TWI666319B - 在分泌ｆｕｒｉｎ之哺乳動物表現系統中生產經完全加工且具功能性之因子Ｘ - Google Patents

在分泌ｆｕｒｉｎ之哺乳動物表現系統中生產經完全加工且具功能性之因子Ｘ Download PDF

Info

Publication number
TWI666319B
TWI666319B TW104126066A TW104126066A TWI666319B TW I666319 B TWI666319 B TW I666319B TW 104126066 A TW104126066 A TW 104126066A TW 104126066 A TW104126066 A TW 104126066A TW I666319 B TWI666319 B TW I666319B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
furin
expression vector
hours
cells
concentration
Prior art date
Application number
TW104126066A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201625791A (zh
Inventor
伊恩斯特 伯瑞門
法郎西斯卡 侯恩林
家莊卡 寇瑞恩
麥克 都可卡
Original Assignee
美商巴克斯歐塔公司
瑞士商巴克斯歐塔有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商巴克斯歐塔公司, 瑞士商巴克斯歐塔有限公司 filed Critical 美商巴克斯歐塔公司
Publication of TW201625791A publication Critical patent/TW201625791A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI666319B publication Critical patent/TWI666319B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6454—Dibasic site splicing serine proteases, e.g. kexin (3.4.21.61); furin (3.4.21.75) and other proprotein convertases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21075—Furin (3.4.21.75)

Abstract

本文揭示用於在生產每毫升培養物上清液50U與300U之間的受控量之furin之表現系統中生產經完全加工之成熟因子X之方法。亦揭示用於表現furin及因子X之轉形細胞、表現系統及表現載體。

