-用包含furin的溶液孵育该固定化的VWF前肽以获得固定化的成熟VWF，以及
-通过洗脱从离子交换树脂上分离成熟VWF。
附图说明
[0013]图1所示为furin活性对Ca2+的依赖性。
[0014]图2所示为熟化效力对VWF浓度的依赖性。5ml溶于再增溶缓冲液(100mM柠檬酸，100mM HEPES，pH＝7.0)的VWF试样掺入5单位furin/U VWF，并在37℃下孵育22h。通过SDS-PAGE在8％凝胶上分析试样，并且通过银染色法显现分离的多肽。
泳道1：1U/ml VWF+5U/U furin，0h
泳道2：5U/ml VWF+5U/U furin，0h
泳道3：10U/ml VWF+5U/U furin，0h
泳道4：1U/ml VWF+5U/U furin，6h
泳道5：5U/ml VWF+5U/U furin，6h
泳道6：10U/ml VWF+5U/U furin，6h
泳道7：1U/ml VWF+5U/U furin，24h
泳道8：5U/ml VWF+5U/U furin，24h
泳道9：10U/ml VWF+5U/U furin，24h。
[0015]图3所示为熟化效力对VWF浓度的依赖性。5ml溶于再增溶缓冲液(100mM柠檬酸，100mM HEPES，pH＝7.0)的VWF试样掺入0.5-4.0单位furin/U VWF，并在37℃下进行孵育。在T＝0、20以及24小时处抽取试样。通过SDS-PAGE在8％凝胶上分析试样，并且通过银染色法显现分离的多肽。
泳道1：VWF 10U/ml
泳道2：VWF+0.5U/U furin，0h
泳道3：VWF+1U/U furin，0h
泳道4：VWF+2U/U furin，0h
泳道5：VWF+2.5U/U furin，0h
泳道6：VWF+4U/U furin，0h
泳道7-11：同上，20h
泳道12-16：同上，24h。
[0016]图4所示为在柱上熟化后的TMAE洗脱液。经由包含VWF/VWF前肽的材料的MAB液流在熟化之前以约180-220单位VWF Ag/ml树脂和VWF前肽/VWF被泵抽到柱子上。
1CR29-E1+E2(2.4U furin/U VWF；在37℃下3h；FUR24_04_UFK_02；梯度洗脱；
2CR30-E1+E2(3.2U furin/U VWF；在37℃下1h；FUR_UF06_01(克隆488-3)；梯度洗脱
3CR36-E，(7.8U furin/U VWF；在4℃下4h；FUR_015(在TMAE上预纯化)，分步洗脱；
4CR37-E，(5.8U furin/U VWF；在4℃下8h；FUR_UF06_01(克隆488-3)，分批洗脱；
5CR38-E1+E2(4.8U furin/U VWF；在4℃下8h；FUR_018(在TMAE上预纯化)；梯度洗脱。
具体实施方式
[0017]本发明涉及一种用于由冯威勒布兰特因子前肽制备成熟冯威勒布兰特因子(VWF)的方法，其包括如下步骤：
-将VWF前肽固定在离子交换树脂上，
-用包含furin的溶液孵育该固定化的VWF前肽以获得固定化的成熟VWF，以及
-通过洗脱从离子交换树脂上分离成熟VWF。
[0018]本发明的方法特别适用于由其VWF前肽在体外熟化VWF。目前制备成熟VWF的传统方法包括通过用液相中的蛋白酶孵育其前肽形式从而使本身熟化(即来自前蛋白的前肽的裂解)，以未结合态在游离溶液中发生；或者例如，如WO 00/49047中所述，通过将蛋白酶固定在固体载体上从而与包含VWF前肽的制品接触并进行孵育(例如，参见WO00/49047)。然而，这些方法相对于根据本发明的方法具有各种缺点。
[0019]工业上，VWF，尤其是重组体VWF(rVWF)被与rFVIII一起在基因工程CHO细胞株中合成并表达。共表达rVWF的作用是在细胞孵育步骤中稳定rFVIII。rVWF在作为前体形式的细胞中被合成，其包含大量的连结在N端上的前肽。在内质网状物和高尔基氏体(Golgi apparatus)中熟化时，前肽因细胞蛋白酶furin的作用而裂解，从而作为由被表达蛋白质中的二聚体构成的、相同亚基的均聚体被分泌出来。然而，该熟化是不完全的，从而得到包含前肽和成熟VWF的混合物的产品。
[0020]由于本发明的方法的高效力，在重组体合成期间表达的未熟化的VWF前肽基本上全部转变成成熟VWF。通过该方法可获得的制品可包含相对于其VWF前肽至少90％、更优选至少95％、进一步优选至少98％、更进一步优选至少99％的成熟VWF。
