CN103889454A - 重组成对碱性氨基酸蛋白酶的制剂 - Google Patents

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Abstract

本申请提供成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的稳定化制剂，所述制剂含有糖、糖醇、和/或非离子型表面活性剂。与非稳定化组合物相比，本发明所公开的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂在储存和/或经受机械应力时保留较大量的成对碱性氨基酸蛋白酶活性和单体成对碱性氨基酸蛋白酶含量，同时减少成对碱性氨基酸蛋白酶聚集。还提供用于稳定地稀释成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的方法。

Description

重组成对碱性氨基酸蛋白酶的制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年6月2日提交的美国临时申请号61/492,712的权益，出于所有的目的，所述申请的内容明确地以引用的方式整体并入本文。
应用领域
本申请总体上涉及蛋白质制剂的领域。
发明背景
蛋白水解哺乳动物枯草杆菌蛋白酶样蛋白原转化酶(SPC或PC)家族与细菌枯草杆菌蛋白酶和酵母Kex2p同源。迄今为止，已经鉴别出SPC家族的七个不同成员，包括成对碱性氨基酸蛋白酶(furin)、PC1(还称为PC3)、PC2、PACE4、PC4、PC5(还称为PC6)、PC7(LPC、PC8、或SPC7)，其各自展现出独特的组织分布。
成对碱性氨基酸蛋白酶，还称为PACE(成对碱性氨基酸裂解酶)普遍表达于所有哺乳动物组织和细胞系中，并且能够加工分泌途径中的广泛范围的生物活性前体蛋白，还包括激素、生长因子、受体、病毒和细菌蛋白、以及血浆蛋白。它是结构上安排成几个域的钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，所述域即信号肽、前肽、催化结构域、中间结构域(还称为homo-B或P结构域)、C末端定位的富含半胱氨酸的结构域、跨膜结构域以及胞质尾区。成对碱性氨基酸蛋白酶的蛋白酶裂解位点包含识别序列，其特征为氨基酸序列Arg-X-Lys/Arg-Arg(Hosaka等,J Biol Chem.1991;266:12127-30)。
成对碱性氨基酸蛋白酶属于蛋白原转化酶家族并且依赖于钙(Ca2+)。成对碱性氨基酸蛋白酶特异性地裂解在1位和4位处含有精氨酸的特定序列内的C末端的精氨酸肽键。这种序列可以在许多人蛋白质中发现，从而表明成对碱性氨基酸蛋白酶在多种人蛋白原的成熟过程中起着重要作用。因此，成对碱性氨基酸蛋白酶是将潜在的前体蛋白加工成其生物活性产物的蛋白原转化酶。成对碱性氨基酸蛋白酶是使前体蛋白在其成对碱性氨基酸加工位点处裂解的钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶。成对碱性氨基酸蛋白酶的一种底物是冯·维勒布兰德(von Willebrand)因子(vWF)。
成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)能够通过裂解VWF的Arg741-Ser742肽键来将前VWF(原冯·维勒布兰德因子)转化成成熟VWF。这一成熟步骤是(例如)提供冯·维勒布兰德病B型的疗法的rVWF产生过程的一部分。活化重组蛋白质的产生具有高度临床和诊断重要性。例如，活性或成熟蛋白质(像成熟VWF)可以用于控制凝血。
成对碱性氨基酸蛋白酶制剂，特别是重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))制剂经常由于来自蛋白质降解(经常来自成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质的自身裂解)的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性损失而具有较短的保质期(少于6个月)。此外，当用于某些产生过程(如产生成熟vWF)时，重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂经常被稀释200倍，并且稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶通常显示不成比例的活性损失。因此，在本领域中需要使成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组成物稳定化的方法和制剂，以及用于稀释浓成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物而不损失大部分成对碱性氨基酸蛋白酶活性的方法。
发明概述
通过提供用于使成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)稳定化的方法和制剂，本公开实现了成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)配制、储存、以及操作领域中的这些和其它需求。通过添加糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂显著增加成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物在储存和机械应力过程中的稳定性的发现，使这些需求至少部分地得到满足。
因此，本发明提供高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂，特别是高度稳定化的重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂，所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂与起始(对照)成对碱性氨基酸蛋白酶制剂相比在高温、搅拌以及不同pH条件下显示出增加的稳定性。
一方面，本公开提供一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的稳定化水性组合物，所述组合物包含：8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；100mM至300mM药学上可接受的盐；0.5mM至2mM钙；2%至20%糖或糖醇；10ppm至200ppm非离子型表面活性剂；10mM至200mM缓冲剂；以及5.5至7.5的pH。
在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含150mM至250mM药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含190±10mM药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含190mM药学上可接受的盐。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钾。
在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含0.9±0.2mM钙。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含0.92mM钙。
在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含5%至15%糖或糖醇。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含10±2%糖或糖醇。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含10%糖或糖醇。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，糖或糖醇选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合组成的组。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中，糖或糖醇是蔗糖。
在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含10ppm至100ppm非离子型表面活性剂。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含50ppm至100ppm非离子型表面活性剂。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含75ppm非离子型表面活性剂。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80。
在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含50mM至150mM缓冲剂。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含90±10mM缓冲剂。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含91mM缓冲剂。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，缓冲剂包含乙酸盐。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中，缓冲剂包含HEPES。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中，缓冲剂包含MES。在以上所提供的组合物的另一个实施方案中，缓冲剂包含乙酸盐和HEPES。
在一个实施方案中，以上所提供的组合物包含25mM至75mM乙酸盐和25mM至75mM HEPES。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含45±5mM乙酸盐和45±5mM HEPES。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物包含45mM乙酸盐和46mM HEPES。
在一个实施方案中，以上所提供的组合物具有5.5至7.0的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有5.5至6.5的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有6.0±0.2的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有6.0的pH。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在于37℃下储存时具有增加的稳定性。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在于37℃下储存时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在于37℃下储存时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在搅拌时具有增加的稳定性。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在搅拌时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在搅拌时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在稀释时具有增加的稳定性。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在稀释时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
在以上所提供的组合物的一个实施方案中，组合物与不含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比在稀释时维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
一方面，本公开提供一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的稳定化水性组合物，所述组合物包含：8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；190mM氯化钠；0.92mM钙；10%海藻糖；75ppm聚山梨酯80；45mM乙酸；46mM HEPES；以及5.5至7.5的pH。
在一个实施方案中，以上所提供的组合物具有5.5至7.0的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有5.5至6.5的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有6.0±0.2的pH。在另一个实施方案中，以上所提供的组合物具有6.0的pH。
一方面，本公开提供一种用于稀释重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物的方法，所述方法包括向所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物添加包含10ppm至200ppm非离子型表面活性剂的稀释缓冲液，从而形成稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物。
在以上所提供的方法的一个实施方案中，稀释缓冲液包含10ppm至100ppm非离子型表面活性剂。在以上所提供的方法的另一个实施方案中，稀释缓冲液包含50ppm至100ppm非离子型表面活性剂。在以上所提供的方法的另一个实施方案中，稀释缓冲液包含75ppm非离子型表面活性剂。
在以上所提供的方法的一个实施方案中，稀释缓冲液具有5.5至7.5的pH。在以上所提供的方法的另一个实施方案中，稀释缓冲液具有5.5至6.5的pH。在以上所提供的方法的另一个实施方案中，稀释缓冲液具有6.0±0.2的pH。在以上所提供的方法的另一个实施方案中，稀释缓冲液具有6.0的pH。
在以上所提供的方法的一个实施方案中，稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含至少50%存在于稀释前的重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
在以上所提供的方法的一个实施方案中，稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含至少75%存在于稀释前的重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
一方面，本公开提供一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度稳定化的制剂，所述制剂包含：8,000U/mL至52,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；1mM至300mM药学上可接受的盐；0.1mM至2mM氯化钙；1%至20%糖和/或糖二水合物；50ppm至100ppm表面活性剂；以及1mM至100mM羧酸、浓度足以维持4.0至7.0的pH的缓冲剂、或所述羧酸和所述缓冲剂二者。
在一个实施方案中，以上所提供的制剂包含180mM至200mM盐。
在以上所提供的制剂的一个实施方案中，盐是氯化钠。
在一个实施方案中，以上所提供的制剂包含0.5mM至1.0mM钙。
在一个实施方案中，以上所提供的制剂包含5%至15%糖或糖二水合物。
在以上所提供的制剂的一个实施方案中，糖或糖二水合物选自由蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合组成的组。
在以上所提供的制剂的一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。
在以上所提供的制剂的一个实施方案中，表面活性剂以约65ppm至约85ppm的浓度存在。
在以上所提供的制剂的一个实施方案中，羧酸是乙酸。
在以上所提供的制剂的一个实施方案中，羧酸的浓度是35mM至55mM。
在以上所提供的制剂的一个实施方案中，缓冲剂是HEPES。
在以上所提供的制剂的一个实施方案中，缓冲剂的浓度是约20ppm至约100ppm。
在以上所提供的制剂的一个实施方案中，所述制剂与不含糖或糖二水合物的制剂相比在于37℃下储存之后显示出改进的稳定性。
在以上所提供的制剂的一个实施方案中，通过向包含1%聚山梨酯80、500mM HEPES、400mM乙酸、1mM氯化钙、以及海藻糖二水合物粉末的组合物添加重组成对碱性氨基酸蛋白酶来制备所述制剂，其中所述组合物在添加至所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶之前具有6.0的pH。
一方面，本公开提供一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度稳定化的制剂，所述制剂包含：8,000U/mL至57,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；190mM氯化钠；0.92mM氯化钙；10%w/w海藻糖二水合物；75ppm聚山梨酯80；45mM乙酸；以及46mM HEPES。
一方面，本公开提供一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度稳定化的制剂，所述制剂包含：(a)8,000U/mL至52,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(b)1mM至300mM药学上可接受的盐；(c)0.1mM至2mM氯化钙；(d)1%至20%糖和/或糖二水合物；(e)50ppm至100ppm表面活性剂；以及(f)1mM至100mM羧酸、或浓度足以维持4.0至7.0的pH的缓冲剂、或所述羧酸和所述缓冲剂二者。
附图简述
图1.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的温度研究。将对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在室温、37℃或45℃下孵育至多7天。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的活性相对于孵育天数进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图2.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的温度研究。使用SEC来分析与图1中相同的样品。相对重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于孵育天数进行绘图。相对峰高以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式进行计算。
图3.使用SEC分析在37℃下孵育的对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶。将对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在37℃下孵育7天。图3示出在280nm下六个时间点的SEC吸收特征的叠合图。与图1中相同的研究。
图4.使用蛋白质印迹法分析在室温和37℃下孵育的对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶。与图1中相同的研究。泳道：(1)MWM标记；(2)T=0；(3)在室温下孵育1天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(4)在室温下孵育2天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(5)在室温下孵育3天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(6)在室温下孵育7天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(7)MWM标记；(8)在37℃下孵育1天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(9)在37℃下孵育2天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(10)在37℃下孵育3天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶；以及(11)在37℃下孵育7天的重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
图5.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的冷冻/解冻研究。重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性相对于冷冻/解冻循环次数进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图6.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的冷冻/解冻研究。重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于冷冻/解冻循环次数进行绘图。
图7.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用活性测定分析的搅拌研究。重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性相对于搅拌时间进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图8.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的搅拌研究。重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于搅拌时间进行绘图。
图9.使用蛋白质印迹法比较不同批次的重组成对碱性氨基酸蛋白酶。使用蛋白质印迹法分析不同批次的重组成对碱性氨基酸蛋白酶。产生次序按字母顺序表示。泳道：(1)MWM标记；(2)成对碱性氨基酸蛋白酶参考；(3)03-04-09(批次018342，2mL小瓶)；(4)03-08-09(批次018365，2mL小瓶)；(5)03-15-09(批次018366，2mL小瓶)；(6)03-01-09(批次018315，2mL小瓶)；(7)07-26-10(批次X572，200mL瓶子)；(8)03-06-09(批次018365，200mL瓶子)；(9)08-01-10(批次X576，200mL瓶子)；(10)03-09-09(批次018366，200mL瓶子)；(11)MWM标记；(12)成对碱性氨基酸蛋白酶参考；(13)08-03-10(批次X577，200mL瓶子)；(14)07-24-10(批次X573，200mL瓶子)；(15)07-30-10(批次X575，200mL瓶子)；(16)018346(在-80℃下的QC稳定性)；(17)018346(在-25℃下的QC稳定性)；(18)018315(在-80℃下的QC稳定性)；以及(19)018315(在-25℃下的QC稳定性)。
图10.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的融化方法对重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的影响。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品活性以在4℃(左)抑或室温(RT；右)下解冻的不同批次的重组成对碱性氨基酸蛋白酶的条形图的形式示出。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图11.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的pH5和pH5.5对重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的作用。将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在37℃下在pH5.0、pH5.5抑或pH6.0(对照制剂)下孵育至多7天。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的活性相对于孵育天数进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图12.使用SEC分析的pH5和pH5.5对重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的作用。将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在37℃下在pH5.0、pH5.5抑或pH6.0(对照制剂)下孵育。重组成对碱性氨基酸蛋白酶的相对峰高相对于孵育天数进行绘图。相对峰高以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式进行计算。
图13.使用SEC分析的在37℃下对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。将对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在37℃下孵育四天。280nm吸收特征的叠合图示出三个时间点：T=0、孵育1天以及4天。
图14.使用SEC分析的MES(pH6.0)中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以MES(最终C=100mM，pH6.0)并且在37℃下孵育四天。280nm吸收特征的叠合图示出三个时间点：T=0、孵育1天以及4天。
图15.使用SEC分析的HEPES(pH7.0)中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以HEPES(最终C=100mM，pH7.0)并且在37℃下孵育四天。280nm吸收特征的叠合图示出三个时间点：T=0、孵育1天以及4天。
图16.使用SEC分析的HEPES(pH8.0)中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以HEPES(最终C=100mM，pH8.0)并且在37℃下孵育四天。280nm吸收特征的叠合图示出三个时间点：T=0、孵育1天以及4天。
图17.使用SEC分析的在37℃下蔗糖和聚山梨酯80添加剂对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。将样品在37℃下孵育四天。重组成对碱性氨基酸蛋白酶的相对峰高相对于孵育时间进行绘图。相对峰高以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式进行计算。