Description

在分泌furin之哺乳動物表現系統中生產經完全加工且具功能性之因子X
本文揭示用於在furin存在下表現經完全加工且具活性之重 組因子X之表現系統、轉形細胞及與其相關之方法。
人類凝血因子X(FX)、活化FX(FXa)及其變異體用作包 括(但不限於)血友病(hemophilia)及馮威里氏病(von Willebrand disease)之凝血障礙中之治療劑。維生素K依賴性絲胺酸蛋白酶FX合成為內質網中之單鏈前驅蛋白質，伴以高爾基器(Golgi apparatus)中之後續細胞內蛋白水解furin裂解，隨後藉由生產細胞分泌至血流中，或在重組表現之情況下分泌至培養基中。FX中之三個furin裂解位點負責恰當FX蛋白分解加工。 FX之成熟形式為在前驅蛋白質之裂解之後形成的由重鏈及輕鏈組成之雙硫連接的雙鏈分子。分子之其他修飾包括輕鏈之γ-羧化及附接到重鏈之活化肽之N-及O-連接醣基化。
除FX以外，攜有一致性識別位點Arg-X-Lys/Arg-Arg之其他 維生素K依賴性凝血因子為泛表現內切蛋白酶furin，亦稱為成對鹼性胺基酸殘基裂解酶(PACE)之受質。凝血級聯之重組蛋白質之足夠蛋白水解加 工由於高產率表現下之細胞內加工限制而在細胞培養物表現系統中削弱。 與在重組哺乳動物細胞中以高表現率展現不充分蛋白水解加工之馮威里氏因子及凝血因子IX(FIX)類似，低產量CHO細胞純系中之FX分泌藉由經完全加工之FX特性化，而高產量純系除包含經恰當加工之FX重鏈及輕鏈物質以外，亦包含未經加工之單鏈FX及多個未經加工形式之FX輕鏈。 未經加工之FX輕鏈之類型及程度在個別細胞純系中及不同細胞培養條件，諸如細胞密度下變化。需要額外活體內furin共表現或細胞培養後試管內furin培育以支持內源性furin蛋白水解機制，促進完整蛋白質裂解。
Furin共表現對於高產率下之經完全加工之FX之表現必不 可少。然而，迄今為止，未報導將確保細胞培養系統中高百分比之完整經加工之FX之furin之臨限量。高量之furin有毒性，因此，生產FX之哺乳動物表現系統之furin表現量必須在有毒性、但潛在地加工100% FX前驅蛋白質之量與太低、導致生產次最佳經加工之FX之健康細胞培養物之量之間平衡。
本文揭示一種在相同細胞系中表現furin及人類因子X(FX) 且從而在培養物上清液中提供臨界furin濃度以產生經完全加工且完全具活性之FX，同時維持培養物之活力的系統。
因此，本文揭示一種轉形細胞，其包含編碼人類furin之核 苷酸序列，使得轉形細胞表現及分泌功能性furin到培養物上清液中，其中功能性furin在培養約36小時與約78小時之間以後以約50U/mL至約300U/mL之濃度分泌於培養物上清液中。在一個具體實例中，轉形細胞另外包 含編碼可藉由furin裂解且展現Arg-(Lys/Arg)-Arg基序之蛋白質之核苷酸序列。在另一具體實例中，編碼人類furin之核苷酸序列及編碼蛋白質之核苷酸序列在不同表現載體上。在另一具體實例中，編碼人類furin之核苷酸序列及編碼蛋白質之核苷酸序列在相同表現載體上。
亦提供一種真核蛋白質表現系統，其包含適合於表現哺乳動 物蛋白質之細胞系；適於藉由細胞系表現人類furin之第一表現載體，其中第一表現載體包括編碼人類furin多肽之核苷酸序列；及適於藉由細胞系表現蛋白質之第二表現載體，其中第二表現載體包括編碼可藉由furin裂解且展現Arg-(Lys/Arg)-Arg基序之蛋白質之核苷酸序列，其中細胞系能夠在培養約36小時與約78小時之間以後以約50U/mL至約300U/mL之濃度分泌功能性furin至培養物上清液中。
亦提供一種真核蛋白質表現系統，其包含適合於表現哺乳動 物蛋白質之細胞系；適於藉由細胞系表現人類furin及可藉由furin裂解且展現Arg-(Lys/Arg)-Arg基序之蛋白質之第一表現載體，其中第一表現載體包括編碼人類furin多肽之核苷酸序列及編碼可藉由furin裂解之蛋白質之核苷酸序列，其中細胞系能夠在培養約36小時與約78小時之間以後以約50U/mL至約300U/mL之濃度分泌功能性furin至培養物上清液中。在一個具體實例中，編碼人類furin之核苷酸序列及編碼蛋白質之核苷酸序列在不同表現載體上。在另一具體實例中，編碼人類furin之核苷酸序列及編碼蛋白質之核苷酸序列在相同表現載體上。
亦提供一種轉形細胞，其包含編碼人類furin之第一核苷酸 序列及編碼人類FX之第二核苷酸序列，使得轉形細胞表現及分泌功能性 furin及FX至培養物上清液中，其中furin在培養約36小時與約78小時之間以後以約50U/mL至約300U/mL之濃度分泌於培養物上清液中且至少85%之FX經完全加工。在一個具體實例中，編碼人類furin之核苷酸序列及編碼FX之核苷酸序列在不同表現載體上。在另一具體實例中，編碼人類furin之核苷酸序列及編碼FX之核苷酸序列在相同表現載體上。
亦提供一種真核蛋白質表現系統，其包含適合於表現哺乳動 物蛋白質之細胞系；適於藉由細胞系表現人類furin之第一表現載體，其中第一表現載體包括編碼人類furin多肽之核苷酸序列；及適於藉由細胞系表現FX之第二表現載體，其中第二表現載體包括編碼FX之核苷酸序列，其中細胞系能夠在培養約36小時與約78小時之間以後以約50U/mL至約300U/mL之濃度分泌功能性furin至培養物上清液中。
另外提供一種真核蛋白質表現系統，其包含適合於表現哺乳 動物蛋白質之細胞系；適於表現人類furin及FX之第一表現載體，其中第一表現載體包括編碼人類furin多肽之核苷酸序列及編碼FX之核苷酸序列，其中細胞系能夠在培養約36小時與約78小時之間以後以約50U/mL至約300U/mL之濃度分泌功能性furin至培養物上清液中。
亦提供一種製備重組蛋白質之方法，其包含用適於藉由細胞 系表現人類furin之第一表現載體轉染適合於表現哺乳動物蛋白質之細胞系，其中第一表現載體包括編碼人類furin多肽之核苷酸序列；及用適於藉由細胞系表現蛋白質之第二表現載體轉染細胞系，其中第二表現載體包括編碼展現Arg-(Lys/Arg)-Arg基序之蛋白質的核苷酸序列；其中經第一及第二表現載體轉染之細胞系在培養約40小時與約80小時或約36小時與約78 小時之間以後以約50U/mL至約300U/mL之濃度表現及分泌功能性人類furin於培養物上清液中。在一個具體實例中，細胞系實質上同時經第一表現載體及第二表現載體轉染。在另一具體實例中，細胞系經第一表現載體轉染且獲得分泌穩定量之furin之細胞，隨後經第二表現載體轉染細胞系。 在另一具體實例中，細胞系經第二表現載體轉染且獲得分泌穩定量之蛋白質之細胞，隨後經第一表現載體轉染細胞系。
在一個具體實例中，蛋白質為馮威里氏因子、因子II、因子 IX、因子X、蛋白質C、蛋白質S或蛋白質Z。在另一具體實例中，蛋白質為因子X。
亦提供一種製備重組蛋白質之方法，其包含用適於藉由細胞 系表現人類furin之第一表現載體轉染適合於表現哺乳動物蛋白質之細胞系，其中第一表現載體包括編碼人類furin多肽之核苷酸序列；及用適於藉由細胞系表現FX之第二表現載體轉染細胞系，其中第二表現載體包括編碼FX多肽之核苷酸序列；其中經第一及第二表現載體轉染之細胞系在培養約36小時與約78小時之間以後以約50U/mL至約300U/mL之濃度表現及分泌功能性人類furin於培養物上清液中。在一個具體實例中，細胞系實質上同時經第一表現載體及第二表現載體轉染。在另一具體實例中，細胞系經第一表現載體轉染且獲得分泌穩定量之furin之細胞，隨後經第二表現載體轉染細胞系。在另一具體實例中，細胞系經第二表現載體轉染且獲得分泌穩定量之蛋白質之細胞，隨後經第一表現載體轉染細胞系。