[0021]在上述出版物中已经表明，VWF前肽可通过用furin或类furin的蛋白酶进行体外处理而转变为成熟形式(Schlokat U.等(1996)，Biotechnol.Appl.Biochem.24：257-267；Preininger A.等(1999)，Cytotechnology 30：1-15)。Furin属于前蛋白转化酶(convertases)的家族并且依赖于Ca++。该酶可特异性地切断包含位置-1和-4处精氨酸的特定序列内的精氨酸中的C端肽键。该序列可在许多人源蛋白质中被发现，这表明furin在许多人源前肽蛋白质的熟化中举足轻重。
[0022]用于本发明的方法的furin优选为重组体来源。优选使用重组产生的蛋白酶，这是因为可以以较高的产量制备它们。
[0023]与传统方法相反，VWF前肽以如下方式固定在固体载体(即离子交换树脂)上：成熟蛋白质在其熟化反应之后将保持固定在所述载体上。这相对于本领域已知的方法具有一些优点。
[0024]本发明的方法组合使用提纯步骤、优选色谱提纯步骤和VWF前肽的熟化反应。因此，不需要使用分离工序以除去前肽或蛋白酶。此外，相反地，本领域已知的方法始终需要从蛋白质/蛋白酶/前肽混合物或从蛋白质/前肽混合物中进一步提纯成熟蛋白质。本发明的方法中的VWF前肽优选被包含在流经固体载体的液流中或通过至少一个洗涤步骤从固体载体中除去，而成熟蛋白质则在该处理中始终保持结合在固体载体上。因此，与现有技术中的方法相比，本发明的方法提高了工艺经济性并且便于由其前肽制备成熟蛋白质。
[0025]根据本发明的方法的另一优点是，furin可以从分泌所述蛋白酶的细胞系的细胞的粗的培养上清液或细胞提取物中获得。因此，不需要纯化或仅需要部分纯化前蛋白转化酶(convertase)，就可熟化结合在离子交换树脂上的前蛋白。
[0026]在将VWF前肽熟化为成熟VWF之后，可以洗涤固定在离子交换树脂上的成熟蛋白质从而从树脂中除去不希望有的分子。这些分子包括VWF前肽或在孵育期间添加到所述树脂中的其他蛋白质和化合物。
[0027]当成熟VWF蛋白质从离子交换树脂中洗脱时，本发明的方法结束。这是特别有益的，因为其允许在离子交换树脂上纯化成熟VWF而不需要额外的工序。例如，其也允许在洗脱之前增加洗涤步骤以除去VWF前肽。因此，本发明方法中的洗脱可以使用具有预期性能的洗脱缓冲液进行，而不使用需要活化VWF前肽的缓冲液或溶液。
[0028]因为VWF前肽可通过重组法大量制备，故其是本发明方法中的VWF前肽的优选来源。然而，用于本发明的VWF前肽不仅限于重组获得的VWF前肽。本发明的方法可以使用从包括，但不限于，血浆、血浆部分以及由此衍生的溶液的任何来源所获得的VWF前肽。根据本发明的待熟化的VWF前肽可以来自各种来源，借此可提供纯化的、部分纯化的或甚至未纯化形式的VWF。如果提供部分纯化或未纯化形式的VWF前肽，那么必须考虑一些组分(杂质)会抑制或部分抑制熟化处理。
[0029]由于在本发明的方法中优选使用重组体来源的VWF前肽，故包含溶液的VWF前肽可以是由重组细胞培养物制备的培养上清液。当然，本发明的VWF前肽的来源可以包括可用于熟化的部分纯化的、重组制备的VWF前肽。
[0030]根据本发明的优选实施方式，离子交换树脂包括三甲基氨基乙基基团(TMAE)。本领域已知的可结合VWF前肽的其他离子交换树脂也是适合的。
[0031]为了便于熟化处理以及提供以增加的浓度固定在树脂上的VWF前肽，在本发明的一个实施方式中，将色谱树脂装进色谱柱中。由于VWF前肽的浓度在其体外熟化过程中会影响熟化效率，故将色谱树脂装入色谱柱中是有益的。此外，色谱柱的使用允许以可再现性更高的方式来有效地控制熟化参数，从而更简单地在体外进行VWF的熟化。
[0032]如果VWF前肽被固定在阴离子交换树脂上并用显示VWF前肽转化酶活性的溶液孵育，那么在25℃处测得的电导率在本发明的一个实施方式中低于25mS/cm，在本发明的另一实施方式中低于20mS/cm，并且在本发明的另一实施方式中低于16mS/cm。
[0033]VWF前肽以及VWF在这些电导率水平上可有效地固定在阴离子交换树脂上。于是，用于本发明方法中的缓冲液必须相适应地使用。
[0034]在25℃下测定的如下电导率下，从阴离子交换树脂中洗脱出成熟VWF：在本发明的一个实施方式中为至少40mS/cm，在本发明的另一实施方式中为至少60mS/cm，以及在本发明的另一实施方式中为至少80mS/cm。
[0035]当然，可以在从阴离子交换树脂中洗脱出成熟VWF之前，另外实施洗涤步骤。