图18.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37℃下蔗糖和聚山梨酯80对对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的相对活性相对于孵育天数进行绘图以便比较以下样品：无添加剂的对照制剂、对照制剂加10%蔗糖、以及对照制剂加10%蔗糖加25ppm聚山梨酯80。相对活性值以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式进行计算。误差棒是±1标准偏差=4。
图19.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37℃下蔗糖和聚山梨酯80对MES缓冲液中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的相对活性相对于孵育天数进行绘图以便比较以下样品：无添加剂的对照制剂、掺以MES(最终C=100mM，pH6.0)、掺以MES(最终C=100mM，pH6)加10%蔗糖、以及掺以MES(最终C=100mM，pH6.0)加10%蔗糖加25ppm聚山梨酯80。相对活性值以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式进行计算。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图20.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37℃下对照制剂与MES缓冲液中的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的比较。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的相对活性相对于孵育天数进行绘图以便比较以下样品：无添加剂的对照制剂、对照制剂加10%蔗糖、以及掺以MES(最终C=100mM，pH6.0)加10%蔗糖。相对活性值以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式进行计算。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图21.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37℃下蔗糖与甘露糖醇中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的比较。所有样品均掺以HEPES/乙酸，pH6.0。重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的相对活性相对于孵育天数进行绘图以便比较以下样品：无添加剂、10%蔗糖、10%甘露糖醇、10%蔗糖加25ppm聚山梨酯80、以及10%甘露糖醇加25ppm聚山梨酯80。相对活性值以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的百分比的形式进行计算。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图22.在37℃下的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性：使用SEC分析的蔗糖对甘露糖醇。使用SEC分析与图21中相同的样品。相对重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于孵育时间进行绘图。相对峰高以在时间零点处的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式进行计算。
图23.由成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37℃下孵育5天后海藻糖中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定检验在37℃下不同量的海藻糖和聚山梨酯80对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。首先，将所有样品均掺以HEPES和乙酸(最终浓度：HEPES–50mM，乙酸–50mM，pH6.0)，然后添加10%蔗糖抑或不同量的海藻糖和/或聚山梨酯80。还包括对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品。将数据从在37℃下孵育5天后的最高活性值至最低活性值进行排序(各对中的右侧条)。各对中的左侧条描绘在时间零点处的成对碱性氨基酸蛋白酶活性值。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图24.在37℃下孵育5天后海藻糖中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。在重新计算后展示与图23中相同的样品以便示出在37℃下孵育5天后各样品剩余的初始活性的百分比。还包括对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图25.使用SEC分析的在37℃下孵育5天后海藻糖中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。与图24中相同的样品。图示出在37℃下孵育5天后各样品剩余的初始重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰值的百分比。还包括对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品。
图26.使用蛋白质印迹法分析的在35℃下孵育5天后海藻糖中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。与图24中相同的样品。使样品成对：第一样品-时间零点，第二样品-在37℃下孵育5天。泳道：(1)MWM标记；(2)成对碱性氨基酸蛋白酶参考，(3)对照；(4)对照制剂，T=0；(5)对照制剂，5天；(6)10%蔗糖，T=0；(7)10%蔗糖，5天；(8)2%海藻糖，T=0；(9)2%海藻糖，5天；(10)10%海藻糖，T=0；(11)10%海藻糖，5天；(12)MWM标记；(13)成对碱性氨基酸蛋白酶参考；(14)对照；(15)5%海藻糖，T=0；(16)5%海藻糖，5天；(17)5%海藻糖，+10ppm吐温80，T=0；(18)5%海藻糖，+10ppm吐温80，5天；(19)5%海藻糖，+25ppm吐温80，T=0；(20)5%海藻糖，+25ppm吐温80，5天；(21)5%海藻糖，+100ppm吐温80，T=0；以及(22)5%海藻糖，+100ppm吐温80，5天。
图27.在37℃下孵育5天后测试的海藻糖含量对重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的作用。与图24中相同的实验。首先，将所有样品均掺以HEPES和乙酸(最终浓度：HEPES–50mM，乙酸–50mM，pH6.0)，然后添加不同量的海藻糖。在37℃下孵育5天后的成对碱性氨基酸蛋白酶活性相对于添加至样品中的海藻糖的百分比进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图28.孵育5天后使用SEC分析的在37℃下海藻糖含量对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。与图27中相同的实验。在37℃下孵育5天后的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于添加至样品中的海藻糖的百分比进行绘图。
图29.在37℃下孵育5天后测试的聚山梨酯80含量对重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的作用。与图24中相同的实验。首先，将所有样品均掺以HEPES、乙酸(最终浓度：HEPES–50mM，乙酸–50mM，pH6.0)、以及5%海藻糖，然后添加不同量的聚山梨酯80。在37℃下孵育5天后的成对碱性氨基酸蛋白酶活性相对于添加至样品中的聚山梨酯80的量进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图30.孵育5天后使用SEC分析的在37℃下聚山梨酯80含量对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的作用。与图29中相同的样品。在37℃下孵育5天后的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于添加至样品中的聚山梨酯80的量进行绘图。
图31.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的搅拌研究。高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以不同量的聚山梨酯80。图示出在搅拌三小时之前和之后的成对碱性氨基酸蛋白酶活性值。数据从最高活性至最低活性进行排序。误差棒是±1标准偏差；n=4。各对中的左侧条示出在时间0处的活性，各对中的右侧条示出搅拌后的活性。
图32.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的搅拌研究。与图31中相同的实验。图示出在搅拌三小时之前和之后的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高。数据从最高至最低进行排序。各对中的左侧条示出在时间0处的活性，各对中的右侧条示出搅拌后的活性。
图33.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的搅拌研究中聚山梨酯含量的作用。与图32中相同的样品。搅拌三小时后的成对碱性氨基酸蛋白酶活性相对于聚山梨酯80的含量进行绘图。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图34.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的搅拌研究中聚山梨酯80的作用。与图32中相同的样品。搅拌三小时后的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高相对于聚山梨酯80的含量进行绘图。
图35.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的搅拌研究。色谱图示出在280nm下SEC吸收特征的叠合图，比较在搅拌三小时之前和之后对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品。搅拌的样品的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰值显著小于对照样品。观察到搅拌的样品中高分子质量峰的缺乏(参见用于解释的第3.5.1段)。
图36.对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶的UV光谱(与图35中相同的样品)。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱与搅拌前的样品相比显示倾斜并且极度升高的特征，这指示搅拌的样品中显著水平的聚集体的存在。
图37.无聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱与搅拌前的样品相比显示升高的特征，这指示搅拌的样品中显著水平的聚集体的存在。
图38.无聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的搅拌研究。色谱图示出在280nm下SEC吸收特征的叠合图，比较在搅拌三小时之前和之后无聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品。搅拌的样品的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰值显著小于对照样品。观察到高分子质量峰的缺乏。
图39.含有10ppm聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱与搅拌前的样品相比显示稍微升高的特征，这指示搅拌的样品中聚集体的存在。相对于在无聚山梨酯的样品中见到的光谱(图36和图37)，“搅拌”的光谱与“搅拌前”的光谱接近，这指示聚集水平低于在无聚山梨酯的样品中见到的聚集水平。
图40.含有25ppm聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱与搅拌前的样品相比显示稍微升高的特征，这指示搅拌的样品中少量聚集体的存在。
图41.含有50ppm聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱显示与搅拌前的样品非常类似的特征。光谱既不倾斜也不升高，这指示样品均不含有大量较大聚集体。
图42.含有100ppm聚山梨酯80的高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱。搅拌三小时后重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV光谱显示与搅拌前的样品非常类似的特征。光谱既不倾斜也不升高，这指示样品均不含有大量较大聚集体。
图43.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的冷冻/解冻研究。将高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以不同量的聚山梨酯80。数据显示在5个冷冻/解冻循环之前和之后样品中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。将数据从最高至最低进行排序。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图44.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的冷冻/解冻研究。与图43中相同的样品。数据显示在5个冷冻/解冻循环之前和之后的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高。将数据从最高至最低进行排序。
图45.高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶——使用SEC分析的冷冻/解冻研究。与图44中相同的样品。重组成对碱性氨基酸蛋白酶的相对峰高相对于冷冻/解冻循环次数进行绘图。相对峰高以第一个冷冻/解冻循环前重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高的百分比的形式进行计算。
图46.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37℃下高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。对照制剂抑或高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品在37℃下孵育4天。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图47.使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析的在37℃下高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。重新计算与图46中相同的样品。各样品的相对活性以其初始活性的百分比的形式进行计算。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图48.使用SEC分析的在37℃下高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。与图46中相同的样品。各样品的重组成对碱性氨基酸蛋白酶的相对峰高以其初始峰高的百分比的形式进行计算。误差棒是±1标准偏差；n=4。
图49.温度对高度稳定化的制剂储备缓冲液(500mM HEPES、400mM乙酸、1mM CaCl2，pH6.0)的pH(B)和传导率(A)的作用。
发明详述
I.前言
本公开是部分基于以下发现：成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物可以通过添加糖、糖醇、以及非离子型表面活性剂而针对各种化学和机械应力稳定化。与缺乏糖、糖醇以及非离子型表面活性剂的类似成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，本文所描述的成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物在室温或高于室温下储存时以及在经受机械应力时显著更稳定。本公开还部分基于以下发现；向成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液添加非离子型表面活性剂能够在所述酶稀释至在制造不同重组生物制品(如VWF)过程中所使用的较低浓度时实现成对碱性氨基酸蛋白酶活性的较大恢复。
有利地，本文所描述的研究证明向成对碱性氨基酸蛋白酶组合物添加糖或糖醇使所述组合物在储存一段时间时的稳定性增强。例如，本文显示成对碱性氨基酸蛋白酶水性制剂中包含仅2%糖或糖醇可以使所述组合物的稳定性增加10%以上。进一步显示成对碱性氨基酸蛋白酶水性制剂中包含10%糖或糖醇可以使所述组合物的稳定性增加75%以上。
有利地，本文所描述的研究还证明向成对碱性氨基酸蛋白酶组合物添加非离子型表面活性剂使所述组合物在经受机械应力时的稳定性增强。例如，本文显示成对碱性氨基酸蛋白酶水性制剂中包含仅10ppm非离子型表面活性剂可以使所述组合物的稳定性增加75%以上。
有利地，本文描述的研究还证明向成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液包含非离子型表面活性剂使成对碱性氨基酸蛋白酶稀释后的活性恢复增加。例如，本文显示成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液中包含75ppm非离子型表面活性剂使成对碱性氨基酸蛋白酶稀释后的活性恢复增加3至4倍。
因此，本公开提供高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的组合物。虽然本文的大部分讨论是依据重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的高度稳定化的制剂，但应理解任何成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质(包括从受试者分离的成对碱性氨基酸蛋白酶或成对碱性氨基酸蛋白酶的任何衍生物或突变体)可以包含于本发明的制剂中。
一方面，本公开提供高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂，其在使制剂经受一种或多种应激物后测定时显示出优于对照制剂的改进的稳定性，这一种或多种应激物包括但不限于使制剂暴露于一系列温度、几个冷冻/解冻循环、和/或搅拌。通常通过成对碱性氨基酸蛋白酶活性的水平来评定改进的稳定性——例如，在高于环境室温下储存之后，与各自在储存前(即，在时间=0时)的活性相比，高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂将显示出比在相同条件下储存的对照制剂更高的活性水平。本文描述用于评定成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的稳定性的方法。
在其它方面，本公开提供用于形成本发明的高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的方法。所述方法包括用于针对储存(包括冷冻储存、在环境室温或高于环境室温下储存、或冻干)使成对碱性氨基酸蛋白酶的制剂稳定化的方法。
在又其它方面，本公开提供用于稀释浓成对碱性氨基酸蛋白酶溶液的方法，所述方法在稀释之后引起成对碱性氨基酸蛋白酶活性的增加的保留。与用缺乏非离子型表面活性剂的溶液稀释的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，根据本文所提供的方法稀释的成对碱性氨基酸蛋白酶的水性组合物保留多3至4倍的酶活性。
II.定义
如本文所用，术语“成对碱性氨基酸蛋白酶”是指具有成对碱性氨基酸蛋白酶活性(特别是裂解前冯·维勒布兰德因子(前VWF)多肽的残基Arg-763与Ser-764之间的肽键的能力)的任何蛋白质或多肽。在示例性实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶是指包含与NP_002560.1(人成对碱性氨基酸蛋白酶前蛋白原)的氨基酸序列相同或高度相同的氨基酸序列的多肽。在示例性实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶是指包含与NP_002560.1的氨基酸25-794(人成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白原)相同或高度相同的氨基酸序列的多肽。在示例性实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶是指包含与NP_002560.1的氨基酸108-794(人成熟成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质)相同或高度相同的氨基酸序列的多肽。如本文所用，成对碱性氨基酸蛋白酶多肽还包括具有VWF裂解活性的成对碱性氨基酸蛋白酶的天然变体以及具有VWF裂解活性的修饰的成对碱性氨基酸蛋白酶构建体。如本文所用，成对碱性氨基酸蛋白酶包涵保留一些基本活性(例如，与野生型成对碱性氨基酸蛋白酶的活性相比至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高活性)的任何天然变体、替代序列、亚型或突变体蛋白。人群体中发现的成对碱性氨基酸蛋白酶突变的实例包括但不限于A43E、A43G、A43V、R50W、Y64C、L77P、R81C、E97A、E97V、V109M、V109L、R130W、A139V、P169T、N245S、E271K、Q339R、N407S、E457Q、R464W、K469R、S524Y、T536S、L570F、D624N、A642T、S685P、V728I、V735I、R745Q、P772L、以及A793T。成对碱性氨基酸蛋白酶多肽还包括含有翻译后修饰的多肽。例如，已经显示成对碱性氨基酸蛋白酶在残基S773和S775处磷酸化并且预测成对碱性氨基酸蛋白酶在残基N387、N440、以及N553处糖基化。
在本公开的背景下，成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质包括重组成对碱性氨基酸蛋白酶多肽以及从源材料(例如，组织或血液)分离的天然成对碱性氨基酸蛋白酶多肽。成对碱性氨基酸蛋白酶多肽(重组和来源纯化的)及其生物活性衍生物可以源自任何适合的生物体，例如哺乳动物，如灵长类动物、人类、猴子、兔、猪、啮齿动物、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、犬、猫。还包涵具有VWF裂解活性的突变体和变体成对碱性氨基酸蛋白酶多肽以及功能片段以及包含成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的融合蛋白。此外，本文所描述的成对碱性氨基酸蛋白酶多肽可以进一步包含有助于纯化、检测或二者的标签。本文所描述的成对碱性氨基酸蛋白酶多肽可以进一步用治疗性部分或适合用于体外或体内成像的部分进行修饰。
可以通过在细胞培养物(例如，哺乳动物细胞培养物)中表达来制备蛋白水解活性重组成对碱性氨基酸蛋白酶。用于制备重组成对碱性氨基酸蛋白酶的表达和纯化方法的非限制性实例描述于WO1991/06314、WO1992/09698、美国专利号6,210,929和6,596,526以及美国专利申请公布号2009/0181423和2009/0304669中，出于所有目的，所述文献的内容特此以引用的方式整体并入。
如本文所用，“活性”是指成对碱性氨基酸蛋白酶或其部分的与全长(完全)蛋白质相关的一种或多种功能活性。功能活性包括但不限于生物活性，包括参与蛋白原底物的蛋白水解成熟过程和测试底物(如Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO:1；AMC=7-氨基-4-甲氧基香豆素))的裂解。成对碱性氨基酸蛋白酶的底物包括冯?维勒布兰德因子、甲状旁腺激素原(proparathyroid hormone)、转化生长因子β1前体、原白蛋白(proalbumin)、原β-分泌酶、膜1型基质金属蛋白酶、以及原神经生长因子的β亚单位。在一个实施方案中，一个单位(U)的成对碱性氨基酸蛋白酶活性被定义为每分钟使1pmol AMC从Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO:1)释放的成对碱性氨基酸蛋白酶的量。
如本文所用，术语“稳定性”(如成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性或成对碱性氨基酸蛋白酶制剂稳定性)用于结构背景(例如，与蛋白质的结构完整性有关)或功能背景(例如，与蛋白质随时间推移保留其功能和/或活性的能力有关)中。应理解，所讨论的蛋白质可以包含于根据本文所描述的方法和组合物的制剂内，并且所述蛋白质的稳定性是指其在所述制剂中的稳定性。在一个实施方案中，通过测量成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的成对碱性氨基酸蛋白酶活性来测定所述组合物的稳定性。例如，通过使用可检测的成对碱性氨基酸蛋白酶底物，如Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO:1；例如，由Enzo LifeSciences出售的ALX-260-040-M001)，例如在如Malloy SS等,J BiolChem.1992年8月15日;267(23):16396-402中所描述的测定中，出于所有的目的，所述文献的内容特此以引用的方式整体并入本文。在一个实施方案中，将如本文所描述的用糖、糖醇、和/或非离子型表面活性剂配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的稳定性与未用糖、糖醇、和/或非离子型表面活性剂配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进行比较。