在另一具體實例中，細胞能夠在培養約36小時與約78小時 之間以後以至少約50U/mL至約60U/mL之濃度分泌功能性furin至培養物 上清液中且其中至少90%之FX經完全加工。在另一具體實例中，細胞能夠在培養約36小時與約78小時之間以後以至少約90U/mL至約100U/mL之濃度分泌功能furin至培養物上清液中且其中至少95%之FX經完全加工。
亦提供一種藉由本文揭示之轉形細胞生產之重組FX。
另外提供一種藉由本文揭示之表現系統生產之重組FX。
亦提供一種藉由本文揭示之方法生產之重組FX。
亦提供一種用於重組FX之表現系統，其適於在培養約36小時與約78小時之間以後以約50U/mL與約300U/mL之間的濃度分泌furin至培養物上清液中。
亦提供一種生產成熟、經完全加工之FX之方法，其包含在培養約36小時與約78小時之間以後以約50U/mL與約300U/mL之間的濃度分泌furin至培養物上清液中的表現系統。
圖1A描繪RCL.012-74.pD3H-Furin表現載體且圖1B描繪載體之核苷酸序列。人類furin序列加下劃線且起始及終止密碼子加雙下劃線。
圖2描繪人類furin之核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。起始及終止密碼子加雙下劃線。
圖3描繪人類furin之胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。
圖4描繪培養物中之經完全加工之因子X(FX)之程度。進行還原條件下之FX西方墨點之密度計定量且藉由多株抗FX抗體染色。純系(純系標識42到52)展現至多4種具有改變像素強度之FX之物質，包括未經加工FX單鏈(框1、5、9等)、FX重鏈(框2、6、10等)、未經 加工含前肽FX輕鏈(框3、7、11等)及經加工之FX輕鏈(框4、8、12等)。測定框45-48之像素強度用於背景減除。
圖5描繪培養物中之分泌furin濃度及經完全加工之FX/總 FX之百分比。在細胞培養物上清液中之分泌furin濃度(藉由furin活性檢定測定)與經完全加工之FX/總FX%(藉由西方墨點中之各別帶之密度計定量測定)之間存在劑量反應關係。
圖6描繪furin劑量及經完全加工之FX之分析。資料(圓圈) 與細胞特定值(深色線)及群體平均值(淺色線)藉由Emax模型預測經完全加工之FX/總FX(%)隨furin濃度而變。
圖7A-D描繪Emax模型有效性測試。圖7A描繪反應殘餘相 對於預測反應，其中資料點對稱地分散於零周圍，指示無系統性趨勢。圖7B描繪殘餘物之正態Q-Q圖，指示正態分佈誤差之假設成立，因為資料點分散於等值線周圍。圖7C描繪反應殘餘相對於細胞系，其中資料點對稱地分散於零周圍，指示無系統性趨勢。圖7D描繪相對於彼此標繪之觀測及預測值，指示資料之良好擬合，因為資料點對稱地分散於等值線周圍。
圖8描繪測試FX加工之程度獨立於furin濃度之假定的空值 模型。資料(圓圈)及具有截距之擬合空值模型僅假設經加工之FX獨立於furin濃度(細胞特定值及群體平均值分別擬合為深色線及淺色線)。
圖9描繪產生90%及95%經加工之FX之劑量-反應曲線及計 算之furin最小濃度。群體平均預測藉由擬合模型之數值最佳化獲得之隨furin濃度而變的經完全加工之FX/總FX(%)(黑線)連同得到90%及95%經完全加工之FX/總FX之furin濃度。
本文提供用於生產重組蛋白質之轉形細胞、真核表現系統、 方法及藉由該等方法製得之重組蛋白質，全部涉及在相同細胞系中表現furin及因子X(FX)且從而提供培養物上清液中之臨界furin濃度以產生經完全加工且成熟之FX，同時維持培養物之活力。
用於生產重組蛋白質之轉形細胞、真核表現系統及方法的共 同之處為宿主細胞生產一致量之重組furin的能力。Furin對於將某些哺乳動物蛋白質(包括FX)自前驅蛋白質形式裂解為成熟、經完全加工之形式為所需的。表現系統之培養物上清液中之furin之低濃度導致蛋白質之含前肽及其他非加工或部分加工形式之積聚。過高之furin濃度導致宿主細胞之生長受損且最終導致細胞死亡。
如本文所用，術語「furin」包括全長furin以及任何能夠裂 解一致性識別位點Arg-X-Lys/Arg-Arg之furin片段。furin之活性截短形式在此項技術中已知且適用於本發明，適合之furin片段之非限制性實例可發現於U.S.6,210,926及Preininger等人(Cytotechnology 30：1-15,1999)，其關於重組furin之截短形式之所有揭示內容均以引用的方式併入本文中。
亦在本發明之範疇內的為本文揭示之furin及因子X蛋白質 之變異體。舉例而言，可作出保守胺基酸變化，儘管其改變蛋白質或肽之一級序列，但通常不改變其功能。保守胺基酸取代通常包括在以下群組內之取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸；天冬醯胺、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；及離胺酸、精胺酸；苯丙胺酸、酪胺酸。
亦包括融合蛋白或其他修飾或FX，其在向個體投予之後具 有增加之半衰期。此類之實例將為與免疫球蛋白Fc域、白蛋白域、伸展(XTEN)重組多肽(參見US 8,673,860，其關於XTEN多肽之所有揭示內容以引用的方式併入本文中)、聚Glu或聚Asp序列、運鐵蛋白或附接到FX序列之含PAS(Pro Ala Ser)多肽的融合物。
修飾(其通常不改變一級序列)包括多肽之活體內或試管內 化學衍生作用，例如乙醯化或羧化。亦包括醣基化之修飾，例如藉由在多肽之合成及加工期間或在其它加工步驟中修飾多肽之醣基化圖案製得之彼等；例如藉由將多肽暴露於影響醣基化之酶，例如哺乳動物醣基化或去醣基化酶。亦涵蓋具有磷酸化胺基酸殘基，例如磷酸酪胺酸、磷絲胺酸或磷酸蘇胺酸之序列。蛋白質亦可在藉由水可溶生物相容性聚合物，例如聚乙二醇、聚唾液酸或羥乙基澱粉純化之後經化學修飾。
亦包括已使用一般分子生物技術修飾以提高其對蛋白水解 降解之抗性或使可溶性特性最佳化之多肽。此類多肽之類似物包括含有除天然存在之L-胺基酸，例如D-胺基酸或非天然存在之合成胺基酸以外的殘基之彼等多肽類似物。本發明之肽不限於本文中所列之特定例示性方法中之任一者之產物。
本文中的本發明總體上涉及用於生產至少一個藉由furin轉 譯後加工之重組哺乳動物蛋白質(重組需要furin之哺乳動物蛋白質)之系統、轉形細胞、表現載體及方法。哺乳動物蛋白質為馮威里氏因子、因子II、因子IX、因子X、蛋白質C、蛋白質S或蛋白質Z中之一或多者。在另一具體實例中，蛋白質為FX。
培養物上清液中之furin之濃度定向在用於在定義培養時段 之後生產成熟、經完全加工之蛋白質，同時維持培養物之活力的最優範圍內。因此，用於生產成熟、經完全加工之哺乳動物蛋白質的培養物上清液中之furin之適用濃度在約50U/mL與約400U/mL之間、在約50U/mL與約350U/mL之間、在約50U/mL與約300U/mL之間、在約50U/mL與約250U/mL之間、在約50U/mL與約200U/mL之間、在約50U/mL與約175U/mL之間、在約50U/mL與約150U/mL之間、在約50U/mL與約125U/mL之間或在約50U/mL與約100U/mL之間。在一個具體實例中，培養物上清液中之furin之濃度不小於50U/mL。