[0036]根据本发明的实施方式，furin还包括浓度为0.01-10mM的CaCl2；根据另一实施方式，包括浓度为0.1-5mM的CaCl2；以及根据另一实施方式，包括浓度为0.2-2mM的CaCl2。
[0037]为了它们的蛋白水解活性，许多蛋白酶需要辅因子比如二价金属离子。Furin要求其活性钙离子。因此，如果furin用于在体外活性化VWF，那么钙盐被使用。最优选的钙盐是氯化钙。
[0038]furin对于固定化VWF前肽的孵育时间可根据所用体系而改变。此外，其他因素比如温度、缓冲液等会影响熟化处理的效率。然而，本领域技术人员能够识别和选择最合适的孵育时间。通常，该熟化处理在少于48小时内结束，并且仅熟化1分钟以下就足以由VWF前体制备出成熟VWF。由于furin的高特异性，故即使在延长的孵育时间之后，也不会发生VWF的“过度活性化”(进一步的蛋白水解降解)。
[0039]根据本发明的实施方式，孵育进行少于1分钟至48小时；在另一实施方式中进行10分钟至42小时；在另一实施方式中进行20分钟至36小时；以及在另一实施方式中进行30分钟至24小时。
[0040]该熟化处理还取决于在孵育过程中所选用的温度。furin的优选酶活性随温度而改变。
[0041]根据本发明的一个实施方式中，孵育在2-40℃的温度下进行；在另一实施方式中，在4-37℃下进行。Furin在低温比如2℃下已具有有效的活性。应当仔细选择最高温度，从而不出现或基本上不出现非特异性的蛋白质降解。这通常在如下情况下实现：在本发明的一个实施方式中，采用的最高温度低于50℃；在另一实施方式中，最高温度低于45℃。
[0042]此外，本发明的另一方面涉及通过根据本发明的方法可由VWF前肽获得的VWF制品。本发明的方法提供了VWF，其由于较高的处理效率而基本上不含VWF前肽。
[0043]本发明的另一方面涉及一种包含根据本发明的VWF制品的药物制剂。该药物制剂可特别地用于治疗凝血病，并且可与其他活性成分比如其他凝血因子组合使用。此外，该制剂还可包含药学可接受的赋形剂、载体和稀释剂。
[0044]本发明的另一方面涉及根据本发明的VWF制品用于制造治疗冯威勒布兰特病(VWD)的药剂的用途。
实施例
实施例1：furin对钙的依赖型
[0045]对furin的酶催化研究(Molloy S.E.等，(1992)，J.Biol.Chem.267：16396-16402)表明，其活性依赖于Ca2+，并且晶体结构的评估(Than等，(2005)，Acta Cryst.D61：505-512)表明，其分子具有两个用于Ca2+的结合位置。Cameron等(Cameron A等，(2000)，J.Biol.Chem.，275：36741-367499)描述了furin要求至少1mM的钙浓度以便获得完全的活性，该活性与Ca2+浓度增加到50mM时的活性没有差别。在第一组试验中，发明人研发的重组体furin对钙的依赖性被测试和定量。由试验用CHO克隆CHO 257/1638-25的furin被表达并且作为在C端处包含组氨酸标记(His-Tag)的可溶酶而被分泌入细胞孵育基中。通过Ni螯合物色谱法预纯化的furin制品使用作为底物的合成肽Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC进行活性测定。VWF前肽熟化反应在包含0-40mM的Ca2+的测定缓冲液中进行。图1所示的结果确认如下数据：由CHO细胞系表达的重组的可溶性furin显示出明显的对钙的依赖性，其最大活性在Ca2+浓度为0.5-1mM处被发现，而且在钙浓度高于5mM处，其活性受到明显地抑制。当rVWF的来源材料包含大量Ca+时，必须考虑钙的这种抑制可能。
实施例2：对VWF浓度的依赖性
[0046]作为由经典酶动力学得出的结论，人们认为底物浓度越高，导致酶的转化率越高，从而允许以降低的furin消耗或降低的熟化时间进行VWF熟化。于是，VWF熟化实验在如下条件下进行：在标准化孵育体积中使用5单位furin/U VWF Ag，在1、5和10单位/ml的VWF浓度处进行。通过SDS-PAGE分析在37℃处孵育0、6和24小时时间点处抽取的试样。图2所示的结果表明，VWF浓度越高，VWF熟化进行地越快，从而允许用于该酶催化步骤的孵育时间减少。
[0047]同样地，使用浓缩的VWF制品并在37℃下用0.5-4.0单位furin/单位VWF Ag进行熟化反应，结果表明＞95％的VWF熟化等级可用低于5单位furin/单位VWF Ag在24小时的孵育时间内实现(参见图3)。