如本文所用，“储存稳定”的成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物是指已经被配制以便使蛋白质在给定储存时间内在溶液中的稳定性增加(例如至少10%)的成对碱性氨基酸蛋白酶多肽溶液(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶多肽溶液)。在本公开的背景下，可以通过添加糖、糖醇或非离子型表面活性剂作为稳定剂来使成对碱性氨基酸蛋白酶多肽溶液(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶多肽溶液)“储存稳定”。在一些实施方案中，可以(例如)通过监测一段时期内聚集体的形成、整体酶活性的损失或降解产物的形成来测量成对碱性氨基酸蛋白酶多肽在任何给定制剂中的稳定性。制剂的绝对稳定性和糖、糖醇或非离子型表面活性剂的稳定作用将取决于正稳定化的具体组合物而变化。在一个实施方案中，通过测量成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的成对碱性氨基酸蛋白酶活性来测定所述组合物的稳定性。例如，通过使用可检测的成对碱性氨基酸蛋白酶底物，如Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO:1；例如，由Enzo LifeSciences出售的ALX-260-040-M001)，在(例如)如Malloy SS等,J BiolChem.1992年8月15日;267(23):16396-402中所描述的测定中，出于所有的目的，所述文献的内容特此以引用的方式整体并入。在一个实施方案中，将如本文所描述的用糖、糖醇、和/或非离子型表面活性剂配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的稳定性与未用糖、糖醇、和/或非离子型表面活性剂配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进行比较。
如本文中所用，“保质期”是指制剂在预定温度下维持预定的稳定性水平的一段时间。在具体实施方案中，预定温度是指冷冻(例如，-80℃、-25℃、0℃)、冷藏(例如，0℃至10℃)、或室温(例如，18℃至32℃)储存。
如本文所用，术语“稳定性时间”是指制剂被认为是稳定的持续时间。例如，制剂的稳定性时间可以指制剂中的蛋白质聚集和/或降解的水平保持在某一阈值(例如，1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%，等等)以下的持续时间，和/或制剂维持生物活性在某一阈值(例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%，等等)以上的持续时间，该阈值为在储存期开始时制剂中所存在的活性的量的阈值。
在本公开的背景下，与未用糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂配制的相同成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的组合物相比，用糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂配制的储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶多肽(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶多肽)的水性组合物将具有较长的稳定性时间。在一些实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的水性组合物将具有比在缺乏糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂的情况下配制的相同组合物的稳定性时间高例如至少10%的稳定性时间，或具有比在缺乏糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂的情况下配制的相同组合物的稳定性时间高至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、或至少2倍、或至少2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10倍或更多倍的稳定性时间。
如本文所用，“储存”意指制剂在制备后不立即施用至受试者或用于产生过程中，而在使用前在特定条件(例如，特定温度)下保持一段时间。例如，成对碱性氨基酸蛋白酶制剂可以在施用至受试者之前在不同温度(如冷冻(例如，-80℃、-25℃、0℃)、冷藏(例如，0℃至10℃)、或室温(例如，18℃至32℃))下保持数天、数周、数月或数年。应理解，所述制剂可以是液体或冻干制剂。
如本文所用，术语“约”表示指定值加10%或减10%的近似范围。例如，措辞“约20%”包涵18%至22%的范围。
如本文所用，在提及组合物的单个组分的浓度时，短语“不大于X”和“0至X”是等效的并且是指0与X之间并且包括0和X的任何浓度。例如，短语“不大于2%的浓度”和“0%至2%的浓度”是等效的并且包括0%、1%以及2%。
如本文所用，在提及组合物的单个组分的浓度时，短语“不小于X”是指X或X以上的任何浓度。例如，短语“不小于98%的浓度”包括98%、99%以及100%。
如本文所用，在提及组合物的单个组分的浓度时，短语“X与Y之间”和“X至X”是等效的并且是指X与Y之间并且包括X和Y的任何浓度。例如，短语“49%与51%之间的浓度”和“49%至51%的浓度”是等效的并且包括49%、50%以及51%。
如本文所用，“糖”是指具有通式CxH2yOy(直链)或CxH(2y-1)Oy(环状)的单糖和通过脱水反应形成的由两个单糖单位组成的二糖。单糖可以根据它们所包含的碳原子数目分类为：乙糖(2)、丙糖(3)、丁糖(4)、戊糖(5)、己糖(6)、庚糖(7)，等等。因此，如本文所用，C(X)糖是指含有X数目的碳分子的糖。例如，C(5)糖是指戊糖，而C(6)糖是指己糖。可以用于本文所提供的制剂中的糖的非限制性实例包括：乙糖乙醇醛、丙糖甘油醛以及二羟基丙酮；丁糖，赤藓糖(erythrose)、苏糖(threose)、以及赤藓酮糖(erythrulose)；戊糖，阿拉伯糖(arabinose)、来苏糖(lyxose)、核糖、木糖(xylose)、核酮糖、以及木酮糖(xylulose)；己糖，阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、葡萄糖、甘露糖(mannose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、半乳糖、塔罗糖(talose)、阿洛酮糖(psicose)、果糖、山梨糖(sorbose)、以及塔格糖(tagatose)；庚糖，景天庚酮糖(sedoheptulose)、甘露庚酮糖(mannoheptulose)、以及L-甘油-D-甘露-庚糖；以及由其形成的二糖的所有可能的组合，包括但不限于蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、曲二糖(kojibiose)、黑曲霉糖(nigerose)、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐糖(sophorose)、昆布二糖(laminaribiose)、龙胆二糖(gentiobiose)、松二糖(turanose)、麦芽酮糖(maltulose)、帕拉金糖(palatinose)、gentiobiulose、甘露二糖(mannobiose)、蜜二糖(melibiose)、车前二糖(melibiulose)、芸香糖(rutinose)、rutinulose、以及木二糖(xylobiose)。
如本文所用，“糖醇”是指单糖或二糖的氢化形式，所述单糖或二糖的羰基已经被还原以便形成伯羟基或仲羟基。在一个实施方案中，糖醇具有约4至约8个碳原子。可以用于本文所提供的制剂中的糖醇的非限制性实例包括乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、核糖醇、岩藻糖醇(fucitol)、艾杜糖醇、倭勒米糖醇(volmitol)、异麦芽糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇(galactitol)、甜醇(dulcitol)、木糖醇、以及阿拉伯糖醇。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指药物制剂中安全施用至受试者(例如，人)的盐。药学上可接受的盐的选择和使用是本领域中熟知的，例如，参见Stahl和Wermuth,Pharmaceutical Salts:Properties, Selection,and Use,第二修订版,Wiley,Hoboken,New Jersey。在某些实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠、氯化钾、或其组合。
如本文所用，术语“非离子型表面活性剂”是指在生理相关条件下非离子化的表面活性剂。适用于本文所提供的稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物的非离子型表面活性剂的非限制性实例包括：非离子型水溶性甘油单酯、甘油二酯及甘油三酯(例如，丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯(例如
Figure BDA0000463803880000271
840)、中链甘油单酯和甘油二酯(例如
Figure BDA0000463803880000272
和
Figure BDA0000463803880000273
72)、中链甘油三酯(例如辛酸甘油三酯和癸酸甘油三酯，如LAVRAFAC、
Figure BDA0000463803880000274
810或812、GTCC-PN、以及SOFTISON378)、长链甘油单酯(例如甘油单油酸酯，如
Figure BDA0000463803880000276
和甘油单亚油酸酯，如
Figure BDA0000463803880000277
)、聚氧乙烯蓖麻油(例如聚乙二醇蓖麻油酸酯、聚乙二醇羟基硬脂酸酯、聚乙二醇十六基十八基醚))；聚乙二醇的非离子型水溶性单脂肪酸酯和二脂肪酸酯；非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，脱水山梨糖醇单月桂酸酯，如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(TWEEN20)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯(SPAN20)；脱水山梨糖醇单棕榈酸酯，如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(TWEEN40)和脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(SPAN40)；脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(TWEEN60)和脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(SPAN60)；脱水山梨糖醇单油酸酯，如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(TWEEN80)和脱水山梨糖醇单油酸酯(SPAN80)；脱水山梨糖醇三油酸酯，如脱水山梨糖醇三油酸酯(SPAN85)；以及脱水山梨糖醇三硬脂酸酯，如脱水山梨糖醇三硬脂酸酯(SPAN65))；聚乙二醇化甘油酯(例如，聚乙二醇-6甘油月桂酰酯(M2130CS)；聚乙二醇1000丁二酸d-α-生育酚酯(TPGS)、聚乙二醇66012-羟基硬脂酸酯(
Figure BDA0000463803880000279
HS15)、聚氧乙烯油酸酯和硬脂酸酯(例如PEG400单硬脂酸酯和PEG1750单硬脂酸酯))；非离子型水溶性三嵌段共聚物(例如聚(氧化乙烯)/聚(氧化丙烯)/聚(氧化乙烯)三嵌段共聚物，如甲基环氧乙烷与环氧乙烷的聚合物BHT(
Figure BDA00004638038800002710
F-127))。
在一个实施方案中，提供储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的组合物，所述组合物包含选自以下的非离子型表面活性剂：非离子型水溶性甘油单酯、非离子型水溶性甘油二酯、非离子型水溶性甘油三酯、聚乙二醇的非离子型水溶性单脂肪酸酯、聚乙二醇的非离子型水溶性二脂肪酸酯、非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯、非离子型聚乙二醇化甘油酯、非离子型水溶性三嵌段共聚物、以及其组合。
如本文所用，术语“生物活性衍生物”在成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的背景下使用时还包涵经由重组DNA技术获得的多肽。这种技术可以包括用于以下的本领域中已知的任何方法：(i)通过遗传工程产生重组DNA，例如，经由反转录RNA和/或扩增DNA产生；(ii)通过转染将重组DNA引入原核细胞或真核细胞中，例如，经由电穿孔或显微注射引入；(iii)培养所述转化细胞，例如，以连续或分批方式培养；(iv)表达成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质，例如，组成性表达或在诱导后表达；以及(v)分离所述成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质，例如，从培养基或通过收获转化细胞分离；以便(vi)获得大致上纯化的重组成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质，例如，经由离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法等获得。术语“生物活性衍生物”还包括嵌合分子，例如像成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质或其功能片段与第二多肽(例如，免疫球蛋白Fc结构域或白蛋白结构域)的组合，以便改进生物学/药理学特性，例如像成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质在哺乳动物(特别是人)的循环系统中的半衰期。
除非上下文另外清楚地规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“缓冲剂”是指一种试剂或所述试剂的混合物，并且提及“方法”包括提及本领域技术人员已知的等效步骤和方法，诸如此类。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。出于描述和公开描述于公布中并且可能与目前所描述的发明结合使用的装置、组合物、制剂以及方法学的目的，本文所提及的所有公布均以引用的方式并入本文。
如果提供一定范围的值，那么应理解除非上下文另外清楚地规定，否则本发明内包涵所述范围的上限与下限之间的各插入值(至下限单位的十分之一)和在所陈述的范围中的任何其它陈述值或插入值。本发明内还包涵可以独立地包括于这些较小范围中的所述较小范围的上限和下限，从属于所陈述的范围中的任何具体排除的限值。如果所陈述的范围包括一或两个限值，那么排除任一个或两个所包括的限制的范围也包括于本发明中。
如本文所用，“BDS”是指“散装原料药”。
III.重组成对碱性氨基酸蛋白酶的稳定化水性组合物
一方面，本公开提供成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的稳定化水性制剂。以下实施方案是部分基于以下发现：与缺乏糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂的组合物相比，糖、糖醇和/或非离子型表面活性剂的包含使成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物稳定化。
如本领域技术人员将认识到，除明确公开的组分之外，根据本文所提供的实施方案配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)还可以包含通过包含溶液组分或pH调节剂贡献的平衡离子，例如，从乙酸盐、氢氧化钠或氢氧化钾贡献的钠或钾，或由氯化钙或盐酸贡献的氯。在本公开的背景下，如在特定pH下的配制过程所需要，由给定制剂组成或主要上由给定制剂组成的储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)可以进一步包含一种或多种平衡离子。
在一个实施方案中，本文所提供的储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)将在室温(即，18℃与32℃之间)下稳定一段时间。例如，在一个实施方案中，储存稳定的免疫球蛋白水性组合物在于室温下储存时将稳定至少4天。在其它实施方案中，组合物将在室温下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28天或更多天。在其它实施方案中，组合物将稳定至少1个月。在又其它实施方案中，组合物将稳定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48个月或更多个月。在某些实施方案中，室温是指在20℃与30℃之间、在21℃与29℃之间、在22℃与28℃之间、在23℃与27℃之间、在24℃与26℃之间、或约25℃。在具体实施方案中，组合物在于20℃与25℃之间的温度下储存时将稳定延长的一段时间。
在一个实施方案中，本文所提供的储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)将在冷藏温度(即，2℃与10℃之间)下稳定一段时间。例如，在一个实施方案中，储存稳定的水性免疫球蛋白组合物在于冷藏温度下储存时将稳定至少4天。在其它实施方案中，组合物将在冷藏温度下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28天或更多天。在其它实施方案中，组合物将稳定至少1个月。在又其它实施方案中，组合物将稳定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48个月或更多个月。在具体实施方案中，组合物在于2℃与8℃之间的温度下储存时将稳定延长的一段时间。
在一个实施方案中，本文所提供的储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)将在高温(即，32℃与42℃之间)下稳定一段时间。例如，在一个实施方案中，储存稳定的水性免疫球蛋白组合物在于高温下储存时将稳定至少4天。在其它实施方案中，组合物将在高温下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28天或更多天。在其它实施方案中，组合物将稳定至少1个月。在又其它实施方案中，组合物将稳定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48个月或更多个月。在具体实施方案中，组合物在于35℃与40℃之间的温度下储存时将稳定延长的一段时间。
在一个实施方案中，只要储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物维持至少40%的在储存期开始时(例如，在时间=0时)所存在的成对碱性氨基酸蛋白酶活性，所述组合物就被认为是储存稳定的。在另一个实施方案中，只要储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物维持至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的在储存期开始时(例如，在时间=0时)所存在的成对碱性氨基酸蛋白酶活性，所述组合物就被认为是储存稳定的。在一个实施方案中，在如Malloy SS等,J Biol Chem.1992年8月15日;267(23):16396-402中所描述的测定中测量成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
在一个实施方案中，当在储存一段时间后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含多至少10%的成对碱性氨基酸蛋白酶活性时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在其它实施方案中，当在储存一段时间后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含多至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的成对碱性氨基酸蛋白酶活性时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。
在一个实施方案中，只要以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于50%，储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物就被认为是稳定的。在其它实施方案中，只要以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于45%、40%、35%、30%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少，储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物就被认为是稳定的。
在一个实施方案中，当在储存一段时间后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含少至少10%的以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在其它实施方案中，当在储存一段时间后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含少至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。
在一个实施方案中，只要储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物在经受机械应力之后维持至少40%的起始成对碱性氨基酸蛋白酶活性(例如，在时间=0时)，所述组合物就被认为是稳定的。在另一个实施方案中，只要储存的组合物在经受机械应力之后维持45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的起始成对碱性氨基酸蛋白酶活性(例如，在时间=0时)，所述组合物就被认为是稳定的。在具体实施方案中，机械应力是搅拌(例如，振荡)。
在一个实施方案中，当在经受机械应力之后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含多至少10%的成对碱性氨基酸蛋白酶活性时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在其它实施方案中，当在经受机械应力之后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含多至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的成对碱性氨基酸蛋白酶活性时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在具体实施方案中，机械应力是搅拌(例如，振荡)。
在一个实施方案中，在经受机械应力之后，只要以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于50%，储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物就被认为是稳定的。在其它实施方案中，在经受机械应力之后，只要以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶的百分比保持不大于45%、40%、35%、30%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少，储存的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物就被认为是稳定的。在具体实施方案中，机械应力是搅拌(例如，振荡)。
在一个实施方案中，当在经受机械应力之后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含少至少10%的以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在其它实施方案中，当在经受机械应力之后，与不含稳定剂或含有较低量的稳定剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比，成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含少至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更大百分比的以聚集态存在的成对碱性氨基酸蛋白酶时，所述组合物被认为已经通过添加稳定剂(例如，糖、糖醇或非离子型表面活性剂)而稳定化。在具体实施方案中，机械应力是搅拌(例如，振荡)。
虽然本申请中所描述的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂可以以指示的浓度冻干和复原，但应理解这些制剂还可以以更稀释的形式复原。例如，为冻干的和/或通常以2mL溶液复原的根据本公开的制剂还可以以较大体积的稀释剂(如5mL)复原。同样地，冻干的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂还可以以更浓的形式复原。例如，为冻干的和/或通常以2ml溶液复原的根据本公开的制剂还可以以较小体积(如1mL)复原。
有利地，一方面，将本发明的高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂与稀释剂组合，所述稀释剂在所得到的组合物用于产生方法，例如用于rVWF的成熟过程(本文还称为“rVWF成熟方法”)中时赋予增加的成对碱性氨基酸蛋白酶恢复。前冯·维勒布兰德因子(vWF)成熟至其活性形式需要在残基763处的氨基二羧酸对(-Lys-Arg-)之后进行蛋白水解加工。已经显示vWF优选地通过成对氨基二羧酸裂解酶成对碱性氨基酸蛋白酶进行加工。因此，vWF的产生过程包括使用成对碱性氨基酸蛋白酶，优选在高度稳定化的制剂中。另一方面，与放置于对照稀释剂中的对照制剂相比，在这种稀释剂中的高度稳定化的制剂使成对碱性氨基酸蛋白酶在rVWF成熟步骤中的活性恢复增加3至4倍。
在某些方面，本发明的高度稳定化的制剂具有至少6个月的保质期。应理解，这种保质期可以是在冷冻温度(即，-80℃、-25℃、0℃)、冷藏(0℃至10℃)、或室温(20℃至32℃)下呈液体或冻干形式。在其它方面，本发明的高度稳定化的制剂具有至少12、18、24、30、36、42、48、54或60个月的保质期。
在其它方面并且根据上述方面，通过在于任何上述温度下储存任何上述时间段之后剩余的百分比活性来测定保质期。在某些实施方案中，保质期意指与在于任何上述温度下储存任何上述时间量之前的活性相比，如通过本文所描述或本领域中已知的任何测定所测量，制剂保留至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
一方面，根据本公开的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的高度稳定化的制剂包含：(a)8,000U/mL至57,000U/mL成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)；(b)190mM氯化钠；(c)0.92mM氯化钙；(d)10%w/w海藻糖二水合物；(e)75ppm聚山梨酯80；(f)45mM乙酸；以及(g)46mMHEPES。
在某些方面，本公开的高度稳定化的制剂包含以下组分：47mMHEPES、46mM乙酸、195mM氯化钠、0.094mM氯化钙、0.0075%聚山梨酯80、10%w/w海藻糖二水合物，pH6.0。