在其他具體實例中，用於在定義培養時段之後生產成熟、經 完全加工之哺乳動物蛋白質的培養物上清液中之furin之適用濃度在約50U/mL與約60U/mL之間、在約55U/mL與約65U/mL之間、在約60U/mL與約70U/mL之間、在約65U/mL與約75U/mL之間、在約70U/mL與約80U/mL之間、在約75U/mL與約85U/mL之間、在約80U/mL與約90U/mL之間、在約85U/mL與約95U/mL之間、在約90U/mL與約95U/mL之間、在約95U/mL與約105U/mL之間、在約100U/mL與約110U/mL之間、在約115U/mL與約125U/mL之間、在約120U/mL與約130U/mL之間、在約125U/mL與約135U/mL之間、在約130U/mL與約140U/mL之間、在約135U/mL與約145U/mL之間、在約140U/mL與約150U/mL之間、在約145U/mL與約155U/mL之間、在約150U/mL與約160U/mL之間、在約155U/mL與約165U/mL之間、在約160U/mL與約170U/mL之間、在約165U/mL與約175U/mL之間、在約170U/mL與約180U/mL之間、在約175U/mL與約185 U/mL之間、在約180U/mL與約190U/mL之間、在約185U/mL與約195U/mL之間或在約190U/mL與約200U/mL之間。在另一具體實例中，用於在定義培養時段之後生產成熟、經完全加工之哺乳動物蛋白質的培養物上清液中之furin之適用濃度在約50U/mL與約60U/mL之間，或約57U/mL。在另一具體實例中，用於生產成熟、經完全加工之哺乳動物蛋白質的培養物上清液中之furin之適用濃度在約90U/mL與約100U/mL之間，或約96U/mL。
在其他具體實例中，用於在定義培養時段之後生產成熟、經 完全加工之哺乳動物蛋白質的培養物上清液中之furin之適用濃度小於約400U/mL、小於約375U/mL、小於約350U/mL、小於約325U/mL、小於約300U/mL、小於約275U/mL、小於約250U/mL、小於約225U/mL、小於約200U/mL、小於約175U/mL、小於約150U/mL、小於約125U/mL或小於約100U/mL。
在其他具體實例中，用於在定義培養時段之後生產成熟、經 完全加工之哺乳動物蛋白質的培養物上清液中之furin之適用濃度大於約50U/mL、大於約60U/mL、大於約70U/mL、大於約80U/mL、大於約90U/mL、大於約100U/mL、大於約110U/mL、大於約120U/mL、大於約130U/mL、大於約140U/mL、大於約150U/mL、大於約160U/mL、大於約170U/mL、大於約180U/mL、大於約190U/mL或大於約200U/mL。
出於本發明的目的，本文揭示之培養物上清液中之furin之 量在距培養起始之後約12小時至約96小時的時段內(在培養約12小時至約96小時之後)產生且反映在該時段期間在培養物上清液中積聚之furin之量。在其他具體實例中，在培養起始之後約18小時至約90小時、約24 小時至約84小時、約30小時至約78小時、約36小時至約72小時、約40小時至約80小時、約42小時至約68小時或約48小時至約72小時內，或在培養指定時段之後達到培養物上清液中之furin之所需量。
或者，本文揭示之培養物上清液中之furin之量表示為每天 每體積之培養物上清液之量的細胞所分泌之furin之濃度。在非限制性實例中，furin之濃度表示為U/106細胞/天。在其他具體實例中，用於生產成熟、經完全加工之哺乳動物蛋白質的培養物上清液中之furin之適用濃度在約20U/106細胞/天與約75U/106細胞/天之間、在約25U/106細胞/天與約75U/106細胞/天之間、在約30U/106細胞/天與約75U/106細胞/天之間、在約35U/106細胞/天與約75U/106細胞/天之間、在約40U/106細胞/天與約75U/106細胞/天之間、在約45U/106細胞/天與約75U/106細胞/天之間、在約50U/106細胞/天與約75U/106細胞/天之間、在約55U/106細胞/天與約75U/106細胞/天之間、在約60U/106細胞/天與約75U/106細胞/天之間、在約20U/106細胞/天與約70U/106細胞/天之間、在約20U/106細胞/天與約65U/106細胞/天之間、在約20U/106細胞/天與約60U/106細胞/天之間、在約20U/106細胞/天與約55U/106細胞/天之間、在約25U/106細胞/天與約55U/106細胞/天之間、在約25U/106細胞/天與約50U/106細胞/天之間、在約25U/106細胞/天與約45U/106細胞/天之間或在約25U/106細胞/天與約40U/106細胞/天之間。
培養物上清液中之furin之濃度足以將至少約75%之哺乳動 物前驅蛋白質加工為成熟、功能蛋白。蛋白質為任何至少部分藉由furin之作用轉譯為前驅蛋白質且加工為成熟形式的蛋白質。在一個具體實例中，蛋白質為FX。在其他具體實例中，furin濃度足以將至少約80%之哺乳動物 FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約82%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約84%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約86%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約88%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約90%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約92%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約93%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約94%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約95%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約96%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約97%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約98%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，將至少約99%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質，或將100%之哺乳動物FX前驅蛋白質加工為成熟、功能FX蛋白質。
如本文所用，術語「前驅蛋白質」係指非活性且藉由合成之 後細胞中之裂解及視情況存在之其他轉譯後修飾變為活性形式的前驅蛋白質。
因此，本文提供適於分泌furin及哺乳動物蛋白質(如FX) 兩者之轉形細胞。轉形細胞可為任何適合於分泌哺乳動物蛋白質之真核細胞，不管該等細胞是否生產內源性furin。用於產生轉形細胞的適合之細胞系包括(但不限於)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚腎細胞、靈長類動 物腎細胞(例如COS細胞、HEK293)、纖維母細胞(例如鼠類纖維母細胞)及小鼠骨髓瘤細胞(例如NSO-GS)。適合之細胞系能夠高水準表現哺乳動物蛋白質且能夠轉譯後修飾，例如醣基化、形成雙硫鍵、磷酸化及γ-羧化。 選擇及培養宿主細胞及誘導宿主細胞以表現多肽之方法一般為熟習此項技術者已知。