[0048]如该实施例所示，当底物VWF前肽在柱子上的局部浓度很高时，本发明进一步提高了furin熟化效率。结果还表明更高浓度的VWF前肽可增加熟化速度。
实施例3：VWF熟化
[0049]在该实施例中，使用furin的VWF前肽熟化被显示。Furin与结合在色谱柱上的VWF前肽接触。在TMAE阴离子交换树脂上进行色谱法步骤。使用表2所示的缓冲液配方进行TMAE纯化步骤的具体说明如表1中所列举。就实施该方案来说，用于在柱上熟化结合的VWF前肽的不同步骤被研究；包括furin的循环泵入或向下泵出，同时改变如下参数：温度、接触时间、NaCl含量以及特定的furin含量。通过SDS-PAGE以及VWF前肽/VWF比值的目测，研究在洗脱液池中发现的VWF，进行熟化分级(例如，参见图4)。
[0050]影响熟化效率的另一参数是furin试剂的品质。furin来源于具有较低表达水平的表达组氨酸标记的furin的克隆株(试验用CHO 257/1 638-25)和/或具有较高表达水平的表达没有标记的可溶性furin的克隆株的细胞培养上清液。表3所示的结果表明，用结合于柱子上的低至2.4单位furin/单位VWF Ag的特定furin含量可实现在37℃(1小时接触时间)处高效率的熟化。在2-8℃处，用3.3单位furin/单位VWF Ag的特定furin含量，经4小时接触时间可获得＞95％的熟化。通过使未结合到离子交换树脂上的furin处于这些状况，150mMNaCl的离子强度处的柱上熟化总效率高于90mM NaCl下的熟化总效率。
[0051]表4a和表4b中显示了洗脱液池中的用于CHO蛋白质的杂质分布以及furin蛋白酶活性与在TMAE上的VWF熟化步骤所用参数的关系。结果表明，在熟化期间泵到色谱柱上的具有最高含量的附加的CHO细胞培养上清液的来自“组氨酸标记”试验用克隆株(较低的表达水平)的furin浓缩物导致了最高的CHO杂质水平。使用来自GMP克隆株的furin的熟化步骤所获得的数据导致在洗脱液池中相对较低的CHO污染水平，并且泵抽到色谱柱上的附加CHO细胞培养物的体积低于在VWF制品加载期间加载在色谱柱上的体积的2％。VWF前肽熟化需要较低的furin细胞培养物体积表明，洗脱液池中的CHO杂质水平受furin试剂的影响不明显，其主要由VWF来源导致。对于类似于“CHO杂质”的furin蛋白酶活性能够进行类似的污染分布检测。
表1：TMAE俘获/熟化步骤的详细说明
Figure A20088001637400121
表2：用于TMAE俘获/熟化步骤的缓冲液
[0052]在色谱柱上试验期间，可以观察到该步骤的性能随着对一个色谱柱上所做批次数的增加而明显降低。确定的原因是色谱柱由于不充分的色谱柱再生步骤导致的污染，该再生步骤包括5CV的0.5M NaOH和5CV的2M NaCl。该步骤犹如保持原样，但碱在30-40℃下被预热，用于改善清洁效果。检测结果发现足以抑制色谱柱污染以及在工艺步骤中性能的下降。
表3：用于在TMAE上熟化VWF前肽的条件
Figure A20088001637400141
[0053]加载在色谱柱上的VWF始终在160-180抗原单位/ml树脂的范围内。在根据表1加载并洗涤后，紧接着使用表中所示的参数进行furin VWF前肽熟化。最后一栏列举了经由色谱柱泵抽的经稀释的furin中的NaCl含量。
表4a：VWF前肽在色谱柱上的熟化；洗脱液池中的CHO和Furin分布。
Figure A20088001637400151
表4b：VWF前肽在色谱柱上的熟化；在洗脱液池中的CHO和Furin分布
Figure A20088001637400161
[0054]在表4a和4b中，色谱柱上的熟化试验的具体条件被显示，包括VWF/VWF前肽的体积(MAB流)、furin浓度以及相应当量的施加在色谱柱上的细胞培养上清液。洗脱液池中的CHO蛋白质中的杂质分布以及furin蛋白酶活性被显示。试验CR24-29使用组氨酸标记的试验克隆株的furin浓度(中试规模制造)；CR30-CR33使用GMP克隆的furin浓缩物(以10升发酵器规模制造)；CR23和CR35-CR38分别使用来自试验克隆和GMP克隆的预纯化furin。
[0055]考虑到因琼脂糖凝胶电泳导致的附加的蛋白水解降解，还研究了洗脱液池的VWF品质。附加的蛋白水解降解可通过在2.5％凝胶上的琼脂糖凝胶电泳而很好地显现，其中VWF多聚体结构的主条带侧翼为弱的称为“卫星”条带的附加条带。几个批次的免疫印记(Western Blot)结果表明，在柱上熟化之后，在VWF TMAE洗脱液池上没有形成明显的卫星条带，这与所用条件无关。