在其它方面，根据本公开的成对碱性氨基酸蛋白酶(包括重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的高度稳定化的制剂包含：(a)约5,500U/mL至55,000U/mL、6,000U/mL至50,000U/mL、6,500U/mL至45,000U/mL、7,000U/mL至40,000U/mL、7,500U/mL至35,000U/mL、8,000U/mL至30,000U/mL、8,500U/mL至25,000U/mL、9,000U/mL至20,000U/mL、9,500U/mL至15,000U/mL、或10,000U/mL成对碱性氨基酸蛋白酶；(b)约100mM至300mM、110mM至280mM、120mM至260mM、130mM至240mM、140mM至220mM、150mM至200mM、或160mM至180mM氯化钠；(c)约0.5mM至9mM、1mM至8mM、1.5mM至7mM、2mM至6mM、2.5mM至5mM、或3mM至4.5mM氯化钙；(d)约0.5%至19%、1%至18%、1.5%至17%、2.0%至16%、2.5%至15%、3.0%至14%、3.5%至13%、4.0%至12%、4.5%至11%、5.0%至10%、5.5%至9%、或6.0%至8%海藻糖二水合物；(e)约0.5ppm至140ppm、1.0ppm至130ppm、10ppm至120ppm、20ppm至110ppm、30ppm至100ppm、40ppm至95ppm、50ppm至90ppm、55ppm至85ppm、60ppm至80ppm、或70ppm至75ppm聚山梨酯80；(f)约25mM至90mM、30mM至80mM、35mM至70mM、40mM至60mM、或45mM至50mM乙酸；以及(g)15mM至95mM、20mM至90mM、25mM至85mM、30mM至80mM、35mM至75mM、40mM至70mM、45mM至65mM、或50mM至60mM HEPES。
一方面，本公开提供一种稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)，所述组合物包含：成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)、2%至20%糖或糖醇、10ppm至200ppm非离子型表面活性剂、50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至10mM钙、缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，糖是戊糖或己糖。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)包含：成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)、100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、2%至20%糖或糖醇、100ppm至200ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，糖是戊糖或己糖。
在具体实施方案中，本发明的高度稳定化的制剂包含以下组分：47mM HEPES、46mM乙酸、195mM氯化钠、0.094mM氯化钙、0.0075%聚山梨酯80、10%w/w海藻糖二水合物，pH6.0。
在另一个具体实施方案中，根据本发明的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的高度稳定化的制剂包含：(a)8,000U/mL至57,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；(b)190mM氯化钠；(c)0.92mM氯化钙；(d)10%w/w海藻糖二水合物；(e)75ppm聚山梨酯80；(f)45mM乙酸；以及(g)46mM HEPES。
A.稳定剂
有利地，据发现包含糖、糖醇以及非离子型表面活性剂使水性成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物稳定化。这些作用在本文所提供的实施例中证明。例如，添加这些试剂使液体储存后成对碱性氨基酸蛋白酶活性保留率增加、液体储存后成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的聚集减少、液体储存后成对碱性氨基酸蛋白酶多肽的降解减少、成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物搅拌后成对碱性氨基酸蛋白酶活性的损失减少、并且使由搅拌成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物引起的聚集减少。
因此，在一个实施方案中，本公开提供一种成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)，所述组合物包含2%至20%糖或糖醇和10ppm至200ppm非离子型表面活性剂。在另一个实施方案中，组合物包含2%至10%糖或糖醇和10ppm至100ppm非离子型表面活性剂。在另一个实施方案中，组合物包含10±2%糖或糖醇和75±25ppm非离子型表面活性剂。在具体实施方案中，组合物包含10%糖或糖醇和75ppm非离子型表面活性剂。在又其它实施方案中，组合物包含糖或糖醇与非离子型表面活性剂的组合，所述组合选自表1至表9中发现的变化形式1至变化形式6035。
表1.适用于成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的糖或糖醇与非离子型表面活性剂浓度的组合的示例性实施方案。
Figure BDA0000463803880000371
Figure BDA0000463803880000381
Figure BDA0000463803880000391
Figure BDA0000463803880000401
Figure BDA0000463803880000411
Var.=变化形式
表2.适用于成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的糖或糖醇与非离子型表面活性剂浓度的组合的示例性实施方案。
Figure BDA0000463803880000421
Figure BDA0000463803880000431
Figure BDA0000463803880000441
Figure BDA0000463803880000451
Var.=变化形式
表3.适用于成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的糖或糖醇与非离子型表面活性剂浓度的组合的示例性实施方案。
Figure BDA0000463803880000452
Figure BDA0000463803880000461
Figure BDA0000463803880000471
Figure BDA0000463803880000481
Figure BDA0000463803880000491
Figure BDA0000463803880000501
Var.=变化形式
表4.适用于成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的糖或糖醇与非离子型表面活性剂浓度的组合的示例性实施方案。
Figure BDA0000463803880000502
Figure BDA0000463803880000521
Figure BDA0000463803880000531
Figure BDA0000463803880000541
Var.=变化形式
表5.适用于成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的糖或糖醇与非离子型表面活性剂浓度的组合的示例性实施方案。
Figure BDA0000463803880000542
Figure BDA0000463803880000551
Figure BDA0000463803880000561
Figure BDA0000463803880000571
Figure BDA0000463803880000581
Var.=变化形式
表6.适用于成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的糖或糖醇与非离子型表面活性剂浓度的组合的示例性实施方案。
Figure BDA0000463803880000582
Figure BDA0000463803880000601
Figure BDA0000463803880000611
Figure BDA0000463803880000621
Var.=变化形式
表7.适用于成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的糖或糖醇与非离子型表面活性剂浓度的组合的示例性实施方案。
Figure BDA0000463803880000622
Figure BDA0000463803880000631
Figure BDA0000463803880000641
Figure BDA0000463803880000651
Var.=变化形式
表8.适用于成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的糖或糖醇与非离子型表面活性剂浓度的组合的示例性实施方案。
Figure BDA0000463803880000652
Figure BDA0000463803880000661
Figure BDA0000463803880000671
Figure BDA0000463803880000681
Figure BDA0000463803880000691
Var.=变化形式
表9.适用于成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的糖或糖醇与非离子型表面活性剂浓度的组合的示例性实施方案。
Figure BDA0000463803880000692
Figure BDA0000463803880000701
Figure BDA0000463803880000711
Figure BDA0000463803880000721
Figure BDA0000463803880000731
Var.=变化形式
1.糖和糖醇
有利地，已发现向成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)添加糖和/或糖醇使所述组合物的储存稳定性增加。例如，如图17至图20和图22至图25中所示，包含仅2%糖和/或糖醇可以使成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的储存稳定性增加至少20%。并且包含10%糖和/或糖醇可以使成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的储存稳定性增加至少75%。因此，在本公开的一个方面，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的组合物包含稳定化量的糖和/或糖醇。
在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的组合物包含单糖。在具体实施方案中，单糖选自由以下各项组成的组：乙糖、丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖、以及辛糖。在具体实施方案中，糖是戊糖、己糖、或其组合。在具体实施方案中，糖是己糖。
在另一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的组合物包含二糖。在具体实施方案中，二糖选自由戊糖和/或己糖单糖形成的二糖。在另一个具体实施方案中，糖选自由己糖单糖形成的二糖。在一个实施方案中，糖是蔗糖、海藻糖、或其组合。在一个具体实施方案中，糖是蔗糖。在另一个具体实施方案中，糖是海藻糖。在一个实施方案中，糖以海藻糖二水合物的形式进行配制。
在另一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的组合物包含糖醇。在具体实施方案中，糖醇选自乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、核糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇、倭勒米糖醇、异麦芽糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇(galactitol)、甜醇、木糖醇、以及阿拉伯糖醇。在另一个具体实施方案中，糖醇是甘露糖醇。
在又另一个实施方案中，稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的组合物包含糖与糖醇的混合物。在一个实施方案中，混合物包含单糖、二糖、以及糖醇中的至少两者。在另一个实施方案中，混合物包含戊糖、己糖、由戊糖和/或己糖单糖形成的二糖、以及糖醇中的至少两者。在另一个实施方案中，混合物包含蔗糖、海藻糖、以及甘露糖醇中的至少两者。
在一个实施方案中，糖或糖醇以下列浓度存在：2%至20%、2%至17.5%、2%至15%、2%至12.5%、2%至10%、2%至9%、2%至8%、2%至7%、5%至20%、5%至17.5%、5%至15%、5%至12.5%、5%至10%、7.5%至20%、7.5%至17.5%、7.5%至15%、7.5%至12.5%、10%至20%、10%至17.5%、10%至15%、4±2%、5±2%、6±2%、7±2%、8±2%、9±2%、10±2%、11±2%、12±2%、13±2%、14±2%、15±2%、16±2%、17±2%、18±2%、3±1%、4±1%、5±1%、6±1%、7±1%、8±1%、9±1%、10±1%、11±1%、12±1%、13±1%、14±1%、15±1%、16±1%、17±1%、18±1%、19±1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、或20%。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至20%糖或糖醇、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含10ppm至200ppm非离子型表面活性剂。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至20%糖或糖醇、10ppm至100ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至20%海藻糖、10ppm至100ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型表面活性剂的组合、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的海藻糖与非离子型表面活性剂的组合、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、2%至20%糖或糖醇、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含10ppm至200ppm非离子型表面活性剂。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、2%至20%糖或糖醇、10ppm至100ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、2%至20%海藻糖、10ppm至100ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型表面活性剂的组合、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的海藻糖与非离子型表面活性剂的组合、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、10±5%糖或糖醇、90±25mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含10ppm至200ppm非离子型表面活性剂。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±2%糖或糖醇。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±1%糖或糖醇。在另一个具体实施方案中，组合物包含10%糖或糖醇。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、10±5%糖或糖醇、10ppm至100ppm非离子型表面活性剂、90±25mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±2%糖或糖醇。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±1%糖或糖醇。在另一个具体实施方案中，组合物包含10%糖或糖醇。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、10±5%海藻糖、10ppm至100ppm非离子型表面活性剂、90±25mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±2%海藻糖。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±1%海藻糖。在另一个具体实施方案中，组合物包含10%海藻糖。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型表面活性剂的组合、90±25mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的海藻糖与非离子型表面活性剂的组合、90±25mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、10±5%糖或糖醇、91mM缓冲剂，以及6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含10ppm至200ppm非离子型表面活性剂。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±2%糖或糖醇。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±1%糖或糖醇。在另一个具体实施方案中，组合物包含10%糖或糖醇。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、10±5%糖或糖醇、75ppm非离子型表面活性剂、91mM缓冲剂，以及6.0±0.2的pH。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±2%糖或糖醇。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±1%糖或糖醇。在另一个具体实施方案中，组合物包含10%糖或糖醇。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、10±5%海藻糖、75ppm非离子型表面活性剂、91mM缓冲剂，以及6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±2%海藻糖。在另一个具体实施方案中，组合物包含10±1%海藻糖。在另一个具体实施方案中，组合物包含10%海藻糖。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型表面活性剂的组合、91mM缓冲剂，以及6.0±0.2的pH。在具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的海藻糖与非离子型表面活性剂的组合、91mM缓冲剂，以及6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一些实施方案中，用于本公开的制剂中的稳定剂选自包括但不限于以下各项的组：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、棉子糖(raffinose)、以及精氨酸。这些试剂以0.1%至20%的量存在于本发明的制剂中。在某些实施方案中，稳定剂是以5%至15%、或约10%的量存在。在其它实施方案中，本公开的制剂包含以下量的稳定剂：0.5%至19%、1%至18%、1.5%至17%、2.0%至16%、2.5%至15%、3.0%至14%、3.5%至13%、4.0%至12%、4.5%至11%、5.0%至10%、5.5%至9%、或6.0%至8%。某些制剂包含甘露糖醇、蔗糖、和/或海藻糖与一种或多种本文所公开的任何其它制剂组分的组合。
2.非离子型表面活性剂
有利地，已发现向成对碱性氨基酸蛋白酶组合物(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)添加糖非离子型表面活性剂使所述组合物对机械应力的稳定性增加。例如，如图31至图42中所示，包含仅10ppm非离子型表面活性剂可以使经受机械应力的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的稳定性增加至少25%。并且包含50ppm非离子型表面活性剂可以使经受机械应力的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物的稳定性增加至少40%。因此，在本公开的一个方面中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的组合物包含稳定化量的非离子型表面活性剂。
在一个实施方案中，提供储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的组合物，所述组合物包含选自以下的非离子型表面活性剂：非离子型水溶性甘油单酯、非离子型水溶性甘油二酯、非离子型水溶性甘油三酯、聚乙二醇的非离子型水溶性单脂肪酸酯、聚乙二醇的非离子型水溶性二脂肪酸酯、非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯、非离子型聚乙二醇化甘油酯、非离子型水溶性三嵌段共聚物、以及其组合。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。
在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是以下列浓度存在：10ppm至200ppm、10ppm至175ppm、10ppm至150ppm、10ppm至125ppm、10ppm至100ppm、10ppm至90ppm、10ppm至80ppm、10ppm至75ppm、10ppm至70ppm、10ppm至60ppm、10ppm至50ppm、10ppm至25ppm、25ppm至200ppm、25ppm至175ppm、25ppm至150ppm、25ppm至125ppm、25ppm至100ppm、25ppm至90ppm、25ppm至80ppm、25ppm至70ppm、25ppm至60ppm、25ppm至50ppm、50ppm至200ppm、50ppm至175ppm、50ppm至150ppm、50ppm至125ppm、50ppm至90ppm、50ppm至80ppm、75ppm至200ppm、75ppm至175ppm、75ppm至150ppm、100ppm至200ppm、100ppm至175ppm、50±25ppm、60±25ppm、70±25ppm、75±25ppm、80±25ppm、90±25ppm、100±25ppm、125±25ppm、150±25ppm、175±25ppm、30±10ppm、40±10ppm、50±10ppm、60±10ppm、70±10ppm、75±10ppm、80±10ppm、90±10ppm、100±10ppm、110±10ppm、120±10ppm、125±10ppm、130±10ppm、140±10ppm、150±10ppm、160±10ppm、170±10ppm、175±10ppm、180±10ppm、190±10ppm、25ppm、30ppm、40ppm、50ppm、60ppm、70ppm、75ppm、80ppm、90ppm、100ppm、110ppm、120ppm、125ppm、130ppm、140ppm、150ppm、160ppm、170ppm、175ppm、180ppm、190ppm、或200ppm。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、10ppm至200ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含2%至20%糖或糖醇。在一个具体实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至10%糖或糖醇、10ppm至200ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个具体实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至10%糖或糖醇、10ppm至200ppm非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型表面活性剂的组合、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一个具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在又另一个具体实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯，并且糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯的组合、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在另一个具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在又另一个具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、10ppm至200ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含2%至20%糖或糖醇。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、2%至10%糖或糖醇、10ppm至200ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、2%至10%糖或糖醇、10ppm至200ppm非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型表面活性剂的组合、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一个具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在又另一个具体实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯，并且糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含100mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯的组合、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在另一个具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在又另一个具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、75±25%非离子型表面活性剂、90±25mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含2%至20%糖或糖醇。