本文亦揭示包含適合於生產哺乳動物蛋白質之細胞及至少 一個適於表現至少一種哺乳動物蛋白質之表現載體的表現系統。真核表現載體一般可用於哺乳動物細胞中之表現，以使得furin及哺乳動物蛋白質，諸如FX能夠根據本文揭示之方法表現，編碼蛋白質之核苷酸序列藉助於經表現載體之轉染、轉形或感染引入至真核細胞中，藉此表現多肽。furin及/或哺乳動物蛋白質之表現可為暫時或穩定的。furin及哺乳動物核苷酸序列呈現為質體，或病毒或非病毒表現載體的一部分。尤其適合之病毒載體包括(但不限於)桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、巨細胞病毒、腺相關病毒、複製能力慢病毒(RCL)及疱疹病毒。病毒真核表現載體之非限制性實例包括Rc/CMV、Rc/RSV、RCL及SV40載體。例示性非病毒真核表現載體包括(但不限於)病毒顆粒、脂質體、陽離子脂質、質粒及聚離胺酸共軛DNA。 例示性質體表現載體包括(但不限於)pSLX、pcDNA及一般熟習此項技術者已知之其他者。
在另一具體實例中，本文揭示包含編碼furin之核苷酸序 列、編碼哺乳動物蛋白質之核苷酸序列，諸如編碼FX之核苷酸序列或其組合之表現載體。在一個具體實例中，furin及蛋白質序列均表現自單一表現載體。在另一具體實例中，furin序列及蛋白質序列表現自不同表現載體。 在一個具體實例中，若furin及蛋白質核苷酸序列表現自相同表現載體，則其視情況藉由內部核糖體進入位點(IRES)分離。基因可表現自一或多個啟動子。此外，編碼各蛋白質之核苷酸序列可以質體上之相對方向定向或以相同方向定向。如一般熟習此項技術者所理解，表現載體另外包含可選擇元件及其他調節序列以有效生產哺乳動物蛋白質。
本文亦揭示允許藉由使用重組酶介導之卡匣交換表現furin 及其他哺乳動物蛋白質之表現載體。
若furin及哺乳動物蛋白質表現自不同表現載體，則表現載體將具有不同選擇標記以使得可選擇藉由載體轉形之細胞。此類選擇之細胞可接著經分離且生長為單株培養物
准許真核細胞中之組成性、可調節、組織特異性、細胞類型特異性、細胞循環特異性或代謝特異性表現之啟動子適合於例如哺乳動物細胞中之表現。可調節元件為啟動子、活化子序列、增強子、靜止子及/或抑制因子序列。准許真核生物中之組成性表現之可調節元件之實例為藉由RNA聚合酶III識別之啟動子或病毒啟動子、巨細胞病毒(CMV)增強子、CMV啟動子、SV40啟動子或長末端重複序列(LTR)啟動子，例如衍生自MMTV(小鼠乳房腫瘤病毒)及其他病毒啟動子及活化子序列，其衍生自例如B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、單純疱疹病毒(HSV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus；EBV)、熱休克啟動子或人類免疫缺乏病毒(HIV)。准許真核生物症狀誘導表現之可調節元件之實例為與適當抑制因子組合之四環素操縱子。furin及哺乳動物蛋白質核苷酸序列之表現亦可發生於組織特異性或蛋白質特異性啟動子之 控制下。蛋白質特異性啟動子之非限制性實例為FX基因啟動子或furin基因啟動子。
在某些具體實例中，細胞藉由除furin及哺乳動物蛋白質以 外之另一蛋白質轉形。在一個具體實例中，額外蛋白質為維生素K環氧化物還原酶(VKOR)。在某些具體實例中，額外蛋白質表現自與furin及哺乳動物蛋白質中之一者或兩者相同的表現載體，或額外蛋白質表現自不同表現載體。
本文亦揭示包含宿主細胞及一或多個適於表現furin及至少 一個額外哺乳動物蛋白質，例如FX之表現載體的表現系統。
本文亦揭示生產經完全加工之重組需要furin之哺乳動物蛋 白質，諸如FX的方法。在一個具體實例中，穩定、重組生產furin之細胞系經生產且隨後經含有至少一個需要furin之哺乳動物蛋白質之核苷酸序列的表現載體轉染。可建立及儲存穩定、重組生產furin之細胞系以按需要經含有至少一個需要furin之哺乳動物蛋白質之核苷酸序列的表現載體轉染。 或者，furin及需要furin之哺乳動物蛋白質，諸如FX之表現載體可在約30分鐘、約60分鐘、約2小時、約6小時、約12小時或約24小時內轉染至彼此之宿主細胞中。在另一具體實例中，兩個或兩個以上表現載體實質上同時轉染至宿主細胞中。出於本發明的目的，實質上同時係指任何小於或等於1小時之時段。
轉形細胞係根據存在於表現載體中之選擇標記選擇以生產 穩定的轉形細胞池，接著該等池視情況選殖以產生穩定純系。穩定純系在培養起始之後約36小時至約78小時、約36小時至約72小時、約40小時 至約78小時、約42小時至約68小時或約48小時至約72小時之後，或在培養指定時段之後於培養物上清液中生產在約50U/mL與約300U/mL之間、在約50U/mL與約400U/mL之間、在約50U/mL與約350U/mL之間、在約50U/mL與約300U/mL之間、在約50U/mL與約250U/mL之間、在約50U/mL與約200U/mL之間、在約50U/mL與約175U/mL之間、在約50U/mL與約150U/mL之間、在約50U/mL與約125U/mL之間或在約50U/mL與約100U/mL之間的furin。此外，穩定純系產生藉由轉形細胞生產之所有重組蛋白質，諸如FX之大於80%經完全加工且具活性之重組哺乳動物蛋白質，諸如FX。
本文亦揭示一種用於重組furin及重組FX之表現系統，其在 培養約36小時至約78小時之後以約50U/mL與約300U/mL之間的累積濃度分泌furin至培養物上清液中。
本文亦揭示一種生產成熟、經完全加工之FX之方法，其包 含使用在培養約36小時至約78小時之後以約50U/mL與約300U/mL之間的累積濃度分泌furin至培養物上清液中的表現系統。
本文亦包含藉由主張之方法生產之重組哺乳動物蛋白質及任何經完全加工之哺乳動物重組FX。
實施例 實施例1.藉由定義量之furin生產經完全加工且完全具活性之重組因子X
對於FX表現，使用含有人類密碼子最佳化FX或藉由內部核糖體進入位點(IRES)分離之人類密碼子最佳化FX與人類密碼子最佳化 維生素K環氧化物還原酶(FX/VKOR)兩者之哺乳動物表現質體pSLX。中國倉鼠卵巢(CHO)-S及CHO-DG44表現系統之構築體分別包括遺傳黴素選擇及二氫葉酸還原酶(dhfr)選擇。對於furin表現，使用含有與作為選擇標記之潮黴素組合之人類全長furin之哺乳動物表現質體pcDNA3.1(圖1A)。
起初，CHO衍生之細胞系(CHO-S及CHO DG44)經FX或 FX/VKOR構築體轉染以產生穩定池，且隨後池經受次選殖以產生穩定純系。在第二輪轉染及次選殖中，選擇數目之FX-或FX/VKOR表現純系各自經furin超轉染，產生表現FX/furin或FX/VKOR/furin之穩定池及穩定純系。
穩定重組生產FX之CHO-S及CHO-DG44細胞系在振盪器 燒瓶中之無動物組分培養基中且在補充有4mM麩醯胺酸、500μg/mL遺傳黴素、500μg/mL潮黴素及5μg/mL維生素K1之PowerCHO®-CD培養基(Lonza BioWhittaker)中維持每毫升CHO-S細胞0.3×106或0.5×106個細胞的起始細胞數目的情況下生長約42小時至約72小時。CHO-DG44細胞維持於補充有6mM麩醯胺酸、500nM甲胺喋呤(MTX)及5μg/mL維生素K1之OptiCHOTM-CD培養基(Life Technologies)中。
收穫之細胞培養物上清液藉由西方墨點法在還原條件下分 析以使用多株山羊抗人類FX或多株綿羊抗人類FX(Affinity Biologicals)測定重組人類FX之品質。西方墨點之密度計分析使得能夠定量不同經恰當加工之FX物質，稱為重鏈FX(HC)及輕鏈FX(LC)，及不充分裂解之FX物質，稱為單鏈FX(SC)及含前肽輕鏈FX(PP-LC)。
對於FX定量，細胞培養物上清液藉由ELISA分析以測定 FX濃度且藉由使用魯塞爾蝰蛇蛇毒(Russell's viper venom；RW)作為活化劑之FXa發色檢定分析以測定活性FX之濃度。此等檢定使用血漿衍生FX(Hyphen Biomed)校準。比活性藉由活性FX之濃度除以總FX之濃度乘以100以%給出。對於furin定量，活性furin在相對於furin參考材料(New England Biolabs)校準之furin螢光檢定中測定。