[0056]分析在洗脱液池中发现的成熟VWF的N端序列，从而检测furin在柱上熟化条件下是否使用了正确的断裂位点。来自批次CR33、CR35和CR36的VWF被编序并且被发现的N端序列符合用于成熟VWF的预期的天然序列(N端SLSCRPPVM...)，从而进一步确认体外处理步骤的品质。
实施例4：柱上熟化-中试规模实施
[0057]使用furin的VWF前肽的柱上熟化以中试规模在如下条件下实施：具有30cm直径的9升柱子，每批次施加约16g VWF的总加载量。该处理在2-8℃下进行，furin熟化时间为8小时，符合实验室规模的试验CR35。用于中试规模的设计的TMAE俘获/熟化步骤如表5所示。为进行熟化和洗涤步骤2，在加载之后、但在洗脱之前进行活化和洗涤步骤3。对于成熟VWF的洗脱，实施分步洗脱。
表5：以中试规模进行TMAE俘获/熟化步骤
 步骤   缓冲液   缓冲液体积   流速   时间   注解
  CV   cm/h
 前置条件   SIP1，WP2，EP/WP1   15   150   36分钟
 加载   经1∶4.5稀释的初始材料(在室温下＜15mS/cm)   约765   150   约26小时   160-180VWF Ag U/ml树脂
 洗涤1   EP/WP   5   150   12分钟
 洗涤2   FE1   5   150   12分钟   50mM HEPES，150mM NaCl，1mM CaCl2，pH＝7.0(室温)
 Furin活化   用缓冲液FE1稀释的Furin(约15mS/cm)   2-4   低   8小时   用缓冲液FE1∶50mM HEPES、150mM NaCl，1mM  CaCl2，pH＝7.0(室温)稀释，体积循环约4-5次
 洗涤3   FE1   1   150   2.4分钟
 洗涤4   EP/WP   5   150   12分钟
 洗脱，变量1   EP1   20   75   96分钟
 洗脱，变量2   梯度：20％EP3/80％EP4至80％EP3/20％EP4   7   75   33分钟
 洗脱，变量2   EP3   10   150   24分钟
 后置条件   WP2，SIP1，WP2，EP/WP2   20   150   48   T(温度)＝约30℃
[0058]用于以中试规模进行13个俘获/柱上熟化步骤的数据如表6所示。
表6：以中试车间规模(2100升加载体积/批次)在15 1 Fractogel EMD TMAE 650柱上的柱上熟化
  TMC   加载VWFAg   活性Furin/VWF   熟化时间   熟化温度   洗脱液池中的VWF前肽含量   装载物中的VWF前肽含量
  U/ml树脂   U/U   小时   ℃   ％VWF Ag   ％VWF Ag
  ORVWTMC06006   124   0.7   4   20   0.64   49.61
  ORVWTMC06007   133   1.3   4   20   0.64   61.64
  ORVWTMC06008   113   0.7   4   20   0.52   58.62
  ORVWTMC06009   120   0.7   4   20   0.71   65.58
  ORVWTMC06010   144   2.0   4   20   0.64   55.34
  ORVWTMC06011   159   0.4   4   20   2.61   42.46
  ORVWTMC06012*   123   0.1   4   20   8.15   未检出
  ORVWTMC06013   128   0.4   4   20   1.88   43.91
  ORVWTMC06014   131   1.9   4   20   2.31   72.25
  ORVWTMC06015   114   0.8   4   室温   1.03   46.18
  ORVWTMC06016   123   0.6   4   室温   1.52   56.72
  ORVWTMC06017   128   0.7   4   室温   1.65   57.02
  ORVWTMC06018   143   0.2   4   室温   1.79   未检出(n.d.)