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在一个具体实施方案中，组合物包含75±15ppm非离子型表面活性剂。在另一个具体实施方案中，组合物包含75±5ppm非离子型表面活性剂。在另一个具体实施方案中，组合物包含75ppm非离子型表面活性剂。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、2%至10%糖或糖醇、75±25ppm非离子型表面活性剂、90±25mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在一个具体实施方案中，组合物包含75±15ppm非离子型表面活性剂。在另一个具体实施方案中，组合物包含75±5ppm非离子型表面活性剂。在另一个具体实施方案中，组合物包含75ppm非离子型表面活性剂。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、2%至10%糖或糖醇、75±25ppm非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯、90±25mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在另一个具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在又另一个具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在一个具体实施方案中，组合物包含75±15ppm非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一个具体实施方案中，组合物包含75±5ppm非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一个具体实施方案中，组合物包含75ppm非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型表面活性剂的组合、90±25mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一个具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在又另一个具体实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯，并且糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯的组合、90±25mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在另一个具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在又另一个具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、75±25%非离子型表面活性剂、91mM缓冲剂，以及6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含2%至10%糖或糖醇。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在一个具体实施方案中，组合物包含75±15ppm非离子型表面活性剂。在另一个具体实施方案中，组合物包含75±5ppm非离子型表面活性剂。在另一个具体实施方案中，组合物包含75ppm非离子型表面活性剂。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、10%糖或糖醇、75±25ppm非离子型表面活性剂、91mM缓冲剂，以及6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在一个具体实施方案中，组合物包含75±15ppm非离子型表面活性剂。在另一个具体实施方案中，组合物包含75±5ppm非离子型表面活性剂。在另一个具体实施方案中，组合物包含75ppm非离子型表面活性剂。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、10%糖或糖醇、75±25ppm非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯、91mM缓冲剂，以及6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在另一个具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在又另一个具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。在一个具体实施方案中，组合物包含75±15ppm非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一个具体实施方案中，组合物包含75±5ppm非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一个具体实施方案中，组合物包含75ppm非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型表面活性剂的组合、91mM缓冲剂，以及6.0±0.2的pH。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在另一个具体实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在又另一个具体实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯，并且糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在一个实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、选自可见于表1至表9中的变化形式1至变化形式6035的糖或糖醇与非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯的组合、91mM缓冲剂，以及6.0±0.2的pH。在具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在另一个具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在又另一个具体实施方案中，非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
本发明的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物还优选包含表面活性剂，优选非离子型表面活性剂，并且其量优选是0.1ppm至150ppm、或65ppm至80ppm、或约75ppm。在其它实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含以下量的表面活性剂：0.5ppm至140ppm、1.0ppm至130ppm、10ppm至120ppm、20ppm至110ppm、30ppm至100ppm、40ppm至95ppm、50ppm至90ppm、55ppm至85ppm、60ppm至80ppm、或70ppm至75ppm。在某些实施方案中，表面活性剂选自由以下各项组成的组：聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、甘油、葡糖酰胺(如Mega8)、曲拉通(triton)、以及Brij35(聚氧乙烯23月桂基醚)。几种等级的普朗尼克多元醇(以商品名Pluronic销售，由BASFWyandotte公司制造)可供使用。具有不同分子量(1,000至16,000以上)和物理化学性质的这些多元醇已经用作表面活性剂。分子量为5,000的Pluronic F-38和分子量为9,000的Pluronic F-68均包含(按重量计)80%亲水性聚氧乙烯基团和20%疏水性聚氧丙烯基团。在一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。在具体实施方案中，聚山梨酯80是源自植物的聚山梨酯80。
B.药学上可接受的盐
本文所提供的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的稳定化组合物通常包含在于储存过程中成对碱性氨基酸蛋白酶多肽可耐受的浓度下的药学上可接受的盐。在一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化物盐。在具体实施方案中，药学上可接受的盐是单价氯化物盐。在更具体的实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠、氯化钾、或其组合。
在一个实施方案中，本文所提供的稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物中药学上可接受的盐的浓度是10mM至500mM。在另一个实施方案中，药学上可接受的盐的浓度是100mM至300mM。在另一个实施方案中，药学上可接受的盐的浓度是150mM至250mM。在其它实施方案中，本文所提供的稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物中药学上可接受的盐的浓度选自可见于表10中的变化形式6036至变化形式6180。
表10.适用于使成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的示例性药学上可接受的盐浓度。
10mM至500mM Var.6036 140±5mM Var.6085 179mM Var.6134
100mM至300mM Var.6037 145±5mM Var.6086 180mM Var.6135
150mM至250mM Var.6038 150±5mM Var.6087 181mM Var.6136
50mM至500mM Var.6039 155±5mM Var.6088 182mM Var.6137
50mM至450mM Var.6040 160±5mM Var.6089 183mM Var.6138
50mM至400mM Var.6041 165±5mM Var.6090 184mM Var.6139
100至400mM Var.6042 170±5mM Var.6091 185mM Var.6140
100mM至350mM Var.6043 175±5mM Var.6092 186mM Var.6141
100mM至250mM Var.6044 180±5mM Var.6093 187mM Var.6142
100mM至200mM Var.6045 185±5mM Var.6094 188mM Var.6143
150mM至400mM Var.6046 186±5mM Var.6095 189mM Var.6144
150mM至350mM Var.6047 187±5mM Var.6096 190mM Var.6145
150mM至300mM Var.6048 188±5mM Var.6097 191mM Var.6146
150mM至250mM Var.6049 189±5mM Var.6098 192mM Var.6147
150mM至200mM Var.6050 190±5mM Var.6099 193mM Var.6148
175mM至225mM Var.6051 191±5mM Var.6100 194mM Var.6149
175mM至200mM Var.6052 192±5mM Var.6101 195mM Var.6150
100±25mM Var.6053 193±5mM Var.6102 196mM Var.6151
150±25mM Var.6054 194±5mM Var.6103 197mM Var.6152
200±25mM Var.6055 195±5mM Var.6104 198mM Var.6153
250±25mM Var.6056 196±5mM Var.6105 199mM Var.6154
300±25mM Var.6057 197±5mM Var.6106 200mM Var.6155
350±25mM Var.6058 198±5mM Var.6107 201mM Var.6156
400±25mM Var.6059 199±5mM Var.6108 202mM Var.6157
450±25mM Var.6060 200±5mM Var.6109 203mM Var.6158
190±150mM Var.6061 205±5mM Var.6110 204mM Var.6159
190±125mM Var.6062 210±5mM Var.6111 205mM Var.6160
190±100mM Var.6063 215±5mM Var.6112 206mM Var.6161
190±90mM Var.6064 220±5mM Var.6113 207mM Var.6162
190±80mM Var.6065 225±5mM Var.6114 208mM Var.6163
190±70mM Var.6066 230±5mM Var.6115 209mM Var.6164
190±60mM Var.6067 235±5mM Var.6116 210mM Var.6165
190±50mM Var.6068 240±5mM Var.6117 211mM Var.6166
190±40mM Var.6069 245±5mM Var.6118 212mM Var.6167
190±30mM Var.6070 250±5mM Var.6119 213mM Var.6168
190±25mM Var.6071 255±5mM Var.6120 214mM Var.6169
190±20mM Var.6072 260±5mM Var.6121 215mM Var.6170
190±15mM Var.6073 265±5mM Var.6122 216mM Var.6171
190±10mM Var.6074 270±5mM Var.6123 217mM Var.6172
190±5mM Var.6075 275±5mM Var.6124 218mM Var.6173
190±2mM Var.6076 280±5mM Var.6125 219mM Var.6174
100±5mM Var.6077 285±5mM Var.6126 220mM Var.6175
105±5mM Var.6078 290±5mM Var.6127 221mM Var.6176
110±5mM Var.6079 295±5mM Var.6128 222mM Var.6177
115±5mM Var.6080 300±5mM Var.6129 223mM Var.6178
120±5mM Var.6081 175mM Var.6130 224mM Var.6179
125±5mM Var.6082 176mM Var.6131 225mM Var.6180
130±5mM Var.6083 177mM Var.6132
135±5mM Var.6084 178mM Var.6133
Var.=变化形式
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含在选自可见于表10中的变化形式6036至变化形式6180的浓度下的药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、10ppm至200ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含2%至20%糖或糖醇。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠、氯化钾、或其组合。在具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠。在另一个具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钾。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含在选自可见于表10中的变化形式6036至变化形式6180的浓度下的药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至20%糖或糖醇、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含10ppm至200ppm非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠、氯化钾、或其组合。在具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠。在另一个具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钾。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含在选自可见于表10中的变化形式6036至变化形式6180的浓度下的药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至20%糖或糖醇、10ppm至200ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠、氯化钾、或其组合。在具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠。在另一个具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钾。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含在选自可见于表10中的变化形式6036至变化形式6180的浓度下的药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至10%糖或糖醇、10ppm至100ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠、氯化钾、或其组合。在具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠。在另一个具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钾。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含在选自可见于表10中的变化形式6036至变化形式6180的浓度下的药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、10±5%糖或糖醇、75±25ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠、氯化钾、或其组合。在具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠。在另一个具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钾。在一个实施方案中，缓冲剂的浓度是90±25mM。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含在选自可见于表10中的变化形式6036至变化形式6180的浓度下的药学上可接受的盐、0.9mM钙、10%糖或糖醇、75ppm非离子型表面活性剂、91mM缓冲剂，以及6.0±0.2的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠、氯化钾、或其组合。在具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠。在另一个具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钾。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一些实施方案中，单价氯化物盐(如氯化钠和氯化钾)用于本公开的制剂中。尽管包含单价氯化物盐的制剂组分主要依据氯化钠进行描述，但应理解任何单价氯化物盐(包括氯化钾)均可根据本文针对氯化钠的描述使用。在某些实施方案中，氯化钠是以50mM至500mM的量包含于本发明制剂中。在其它实施方案中，氯化钠是以100mM至300mM、150mM至250mM、或约190mM的量包含于制剂中。在其它实施方案中，氯化钠是以下列量包含于本发明制剂中：100mM至300mM、110mM至280mM、120mM至260mM、130mM至240mM、140mM至220mM、150mM至200mM、或160mM至180mM。在具体实施方案中，制剂包含190mM氯化钠与一种或多种本文所公开的任何其它制剂组分的组合。
C.缓冲剂
有利地，已经发现成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物在pH6.0至pH7.0下稳定。例如，图11和图12中显示在pH5.5下配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物比在pH5.0下配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物稳定。还显示在pH6.0下配制的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物比在pH5.5下配制的组合物进一步稳定。此外，如图17中所示，在pH7.0下配制的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物具有与在pH6.0下配制的组合物类似的稳定性。
因此，在某些实施方案中，本文所提供的稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物是在5.5至7.5的pH下进行配制。在具体实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物是在6.0至7.0的pH下进行配制。在另一个具体实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物是在pH6.0±0.2下进行配制。在更具体的实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物是在pH6.0下进行配制。在其它实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物是在选自可见于表11中的变化形式6181至变化形式6403的pH下进行配制。
表11.适用于使成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的示例性pH范围。
Figure BDA0000463803880001001
Figure BDA0000463803880001021
Var.=变化形式
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、10ppm至200ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及选自可见于表11中的变化形式6181至变化形式6403的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含2%至20%糖或糖醇。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至20%糖或糖醇、10mM至200mM缓冲剂，以及选自可见于表11中的变化形式6181至变化形式6403的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含10ppm至200ppm非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至20%糖或糖醇、10ppm至200ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及选自可见于表11中的变化形式6181至变化形式6403的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至10%糖或糖醇、10ppm至100ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及选自可见于表11中的变化形式6181至变化形式6403的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、2%至10%糖或糖醇、10ppm至100ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及选自可见于表11中的变化形式6181至变化形式6403的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、10±5%糖或糖醇、75±25ppm非离子型表面活性剂、10mM至200mM缓冲剂，以及选自可见于表11中的变化形式6181至变化形式6403的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、10±5%糖或糖醇、75±25ppm非离子型表面活性剂、90±25mM缓冲剂，以及选自可见于表11中的变化形式6181至变化形式6403的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含191mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、10%糖或糖醇、75ppm非离子型表面活性剂、91mM缓冲剂，以及选自可见于表11中的变化形式6181至变化形式6403的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，使用一种或多种缓冲剂在适当pH下配制本文所提供的稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物。在一个实施方案中，所述一种或多种缓冲剂选自组氨酸、咪唑、磷酸盐、柠檬酸盐、Tris、乙酸盐(例如，乙酸)、BIS-Tris丙烷、PIPES、MOPS、HEPES、MES、ACES、以及其组合。在具体实施方案中，缓冲剂是乙酸盐、HEPES、或其组合。在具体实施方案中，缓冲剂是乙酸盐与HEPES的组合。
缓冲剂是以在一段时间(例如，数周、数月、或数年)的储存过程中适合用于维持稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的pH的浓度存在于所述组合物中。在一个实施方案中，制剂中的缓冲剂的浓度是10mM至300mM。在另一个实施方案中，制剂中的缓冲剂的浓度是在10mM与200mM之间。在具体实施方案中，制剂中的缓冲剂的浓度是90±25mM。在其它实施方案中，组合物中的缓冲剂的浓度选自可见于表12中的变化形式6404至变化形式6469。