對於統計分析，經完全加工之FX/總FX(%)使用關於CHO-DG44轉染池(A)、CHO-S轉染池(B)及CHO-S單細胞衍生純系(C)之Emax模型隨furin濃度而變地模型化。此模型用於劑量反應研究之統計評估。Emax模型使用四個參數(E0、Emax、ED50及n)以如下隨furin而變地對FX模型化： y=E 0 +(x n ‧E max )/(ED n 50 =x n )
其中y係指經完全加工之FX/總FX且x係指furin濃度。參數E0係指對應於furin濃度為零時之反應之基礎效應，Emax係指可歸因於furin濃度之最大效應，ED50係指產生Emax之一半的furin濃度，且參數n表示決定曲線陡度之斜率(希爾係數(Hill factor))。
為了說明若furin接近無限大濃度，則經完全加工之FX/總FX接近100%，Emax模型如下地經修改成具有三個待評估之參數的函數； y=E 0 +(x n ‧(100-E 0 )/(ED n 50 =x n )
此模型藉由允許參數E0及n在不同細胞系之間變化，亦藉由將此兩個參數模型化為隨機效應而擬合至使用非線性混合效應模型將三種不同細胞系之間的變異性考慮在內的資料。
進行模型診斷以驗證應用之模型。進行使用似然比測試之擬 合Emax模型與空值模型(null model)之比較以確定Emax模型取決於furin濃度估計總FX中之經完全加工之FX之百分比的統計證據。
結果
包含CHO-DG44轉染池(A)、CHO-S轉染池(B)及CHO-S單細胞衍生純系(C)之用於人類FX之基於CHO之異源表現系統用作研究furin表現對遵循不同轉染策略之人類FX加工之效應的基礎。轉染池以及純系另外表現對研究無影響之VKOR。
在二至三培養天之培育期之後，細胞培養物上清液經受一系列分析，包括還原條件下之西方墨點分析、furin活性檢定、ELISA及RW檢定(表1)。平均起來，生產FX之CHO池及純系顯示超過50%，部分達到100%之FX比活性(表1)。西方墨點分析顯示重組FX不充分地加工至不同程度，如藉由除經完全加工、無前肽FX輕鏈及FX重鏈以外的兩個不完全加工形式之FX(亦即含前肽FX輕鏈及FX單鏈)所示(圖4)。藉助於FX之此四種物質之密度計分析，細胞培養物上清液中經完全加工之FX，亦即FX輕鏈加上FX重鏈相對於總FX之百分比在30%與接近100%之間(表1，圖4)。此外，未觀測到預活化，其將在重鏈帶藉由缺失活化肽之尺寸縮短時可見。亦藉由繪製此兩個參數評估分泌furin之濃度是否對經加工之FX之程度具有影響(圖5)。如圖5中所示，僅FX之部分加工在分泌furin之低濃度(<20U/mL)下可行，而較高量之分泌furin與較佳加工之FX相關。
為了理解furin對FX加工之影響及提供資料之統計支持，總FX中之經完全加工之FX(%)使用關於細胞系A、B及C之Emax模型隨furin濃度而變地模型化(圖6)。指示模型與資料之良好擬合的四種模型診斷曲 線提供於圖7A-D中。使用似然比測試之擬合Emax模型與空值模型之比較產生<0.0001之p值，為總FX中之經完全加工之FX之較高百分比取決於較高furin濃度(圖8)提供統計證據，再次證明資料之有效性。基於統計分析，導致總FX中之等於或高於90%及等於或高於95%經完全加工之FX的如細胞培養基連同FX中偵測之生產細胞系生產之估計furin濃度分別為至少57U/mL及至少96U/mL(圖9)。
總體而言，資料提供足夠FX加工(等於或高於90%及等於 或高於95%)所需的細胞培養物上清液中之分泌furin之定義最小量(至少57U/mL及至少96U/mL)。
在表現高量之重組蛋白質之生物技術製程中，furin過度表 現可用於獲得經完全加工之酶原。藉由吾人之本發明，吾人首次提供保證高FX加工之分泌furin之定義最小值(57U/mL以達成至少90%經完全加工之FX及96U/mL furin以達成至少95%經完全加工之FX)。此發現對表現來自人類及動物物種之重組FX、FXa及變異體之醱酵製程尤其有益，其中furin量可用作FX前驅蛋白質之足夠加工的指標及用作細胞系及製程開發之目標。
除非另外指明，否則本說明書及申請專利範圍中所使用之表 示成分量、特性(諸如分子量、反應條件等)之所有數字應理解為在所有情況下均由術語「約」修飾。如本文所用，術語「約」及「大致」意謂在10%至15%內，較佳在5%至10%內。因此，除非相反指示，否則本說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為近似值，其可取決於本發明設法獲得之所要特性而變化。至少，且不試圖將等效原則之應用限制於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報告之有效數位之個數且藉由應用一般捨入技術來解釋。儘管闡述本發明之廣泛範疇的數值範圍及參數為近似值，但特定實施例中所闡述之數值應儘可能精確地報導。然而，任何數值均固有地含有某些必然由其各別測試量測值中所存在之標準差造成的誤差。
除非本文另外指示或明顯與內容相矛盾，否則在描述本發明之上下文中(尤其在以下申請專利範圍之上下文中)所使用的術語「一」及「該」及類似指示物應解釋為涵蓋單數與複數個兩者。本文中值的範圍 之敍述僅意欲充當個別地提及屬於該範圍內之各單獨值的簡寫方法。除非本文中另外指示，否則各個別值併入至本說明書中，如同其在本文中個別地敍述一般。除非本文另外指明或上下文另外明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何適合順序進行。使用本文中提供之任何及所有實施例或例示性語言(例如「諸如」)僅意欲更好地闡明本發明且不對另外主張的本發明之範疇造成限制。本說明書中之語言不應理解為指示任何未主張之要素對於實踐本發明必不可少。
本文中所揭示的本發明之替代性要素或具體實例的分組不應理解為限制。可個別地或以與群組之其他成員或本文中所發現的其他要素的任何組合來參考及主張各群組成員。預期群組中之一或多個成員可出於便利性及/或專利性原因而包括於群組中或自群組刪除。當任何此包括或刪除發生時，本說明書被認為如所修改地含有群組，因此滿足附加之申請專利範圍中所使用之所有馬庫什群組(Markush group)的書面描述。
本文中描述本發明之某些具體實例，包括本發明人已知之進行本發明的最佳模式。當然，此等所描述具體實例之變化在一般技術者閱讀前述描述後將變得顯而易見。本發明人期望熟習此項技術者適當時採用此等變化，且本發明人意欲以不同於本文中特定描述之方式來實踐本發明。因此，本發明包括如由適用法律所准許之隨附在此之申請專利範圍中所敍述之標的物的所有修改及等效物。此外，除非本文另外指明或另外與上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素在其所有可能變化中之任何組合。
本文揭示之特定具體實例可在申請專利範圍中使用由…… 組成或主要由……組成語言來進一步限制。當用於申請專利範圍中時，不論如所提交抑或根據修改添加，過渡術語「由……組成」排除申請專利範圍中未指定之任何要素、步驟或成分。過渡術語「主要由……組成」將申請專利範圍之範疇限制於指定材料或步驟及不實質上影響基本及新穎特徵之材料或步驟。如此主張之本發明之具體實例固有地或明確地描述並實現於本文中。
此外，已在本說明書通篇中大量參考專利及印刷出版物。上文所引用之參考文獻及印刷出版物中之每一者個別地以全文引用的方式併入本文中。
最後，應理解本文中所揭示之本發明之具體實例說明本發明之原理。可採用之其他修改在本發明之範疇內。因此，作為實例而非限制，可根據本文中之教示利用本發明之替代性組態。因此，本發明不限於如所精確展示及描述的內容。