  平均值   129   0.9   4   无意义(n.a.)   1.3   55.4
  最小值   113   0.2   4   20   0.5   42.5
  最大值   159   2.0   4   25   2.6   72.3
*未考虑用于统计分析的试验
[0059]根据本发明，包括rVWF前肽的rVWF用rfurin处理，虽然非rfurin(非重组的furin)也起作用，同时rVWF被吸附在离子交换树脂上，这可避免在rfurin处理之前需要通过其他方式浓缩rVWF。在合适的稀释之后，将起始材料施加到其上吸附了rVWF的离子交换树脂上。过多的Ca++离子通过平衡步骤除去，并且将rfurin泵到柱子上，使其停留一定量的时间。未结合的rfurin、VWF前肽以及过量的CHO蛋白质通过洗涤步骤除去，并且通过增加离子强度将rVWF从柱子中洗脱。
[0060]表6中的数据表明，柱上的furin熟化是有效的，并且VWF前肽含量可以从在加载材料中的平均55.4％VWF前肽抗原降低到在洗脱液池中的总VWF Ag的平均1.3％VWF前肽抗原。在表中所示的条件下，使用加载在柱上的平均0.9单位furin/单位VWF抗原的furin用量，可实现在平均98.7％成熟VWF Ag/总VWF Ag的洗脱液池中VWF产品熟化水平。在极低浓度的rfurin(0.1单位/单位rVWF)下，熟化处理得到较高含量的剩余VWF前肽。

Claims (22)

1.一种用于由冯威勒布兰特因子前肽制备成熟冯威勒布兰特因子(VWF)的方法，其包括如下步骤：
-将VWF前肽固定在离子交换树脂上，
-用furin孵育固定化的VWF前肽以获得固定化的成熟VWF，以及
-通过洗脱从离子交换树脂上分离成熟VWF。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述VWF前肽是重组体来源。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换树脂包括三甲基氨基乙基基团(TMAE)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换树脂被装入色谱柱中。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述VWF前肽被固定在所述离子交换树脂上，并且在25℃处测定的电导率低于25mS/cm下用furin孵育。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电导率低于20mS/cm。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电导率低于16mS/cm。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在25℃处测定的电导率为至少40mS/cm下，从所述离子交换树脂中洗脱出所述VWF。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述电导率为至少60mS/cm。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述电导率为至少80mS/cm。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述furin被包括在进一步包含0.01-10mM浓度的CaCl2的溶液中。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述CaCl2的浓度为0.1-5mM。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述CaCl2的浓度为0.2-2mM。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育进行1分钟至48小时。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述孵育进行10分钟至42小时。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述孵育进行20分钟至36小时。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述孵育进行30分钟至24小时。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育在2-40℃的温度下进行。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述孵育在4-37℃的温度下进行。
20.根据权利要求1所述的方法制备的成熟冯威勒布兰特因子(VWF)用于制造治疗冯威勒布兰特病(VWD)的药剂的用途。
21.用于治疗哺乳动物中的冯威勒布兰特病的方法，包括对所述哺乳动物给药根据权利要求1所述的方法制备的成熟冯威勒布兰特因子(VWF)。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述furin是重组体来源。
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