表12.适用于使成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物的稳定化的示例性缓冲剂浓度(mM)。
10-300 Var.6404 50-200 Var.6426 91±2 Var.6448
10-275 Var.6405 50-175 Var.6427 80 Var.6449
10-250 Var.6406 50-150 Var.6428 81 Var.6450
10-225 Var.6407 50-125 Var.6429 82 Var.6451
10-200 Var.6408 50-100 Var.6430 83 Var.6452
10-175 Var.6409 75-300 Var.6431 84 Var.6453
10-150 Var.6410 75-275 Var.6432 85 Var.6454
10-125 Var.6411 75-250 Var.6433 86 Var.6455
10-100 Var.6412 75-225 Var.6434 87 Var.6456
25-300 Var.6413 75-200 Var.6435 88 Var.6457
25-275 Var.6414 75-175 Var.6436 89 Var.6458
25-250 Var.6415 75-150 Var.6437 90 Var.6459
25-225 Var.6416 75-125 Var.6438 91 Var.6460
25-200 Var.6417 75-100 Var.6439 92 Var.6461
25-175 Var.6418 90±75 Var.6440 93 Var.6462
25-150 Var.6419 90±50 Var.6441 94 Var.6463
25-125 Var.6420 90±25 Var.6442 95 Var.6464
25-100 Var.6421 90±10 Var.6443 96 Var.6465
50-300 Var.6422 90±5 Var.6444 97 Var.6466
50-275 Var.6423 90±2 Var.6445 98 Var.6467
50-250 Var.6424 91±10 Var.6446 99 Var.6468
50-225 Var.6425 91±5 Var.6447 100 Var.6469
Var.=变化形式
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、10ppm至200ppm非离子型表面活性剂、在选自可见于表12中的变化形式6404至变化形式6469的浓度下的缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含2%至20%糖或糖醇。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，缓冲剂是乙酸盐、HEPES、或其组合。在具体实施方案中，缓冲剂是乙酸盐与HEPES的组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至20%糖或糖醇、在选自可见于表12中的变化形式6404至变化形式6469的浓度下的缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物进一步包含10ppm至200ppm非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，缓冲剂是乙酸盐、HEPES、或其组合。在具体实施方案中，缓冲剂是乙酸盐与HEPES的组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至20%糖或糖醇、10ppm至200ppm非离子型表面活性剂、在选自可见于表12中的变化形式6404至变化形式6469的浓度下的缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，缓冲剂是乙酸盐、HEPES、或其组合。在具体实施方案中，缓冲剂是乙酸盐与HEPES的组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至500mM药学上可接受的盐、0.5mM至5mM钙、2%至10%糖或糖醇、10ppm至100ppm非离子型表面活性剂、在选自可见于表12中的变化形式6404至变化形式6469的浓度下的缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，缓冲剂是乙酸盐、HEPES、或其组合。在具体实施方案中，缓冲剂是乙酸盐与HEPES的组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、2%至10%糖或糖醇、10ppm至100ppm非离子型表面活性剂、在选自可见于表12中的变化形式6404至变化形式6469的浓度下的缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，缓冲剂是乙酸盐、HEPES、或其组合。在具体实施方案中，缓冲剂是乙酸盐与HEPES的组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含50mM至300mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、10±5%糖或糖醇、75±25ppm非离子型表面活性剂、在选自可见于表12中的变化形式6404至变化形式6469的浓度下的缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，缓冲剂是乙酸盐、HEPES、或其组合。在具体实施方案中，缓冲剂是乙酸盐与HEPES的组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含190±50mM药学上可接受的盐、0.5mM至2mM钙、10±5%糖或糖醇、75±25ppm非离子型表面活性剂、在选自可见于表12中的变化形式6404至变化形式6469的浓度下的缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，缓冲剂是乙酸盐、HEPES、或其组合。在具体实施方案中，缓冲剂是乙酸盐与HEPES的组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
在一个实施方案中，稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含191mM药学上可接受的盐、0.9mM钙、10%糖或糖醇、75ppm非离子型表面活性剂、在选自可见于表12中的变化形式6404至变化形式6469的浓度下的缓冲剂，以及5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)，并且糖或糖醇是海藻糖。在一个实施方案中，缓冲剂是乙酸盐、HEPES、或其组合。在具体实施方案中，缓冲剂是乙酸盐与HEPES的组合。在一个实施方案中，组合物的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，组合物的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，组合物的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，组合物的pH是6.0。在具体实施方案中，组合物包含8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
缓冲液还可以与一种或多种本文所描述的任何其它制剂组分组合存在于本发明的制剂中。如实施例中所示，本发明的高度稳定化的制剂在pH6.0下显示增加的稳定性。在某些实施方案中，高度稳定化的制剂的pH优选应维持在6.0至8.0范围中、或维持在约6.0的pH下。缓冲剂可以是具有充当缓冲液的能力的任何生理学上可接受的化学实体或多种化学实体的组合，包括但不限于：组氨酸、咪唑、磷酸盐、柠檬酸盐、Tris、乙酸盐、BIS-Tris丙烷、PIPES、MOPS、HEPES、MES、以及ACES。许多这些缓冲剂的完整化学命名在以下表1中列出。在某些实施方案中，如果钙以高于约5mM的浓度存在于制剂中，那么磷酸盐不用作缓冲剂。在一些实施方案中，包含以下浓度的缓冲剂：10mM至200mM、或10mM至100mM、或30mM至60mM、或约46mM。在其它实施方案中，包含以下浓度的单独缓冲剂：15mM至95mM、20mM至90mM、25mM至85mM、30mM至80mM、35mM至75mM、40mM至70mM、45mM至65mM、或50mM至60mM。在某些实施方案中，制剂包含两种缓冲剂。
表13.示例性缓冲剂
Tris 三-(羟甲基)-氨基甲烷
BIS-Tris丙烷 1,3-双-[三-(羟基-甲基)甲氨基]-丙烷
PIPES 哌嗪-N,N'-双-(2-乙磺酸)
MOPS 3-{N-吗啉代)丙磺酸
HEPES N-2-羟乙基-哌嗪-N'-2-乙磺酸
MBS 2-(N-吗啉代)乙磺酸
ACES N-2-乙酰胺基-2-氨基乙磺酸
在某些方面，本发明制剂包含羧酸与一种或多种本文所描述的制剂组分的组合。在其它方面，羧酸优选是乙酸(例如，乙酸盐)。在某些实施方案中，制剂包含20mM至100mM乙酸、或30mM至50mM、或约45mM乙酸或任何其它羧酸。在其它实施方案中，制剂包含25mM至90mM、30mM至80mM、35mM至70mM、40mM至60mM、或45mM至50mM乙酸或任何其它羧酸。
D.另外制剂组分
本公开的高度稳定化的制剂包含成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)，和稳定剂、缓冲剂、氯化钠、盐、以及其它赋形剂中的一种或多种。在下文更详细地描述这类组分。应理解，任何本文所描述的制剂组分均可以单独地使用或以任何组合的形式使用。
与对照或起始制剂相比，本公开的高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂显示出对剪切(搅拌)、冻干、以及冷冻/解冻压力的增加的稳定性以及对在容器表面处的产品损失或变性的增加的抗性。
成对碱性氨基酸蛋白酶以5,000U/mL至500,000U/mL的浓度包含于本公开的制剂中。在某些实施方案中，包含以下浓度的成对碱性氨基酸蛋白酶：5,500U/mL至55,000U/mL、6,000U/mL至50,000U/mL、6,500U/mL至45,000U/mL、7,000U/mL至40,000U/mL、7,500U/mL至35,000U/mL、8,000U/mL至30,000U/mL、8,500U/mL至25,000U/mL、9,000U/mL至20,000U/mL、9,500U/mL至15,000U/mL、以及约10,000U/mL。在其它实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶以选自可见于表14中的变化形式6470至变化形式6533的浓度(以每mL数千单位的成对碱性氨基酸蛋白酶活性报道)包含于本公开的制剂中。在具体实施方案中，本公开的高度稳定化的制剂中所包含的成对碱性氨基酸蛋白酶是重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
表14.本文所提供的稳定化的组合物中所使用的示例性成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)浓度(以每mL数千单位的成对碱性氨基酸蛋白酶活性表示)。
1-1,000 Var.6470 5-450 Var.6492 8-150 Var.6514
1-900 Var.6471 5-400 Var.6493 8-100 Var.6515
1-800 Var.6472 5-350 Var.6494 8-52 Var.6516
1-700 Var.6473 5-300 Var.6495 8-50 Var.6517
1-600 Var.6474 5-250 Var.6496 10-1,000 Var.6518
1-500 Var.6475 5-200 Var.6497 10-900 Var.6519
1-450 Var.6476 5-150 Var.6498 10-800 Var.6520
1-400 Var.6477 5-100 Var.6499 10-700 Var.6521
1-350 Var.6478 5-52 Var.6500 10-600 Var.6522
1-300 Var.6479 5-50 Var.6501 10-500 Var.6523
1-250 Var.6480 8-1,000 Var.6502 10-450 Var.6524
1-200 Var.6481 8-900 Var.6503 10-400 Var.6525
1-150 Var.6482 8-800 Var.6504 10-350 Var.6526
1-100 Var.6483 8-700 Var.6505 10-300 Var.6527
1-52 Var.6484 8-600 Var.6506 10-250 Var.6528
1-50 Var.6485 8-500 Var.6507 10-200 Var.6529
5-1,000 Var.6486 8-450 Var.6508 10-150 Var.6530
5-900 Var.6487 8-400 Var.6509 10-100 Var.6531
5-800 Var.6488 8-350 Var.6510 10-52 Var.6532
5-700 Var.6489 8-300 Var.6511 10-50 Var.6533
5-600 Var.6490 8-250 Var.6512
5-500 Var.6491 8-200 Var.6513
Var.=变化形式
在另一个实施方案中，本文所提供的稳定化的组合物的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)浓度可以表示为存在于所述组合物中的成对碱性氨基酸蛋白酶的质量。在一个实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)以100ng/mL至100mg/mL的浓度存在于如本文所描述的稳定化的组合物中。在另一个实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)以1μg/mL至10mg/mL的浓度存在于如本文所描述的稳定化的组合物中。在另一个实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)以1μg/mL至1mg/mL的浓度存在于如本文所描述的稳定化的组合物中。在其它实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)以选自可见于表15中的变化形式6534至变化形式6638的浓度存在于如本文所描述的稳定化的组合物中。在具体实施方案中，本公开的高度稳定化的制剂中所包含的成对碱性氨基酸蛋白酶是重组成对碱性氨基酸蛋白酶。
表15.本文所提供的稳定化的组合物中所使用的示例性成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)浓度。
Figure BDA0000463803880001141
Figure BDA0000463803880001151
Var.=变化形式
在本公开的一些方面，成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂包含钙或其它二价金属阳离子。在其它方面，二阶阳离子以盐、优选氯化物盐的形式存在。在某些实施方案中，可以使用0.1mM至10mM、或0.5mM至2mM、或约0.92mM的二阶阳离子盐。在其它实施方案中，本发明的制剂中使用0.5mM至9mM、1mM至8mM、1.5mM至7mM、2mM至6mM、2.5mM至5mM、或3mM至4.5mM二阶阳离子盐。当使用钙盐时，优选氯化钙，但还可以是其它钙盐，如葡萄糖酸钙、葡乳醛酸钙、或葡庚糖酸钙。可以包含二价阳离子(包括钙)与一种或多种本文所公开的其它制剂组分的组合。适用于本文所提供的制剂的二价金属阳离子的非限制性实例包括钙、钡、锰、镁、钴、铜、镍、以及锌。
在一些实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂包含抗氧化剂。已经发现向水性制剂和冻干制剂添加抗氧化剂使这些制剂的稳定性改进，并且因此延长其保存期限。所使用的抗氧化剂必须与药物制剂可兼容使用，并且此外优选是水溶性的。当向制剂添加抗氧化剂时，优选在冻干前的过程中尽可能迟地添加这类抗氧化剂，以便避免抗氧化剂的自发氧化。以下表2列出适合的抗氧化剂，其是通过公司如Calbiochem和Sigma商业上可获得的。
表16.示例性抗氧化剂
Figure BDA0000463803880001171
可以使用浓度在约0.05mg/mL至1.0mg/ml以上范围内的抗氧化剂，并且据信较高浓度也将适用(在一定程度上产生任何毒性作用或不良制造作用(如冻干产品的玻璃化转变温度降低))。因此，在一个实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含0.05mg/mL至1.0mg/mL抗氧化剂。在其它实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物包含0.05mg/mL至0.5mg/mL、0.1mg/mL至0.9mg/mL、0.1mg/mL至0.8mg/mL、0.1mg/mL至0.7mg/mL、0.1mg/mL至0.6mg/mL、0.1mg/mL至0.5mg/mL、0.1mg/mL至0.4mg/mL、0.1mg/mL至0.3mg/mL、0.1mg/mL至0.2mg/mL、0.2mg/mL至0.9mg/mL、0.2mg/mL至0.8mg/mL、0.2mg/mL至0.7mg/mL、0.2mg/mL至0.6mg/mL、0.2mg/mL至0.5mg/mL、0.2mg/mL至0.4mg/mL、0.2mg/mL至0.3mg/mL、0.3mg/mL至0.7mg/mL、0.4mg/mL至0.6mg/mL抗氧化剂。
E.制剂开发
在本公开的某些方面中，通过提供起始(对照)成对碱性氨基酸蛋白酶制剂并且添加组分以便实现所需的组分浓度水平来制备成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的高度稳定化的制剂。例如，向9份缺乏非离子型表面活性剂的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物添加1份750ppm非离子型表面活性剂，以便提供包含75ppm非离子型表面活性剂的最终制剂。这个过程还称为向起始制剂“掺入(spiking in)”。
在某些实施方案中，为了产生本公开的高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂，使起始制剂中包含成对碱性氨基酸蛋白酶并且将缓冲液组合物掺入所述起始制剂中。在其它实施方案中，根据本领域中的已知方法使用透析形成高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂。在一些实施方案中，配制方法涉及将浓缓冲液组合物掺入成对碱性氨基酸蛋白酶的起始制剂中。在一个实施方案中，在添加其它组分之前、特别是在添加海藻糖之前，向起始制剂中添加聚山梨酯80，以便保护成对碱性氨基酸蛋白酶免于在混合过程中的搅拌。
在示例性实施方案中，使成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)散装原料药(BDS)包含于具有10mM乙酸钠、230mM氯化钠、1mM氯化钙、pH6.0的起始制剂中。在一个实施方案中，将以下组分掺入起始制剂中：1%聚山梨酯80、500mMHEPES、400mM乙酸、1mM CaCl2、pH6.0以及海藻糖二水合物粉末，以便获得以下组合物：46mM HEPES、45mM乙酸、190mM NaCl、0.92mM CaCl2、75ppm聚山梨酯80、10%w/w海藻糖二水合物，pH6.0。增加乙酸并且添加HEPES导致pH的更大稳定性。尽管在pH6.0下乙酸和HEPES均超出其最高缓冲能力范围，但高浓度的这些化学品使高度稳定化的制剂的缓冲能力大大增加。在某些实施方案中，在添加其它组分之前向起始制剂中添加聚山梨酯80，以便在混合过程中在添加其它试剂时保护成对碱性氨基酸蛋白酶免于聚集合吸附至容器表面。在某些实施方案中，将起始制剂中的成对碱性氨基酸蛋白酶与聚山梨酯80和/或除海藻糖之外的任何其它组分进行混合。在添加聚山梨酯80之后添加海藻糖和任何其余组分，以便在混合过程中保护成对碱性氨基酸蛋白酶免于聚集和吸附。
在某些实施方案中，将稳定化的制剂与稀释剂组合以使得所述制剂可以用于方法如rVWF成熟过程中。在其它实施方案中，通过将起始稀释剂(50mM HEPES、150mM NaCl、1mM CaCl2，pH7.0)掺以聚山梨酯80至75ppm来制备稳定化的稀释剂。与使用起始成对碱性氨基酸蛋白酶和稀释剂制剂相比，本公开的高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂与这种稳定化的稀释剂的组合使rVWF成熟步骤中的成对碱性氨基酸蛋白酶恢复增加至3至4倍。
在某些实施方案中，将本公开的高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂冻干。在冻干过程中，将制剂从水相转化为非晶形固相，所述过程被认为保护蛋白质免于化学和/或构象不稳定性。在其它实施方案中，冻干之制剂不仅包含非晶相，而且还包含在冻干过程中结晶的组分。
在一些实施方案中，可以将高度稳定化的制剂的一种或多种组分分散于冻干块的非晶相中。此外，非晶相的表观玻璃化转变温度(Tg')在冻干过程中优选相对较高，并且固体的玻璃化转变温度(Tg)在储存过程中同样优选较高。
IV.稀释重组成对碱性氨基酸蛋白酶的水性组合物的方法
一方面，本公开提供用于稀释成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的水性组合物的方法。以下实施方案是部分基于以下发现：与用缺乏非离子型表面活性剂的缓冲液稀释相比，在用于稀释成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的缓冲液中包含非离子型表面活性剂引起多3至4倍的成对碱性氨基酸蛋白酶活性的恢复。
在一个实施方案中，所述方法包括向成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物中添加含有非离子型表面活性剂的稀释缓冲液，以便形成稀释的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物。在一些实施方案中，以1:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)至1,000:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)的比率添加稀释缓冲液。在另一个实施方案中，以1:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)至500:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)的比率添加稀释缓冲液。在另一个实施方案中，以1:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)至250:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)的比率添加稀释缓冲液。在另一个实施方案中，以1:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)至200:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)的比率添加稀释缓冲液。在另一个实施方案中，以1:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)至100:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)的比率添加稀释缓冲液。在另一个实施方案中，以1:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)至50:1(稀释缓冲液:成对碱性氨基酸蛋白酶组合物)的比率添加稀释缓冲液。
在一个实施方案中，所述方法包括向成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物中添加非离子型表面活性剂的第一步骤和向含有所述非离子型表面活性剂的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物中添加稀释缓冲液的第二步骤，以便形成稀释的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物。在一个实施方案中，表面活性剂将以所稀释的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物中所需浓度的X倍的最终浓度添加至成对碱性氨基酸蛋白酶组合物中，其中X是稀释因子。例如，如果待稀释100倍的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物中需要10ppm非离子型表面活性剂的最终浓度，那么将非离子型表面活性剂以1,000ppm(10ppm×100倍稀释度)的最终浓度添加至起始成对碱性氨基酸蛋白酶组合物中，并且随后通过每1份起始溶液(考虑在添加非离子型表面活性剂过程中所添加的体积)添加99份稀释缓冲液来稀释组合物。
在某些实施方案中，将成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)组合物稀释1倍至1,000倍、1倍至500倍、1倍至250倍、1倍至200倍、1倍至100倍、1倍至50倍、1倍至10倍、10倍至1,000倍、10倍至500倍、10倍至250倍、10倍至200倍、10倍至100倍、10倍至50倍、50倍至1,000倍、50倍至500倍、50倍至250倍、50倍至200倍、50倍至100倍、100倍至1,000倍、100倍至500倍、100倍至250倍、100倍至200倍、200倍至1,000倍、200倍至500倍、或200倍至250倍。
A.成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液
在一个实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液将包含药学上可接受的盐、非离子型表面活性剂、以及缓冲剂。在一个实施方案中，稀释缓冲液进一步包含钙。在另一个实施方案中，稀释缓冲液进一步包含糖和/或糖醇。
在一个实施方案中，药学上可接受的盐以10mM至500mM的浓度存在于稀释缓冲液中。在另一个实施方案中，药学上可接受的盐的浓度是100mM至300mM。在另一个实施方案中，药学上可接受的盐的浓度是150mM至250mM。在其它实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液中药学上可接受的盐的浓度选自可见于表10中的变化形式6036至变化形式6180。在一个实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠、氯化钾、或其组合。在具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钠。在另一个具体实施方案中，药学上可接受的盐是氯化钾。