Claims (15)

  1. 一種轉形細胞，其包含：編碼人類furin之第一核苷酸序列，使得該轉形細胞表現及分泌能夠在Arg-(Lys/Arg)-Arg基序(motif)處進行裂解之功能性furin至培養物上清液中，其中該功能性furin在培養36小時至78小時之後以50U/mL至300U/mL之濃度分泌於該培養物上清液中，以及編碼因子X之第二核苷酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之轉形細胞，其中該編碼人類furin之第一核苷酸序列及該編碼因子X之第二核苷酸序列在不同表現載體上或在相同表現載體上。
  3. 如申請專利範圍第2項之轉形細胞，其中該表現載體是病毒載體或非病毒載體。
  4. 如申請專利範圍第1-3項中任一項之轉形細胞，其中該功能性furin以至少50U/mL至60U/mL之濃度分泌於該培養物上清液中。
  5. 如申請專利範圍第4項之轉形細胞，其中至少90%之藉由該轉形細胞生產之因子X經完全加工。
  6. 如申請專利範圍第1-3項中任一項之轉形細胞，其中該功能性furin以至少90U/mL至100U/mL之濃度分泌於該培養物上清液中。
  7. 如申請專利範圍第6項之轉形細胞，其中至少95%之藉由該轉形細胞生產之因子X經完全加工。
  8. 一種生產轉形細胞之方法，該方法包含：對適合表現哺乳動物蛋白質的細胞系用以下者轉染：適於藉由該細胞系表現能夠在Arg-(Lys/Arg)-Arg基序處進行裂解之人類furin之第一表現載體以及適於藉由該細胞系表現因子X的第二表現載體，其中該第二表現載體包括編碼因子X的核苷酸序列；以及選擇經該第一表現載體及該第二表現載體轉染之細胞，其在培養36小時至78小時之後表現功能性人類furin並以50U/mL至300U/mL之濃度分泌功能性人類furin於培養物上清液中。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該表現載體是病毒載體或非病毒載體。
  10. 如申請專利範圍第8或9項之方法，其中該選擇步驟係藉由以下方式進行：選擇經該第一表現載體及該第二表現載體轉染之細胞，其在培養42小時至72小時之後表現功能性人類furin並以300U/mL之濃度分泌功能性人類furin於培養物上清液中。
  11. 如申請專利範圍第8或9項之方法，其中該細胞系實質上同時經該第一表現載體及該第二表現載體轉染。
  12. 如申請專利範圍第8或9項之方法，其中該細胞系經該第一表現載體轉染且獲得分泌穩定量之furin之細胞，隨後該細胞系經該第二表現載體轉染，或以相反順序進行。
  13. 一種經完全加工的重組因子X，其係藉由根據申請專利範圍第1-7項中任一項的轉形細胞生產。
  14. 一種生產成熟、經完全加工的因子X(FX)的方法，該方法包含培養根據申請專利範圍第1-7項中任一項的轉形細胞以產生成熟、經完全加工的FX，並將該FX從培養物上清液中分離。
  15. 一種生產根據申請專利範圍第1項之轉形細胞的方法，該方法包含：用表現載體轉染適合於表現哺乳動物蛋白質的細胞系，該表現載體包括編碼能夠在Arg-(Lys/Arg)-Arg基序處進行裂解之人類furin多肽之核苷酸序列以及用包括編碼因子X之核苷酸序列的第二表現載體轉染；及選擇具有以下特徵的轉形細胞：在培養36小時至78小時之後表現功能性人類furin並以50U/mL至300U/mL之濃度分泌功能性人類furin於培養物上清液中，較佳在培養42小時至72小時之後表現功能性人類furin並以300U/mL之濃度分泌功能性人類furin於培養物上清液中。
TW104126066A 2014-08-12 2015-08-11 在分泌ｆｕｒｉｎ之哺乳動物表現系統中生產經完全加工且具功能性之因子Ｘ TWI666319B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462036438P 2014-08-12 2014-08-12
US62/036,438 2014-08-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201625791A TW201625791A (zh) 2016-07-16
TWI666319B true TWI666319B (zh) 2019-07-21

Family

ID=54035298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104126066A TWI666319B (zh) 2014-08-12 2015-08-11 在分泌ｆｕｒｉｎ之哺乳動物表現系統中生產經完全加工且具功能性之因子Ｘ

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9873892B2 (zh)
EP (1) EP3180427B1 (zh)
JP (1) JP6793114B2 (zh)
CN (1) CN107002041B (zh)
AR (1) AR102048A1 (zh)
AU (1) AU2015301726B2 (zh)
CA (1) CA2958056C (zh)
EA (1) EA035444B1 (zh)
ES (1) ES2742724T3 (zh)
IL (1) IL250530B (zh)
MX (1) MX2017001931A (zh)
NZ (1) NZ729729A (zh)
TW (1) TWI666319B (zh)
WO (1) WO2016025615A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8241623B1 (en) 2009-02-09 2012-08-14 David Bermudes Protease sensitivity expression system
CA3068121A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Baxalta Incorporated Purification of factor viii subspecies
WO2020257942A1 (en) * 2019-06-28 2020-12-30 Peel Sean A F A method for increasing yields and the specific activity of certain recombinant proteins in mammalian cells by co-expressing full-length furin
CN115298204B (zh) * 2022-01-25 2023-04-25 青岛万明赛伯药业有限公司 proNGF突变体及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001094383A2 (en) * 2000-06-09 2001-12-13 Baxter Aktiengesellschaft Mutated furin polypeptides having improved characteristics
CN103889454A (zh) * 2011-06-02 2014-06-25 巴克斯特国际公司 重组成对碱性氨基酸蛋白酶的制剂

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE158816T1 (de) * 1990-11-26 1997-10-15 Genetics Inst Expression von pace in wirtszellen und verfahren zu dessen verwendung
AT404838B (de) * 1995-11-24 1999-03-25 Immuno Ag Herstellung von proteinen aus pro-proteinen durch fusionsproteine abgeleitet von furin oder furinanalogen
US5876923A (en) 1996-07-26 1999-03-02 Arch Development Corporation Herpes simplex virus ICP4 as an inhibitor of apoptosis
EP2292657A1 (en) 1999-11-12 2011-03-09 Baxter Biotech Technology S.A.R.L. Reduced side-effect hemoglobin compositions
CN100385011C (zh) * 2003-05-09 2008-04-30 研究发展基金会 在膜蛋白中插入弗林蛋白酶切割位点及其用途
PT2152735E (pt) * 2007-05-18 2015-07-21 Baxter Int Método para produzir um vwf maturo a partir de um pró- péptido do vwf
CN101910401A (zh) * 2007-12-31 2010-12-08 巴克斯特国际公司 基本上无动物蛋白的重组体弗林蛋白酶及其生产方法
CN116925238A (zh) 2009-02-03 2023-10-24 阿穆尼克斯制药公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001094383A2 (en) * 2000-06-09 2001-12-13 Baxter Aktiengesellschaft Mutated furin polypeptides having improved characteristics
CN103889454A (zh) * 2011-06-02 2014-06-25 巴克斯特国际公司 重组成对碱性氨基酸蛋白酶的制剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Himmelspach, Michèle, et al. "Recombinant human factor X: high yield expression and the role of furin in proteolytic maturation in vivo and in vitro." Thrombosis research 97.2 (2000): 51-67. *
Preininger, Alexandra, et al. "Strategies for recombinant furin employment in a biotechnological process: complete target protein precursor cleavage." Cytotechnology 30.1-3 (1999): 1-16. *

Also Published As

Publication number Publication date
US9873892B2 (en) 2018-01-23
IL250530B (en) 2020-03-31
JP2017524366A (ja) 2017-08-31
EP3180427B1 (en) 2019-05-22
TW201625791A (zh) 2016-07-16
WO2016025615A1 (en) 2016-02-18
US20160046957A1 (en) 2016-02-18
AR102048A1 (es) 2017-02-01
CA2958056A1 (en) 2016-02-18
CN107002041B (zh) 2021-06-29
JP6793114B2 (ja) 2020-12-09
EA035444B1 (ru) 2020-06-17
CA2958056C (en) 2023-07-04
ES2742724T3 (es) 2020-02-17
NZ729729A (en) 2023-07-28
EP3180427A1 (en) 2017-06-21
AU2015301726A1 (en) 2017-03-16
CN107002041A (zh) 2017-08-01
EA201790360A1 (ru) 2017-06-30
MX2017001931A (es) 2017-06-30
IL250530A0 (en) 2017-03-30
AU2015301726B2 (en) 2021-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210095323A1 (en) Method of producing biologically active vitamin k dependent proteins by recombinant methods
TWI666319B (zh) 在分泌ｆｕｒｉｎ之哺乳動物表現系統中生產經完全加工且具功能性之因子Ｘ
EP1896590B1 (en) Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines
KR101190605B1 (ko) 활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법
US8759066B2 (en) Thrombin activator compositions and methods of making and using the same
JP5806465B2 (ja) 実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンおよび実質的に動物性タンパク質を含まない組換えフリンを作製するための方法
AU2013211534B2 (en) Method of producing biologically active vitamin K dependent proteins by recombinant methods
AU2016200807A1 (en) Method of producing biologically active vitamin K dependent proteins by recombinant methods