在一个实施方案中，稀释缓冲液具有5.5至7.5的pH。在一个实施方案中，稀释缓冲液的pH是5.5至7.0。在另一个实施方案中，稀释缓冲液的pH是5.5至6.5。在另一个实施方案中，稀释缓冲液的pH是6.0±0.2。在具体实施方案中，稀释缓冲液的pH是6.0。在其它实施方案中，稀释缓冲液具有选自可见于表11中的变化形式6181至变化形式6403的pH。
在一个实施方案中，缓冲剂以10mM至300mM的浓度存在于稀释缓冲液中。在另一个实施方案中，稀释缓冲液中的缓冲剂的浓度是在10mM至200mM之间。在其它实施方案中，稀释缓冲液中的缓冲剂的浓度选自可见于表12中的变化形式6404至变化形式6469。在一个实施方案中，缓冲剂是乙酸盐、HEPES、或其组合。在具体实施方案中，缓冲剂是乙酸盐与HEPES的组合。
在一些实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液包含钙或另一种二价金属阳离子。在一个实施方案中，二阶阳离子以盐、优选氯化物盐的形式添加。在某些实施方案中，稀释缓冲液中的二阶阳离子(例如，钙)的浓度是0.1mM至10mM、0.5mM至2mM、或约0.92mM。在其它实施方案中，稀释缓冲液中使用0.5mM至9mM、1mM至8mM、1.5mM至7mM、2mM至6mM、2.5mM至5mM、或3mM至4.5mM二阶阳离子。当使用钙盐时，优选氯化钙，但还可以是其它钙盐，如葡萄糖酸钙、葡乳醛酸钙、或葡庚糖酸钙。可以包含二价阳离子(包括钙)与一种或多种本文所公开的其它制剂组分的组合。适用于本文所提供的稀释缓冲液的二价金属阳离子的非限制性实例包括钙、钡、锰、镁、钴、铜、镍、以及锌。
在一些实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液包含糖和/或糖醇。在一个实施方案中，稀释缓冲液包含单糖。在具体实施方案中，单糖选自由以下各项组成的组：乙糖、丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖、以及辛糖。在具体实施方案中，糖是戊糖、己糖、或其组合。在具体实施方案中，糖是己糖。
在另一个实施方案中，稀释缓冲液包含二糖。在具体实施方案中，二糖选自由戊糖和/或己糖单糖形成的二糖。在另一个具体实施方案中，糖选自由己糖单糖形成的二糖。在一个实施方案中，糖是蔗糖、海藻糖、或其组合。在一个具体实施方案中，糖是蔗糖。在另一个具体实施方案中，糖是海藻糖。在一个实施方案中，糖以海藻糖二水合物的形式进行配制。
在另一个实施方案中，稀释缓冲液包含糖醇。在具体实施方案中，糖醇选自乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、核糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇、倭勒米糖醇、异麦芽糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇、木糖醇、以及阿拉伯糖醇。在另一个具体实施方案中，糖醇是甘露糖醇。
在另一个实施方案中，稀释缓冲液包含糖与糖醇的混合物。在一个实施方案中，混合物包含单糖、二糖、以及糖醇中的至少两者。在另一个实施方案中，混合物包含戊糖、己糖、由戊糖和/或己糖单糖形成的二糖、以及糖醇中的至少两者。在另一个实施方案中，混合物包含蔗糖、海藻糖、以及甘露糖醇中的至少两者。
在一个实施方案中、糖或糖醇以下列浓度存在于稀释缓冲液中：2%至20%、2%至17.5%、2%至15%、2%至12.5%、2%至10%、2%至9%、2%至8%、2%至7%、5%至20%、5%至17.5%、5%至15%、5%至12.5%、5%至10%、7.5%至20%、7.5%至17.5%、7.5%至15%、7.5%至12.5%、10%至20%、10%至17.5%、10%至15%、4±2%、5±2%、6±2%、7±2%、8±2%、9±2%、10±2%、11±2%、12±2%、13±2%、14±2%、15±2%、16±2%、17±2%、18±2%、3±1%、4±1%、5±1%、6±1%、7±1%、8±1%、9±1%、10±1%、11±1%、12±1%、13±1%、14±1%、15±1%、16±1%、17±1%、18±1%、19±1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、或20%。在一个实施方案中，糖或糖醇选自蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。在具体实施方案中，糖或糖醇是海藻糖。
在一个实施方案中，提供储存稳定的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)的组合物，所述组合物包含选自以下的非离子型表面活性剂：非离子型水溶性甘油单酯、非离子型水溶性甘油二酯、非离子型水溶性甘油三酯、聚乙二醇的非离子型水溶性单脂肪酸酯、聚乙二醇的非离子型水溶性二脂肪酸酯、非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯、非离子型聚乙二醇化甘油酯、非离子型水溶性三嵌段共聚物、以及其组合。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。
1.非离子型表面活性剂
在一个实施方案中，在稀释之前所添加的成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液或非离子型表面活性剂溶液包含选自以下的非离子型表面活性剂：非离子型水溶性甘油单酯、非离子型水溶性甘油二酯、非离子型水溶性甘油三酯、聚乙二醇的非离子型水溶性单脂肪酸酯、聚乙二醇的非离子型水溶性二脂肪酸酯、非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯、非离子型聚乙二醇化甘油酯、非离子型水溶性三嵌段共聚物、以及其组合。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。
在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是以下列浓度存在于稀释缓冲液中：10ppm至200ppm、10ppm至175ppm、10ppm至150ppm、10ppm至125ppm、10ppm至100ppm、10ppm至90ppm、10ppm至80ppm、10ppm至75ppm、10ppm至70ppm、10ppm至60ppm、10ppm至50ppm、10ppm至25ppm、25ppm至200ppm、25ppm至175ppm、25ppm至150ppm、25ppm至125ppm、25ppm至100ppm、25ppm至90ppm、25ppm至80ppm、25ppm至70ppm、25ppm至60ppm、25ppm至50ppm、50ppm至200ppm、50ppm至175ppm、50ppm至150ppm、50ppm至125ppm、50ppm至90ppm、50ppm至80ppm、75ppm至200ppm、75ppm至175ppm、75ppm至150ppm、100ppm至200ppm、100ppm至175ppm、50±25ppm、60±25ppm、70±25ppm、75±25ppm、80±25ppm、90±25ppm、100±25ppm、125±25ppm、150±25ppm、175±25ppm、30±10ppm、40±10ppm、50±10ppm、60±10ppm、70±10ppm、75±10ppm、80±10ppm、90±10ppm、100±10ppm、110±10ppm、120±10ppm、125±10ppm、130±10ppm、140±10ppm、150±10ppm、160±10ppm、170±10ppm、175±10ppm、180±10ppm、190±10ppm、25ppm、30ppm、40ppm、50ppm、60ppm、70ppm、75ppm、80ppm、90ppm、100ppm、110ppm、120ppm、125ppm、130ppm、140ppm、150ppm、160ppm、170ppm、175ppm、180ppm、190ppm、或200ppm。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。
在一个实施方案中，稀释之后的非离子型表面活性剂的目标浓度为：10ppm至200ppm、10ppm至175ppm、10ppm至150ppm、10ppm至125ppm、10ppm至100ppm、10ppm至90ppm、10ppm至80ppm、10ppm至75ppm、10ppm至70ppm、10ppm至60ppm、10ppm至50ppm、10ppm至25ppm、25ppm至200ppm、25ppm至175ppm、25ppm至150ppm、25ppm至125ppm、25ppm至100ppm、25ppm至90ppm、25ppm至80ppm、25ppm至70ppm、25ppm至60ppm、25ppm至50ppm、50ppm至200ppm、50ppm至175ppm、50ppm至150ppm、50ppm至125ppm、50ppm至90ppm、50ppm至80ppm、75ppm至200ppm、75ppm至175ppm、75ppm至150ppm、100ppm至200ppm、100ppm至175ppm、50±25ppm、60±25ppm、70±25ppm、75±25ppm、80±25ppm、90±25ppm、100±25ppm、125±25ppm、150±25ppm、175±25ppm、30±10ppm、40±10ppm、50±10ppm、60±10ppm、70±10ppm、75±10ppm、80±10ppm、90±10ppm、100±10ppm、110±10ppm、120±10ppm、125±10ppm、130±10ppm、140±10ppm、150±10ppm、160±10ppm、170±10ppm、175±10ppm、180±10ppm、190±10ppm、25ppm、30ppm、40ppm、50ppm、60ppm、70ppm、75ppm、80ppm、90ppm、100ppm、110ppm、120ppm、125ppm、130ppm、140ppm、150ppm、160ppm、170ppm、175ppm、180ppm、190ppm、或200ppm。在一个实施方案中，非离子型表面活性剂是非离子型水溶性脱水山梨糖醇脂肪酸酯。在具体实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)。
在一个实施方案中，与未使用非离子型表面活性剂稀释或使用较低浓度的非离子型表面活性剂稀释的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物中所恢复的活性相比，在成对碱性氨基酸蛋白酶稀释缓冲液中包含非离子型表面活性剂、或在稀释之前添加非离子型表面活性剂使稀释的成对碱性氨基酸蛋白酶组合物中所恢复的成对碱性氨基酸蛋白酶活性增加至少10%。在其它实施方案中，与无非离子型表面活性剂的情况下稀释或使用较低浓度的非离子型表面活性剂稀释之后所恢复的成对碱性氨基酸蛋白酶活性相比，使用非离子型表面活性剂稀释之后所恢复的成对碱性氨基酸蛋白酶活性高至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、2倍、3倍、4倍、5倍、或5倍以上。
V.稳定性测定
如本文所讨论，本公开的高度稳定化的成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂与对照制剂相比显示改进的稳定性。在一个实施方案中，改进的稳定性包括在不同稳定性测定中与对照制剂相比保留较高百分比的活性。这类测定可以用于确定制剂是否是高度稳定化的制剂。在一些实施方案中，当通过本文所讨论或本领域已知的任何稳定性测定评定时，高度稳定化的制剂具有比对照制剂高至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上的活性。
在其它方面中，在应激物条件(如在高温下储存、搅拌、冷冻/解冻循环、或其一些组合)下测试成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂。在这类应激物之后，使用本文所描述或本领域已知的任何方法测定制剂以便测定在这些条件下的稳定性。
一方面，成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定用于评定制剂的稳定性。在一些实施方案中，成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定涉及底物裂解的测量。在一个实施方案中，底物是Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO:1；AMC=7-氨基-4-甲氧基香豆素)，其由成对碱性氨基酸蛋白酶裂解，从而释放7-氨基-4-甲氧基香豆素。例如在ELISA板上进行测定。根据(例如)由质量管理(QC)成对碱性氨基酸蛋白酶标准品建立的标准曲线测定样品中的成对碱性氨基酸蛋白酶活性。活性值一般计算为两种稀释物(各自一式两份)的平均值。
另一方面，大小排阻色谱法(SEC)用于评估成对碱性氨基酸蛋白酶(例如，重组成对碱性氨基酸蛋白酶)制剂的稳定性。在这类测定中，稳定性由对应于单体成对碱性氨基酸蛋白酶的峰的高度指示。单体峰高降低意指产品损失(不稳定)，并且产生较高分子量峰指示发生聚集，并且较低分子量峰意指产品降解。在示例性实施方案中，在37℃下4天之后，对照成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的相对峰高是58.5%，但在高度稳定化的制剂中相对峰高是74.8%(图48)。因此，高度稳定化的制剂维持了组合物中成对碱性氨基酸蛋白酶的稳定性，并且与在较高(37℃)温度下储存4天之前所见的峰高相比保留较大百分比的峰高。
另一方面，定性测定(如蛋白质印迹分析)用于评估成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的稳定性。例如，图26显示在35℃下5天之后，与非稳定化的制剂(泳道5)相比，稳定化的制剂(泳道11)中完整成对碱性氨基酸蛋白酶分子而不是降解物质的信号百分比较大。
另一方面，定性测定(如UV光谱)用于评估稳定性。当所使用的应激物是搅拌时，这类测定尤其适用。UV光谱可以指示的聚集体存在——聚集体的存在是不稳定性的指示。例如，图36显示当搅拌对照制剂时光谱向上(指示聚集)的主要位移。图41和图42显示高度稳定化的制剂在以下方面的保护能力：在搅拌的情况下，搅拌的样品的光谱不向上位移，而是覆盖未搅拌的样品，其指示当制剂通过搅拌受力放置时不形成聚集。
除非另外指示，否则可以采用本领域的技术之内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、以及免疫学的常规技术和描述来实践本发明。这类常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接、以及使用标记的杂交检测。适合的技术的具体说明可以参考本文以下实施例。然而，当然还可以使用其它等效常规程序。这类常规技术和描述可以见于标准实验手册中，如GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series(第I卷至第IV卷)；UsingAntibodies:A Laboratory Manual；Cells:A Laboratory Manual；PCRPrimer:A Laboratory Manual；以及Molecular Cloning:A LaboratoryManual(均来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(第四版)Freeman,Highly stabilized York；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”1984,IRL Press,London；Nelson和Cox(2000),Lehninger,Principles of Biochemistry第三版,W.H.Freeman Pub.,Highly stabilized York,N.Y.；以及Berg等(2002)Biochemistry,第五版,W.H.Freeman Pub.,Highly stabilizedYork,N.Y.，出于所有目的，所述文献均以引用的方式整体并入本文。
在以下描述中，阐述大量具体细节以便提供本发明的更详尽的理解。然而，对于本领域技术人员将是清楚的：可以在无一种或多种这些具体细节的情况下实施本发明。在其它情况下，并未描述本领域技术人员所熟知的熟知特征和程序，以便避免混淆本发明。
虽然主要参照具体实施方案描述本发明，但还预想在阅读本公开后其它实施方案对于本领域技术人员将是清楚的，并且意图这类实施方案包含于本发明的方法内。
实施例
实施例1-水性重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的储存稳定性
在以下三种不同温度下测试对照成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的稳定性：室温(例如，25℃)、37℃、以及45℃。在高温下的这些研究用于研究加速稳定性，其类似于在较低温度下的长期稳定性研究。在时间零点测试样品，随后在孵育1、2、3、4、以及7天之后测试。分析包括成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定、SEC、以及蛋白质印迹法。
简单地说，将几个5mL聚丙烯小瓶装有3mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶并且在以下三种不同温度下孵育：环境温度(室温)、37℃以及45℃。将来自各孵育条件的一个小瓶在时间零点取出，随后在1、2、3、4、以及7天之后取出。在0.65mL聚丙烯小瓶中准备200μL等分试样并且在-80℃下冷冻以待分析。
在这些条件下测定几种成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的稳定性。表17中给出各种制剂的细节。
表17.针对在高温下储存过程中的稳定性测试的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂。
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一种评定稳定性的方法是通过成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定。在这个测定中，根据底物裂解的速率测定成对碱性氨基酸蛋白酶的活性。底物Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC(SEQ ID NO:1；AMC=7-氨基-4-甲氧基香豆素)由成对碱性氨基酸蛋白酶裂解并且释放荧光AMC。例如在ELISA板上进行测定。根据(例如)由质量管理重组成对碱性氨基酸蛋白酶标准品建立的标准曲线测定样品中的成对碱性氨基酸蛋白酶活性。活性值计算为两种稀释物(各自一式两份)的平均值。
在37℃下高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳 定性。这个实验的目的是测试含有75ppm聚山梨酯80的稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性。因为使用海藻糖二水合物(C12H22O11*2H2O，FW378.33)而不是非水合海藻糖(C12H22O11，FW342.30)，所以这个样品的组合物中存在较小变化。使用海藻糖二水合物产生稍微更稀释的样品。搅拌研究表明聚山梨酯80浓度应保持在50ppm与100ppm之间以便提供针对搅拌所致的重组成对碱性氨基酸蛋白酶变性的最佳保护。在这个研究中，将测试制剂#1中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以聚山梨酯80至75ppm并且在37℃下孵育4天。将用对照制剂配制的重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品用作对照。
成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析(图1)显示在37℃和45℃下孵育的对照制剂中的样品中的活性损失。由于45℃样品仅在两天之后就高度降解并且聚集，所以在所述时间之后不对所述样品进行测试。对于在室温下孵育的样品，数据由于测定中可变性的量而是非决定性的，但数据表明重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性相对稳定，其中7天后的活性约相当于T=0。
与对照制剂中的数据形成对比，成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析(图46)显示与对照制剂中相比，测试制剂#1中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶保留其较多的活性。在37℃下孵育4天之后，重组成对碱性氨基酸蛋白酶保留其初始活性的76.7%，而对照制剂仅保存其初始活性的55.5%(图47)。
大小排阻色谱法(SEC)还用于评定不同成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的稳定性。对于SEC方法来说，使用以下设备和材料：
·配备有温度控制的自动进样器和光电二极管阵列检测器的Agilent HPLC1100系列。
·自动进样器100μL聚丙烯小瓶
·大小排阻色谱柱，来自TOSOH Bioscience，TSKgel
·G3000SWxl，7.8mm ID×30cm，5μm
此外，对于SEC方法来说使用以下条件：
·流动相：50mM MOPS，200mM硫酸钠，0.02%叠氮化钠，pH7.0
·流动速率：0.5mL/分钟
·运行时间：30分钟
·样品体积：100μL
·自动进样器温度：4℃
·柱温：环境温度
使用在280nm下的单波长吸收(参考关闭)来建立色谱图。在手动积分之后，使用与制剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶含量对应的在19分钟下的主峰高度来评估稳定性。使用峰高代替峰面积的原因在于色谱峰通常未进行基线分离(其可能导致较大误差)。各样品仅进行一次注射。重组成对碱性氨基酸蛋白酶对照制剂的重复分析显示峰高变化小于2%(数据未示出)。
SEC结果与以上所报道的成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定结果相关。SEC分析(图2)显示对于所有温度，对照制剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体峰高(保留时间19分钟)随孵育时间增加而减少。在于室温下孵育的样品中，重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体峰减少的速率相对较低，在7天孵育之后保持82%峰高。然而，在37℃下，在孵育7天之后，重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体峰高降低至初始高度的21.6%。在45℃下，在孵育两天之后，主峰减少至14.1%。与重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量的损失一致，对应于聚集体(在较早时间点洗脱)和降解产物(在较晚时间点洗脱)的其它色谱峰随时间推移开始出现(图3)。这些另外峰指示对照制剂中重组成对碱性氨基酸蛋白酶的降解和聚集。与室温储存相比，在37℃下的增加的降解也通过蛋白质印迹法证实(图4)。重组成对碱性氨基酸蛋白酶降解可以由与重组成对碱性氨基酸蛋白酶共纯化的蛋白酶引起或由重组成对碱性氨基酸蛋白酶自身的自催化活性引起。
相比之下，SEC分析证实与不含糖或糖醇的对照制剂相比，含有海藻糖的测试制剂#1的增加的稳定性(图48)。图48示出在于37℃下孵育4天之后，与在相同孵育过程中仅维持起始溶液的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体峰高的58.5%的对照制剂相比，测试制剂#1维持起始溶液的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体峰高的74.8%。
实施例2-水性重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂在冷冻/解冻后的储存稳定性
通过冷冻/解冻研究测试对照制剂和测试制剂#2至#6的稳定性。完成五个冷冻/解冻循环，并且通过成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定和SEC来分析样品。研究冷冻/解冻的影响是重要的，因为在这个研究中重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品和重组成对碱性氨基酸蛋白酶BDS是冷冻储存的。使用对照制剂(n=4)的冷冻/解冻实验证实在总共五个冷冻/解冻循环之后成对碱性氨基酸蛋白酶活性的较小损失(大约7%)。虽然似乎存在下降趋势，但这可能是由于蛋白质的真正损失、或测定可变性的反映。无论如何，这一数据支持不仅一次而且多次冷冻和解冻重组成对碱性氨基酸蛋白酶且几乎不损失活性的能力。同样地，对照制剂中成对碱性氨基酸蛋白酶的低聚状态的SEC分析显示在冷冻/解冻实验过程中单体含量无损失(图6)。
由于重组成对碱性氨基酸蛋白酶通常冷冻储存，所以评估解冻方法的影响。活性测定分析(图)证实以下两种解冻方法之间无显著差异：在4℃下解冻过夜，或在室温下解冻2小时。
总而言之，这些数据表明对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶在室温下相对稳定较短时间。此外，在高温下储存后的活性损失与重组成对碱性氨基酸蛋白酶降解和聚集相关。此外，对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶即使在五个冷冻/解冻循环之后也良好地保留其活性。
高度稳定化的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶的冷冻/解冻 研究。使用与先前冷冻/解冻研究相同的一组样品进行冷冻/解冻研究；评估测试制剂#2(0ppm聚山梨酯80)、#3(10ppm聚山梨酯80)、#4(25ppm聚山梨酯80)、#5(50ppm聚山梨酯80)、以及#6(100ppm聚山梨酯80)中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶的稳定性。对照制剂中的成对碱性氨基酸蛋白酶用作对照。与对照制剂的先前分析一致，成对碱性氨基酸蛋白酶活性的分析(图43)证实在五个冷冻/解冻循环之后任何测试制剂中的活性均无显著损失。通过SEC进行的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量的分析(图44和图45)证实在冷冻/解冻之后仅有较小的样品变质趋势。即使在五个冷冻/解冻循环之后，所有样品均还保留其初始活性的95%以上。
实施例3-水性重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂在机械应力后的储存稳定性
在不受理论限制的情况下，搅拌对重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的作用的一种潜在机制是它引起重组成对碱性氨基酸蛋白酶的变性，从而暴露疏水表面。疏水表面被其它疏水表面(如其它变性的重组成对碱性氨基酸蛋白酶蛋白质)吸引，这种吸引引起聚集或造成对样品试管和材料上的疏水表面的吸附。
搅拌研究并非设计用于模拟重组成对碱性氨基酸蛋白酶使用的真实过程，而是用于使样品受应力过度。为了被视为稳定化，重组成对碱性氨基酸蛋白酶的制剂表现至少与对照制剂一样良好，并且高度稳定化的制剂表现优于对照制剂。
通过在含有聚四氟乙烯(Teflon)球的瓶子中振荡重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品来进行搅拌研究。在搅拌2小时和17小时之后采集样品，并且通过成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定和SEC进行分析。如成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定和SEC分析的结果(分别是图7和图8)中所示，对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶在有限时间段中相当耐搅拌。在剧烈搅拌2小时之后，如可能在透析过滤步骤过程中出现，对照制剂中85%以上的重组成对碱性氨基酸蛋白酶仍有活性。然而，在搅拌17小时之后，如可能在样品装运过程中出现，小于10%的重组成对碱性氨基酸蛋白酶含量保持活性。
随后，测试对成对碱性氨基酸蛋白酶测试制剂#2至#6的作用，这些制剂通过九份重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以1份500mMHEPES、400mM乙酸、1mM CaCl2、pH6加10%w/w海藻糖加不同量的聚山梨酯80来制备。
通过将含有测试重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂和对照制剂的具有聚四氟乙烯球的瓶子振荡3小时来进行这个搅拌研究。评估含有以下水平的聚山梨酯80的测试制剂：无、10ppm、25ppm、50ppm、或100ppm。如图31中所示，测试制剂中的聚山梨酯80在搅拌过程中对重组成对碱性氨基酸蛋白酶提供显著保护。搅拌3小时之后，含有聚山梨酯80的样品中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性在31,499±1,218U/mL至36,787±847U/mL的范围内，而无聚山梨酯80的制剂中的样品具有17,835±1,706U/mL成对碱性氨基酸蛋白酶活性。对照制剂(10mM乙酸钠、230mM氯化钠、1mM氯化钙，pH6.0)中的样品具有24,368±1,135U/mL的活性。
SEC分析证实聚山梨酯80在这个研究中的有益作用(图32)。搅拌3小时后，含有聚山梨酯80的样品中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高在37.5mAU至35.9mAU的范围内，而无聚山梨酯80的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高是22.1mAU。对照制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰高是29.9mAU。聚山梨酯80的作用还在图33和图34中示出。较小趋势表明添加10ppm和25ppm聚山梨酯80虽然仍然有益，但不如使用50ppm或100ppm聚山梨酯80有效。对照制剂中搅拌的样品的SEC特征(图35)与未搅拌的样品相比并未显示任何附加峰。这将表明表面吸附是活性损失的主要原因。然而，UV吸收光谱(图36)显示搅拌的样品具有倾斜并且升高的特征，所述特征是由聚集体的存在引起的光散射和遮蔽的标志。光遮蔽一般由与较小分子相比更不透明的不同较大聚集体引起，这些聚集体引起UV光谱升高。分光光度计因其检测器测量通过样品的光的量而不能将这种现象与吸收进行区分。由于进入检测器的光较少，所以将其作为吸收报道；因此吸收特征升高。
光还可以通过聚集体散射，这种散射也将减少进入检测器的光的量。波长越短，越多光散射(散射的光的量与波长的四次方成反比)。这意味波长越短，进入检测器的光越少；因此吸收特征倾斜。很可能聚集体存在于这个样品中，但SEC分析不能检测出所述聚集体。关于SEC分析的这些类型的问题并不常见，因为蛋白质聚集体通常过大而不能通过柱、或被柱基质吸附。无聚山梨酯80的制剂中重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品的UV吸收光谱(图37)显示类似的升高特征。此外，在这个样品的SEC分析中未检测到聚集体(图38)。与未用聚山梨酯80配制的样品相比，用聚山梨酯80配制的样品在通过UV吸收光谱分析时显示出较少聚集(图39至图42)。虽然UV光谱不能定量聚集体的量，但可以再次观察到较小趋势，这暗示与具有10ppm或25ppm聚山梨酯80的样品相比，具有50ppm和100ppm聚山梨酯80的样品在保护重组成对碱性氨基酸蛋白酶免于聚集方面更好。数据表明以75ppm的水平包含于制剂中的聚山梨酯80将是有效的，因为这种浓度处于宽平台(50ppm至10ppm)的中间并且将表示稳健条件。
使用以下设备和材料进行UV分光光度计法分析：
·Agilent8453分光光度计
·石英比色杯1cm光路径
通过首先在比色杯中放置0.5mL适当制剂并且作为空白测量来进行分光光度计法分析。随后，在比色杯中放置0.5mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品，并且采用240nm至400nm扫描。
实施例4-pH、蔗糖以及聚山梨酯80对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的影响
将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以不同缓冲液以便将pH调节至5.0、5.5、6.0、7.0以及8.0。此外，在pH6.0、pH7.0以及pH8.0下向样品中添加蔗糖和/或聚山梨酯80。将样品在37℃下孵育并且通过成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定和SEC进行测试。
成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定(图11)和SEC(图12)均显示在37℃下，重组成对碱性氨基酸蛋白酶在pH6.0下比在pH5.0或pH5.5下更稳定。当通过SEC分析时，在pH6.0下对照制剂(图13)和MES(图14)中的样品比在pH7.0或pH8.0中配制的那些样品(图15和图16)更稳定。向pH6.0和pH7.0的样品中添加蔗糖对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性具有有益作用。SEC分析(图17)显示在于37℃下孵育4天之后，与在无蔗糖情况下的52%相比，含有蔗糖的样品的峰高平均是T=0的75%。成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定分析证实SEC实验的结果(图18和图19)。添加蔗糖使对照制剂和MES(pH6.0)中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性均得以改进(图18和图19)，并且使用任一缓冲液均可见类似稳定性(图20)。如图17、图18以及图19中所示，在37℃下聚山梨酯80对含有蔗糖的制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性如果有影响，那么最小。
这些数据表明在37℃下，与pH5.0、pH5.5、pH7.0以及pH8.0相比，重组成对碱性氨基酸蛋白酶在pH6.0制剂中最稳定。数据进一步显示在37℃下蔗糖对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性具有有益作用。此外，在pH6.0下在10%蔗糖存在下对照缓冲液(乙酸盐)或MES之间的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性未见显著差异。最后，在37℃下聚山梨酯80对蔗糖制剂中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性无显著作用。
实施例5-比较蔗糖与甘露糖醇中的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂稳定性
如实施例4中看出，添加蔗糖使重组成对碱性氨基酸蛋白酶在37℃下的降解和/或活性损失减缓。当下游应用(如rVWF过程)中未使用蔗糖时，其它糖和/或糖醇是如甘露糖醇。向重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂中添加甘露糖醇而不是蔗糖将因此不向vWF过程中引入新的原料。进行这个研究以确定添加甘露糖醇是否将对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性具有有益作用。测试制剂还通过在pH6.0下添加HEPES和乙酸至各50mM的最终浓度而具有改进的缓冲能力。通过将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品掺以10%的500mM HEPES、400mM乙酸、1mM CaCl2，pH6，并且随后添加蔗糖、甘露糖醇和/或聚山梨酯80来制备稳定化的制剂。成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定(图21)和SEC(图22)分析显示在于37℃下孵育4天之后，甘露糖醇和蔗糖对重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂具有类似的稳定作用。此外，聚山梨酯80对这些制剂的作用不显著。虽然活性数据(图21)显示在于37℃下孵育4天之后含有甘露糖醇和聚山梨酯80的样品优于其它样品，但这种样品不仅不遵循整体模式，而且其未得到SEC分析(图)证实。这个结果很可能是离群值。
实施例6-比较蔗糖与海藻糖中的成对碱性氨基酸蛋白酶制剂稳定性
不同公布已显示在冷冻过程中甘露糖醇加速蛋白质变性，这引起关于其包含于重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂缓冲液中的一些关切。尚未报道关于海藻糖(已经是rVWF产生过程的一部分的另一种糖)的这类问题。进行这个研究以确定添加海藻糖是否将对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性具有有益作用。此外，评估不同浓度的聚山梨酯80。使用成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定的分析(图23和图24)显示在37℃下孵育5天后，含有10%蔗糖的样品保留其初始活性的66.2%±2.9%，而含有10%海藻糖的样品保留60.1%±4%。这些样品之间的差异不显著。两种样品在保存重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性方面与对照制剂相比均显著更好，对照制剂仅保留其初始活性的37.5%±4.2%。
SEC分析(图25)证实所述活性分析。与针对10%海藻糖中的样品的75.1%和针对对照制剂的44.2%相比，10%蔗糖中的样品的重组成对碱性氨基酸蛋白酶峰值保留其高度的78.3%。此外，蛋白质印迹法分析(图26)显示含有10%蔗糖或10%海藻糖的样品中的降解最少。应注意样品成对呈现，其中对于各制剂来说第0天后面是第5天。
成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定(图27)和SEC(图28)分析均显示在于37℃下保存重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性方面10%海藻糖优于5%或2%海藻糖。这些发现还由蛋白质印迹法证实(图26)。根据成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定和SEC分析(分别为图29和图30)，在37℃下聚山梨酯80对重组成对碱性氨基酸蛋白酶稳定性的影响最小。
如上所描述进行SEC和成对碱性氨基酸蛋白酶活性测定。使用以下设备和材料进行蛋白质印迹法：
·山羊抗成对碱性氨基酸蛋白酶(肽)一级抗体(目录号SC-12484)，来自Santa Cruz Biotechnology公司
·兔抗山羊IgG-HRP缀合物二级抗体(目录号A5420)，来自Sigma
·Pierce金属增强的底物试剂盒，含有DAB/金属浓缩物10X，
·Pierce(目录号1856090)和稳定的过氧化酶缓冲液，Pierce(目录号185591)
·4%至20%Tris-甘氨酸凝胶(目录号EC6025BOX)，来自Invitrogen
·样品还原剂(0.5M DTT，10x，目录号NP0004)，来自Invitrogen
·非还原性样品缓冲液(4X，目录号84788)，来自Thermo
·PBS(目录号P4417)，来自Sigma
·吐温20(目录号9480)，来自EMD Chemicals
·BSA(目录号A7906)，来自Sigma
·凝胶转移装置(iBLOT目录号IB401001)，来自Invitrogen
·PVDF(Immobilon-P，目录号IPVH07850)转移膜，来自Millipore
在这个研究中使用多克隆抗体代替单克隆抗体以便增加对重组成对碱性氨基酸蛋白酶降解产物的检测。将5μl样品与1μl10×DTT和4μl4×非还原性染料组合。在70℃下将样品加热至75℃后持续10分钟。将10μl样品装载至4%至20%SDS-PAGE凝胶，并且在150V下运行60至70分钟。使用iBLOT在20V下持续6分钟将蛋白凝胶转移至PVDF膜。随后，用含有0.1%吐温20和3%BSA的PBS缓冲液阻断PVDF膜1小时。将膜在用相同缓冲液稀释125倍的一级抗体中孵育一小时。用PBST缓冲液洗涤膜5分钟，各3次。将膜在用与一级抗体相同的缓冲液稀释10,000倍的二级抗体中孵育一小时。孵育时间是1小时。使用PBST缓冲液洗涤印迹5分钟，各3次。将印迹在10mL预混合的显色底物(1ml浓缩物加9ml稳定的过氧化酶缓冲液)中显影，随后用水洗涤10分钟。
实施例7-稳定剂对成对碱性氨基酸蛋白酶组合物稀释的作用
进行重组成对碱性氨基酸蛋白酶稀释研究以便将起始制剂及其稀释剂与稳定化的制剂和稳定化的稀释剂进行比较。所述研究模拟rVWF成熟过程中所使用的稀释方法。简言之，将重组成对碱性氨基酸蛋白酶BDS通过过滤器，随后添加200倍体积的稀释剂。测试稀释方法与起始稀释方法之间的主要区别在于在测试(高度稳定化)方法中，75ppm聚山梨酯80存在于重组成对碱性氨基酸蛋白酶BDS和稀释剂中，而在起始方法中，重组成对碱性氨基酸蛋白酶BDS或稀释剂中均不存在聚山梨酯80。
进行两种稀释实验，并且两者均显示稳定化的制剂与其稳定化的稀释剂的组合优于起始成对碱性氨基酸蛋白酶和稀释剂制剂。在第一实验中，使用稳定化的制剂的测试方法恢复预期重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的83%至87%，而对照方法仅恢复21%至22%(表18)。在这个实验中，将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品通过过滤器并且随后添加200倍体积的稀释剂。将滤液收集至袋子中并且随后转移至刻度量筒中。
表18.在有和无非离子型表面活性剂的情况下进行的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稀释实验的实验结果。
Figure BDA0000463803880001421
在第二实验中，测试方法恢复预期重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性的80%，而对照方法仅恢复27%(表19)。在这个实验中，将重组成对碱性氨基酸蛋白酶样品通过过滤器并且随后添加200倍体积的稀释剂。将滤液收集至圆筒中。与对照方法相比，稳定化的重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂与稳定化的稀释剂的组合使重组成对碱性氨基酸蛋白酶恢复增加3至4倍。在不受理论限制的情况下，改进的恢复与聚山梨酯80的存在有关。
表19.在有和无非离子型表面活性剂的情况下进行的重组成对碱性氨基酸蛋白酶稀释实验的实验结果。
Figure BDA0000463803880001422
实施例8-稳定化的制剂储备缓冲液的特征
可以一致地制得稳定化的重组成对碱性氨基酸蛋白酶制剂的储备缓冲液(500mM HEPES、400mM乙酸、1mM CaCl2、pH6.0)(表20)。pH和传导率的RSD小于0.3%。pH与温度略微并且间接相关，每摄氏度下降0.014单位，而传导率与温度直接相关，每摄氏度上升0.40mS/cm(图49)。在测量pH和传导率时，样品的平均温度是27.6℃。在制造中，在25±0.5℃下读取样品。基于图48中的线性回归，计算在25℃下的预期pH和传导率。向这一值应用来自表20的相对标准偏差以便确定预期范围(±3sd)。在25℃下，pH预期是6.04(±0.01)。在25℃下，传导率预期是19.9±0.2mS/cm。这些预期范围是基于在限定环境下制得的三个批次。缓冲液的规格范围无需设置如此严格。pH规格将与最终BDS pH规格相同，是5.90至6.10。传导率范围将与先前BDS缓冲液所使用的传导率范围相似，例如，对于15.9mS/cm至23.9mS/cm的规格，范围是±20%。rVWF过程的要求一般在设置缓冲液规格方面不具有意义，因为重组成对碱性氨基酸蛋白酶将在rVWF过程中稀释200倍。表21和表22中的实验数据对应于图49中所呈现的图。
表20.稳定化的制剂储备缓冲液的特征。
表21.储备缓冲液传导率对温度的依赖性。
温度，C 传导率，mS/cm
18 17.23
18.4 17.42
18.7 17.53
19 17.63
19.3 17.75
19.6 17.86
19.7 17.91
20 18.03
20.2 17.72
20.5 17.83
21.6 17.86
24.4 19.81
27.6 21.1
表22.储备缓冲液pH对温度的依赖性。
温度，C pH
18 6.135
19.3 6.103
21.6 6.088
27.6 6.005
参考文献
本文所引用的所有参考文献特此均以引用的方式整体并入本文，并且出于所有的目的，所述引用的程度就好像具体地和单独地出于所有的目的将各个公布或专利或专利申请以引用的方式整体并入。
如对于本领域技术人员将是清楚的，可以在不背离本申请的精神和范围的情况下对其作出许多修改和变化。本文所描述的具体实施方案仅以举例的方式提供，并且本申请应仅受所附权利要求的术语和权利要求授权的等效物的全部范围限制。

Claims (56)

1.一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的稳定化水性组合物，所述组合物包含：
(a)8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；
(b)100mM至300mM药学上可接受的盐；
(c)0.5mM至2mM钙；
(d)2%至20%糖或糖醇；
(e)10ppm至200ppm非离子型表面活性剂；
(f)10mM至200mM缓冲剂；以及
(g)5.5至7.5的pH。
2.如权利要求1所述的组合物，其包含150mM至250mM药学上可接受的盐。
3.如权利要求2所述的组合物，其包含190±10mM药学上可接受的盐。
4.如权利要求3所述的组合物，其包含190mM药学上可接受的盐。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述药学上可接受的盐是氯化钠。
6.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述药学上可接受的盐是氯化钾。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其包含0.9±0.2mM钙。
8.如权利要求7所述的组合物，其包含0.92mM钙。
9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其包含5%至15%糖或糖醇。
10.如权利要求9所述的组合物，其包含10±2%糖或糖醇。
11.如权利要求10所述的组合物，其包含10%糖或糖醇。
12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述糖或糖醇选自由以下各项组成的组：蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、以及其组合。
13.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述糖或糖醇是海藻糖。
14.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述糖或糖醇是蔗糖。
15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其包含10ppm至100ppm非离子型表面活性剂。
16.如权利要求15所述的组合物，其包含50ppm至100ppm非离子型表面活性剂。
17.如权利要求16所述的组合物，其包含75ppm非离子型表面活性剂。
18.如权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述非离子型表面活性剂是聚山梨酯80。
19.如权利要求1至18中任一项所述的组合物，其包含50mM至150mM缓冲剂。
20.如权利要求19所述的组合物，其包含90±10mM缓冲剂。
21.如权利要求20所述的组合物，其包含91mM缓冲剂。
22.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂包含乙酸盐。
23.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂包含HEPES。
24.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂包含MES。
25.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂包含乙酸盐和HEPES。
26.如权利要求25所述的组合物，其包含25mM至75mM乙酸盐和25mM至75mM HEPES。
27.如权利要求26所述的组合物，其包含45±5mM乙酸盐和45±5mM HEPES。
28.如权利要求27所述的组合物，其包含45mM乙酸盐和46mM HEPES。
29.如权利要求1至28中任一项所述的组合物，其具有5.5至7.0的pH。
30.如权利要求29所述的组合物，其具有5.5至6.5的pH。
31.如权利要求30所述的组合物，其具有6.0±0.2的pH。
32.如权利要求31所述的组合物，其具有6.0的pH。
33.如权利要求1至32中任一项所述的组合物，其中所述组合物在于37℃下储存时与不包含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比具有增加的稳定性。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所述组合物在于37℃下储存时与不包含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
35.如权利要求33或34所述的组合物，其中所述组合物在于37℃下储存时与不包含糖或糖醇的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
36.如权利要求1至35中任一项所述的组合物，其中所述组合物在搅拌时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比具有增加的稳定性。
37.如权利要求36所述的组合物，其中所述组合物在搅拌时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
38.如权利要求36或37所述的组合物，其中所述组合物在搅拌时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
39.如权利要求1至38中任一项所述的组合物，其中所述组合物在稀释时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比具有增加的稳定性。
40.如权利要求39所述的组合物，其中所述组合物在稀释时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性百分比。
41.如权利要求39或40所述的组合物，其中所述组合物在稀释时与不包含非离子型表面活性剂的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物相比维持较高的重组成对碱性氨基酸蛋白酶单体含量百分比。
42.一种重组成对碱性氨基酸蛋白酶(recombinant furin)(重组成对碱性氨基酸蛋白酶(rfurin))的稳定化水性组合物，所述组合物包含：
(a)8,000U/mL至500,000U/mL重组成对碱性氨基酸蛋白酶；
(b)190mM氯化钠；
(c)0.92mM钙；
(d)10%海藻糖；
(e)75ppm聚山梨酯80；
(f)45mM乙酸；
(g)46mM HEPES；以及
(g)5.5至7.5的pH。
43.如权利要求42所述的组合物，其具有5.5至7.0的pH。
44.如权利要求42所述的组合物，其具有5.5至6.5的pH。
45.如权利要求42所述的组合物，其具有6.0±0.2的pH。
46.如权利要求42所述的组合物，其具有6.0的pH。
47.一种用于稀释重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物的方法，所述方法包括向所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物添加包含10ppm至200ppm非离子型表面活性剂的稀释缓冲液，从而形成稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物。
48.如权利要求43所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含10ppm至100ppm非离子型表面活性剂。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含50ppm至100ppm非离子型表面活性剂。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述稀释缓冲液包含75ppm非离子型表面活性剂。
51.如权利要求43至50中任一项所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有5.5至7.5的pH。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有5.5至6.5的pH。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有6.0±0.2的pH。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述稀释缓冲液具有6.0的pH。
55.如权利要求43至51中任一项所述的方法，其中所述稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含至少50%在稀释前存在于所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述稀释的重组成对碱性氨基酸蛋白酶组合物包含至少75%在稀释前存在于所述重组成对碱性氨基酸蛋白酶水性组合物中的重组成对碱性氨基酸蛋白酶活性。
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